CN107267502B - 一种高效提取甘蔗糖制品dna的试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种高效提取甘蔗糖制品DNA的试剂盒和方法。该试剂盒包括预处理液、裂解液、DNA沉淀液、结合液、磁珠悬浮液、漂洗液和洗脱液。本发明的方法是先将甘蔗糖制品和预处理液混匀，处理后离心，收集沉淀；沉淀经裂解、去蛋白和DNA沉淀获得初步提取的DNA，用水溶解DNA；加入结合液和磁珠悬浮液，分离磁珠，磁珠再经过两次漂洗和洗脱获得纯化的DNA。本发明提供的试剂盒和方法提取获得的甘蔗糖制品DNA含量和纯度较高、且提取过程中不使用酚、氯仿等有毒试剂，对环境和实验人员不会造成危害。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种高效提取甘蔗糖制品DNA的试剂盒和方法。
背景技术
甘蔗是世界上重要的糖能兼用作物，主要种植与热带与亚热带地区，以甘蔗加工而得的甘蔗糖制品(白糖，红糖，原糖等)的贸易涉及全球范围。近年来，利用转基因技术进行甘蔗的遗传改良在世界各国得到广泛应用，获得一大批转基因植株。近期有消息称，巴西国际生物安全技术委员会已经批准全球首款转基因甘蔗进入市场。为了保证食品的安全，甘蔗糖制品的转基因检测开始受到重视。转基因检测的大多数是以PCR为基础的检测方法，因此提取高质量的DNA是开展转基因检测的基础。
目前常用的植物基因组DNA提取纯化的方法有SDS法、CTAB法和利用介质吸附DNA的方法(柱式法和磁珠法)。甘蔗糖制品是通过蔗茎压榨获取蔗汁，然后澄清、煮糖等程序加工而来。由于甘蔗汁中的主要成分是水，DNA含量低，另外加工过程中需要添加石灰、澄清剂等并经过高温煮糖，这些过程都会造成植物细胞破裂，DNA断裂、降解，使得糖制品中的DNA含量极少，片段较短。另外，在糖加工过程还会产生多糖、焦糖色素、多酚等杂质，这些在DNA提取过程中很难去除，利用传统的DNA提取方法和现有的DNA提取试剂盒，获得的DNA产量和纯度都较低，无法满足下一步试验的要求。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种高效提取甘蔗糖制品DNA的试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种高效提取甘蔗糖制品DNA的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种高效提取甘蔗糖制品DNA的试剂盒，包括：预处理液、裂解液、DNA沉淀液、结合液、磁珠悬浮液；
其中，预处理液为10％～20％(w/v)的PEG8000、25％～50％(v/v)异丙醇、或10％(w/v)的PEG8000加25％(v/v)异丙醇形成的混合液；
裂解液的组成如下：300～800mM NaCl、30～80mM Tris-HCl、30～80mM EDTA、2～4％(w/v)SDS，2～3％(w/v)PVPP或PVP，pH 8.0，溶剂为水；
DNA沉淀液为10％～30％(w/v)的PEG8000；
结合液的组成如下：10％～15％(w/v)的PEG8000、2～6M GITC、30～60mM NaCl、30～60mM Tris-HCl，pH6.4，溶剂为水。
所述的高效提取甘蔗糖制品DNA的试剂盒，还包括漂洗液和洗脱液。
所述的漂洗液用于洗去不与磁珠结合的蛋白，其组成优选如下：50％(v/v)乙醇、0.2M NaCl、10mM EDTA、50mM Tris-HCl、2M GITC，pH7.6，溶剂为水。
所述的洗脱液用于将与磁珠结合的DNA洗脱下来，其组成优选如下：10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.0，溶剂为水。
所述的甘蔗糖制品是指由甘蔗汁直接加工生产得到的红糖、黑糖、原糖、白糖等糖制品。
所述的预处理液优选为10％(w/v)的PEG8000。
所述的裂解液的组成优选如下：500mM NaCl、50mM Tris-HCl、50mM EDTA、4％(w/v)SDS，2％(w/v)PVPP或PVP，pH 8.0，溶剂为水。
所述的DNA沉淀液优选为20％(w/v)的PEG8000。
所述的结合液的组成优选如下：10％(w/v)的PEG8000、4M GITC、50mM NaCl、50mMTris-HCl，pH6.4，溶剂为水。
所述的磁珠悬浮液的浓度为10mg/mL。
所述的磁珠优选为羟基磁珠。
一种高效提取甘蔗糖制品DNA的方法，是使用上述试剂盒中的试剂进行，包括如下步骤：
(1)预处理：将3～5g甘蔗糖制品和10～20mL预处理液混匀，于-20～-80℃处理至少24h，第一次离心，收集沉淀；
(2)DNA的初步提取：在沉淀中加入500～1000μL裂解液，混匀后于65～75℃，温浴15～30min；接着加入80～100μL浓度为10M的NH4AC或浓度为3M的KAC，冰上放置，第二次离心，取上清；接着在上清中加入等体积的DNA沉淀液进行沉淀，第三次离心，取沉淀；用浓度为70～75％(v/v)的乙醇清洗沉淀，加入100～200μL水溶解DNA；
(3)DNA的纯化：
①在步骤(2)最终得到的溶液中加入200～400μL结合液和20～40μL浓度为10mg/mL的磁珠悬浮液，漩涡震荡，置于磁力架上静置，分离磁珠；
②在磁珠中加入漂洗液，漩涡混匀，置于磁力架上静置，分离磁珠；
③在磁珠中加入浓度为75％(v/v)的乙醇，漩涡混匀，置于磁力架上静置，分离磁珠；
④待磁珠干燥，乙醇挥发完全，加入洗脱液，60～65℃温浴10～15min，分离磁珠，上清为纯化得到的DNA。
步骤(1)中所述的处理的时间优选为48h。适当延长处理的时间可以提高DNA的得率，但是同时也会适当更多的杂质沉淀，处理48h效果最佳。
步骤(1)中所述的第一次离心的条件优选为10000rpm离心30min。
步骤(2)中所述的冰上放置的时间优选为10min。
步骤(2)中所述的第二次离心的条件优选为4℃下12000rpm离心10min。
步骤(2)中所述的进行沉淀的时间优选为10min。
步骤(2)中所述的第三次离心的条件优选为12000rpm离心10min。
步骤(2)中所述的清洗沉淀的次数优选为1次。
步骤(3)①中所述的漩涡震荡的时间优选为5min。
步骤(3)①中所述的置于磁力架上静置的时间优选为30s。
步骤(3)②中所述的漂洗液的用量优选为400～800μL；更优选为500μL。
步骤(3)②中所述的漩涡混匀的时间优选为1min。
步骤(3)②中所述的置于磁力架上静置的时间优选为30s。
步骤(3)③中所述的乙醇的用量优选为500～1000μL；更优选为500～800μL。
步骤(3)③中所述的漩涡混匀的时间优选为5min。
步骤(3)③中所述的置于磁力架上静置的时间优选为30s。
步骤(3)③优选为重复一次。
步骤(3)④中所述的洗脱液的用量优选为30～50μL；更优选为30μL。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供的试剂盒提取获得的甘蔗糖制品DNA含量和纯度较高。
(2)本发明提供的试剂盒和方法克服现有技术由于甘蔗糖制品中多糖、多酚、色素等杂质难以去除而影响后续试验的问题，提高提取DNA的纯度和DNA的产率，并且提取过程中不使用酚、氯仿等有毒试剂，对环境和实验人员不会造成危害。
附图说明
图1是实施例2三种方法提取到的DNA的检测图；泳道1为方法1提取的DNA；泳道2为方法2提取的DNA；泳道3为方法3提取的DNA；泳道M为DNA Marker。
图2是实施例3三种方法提取到的DNA为模板扩增ScALS基因的结果图；其中，泳道1～3为本发明方法提取的DNA；泳道4～6为植物基因组提取试剂盒(柱式法)提取的DNA；泳道7～9为植物基因组提取试剂盒(磁珠法)提取的DNA；泳道10为阳性对照；泳道11为阴性对照。
图3是实施例3三种方法提取到的DNA为模板扩增ScF2KP基因的结果图；其中，泳道1～3为本发明方法提取的DNA；泳道4～6为植物基因组提取试剂盒(柱式法)提取的DNA；泳道7～9为植物基因组提取试剂盒(磁珠法)提取的DNA；泳道10为阳性对照；泳道11为阴性对照。
图4是本发明的试剂盒及方法提取黑糖DNA的甘蔗内标基因ScALS荧光定量PCR检测的结果图；其中，图A为扩增曲线图；图B为溶解曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一、五种方法提取红糖中的DNA
方法1：采用本发明的预处理液、裂解液、DNA沉淀液
(1)预处理：取5g红糖加入10mL预处理液，预处理液为10％(w/v)的PEG8000，放入-20℃沉淀，处理时间在48h，然后10000rpm离心30min，去除上清液。
(2)初步提取：加入800μl裂解液(裂解液的组成如下：500mM NaCl、50mM Tris-HCl、50mM EDTA、3％(w/v)SDS、2％(w/v)PVPP，pH 8.0，溶剂为水)将沉淀溶解，并反复清洗离心管内壁，将液体转移到1.5ml的离心管中，65℃温浴30min，期间颠倒混匀；加入100μL浓度为10M的NH4AC，冰上放置10min，4℃、12000rpm离心10min，取上清；加入等体积的DNA沉淀液(DNA沉淀液的组成如下：20％(w/v)PEG8000，溶剂为水)，静置10min。12000rpm离心10min，弃上清，用75％(v/v)的乙醇清洗沉淀一次，沉淀加200μL ddH2O溶解。
(3)纯化：加入400μL结合液(结合液的组成如下：10％(w/v)PEG8000、4M GITC(异硫氰酸胍)、50mM NaCl、50mM Tris-HCl，pH6.4，溶剂为水)，20μL浓度为10mg/mL的磁珠(苏州海狸生物医学工程有限公司提供)。漩涡混匀5min，置于磁力架上静置30s，分离磁珠，将液体吸出；加入500μL漂洗液(漂洗液的组成如下：50％(v/v)乙醇、0.2M NaCl、10mM EDTA、50mM Tris-HCl、2M GITC、pH7.6，溶剂为水)，漩涡混匀1min，置于磁力架上静置30s，分离磁珠，将液体吸出；加入800μL的75％(v/v)的乙醇，漩涡混匀1min，置于磁力架上静置30s，分离磁珠，将液体吸出，重复一次；短暂离心，置于磁力架上将液体吸干净，放置10～15min，待磁珠干燥，乙醇挥发完全，加入30μL洗脱液(洗脱液的组成如下：10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH8.0，溶剂为水)，65℃温浴10min，分离磁珠，将DNA吸出加入新的离心管中。
方法2：不进行预处理
与方法1基本相同，区别仅在于：步骤(1)不加入预处理液，仅用水进行DNA的溶解，其他步骤相同。
方法3、裂解液中添加1％的PVPP
与方法1基本相同，区别仅在于：步骤(2)的裂解液成分由2％的PVPP改为1％的PVPP，其他步骤相同。
方法4、裂解液中不添加PVPP
与方法1基本相同，区别仅在于：步骤(2)的裂解液成分不含PVPP，其他步骤相同。
方法5、以DNA提取常用的异丙醇进行粗提取DNA的沉淀
与方法1基本相同，区别仅在于：步骤(2)中将DNA沉淀液改为用等体积的异丙醇进行沉淀，其他步骤相同。
五种方法各做三次重复。
二、结果比较：DNA的纯度和浓度的检测结果：
取各个方法提取到的2.5μL DNA用ddH2O稀释到100μL，再用Eppendorf的核酸蛋白测定仪(D30)测定所提DNA的A260/280及浓度。结果如表1所示。
表1
采用本发明方法(方法1)预处理液、裂解液、DNA沉淀液进行红糖的预处理和DNA的粗提取，然后再进行纯化所提取的DNA纯度和浓度均高于其他方法。
实施例2
一、三种方法提取红糖中的DNA
方法1、本发明的磁珠结合液、洗涤液、洗脱液和磁珠1
(1)预处理：取5g红糖加入10mL预处理液，预处理液为10％(w/v)的PEG8000，放入-20℃沉淀，处理时间在48h，然后10000rpm离心30min，去除上清液。
(2)初步提取：加入800μl裂解液(裂解液的组成如下：500mM NaCl、50mM Tris-HCl、50mM EDTA、4％(w/v)SDS、2％(w/v)PVPP，pH 8.0，溶剂为水)将沉淀溶解，并反复清洗离心管内壁，将液体转移到1.5ml的离心管中，65℃温浴30min，期间颠倒混匀；加入100μL浓度为10M的NH4AC，冰上放置10min，4℃、12000rpm离心10min，取上清；加入等体积的DNA沉淀液(DNA沉淀液的组成如下：20％(w/v)PEG8000，溶剂为水)，静置10min。12000rpm离心10min，弃上清，用75％(v/v)的乙醇清洗沉淀一次，沉淀加200μL ddH2O溶解。
(3)纯化：加入400μL结合液(结合液的组成如下：10％(w/v)PEG8000、4M GITC、50mM NaCl、50mM Tris-HCl，pH6.4，溶剂为水)，20μL浓度为10mg/mL的磁珠(苏州海狸生物医学工程有限公司提供)。漩涡混匀5min，置于磁力架上静置30s，分离磁珠，将液体吸出；加入500μL的漂洗液(漂洗液的组成如下：50％(v/v)乙醇、0.2M NaCl、10mM EDTA、50mM Tris-HCl、2M GITC、pH7.6，溶剂为水)，漩涡混匀1min，置于磁力架上静置30s，分离磁珠，将液体吸出；加入500μL的75％(v/v)乙醇，漩涡混匀1min，置于磁力架上静置30s，分离磁珠，将液体吸出，重复一次；短暂离心，置于磁力架上将液体吸干净，放置10-15min，待磁珠干燥，乙醇挥发完全，加入30μL洗脱液(洗脱液的组成如下：10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH8.0，溶剂为水)，65℃温浴10min，分离磁珠，将DNA吸出加入新的离心管中。
方法2、本发明的磁珠结合液、洗涤液、洗脱液和磁珠2
与方法1基本相同，区别仅在于：步骤(3)中将磁珠改为植物基因组提取试剂盒(磁珠法，天根生化科技有限(北京)公司)中提供的磁珠，其他方法步骤同方法1。
方法3、采用植物基因组提取试剂盒(磁珠法，天根生化科技有限(北京)公司)进行DNA纯化
与方法1基本相同，区别仅在于：步骤(3)的纯化是根据试剂盒提供的方法进行DNA的纯化。
二、结果比较：DNA的纯度和浓度的检测结果：
取各个方法提取到的2.5μL DNA用ddH2O稀释到100μL，再用Eppendorf的核酸蛋白测定仪(D30)测定所提DNA的A260/280及浓度。结果如表2所示。
表2
| 方法 | A260/A280 | 浓度(ng/ul) |
| 方法1 | 1.92 | 795 |
| 方法2 | 1.94 | 965 |
| 方法3 | 1.4 | 262.5 |
以本发明方法磁珠结合液、洗涤液、洗脱液提取的DNA浓度高于采用试剂盒进行纯化的DNA浓度。以1.5％的琼脂糖胶进行电泳检测，方法1和方法2可见DNA条带，而方法3的DNA条带非常弱(图1)。
实施例3
一、三种方法提取红糖中的DNA
方法1、本发明试剂盒和方法提取市售红糖中的DNA：
(1)预处理：取5g红糖加入10mL预处理液，预处理液为10％(w/v)的PEG8000，放入-20℃沉淀，处理时间在48h，然后10000rpm离心30min，去除上清液。
(2)初步提取：加入600μl裂解液(裂解液的组成如下：500mM NaCl、50mM Tris-HCl、50mM EDTA、4％(w/v)SDS、2％(w/v)PVPP，pH 8.0，溶剂为水)，将沉淀溶解，并反复清洗离心管内壁，将液体转移到1.5ml的离心管中，65℃温浴30min，期间颠倒混匀；加入80μL浓度为10M的NH4AC，冰上放置10min，4℃下12000rpm离心10min，取上清；加入等体积DNA沉淀液(DNA沉淀液的组成如下：20％(w/v)PEG8000，溶剂为水)，静置10min。12000rpm离心10min，弃上清，用75％(v/v)的乙醇清洗沉淀一次，晾干去除乙醇，沉淀加100μL ddH2O溶解。
(3)纯化：加入400μL结合液(结合液的组成如下：10％(w/v)PEG8000、4M GITC、50mM NaCl、50mM Tris-HCl，pH6.4，溶剂为水)，20μL浓度为10mg/mL的磁珠(苏州海狸生物医学工程有限公司提供)，漩涡混匀5min，置于磁力架上静置30s，分离磁珠，将液体吸出；加入500μL漂洗液(漂洗液的组成如下：50％(v/v)乙醇、0.2M NaCl、10mM EDTA、50mM Tris-HCl、2M GITC、pH7.6，溶剂为水)，漩涡混匀1min，置于磁力架上静置30s，分离磁珠，将液体吸出；加入500μL 75％(v/v)的乙醇，漩涡混匀1min，置于磁力架上静置30s，分离磁珠，将液体吸出，重复一次；短暂离心，置于磁力架上将液体吸干净，放置10-15min，待磁珠干燥，乙醇挥发完全，加入30μL洗脱液(洗脱液的组成如下：10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH8.0，溶剂为水)，65℃温浴10min，分离磁珠，将DNA吸出加入新的离心管中。
方法2、植物基因组提取试剂盒(柱式法，购于TaKaRa)提取红糖中的DNA：
(1)预处理：同方法1步骤(1)。
(2)DNA提取：按照试剂盒提供的方法进行。
方法3、植物基因组提取试剂盒(磁珠法，购于天根生化科技有限(北京)公司)提取红糖中的DNA：
(1)预处理：同方法1步骤(1)。
(2)DNA提取：按照试剂盒提供的方法进行。
二、结果比较：
(1)DNA的纯度和浓度的检测结果
取各个方法提取到的2.5μL DNA用ddH2O稀释到100μL，再用Eppendorf的核酸蛋白测定仪(D30)测定所提DNA的A260/280及浓度。结果如表3所示。
表3
| 方法 | A260/A280 | 浓度(ng/ul) |
| 本发明方法 | 1.78-1.75 | 148-256 |
| 植物基因组提取试剂盒(柱式法) | 1.21-1.1.1 | 52.5-57.5 |
| 植物基因组提取试剂盒(磁珠法) | 1.12-1.16 | 82-97.5 |
本发明方法(方法1)提取的DNA纯度高于两种试剂盒提取的DNA，浓度测定显示本发明试剂盒和方法提取的浓度高于植物基因组提取试剂盒(柱式法)和植物基因组提取试剂盒(磁珠法)。
(2)DNA用于后续PCR的检测结果
用如下引物进行PCR扩增，分别扩增甘蔗低拷贝的内标基因乙酰乳酸合酶基因(ScALS)和果糖-6-磷酸2-激酶基因(ScF2KP)，长度分别为171bp和300bp。
ScALS-F：5’-CTCCCAGTGAAGGTCTTTGCG-3’；
ScALS-R：5’-TGCTGGAATGTTGAACCCTT-3’；
ScF2KP-F：5’-CCTGGGAGGATTGTCTTCTTC-3’；
ScF2KP-R：5’-ATCACCACCGATTCTTCCTCT-3’。
PCR反应体系如下：10×buffer 5μL，dNTP(2.5mM)5μL，LaTaq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，正反向引物(10μM)各0.5μmol/L，DNA模板2.5μL，水补足至50μL。反应程序：预变性94℃、5min；94℃变性15s、58℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环；72℃终延伸10min。扩增产物经2.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统上观察并拍照，结果显示(见图2和图3)，本发明方法提取的DNA为模板均能扩增得到甘蔗两个内标基因，显示特异性的清晰条带，而两种市售试剂盒提取红糖的DNA没有明显的扩增条带，说明这两种提取的DNA浓度低，且纯度低，严重影响到后续的PCR试验。由此可见本发明的试剂盒和方法可以有效提取到红糖中残留的微量DNA，并且提取的DNA可以满足后续以PCR为基础的试验要求。
实施例4本发明方法提取市售黑糖中DNA的效果
(1)预处理：取5g黑糖置于50mL的离心管中，加入10mL预处理液，预处理液为13％(w/v)的PEG8000，放入-20℃沉淀，处理时间在48h，然后10000rpm离心30min，去除上清液。
(2)初步提取：加入800μl裂解液(裂解液的组成如下：500mM NaCl、50mM Tris-HCl、50mM EDTA、4％(w/v)SDS、2％(w/v)PVPP，pH 8.0，溶剂为水)，将沉淀溶解，并反复清洗离心管内壁，将液体转移到2ml的离心管中，65℃温浴30min，期间颠倒混匀；加入100μL浓度为3M的KAC，冰上放置10min，4℃下12000rpm离心10min，取上清；加入等体积DNA沉淀液(DNA沉淀液的组成如下：20％(w/v)PEG8000，溶剂为水)，静置10min。12000rpm离心10min，弃上清，用75％(v/v)的乙醇清洗沉淀一次，晾干去除乙醇，沉淀加100μL ddH2O溶解。
(3)纯化：加入200μL结合液(结合液的组成如下：15％(w/v)PEG8000、4M GITC、50mM NaCl、50mM Tris-HCl，pH6.4，溶剂为水)，20μL浓度为10mg/mL的羟基磁珠(苏州海狸生物医学工程有限公司提供)，漩涡混匀5min，置于磁力架上静置30s，分离磁珠，将液体吸出；加入500μL漂洗液(漂洗液的组成如下：50％(v/v)乙醇、0.2M NaCl、10mM EDTA、50mMTris-HCl、2M GITC、pH7.6，溶剂为水)，漩涡混匀1min，置于磁力架上静置30s，分离磁珠，将液体吸出；加入500μL 75％(v/v)的乙醇，漩涡混匀1min，置于磁力架上静置30s，分离磁珠，将液体吸出，重复一次；短暂离心，置于磁力架上将液体吸干净，放置10-15min，待磁珠干燥，乙醇挥发完全，加入30μL洗脱液(洗脱液的组成如下：10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH8.0，溶剂为水)，65℃温浴10min，分离磁珠，将DNA吸出加入新的离心管中。
(2)DNA用于后续荧光定量PCR的检测结果
用如下引物进行PCR扩增，分别扩增甘蔗低拷贝的内标基因乙酰乳酸合酶基因(ScALS)，长度分别为171bp。
ScALS-F：5’-CTCCCAGTGAAGGTCTTTGCG-3’；
ScALS-R：5’-TGCTGGAATGTTGAACCCTT-3’。
以提取的DNA在在实时荧光定量PCR仪(7500 Real Time PCR System，ABI)上进行检测，反应体系为：DNA 1μL，10μmol·L-1上下游引物各0.5μL，2×SYBR Mix溶液10μL(TOYOBO)，超纯水补充体积至20μL。反应条件为95℃预变性5min；95℃10s、60℃45s，40个循环。三个重复的CT值均在29-30之间，溶解曲线显示具有单一的扩增产物(图4)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省生物工程研究所（广州甘蔗糖业研究所）
<120> 一种高效提取甘蔗糖制品DNA的试剂盒和方法
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> ScALS-F
<400> 1
ctcccagtga aggtctttgc g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ScALS-R
<400> 2
tgctggaatg ttgaaccctt 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ScF2KP-F
<400> 3
cctgggagga ttgtcttctt c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ScF2KP-R
<400> 4
atcaccaccg attcttcctc t 21
Claims (7)
1.一种高效提取甘蔗糖制品DNA的方法，其特征在于：使用一种高效提取甘蔗糖制品DNA的试剂盒进行，包括如下步骤：
（1）预处理：将3～5 g甘蔗糖制品和10～20 mL预处理液混匀，于-20～-80 ℃处理至少24 h，第一次离心，收集沉淀；
（2）DNA的初步提取：在沉淀中加入500～1000 µL裂解液，混匀后于65～75 ℃，温浴15～30 min；接着加入80～100 µL 浓度为10 M的NH4AC或浓度为3 M的KAC，冰上放置，第二次离心，取上清；接着在上清中加入等体积的DNA沉淀液进行沉淀，第三次离心，取沉淀；用浓度为70～75%（v/v）的乙醇清洗沉淀，加入100～200 μL水溶解DNA；
（3）DNA的纯化：
①在步骤（2）最终得到的溶液中加入200～400 μL结合液和20～40 μL浓度为10 mg/mL的磁珠悬浮液，漩涡震荡，置于磁力架上静置，分离磁珠；
②在磁珠中加入漂洗液，漩涡混匀，置于磁力架上静置，分离磁珠；
③在磁珠中加入浓度为75%（v/v）的乙醇，漩涡混匀，置于磁力架上静置，分离磁珠；
④待磁珠干燥，乙醇挥发完全，加入洗脱液， 60～65 ℃ 温浴10～15 min，分离磁珠，上清为纯化得到的DNA；
所述的高效提取甘蔗糖制品DNA的试剂盒包括：预处理液、裂解液、DNA沉淀液、结合液、磁珠悬浮液；
其中，预处理液为10%～20%（w/v）的PEG8000；
裂解液的组成如下：300～800 mM NaCl、30～80 mM Tris-HCl、30～80 mM EDTA、2～4%（w/v）SDS，2～3%（w/v）PVPP或PVP，pH 8.0，溶剂为水；
DNA沉淀液为10%～30%（w/v）的PEG8000；
结合液的组成如下：10%～15%（w/v）的PEG8000、2～6 M GITC、30～60 mM NaCl、30～60mM Tris-HCl，pH6.4，溶剂为水。
2.根据权利要求1所述的高效提取甘蔗糖制品DNA的方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的处理的时间为48 h；
步骤（1）中所述的第一次离心的条件为10000 rpm离心 30 min；
步骤（2）中所述的冰上放置的时间为10 min；
步骤（2）中所述的第二次离心的条件为4 ℃下12000 rpm离心10 min；
步骤（2）中所述的进行沉淀的时间为10 min；
步骤（2）中所述的第三次离心的条件为12000 rpm离心10 min；
步骤（3）①中所述的漩涡震荡的时间为5 min；
步骤（3）①中所述的置于磁力架上静置的时间为30 s；
步骤（3）②中所述的漂洗液的用量为400～800 μL；
步骤（3）②中所述的漩涡混匀的时间为1 min；
步骤（3）②中所述的置于磁力架上静置的时间为30 s；
步骤（3）③中所述的乙醇的用量为500～1000 μL；
步骤（3）③中所述的漩涡混匀的时间为5 min；
步骤（3）③中所述的置于磁力架上静置的时间为30 s；
步骤（3）④中所述的洗脱液的用量为30～50 μL。
3.根据权利要求1所述的高效提取甘蔗糖制品DNA的方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的清洗沉淀的次数为1次；
步骤（3）③重复一次。
4.根据权利要求1所述的高效提取甘蔗糖制品DNA的方法，其特征在于：
所述高效提取甘蔗糖制品DNA的试剂盒还包括漂洗液和洗脱液；
所述的漂洗液的组成如下：50%（v/v）乙醇、0.2 M NaCl、10 mM EDTA、50 mM Tris-HCl、2 M GITC，pH7.6，溶剂为水；
所述的洗脱液的组成如下：10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH8.0，溶剂为水。
5.根据权利要求1所述的高效提取甘蔗糖制品DNA的方法，其特征在于：所述的预处理液为10%（w/v）的 PEG8000；
所述的裂解液的组成如下：500 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、50 mM EDTA、4%（w/v） SDS，2%（w/v） PVPP或PVP，pH 8.0，溶剂为水；
所述的DNA沉淀液为20%（w/v）的PEG8000；
所述的结合液的组成如下：10%（w/v）的PEG8000、4 M GITC、50 mM NaCl、50 mM Tris-HCl，pH6.4，溶剂为水。
6.根据权利要求1所述的高效提取甘蔗糖制品DNA的方法，其特征在于：所述的磁珠悬浮液的浓度为10 mg/mL。
7.根据权利要求6所述的高效提取甘蔗糖制品DNA的方法，其特征在于：所述的磁珠为羟基磁珠。
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