CN114164206B

CN114164206B - 大豆基因组dna提取试剂及其应用

Info

Publication number: CN114164206B
Application number: CN202111544731.9A
Authority: CN
Inventors: 张慧; 黄明贤; 任辉
Original assignee: Suzhou Beaver Biomedical Engineering Co ltd
Current assignee: Suzhou Beaver Biomedical Engineering Co ltd
Priority date: 2021-12-16
Filing date: 2021-12-16
Publication date: 2023-08-04
Anticipated expiration: 2041-12-16
Also published as: CN114164206A

Abstract

本发明涉及核酸提取纯化技术领域，尤其涉及大豆基因组DNA提取试剂及其应用。本发明提供的大豆基因组DNA的提取试剂，其包括：磁珠、RNase A、蛋白酶K、裂解液、结合液、洗涤液I、洗涤液II、洗涤液III和洗脱液。本发明的试剂中蛋白酶K、RNase A成分在裂解步骤加入，能够避免油脂、蛋白质、RNA对提取产物的影响；结合液能够使DNA与磁珠良好的结合，从而提高得率。洗涤液中含有不同浓度的胍盐，从而有效去除大豆蛋白、盐类及其他小分子化合物。实验表明，本发明试剂能够高效提取大豆种子的基因组DNA，其效果与其他组成或其他浓度的试剂存在显著性差异。

Description

大豆基因组DNA提取试剂及其应用

技术领域

本发明涉及核酸提取纯化技术领域，尤其涉及大豆基因组DNA提取试剂及其应用。

背景技术

大豆(Glycine max L.)是世界四大粮食作物之一，是重要的油料作物和高蛋白粮饲兼用经济作物。20世纪80年代，孟山都公司将矮牵牛质粒(caMv)中35s启动子控制EPsPs基因导入大豆基因组中，进而培育出抗草甘膦大豆品种。这种转基因大豆于1994年被美国食品与药品管理局(FDA)批准，较早成为商业化大规模推广的生产转基因作物之一。此外，转基因大豆还包括高蛋氨酸大豆品种等。

由于转基因大豆的毒性和安全隐患问题一直备受争议，人们对转基因大豆的检测也越来越受到重视。对转基因大豆的检测主要是对大豆基因组进行检测，因此试剂盒提取大豆种子的效果对检测结果是否准确起到至关重要的作用。

商品大豆通常是以种子形式出售，其中的豆荚、叶片或根茎组织已经难觅踪迹。但目前大部分植物基因组核酸提取试剂仅适合用于植物叶片组织基因组的提取，并不适合高油、高蛋白含量的大豆种子。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供大豆种子的基因组DNA提取试剂及其应用，该检测试剂能够实现对大豆种子的高效提取，并且无需使用氯仿、β-巯基乙醇等有毒试剂，无毒环保。

本发明提供的大豆基因组DNA的提取试剂，其包括：磁珠、RNase A、蛋白酶K、裂解液、结合液、洗涤液I、洗涤液II、洗涤液III和洗脱液；

所述裂解液包括：KAc、乙二胺四乙酸、GuHCl、柠檬酸钠、吐温-20；

所述结合液包括：GuSCN、NaCl和PEG-8000；

所述洗脱液包括：三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和乙二胺四乙酸

所述洗涤液I包括：GuSCN、NaCl、PEG-8000、乙二胺四乙酸、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和异丙醇；

所述洗涤液II包括：GuHCl、NaCl、吐温-20和异丙醇；

所述洗涤液III包括：三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和乙醇。

本发明提供的试剂无需使用β-巯基乙醇等有毒试剂，避免对人体的伤害；裂解液胍盐、蛋白酶K、RNase A等主要成分能够在常温条件下快速裂解植物细胞，同时避免蛋白质、RNA对提取产物的影响；在洗涤阶段，采用不同浓度的胍盐洗涤液有效去除大豆蛋白、盐类及其他小分子化合物，获得高质量的大片段基因组DNA。

本发明中，所述裂解液包括水和：0.1mol/L～1mol/L KAc、0.001mol/L～0.2mol/L乙二胺四乙酸、1mol/L～10mol/L GuHCl、0.001mol/L～0.1mol/L柠檬酸钠和1vol％～10vol％吐温-20。

一些实施例中，所述裂解液包括水和：100mmol/L KAc、50mmol/L乙二胺四乙酸、5mol/L GuHCl、50mmol/L柠檬酸钠和10vol％吐温-20。

本发明中，所述结合液包括水和：1mol/L～10mol/L GuSCN、0.5mol/L～5mol/LNaCl和1wt％～20wt％PEG-8000。

一些实施例中，所述结合液包括水和：2mol/L GuSCN、1mol/L NaCl和20wt％PEG-8000。

本发明中，所述洗脱液包括水和：0.01mol/L～0.1mol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和0.001mol/L～0.1mol/L乙二胺四乙酸。

一些实施例中，所述洗脱液包括水和：10m mol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和1mmol/L乙二胺四乙酸。

本发明中，所述洗涤液I包括水和：0.5mol/L～3mol/L GuSCN、0.5mol/L～2mol/LNaCl、1wt％～20wt％PEG-8000、0.001mol/L～0.2mol/L乙二胺四乙酸、0.001mol/L～0.1mol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和1vol％～20vol％异丙醇。

一些实施例中，所述洗涤液I包括水和：1.5mol/L GuSCN、1mol/L NaCl、10wt％PEG-8000、10mmol/L乙二胺四乙酸、50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和15vol％异丙醇。

本发明中，所述洗涤液II包括水和：0.5mol/L～3mol/L GuHCl，0.5mol/L～2.5mol/L NaCl，1vol％～5vol％吐温-20和30vol％～50vol％异丙醇。

一些实施例中，所述洗涤液II包括水和：1.5mol/L GuHCl，0.5mol/L NaCl，2vol％吐温-20和50vol％异丙醇。

本发明中，所述洗涤液III包括水和：0.01mol/L～0.1mol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，75vol％～80vol％乙醇。

一些实施例中，所述洗涤液III包括水和：10mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，75vol％乙醇。

本发明中，所述磁珠为氧化硅羟基纳米磁珠。一些实施例中，所述磁珠为超顺磁性氧化硅羧基纳米磁性微球。一些具体实施例中，所述磁珠的直径为100～1000nm。一些实施例中，所述磁珠的直径为500nm。所述磁珠存在于悬液中，其浓度为20mg/mL。

本发明提供的试剂中，RNase A的浓度为10mg/mL。蛋白酶K浓度为10mg/mL。

本发明提供的试剂能够避免油脂、蛋白质等物质的干扰，适用于大豆籽粒的基因组DNA的提取。

本发明还提供了一种大豆基因组DNA的提取方法，其包括：以大豆种子为原料，以本发明所述的提取试剂进行提取。

本发明所述提取包括：

原料去掉种皮粉碎后，以裂解液、RNase A和蛋白酶K处理后，离心取上清；

所述上清液中加入结合液和磁珠进行孵育，弃上清；

所述沉淀依次以洗涤液I、洗涤液II和洗涤液III进行洗涤后，取磁珠沉淀；

所述磁珠沉淀经洗脱液洗脱获得大豆基因组DNA。

本发明所述提取方法中，所述原料为大豆种子。所述大豆种子去掉种皮后在液氮保护下粉碎获得大豆粉末。

每100mg大豆粉末以600μL裂解液、20μL RNase A和20μL蛋白酶K处理。所述处理的步骤包括：每100mg大豆粉末中加入600μL裂解液、20μL RNase A，涡旋震荡1min后，再加入20μL蛋白酶K溶液，室温静置2min。所述室温为18～30℃。处理后，所述离心的条件包括13000rpm离心5min。

所述上清液与结合液的体积比为1:2。每900μL的液体(上清液+结合液)以800μg磁珠结合。本发明中，磁珠悬液的浓度为20mg/mL，每900μL的液体(上清液+结合液)加入40μL磁珠悬液。所述孵育的条件包括室温静置5min，期间颠倒混匀2次。所述室温为18～30℃。

所述洗涤液I、洗涤液II和洗涤液III的体积比为1:1:2。其中，洗涤液I洗涤的次数为1次，洗涤液II洗涤的次数为1次，洗涤液III洗涤的次数为2次。即共进行四次洗涤，依次采用洗涤液I、洗涤液II、洗涤液III和洗涤液III，四次洗涤的洗涤液体积为1:1:1:1。

所述洗脱液在洗脱前经预热，所述预热包括65℃预热5～10min。所述洗脱包括将磁珠以洗脱液重悬后，于65℃加热5min后，去除磁珠获得DNA溶液。

本发明还提供了一种转基因大豆的检测方法，其包括：以本发明所述提取方法提取大豆种子基因组DNA，然后以目的基因的特异性引物和/或探针进行PCR检测。

所述PCR为荧光定量PCR检测。

本发明中，所述目的基因为lectin、pCaMV或BAR。

Lectin基因的特异性引物、探针包括：

正向引物为cctcctcgggaaagttacaa；

反向引物为gggcatagaaggtgaagtt；

探针为FAM-ccctcgtctcttggtcgcgccctct-BHQ1。

pCaMV 35S基因的特异性引物、探针包括：

正向引物为gcctctgccgacagtggt；

反向引物为aagacgtggttggaacgtcttc；

探针为FAM-caaagatggacccccacccacg-BHQ1。

BAR基因的特异性引物、探针包括：

正向引物为acaagcacggtcaacttcc；

反向引物为actcggccgtccagtcgta；

探针为FAM-ccgagccgcaggaaccgcaggag-BHQ1。

本发明提供的大豆基因组DNA的提取试剂，其包括：磁珠、RNase A、蛋白酶K、裂解液、结合液、洗涤液I、洗涤液II、洗涤液III和洗脱液。本发明的试剂中蛋白酶K、RNase A成分在裂解步骤加入，能够避免油脂、蛋白质、RNA对提取产物的影响；结合液能够使DNA与磁珠良好的结合，从而提高得率。洗涤液中含有不同浓度的胍盐，从而有效去除大豆蛋白、盐类及其他小分子化合物。实验表明，本发明试剂能够高效提取大豆种子的基因组DNA，其效果与其他组成或其他浓度的试剂存在显著性差异。

附图说明

图1示实施例2提取产物的琼脂糖凝胶电泳图；

图2示实施例2提取产物的荧光定量PCR扩增曲线图；

图3示实施例2和对比例1提取产物的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

本发明提供了大豆基因组DNA提取试剂及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

配制转基因大豆基因组提取试剂盒，包括氧化硅羟基纳米磁珠、RNase A、蛋白酶K溶液、裂解液、结合液、洗涤液和洗脱液。

其中，氧化硅羟基纳米磁珠为超顺磁性氧化硅羧基纳米磁性微球，直径为500nm，浓度为20mg/mL。

RNase A和蛋白酶K浓度均为10mg/mL。

裂解液包括：100mM KAc(pH 5.2)、50mM乙二胺四乙酸、5M GuHCl、50mM柠檬酸钠、10％吐温-20。

结合液包括2M GuSCN、1M NaCl、20％PEG-8000。

洗涤液包括洗涤液I、洗涤液II和洗涤液III。

洗涤液I包括1.5M GuSCN、1M NaCl、10％PEG-8000、10mM乙二胺四乙酸、50mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、15％异丙醇；

所述洗涤液II为1.5M GuHCl，0.5M NaCl，2％吐温-20，50％异丙醇；

洗涤液III为10mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，75vol％乙醇。

洗脱液为10mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和1mM乙二胺四乙酸。

实施例2

采用实施例1的试剂盒对转基因大豆种子样本基因组进行提取，提取方法包括如下步骤：

1、样本准备：取4份干净转基因大豆种子，去掉种皮加入液氮用研杵研磨种子成粉末状，取100mg转移至1.5mL离心管。

(1)样本中加入600μL裂解液、20μL RNase A，涡旋震荡1min后，再20μL蛋白酶K溶液，室温静置2min，13000rpm离心5min取上清300μL。

(2)加入600μL结合液、40μL磁珠(20mg/mL)，充分混匀后室温静置5min，期间颠倒混匀2次，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管。

(3)向上述离心管中加入800μL洗涤液I，充分混匀后，涡旋震荡2min，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，弃上清液。向上述离心管中加入800μL洗涤液II，充分混匀后，涡旋震荡2min，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，弃上清液。

(4)向上述离心管中加入800μL洗涤液III，充分混匀后，涡旋震荡2min，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，弃上清液。

(5)重复步骤(4)一次。

(6)保持离心管于磁性分离器上，将其置于超净工作台中风干至磁珠表面无明显光泽(6～10min)。

(7)加入65℃预热5～10min洗脱液100μL，用移液器缓慢吹打磁珠50次或漩涡震荡2min，使磁珠充分重悬，于65℃加热5min后，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，转移上清液至新的离心管中，此即为纯化转基因大豆基因组，可保存于-20℃。

2、洗脱液中DNA含量、纯度测定和琼脂糖凝胶电泳结果结果见表1、附图1。

表1测定洗脱液中的DNA含量和纯度

样本号	浓度ng/μL	总量μg	A260/280	A260/230
					1	57.29	5.73	1.77	1.75
2	56.16	5.62	1.75	1.80
					3	64.79	6.48	1.76	1.55
4	71.30	7.13	1.75	1.56

实验结果：使用本发明的试剂盒能够提取纯度高、含量高(＞20ng/μL)、电泳条带明亮的DNA。

3、洗脱液中DNA的荧光定量PCR检测

(1)检测用引物探针序列如表2：

表2检测用引物探针序列

(2)荧光定量PCR检测反应体系配置如表3。

表3荧光定量PCR检测反应体系

名称	终浓度
		10×PCR反应液	1*
MgCl₂	2.5mmol/L
		dNTP(含dUTP)	0.2mmol/L
UNG酶	0.075U/μL
		游引物	150nmol/L
下游引物	150nmol/L
		探针	150nmol/L
Taq酶	0.05U/μL
		DNA模板	100ng

(3)按表4设置PCR检测反应程序。

表4荧光定量PCR检测反应程序

具体仪器及其他设置如下：

仪器型号：7500Fast(96well)，

反应程序：Quantitation-Standard Curve

探针类型： Reagents

速度类型：Standard

发光基团：FAM

粹灭荧光：None

NTC样品类型选定“N”；待测样本选定样品类型“U”

参比荧光：None

反应体积：25μL

(3)提取产物PCR检测结果如表5、图2

表5荧光定量PCR检测结果

基因名称/Ct值	Lectin	PCaMV35S	BAR
				样本1	22.78	25.21	23.86
样本2	22.93	23.06	22.47

实验结果：本发明试剂盒纯化的转基因大豆基因组能够适用于大豆转基因序列的荧光定量PCR检测，并取得良好效果。

对比例1

在样本裂解步骤不加入RNase A，其余试剂、步骤与实施例1～2相同。

按照上述方法检测实施例和对比例中得到的提取产物的浓度、纯度与片段大小，结果见表6及附图3。

表6测定洗脱液中的核酸含量和纯度

实验结果：相对于不添加RnaseA的对比例，使用实施例1试剂盒能够有效去除RNA(A260/280在1.7～1.9之间)，提取纯度较高的DNA，避免RNA、蛋白等残留对后续检测的影响。

对比例2：

考察不同浓度的胍盐洗涤液对提取基因组纯度的影响：洗涤液II采用高浓度4MGuHCl代替原本1.5M GuHCl，其余步骤、溶液与实施例1～2相同。

按照上述方法检测实施例和对比例2中得到的提取产物的浓度与纯度，结果见表7。

表7测定洗脱液中的核酸含量和纯度

实验结果：使用本发明的胍盐洗涤液能够有效去除盐类及其他小分子化合物，A260/A230＞1.5，获得较纯的DNA。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.大豆基因组DNA的提取试剂，其特征在于，包括：磁珠、RNase A、蛋白酶K、裂解液、结合液、洗涤液I、洗涤液II、洗涤液III和洗脱液；

所述裂解液由水、0.1 mol/L ~1mol/L KAc、0.001 mol/L ~0.2 mol/L 乙二胺四乙酸、1 mol/L ~10 mol/L GuHCl、0.001 mol/L ~0.1 mol/L 柠檬酸钠和1vol%~10vol% 吐温-20组成；

所述结合液由水、1 mol/L ~10 mol/L GuSCN、0.5 mol/L ~5 mol/L NaCl和1wt%~20wt% PEG-8000组成；

所述洗脱液由水、0.01 mol/L ~0.1 mol/L 三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和0.001 mol/L ~0.1 mol/L 乙二胺四乙酸组成；

所述洗涤液I由水、0.5 mol/L ~3 mol/L GuSCN、0.5 mol/L ~2 mol/L NaCl、1wt%~20wt% PEG-8000、0.001 mol/L ~0.2 mol/L 乙二胺四乙酸、0.001 mol/L ~0.1 mol/L 三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和1vol%~20vol%异丙醇组成；

所述洗涤液II由水、0.5 mol/L ~3 mol/L GuHCl，0.5 mol/L ~2.5 mol/L NaCl，1 vol%~5 vol % 吐温-20和30 vol %~50 vol %异丙醇组成；

所述洗涤液III由水、0.01 mol/L ~0.1 mol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和75vol%~80vol%乙醇组成。

2.根据权利要求1所述的提取试剂，其特征在于，所述磁珠为氧化硅羟基纳米磁珠。

3.一种大豆基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括：以大豆种子为原料，以权利要求1或2所述的提取试剂进行提取；所述提取包括：

所述上清液中加入结合液和磁珠进行孵育，弃上清；

所述磁珠沉淀经洗脱液洗脱获得大豆基因组DNA。

4.一种转基因大豆的检测方法，其特征在于，包括：以权利要求3所述的提取方法提取大豆种子基因组DNA，然后以目的基因的特异性引物和/或探针进行PCR检测。