CN113073144B

CN113073144B - 一种筛选磷高效利用小麦的分子标记caps-799、引物组和应用

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Publication number: CN113073144B
Application number: CN202110539032.9A
Authority: CN
Inventors: 康国章; 王鹏飞; 李鸽子; 邵瑞鑫; 葛强; 许海霞; 程西永; 殷贵鸿
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Shenzhen Fengdekang Seed Industry Co ltd; Henan Agricultural University
Priority date: 2021-05-18
Filing date: 2021-05-18
Publication date: 2022-11-18
Anticipated expiration: 2041-05-18
Also published as: CN113073144A

Abstract

本发明涉及分子育种领域，特别是涉及一种筛选磷高效利用小麦的分子标记CAPS‑799、引物组和应用。本发明提供一种筛选磷高效利用小麦品种的分子标记CAPS‑799，所述CAPS‑799的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明通过检测TaPHT1；9‑4B基因在不同小麦品种中的单核苷酸多态性，鉴定出TaPHT1；9‑4B的优异单倍型，并开发了相关分子标记CAPS‑799；本发明提供的分子标记CAPS‑799不能被限制性内切酶Fun4HI识别并切开，利用该特性能够快速、准确地筛选出磷高效利用小麦品种。

Description

一种筛选磷高效利用小麦的分子标记CAPS-799、引物组和应用

技术领域

本发明涉及分子育种领域，特别是涉及一种筛选磷高效利用小麦的分子标记CAPS-799、引物组和应用。

背景技术

磷是植物生长发育所必需的大量营养元素之一，但是土壤中有效磷(Pi)浓度往往不能满足作物正常生长发育的需求，磷缺乏已经成为影响作物产量和品质的一个重要问题(Raghothama KG，Karthikeyan AS.Phosphate acquisition[J].Plant Soil 2005，274：37–49)。虽然施磷能大幅提高作物产量和品质，但由于大多数作物的磷肥利用效率较低，导致大部分磷肥被浪费，引起农业生产成本增加和环境污染(Sattaria SZ，BouwmanAF，Gillera KE，et al.Residual soil phosphorus as the missing piece in the globalphosphorus crisis puzzle[J].Proc NatlAcad Sci USA2012，109：6348–6353)。小麦的高产稳产对于世界粮食安全至关重要，但是在小麦生产过程中，同样面临土壤缺磷和磷肥利用率低的问题，因此提高小麦对磷素的利用效率，培育磷高效利用小麦新品种，对于农业的可持续发展和环境保护具有重要意义。

分子标记辅助选择是作物遗传改良的一种有效手段，目前已有100多个与重要农艺性状相关的功能标记被用于小麦的品种培育和种质资源改良(Meng L，Xiang C，Liu H，et al.The impact ofmodern plant breeding on dominant Chinese wheat cultivars(Triticum aestivum L.)revealed by SSR and functional markers[J].Genet ResourCrop Ev 2018，65：55–65；Zhao J，Wang Z，Liu H，et al.Global status of 47majorwheat loci controlling yield，quality，adaptation and stress resistanceselected over the last century[J].BMC Plant Physiol 2019，19：5；Vishwakarma MK，Arun B，MishraVK，et al.Marker–assisted improvement ofgrain protein content andgrain weight in Indian bread wheat[J].Euphytica 2016208：313–321)。磷缺乏耐受性是一个复杂的数量性状，但是目前关于小麦磷高效的分子标记开发还很匮乏。因此，亟需一种能快速、准确地筛选出磷高效利用小麦品种的分子标记。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种筛选磷高效利用小麦的分子标记CAPS-799、引物组和应用。本发明提供的分子标记CAPS-799能够快速、准确地筛选出磷高效利用小麦品种。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种筛选磷高效利用小麦品种的分子标记CAPS-799，所述CAPS-799的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供一种用于检测上述分子标记CAPS-799的引物组，所述引物组的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述引物组的反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。

本发明还提供了上述分子标记CAPS-799或上述引物组在筛选磷高效利用小麦品种中的应用。

本发明还提供一种筛选磷高效利用小麦品种的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括上述的引物组。

本发明还提供一种筛选磷高效利用小麦品种的方法，包括以下步骤：

利用上述引物组对小麦样本基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；

将所述扩增产物经Fun4HI酶切，根据酶切结果进行判断；当酶切后含有分子标记CAPS-799的小麦样本为磷高效利用小麦品种。

优选的，所述分子标记CAPS-799的判断方法包括电泳或测序。

优选的，通过电泳判断分子标记CAPS-799时；所述分子标记CAPS-799的电泳条带为703bp。

优选的，所述PCR扩增的反应体系为：以50μL计，25μL2×KOD OneTM PCRMasterMix，上下游引物各0.3μM，DNA模板200ng和剩余ddDH₂O。

优选的，所述PCR反应程序为：94℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸3min，循环32次；68℃延伸5min。

本发明还提供上述分子标记CAPS-799或上述引物组或上述试剂或试剂盒或上述方法在分子标记辅助选育磷高效利用小麦新品种中的应用。

有益效果：

本发明提供一种筛选磷高效利用小麦品种的分子标记CAPS-799，所述CAPS-799的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明通过检测TaPHT1；9-4B基因在不同小麦品种中的单核苷酸多态性，鉴定出TaPHT1；9-4B的优异单倍型，并开发了相关分子标记CAPS-799；本发明提供的分子标记CAPS-799不能被限制性内切酶Fun4HI识别并切开，利用该特性能够快速、准确地筛选出磷高效利用小麦品种。

附图说明

图1为实施例1中TaPHT1；9-4B基因启动子与编码区的扩增结果电泳图；

图2为实施例1中TaPHT1；9-4B基因启动子与编码区的序列比对与单倍型分析图；

图3为实施例1中不同TaPHT1；9-4B单倍型启动子(Hap 1～4)在小麦籽粒中的活性分析图；其中(a)为不同启动子驱动GUS基因的载体图谱，(b)为GUS染色结果图，(c)为GUS活性图；

图4为实施例1中不同单倍型小麦品种在低磷胁迫条件下TaPHT1；9-4B的转录水平与磷含量测定结果图；其中(a)为TaPHT1；9-4B在四种单倍型小麦品种中的相对表达量；(b)为为不同单倍型小麦植株中的磷含量；1-16代表四种单倍型小麦品种He1-16，在低磷(50μMPi)条件下培养10d用来检测基因表达与磷含量；

图5为实施例3中酶切后的电泳图。

具体实施方式

本发明提供一种筛选磷高效利用小麦品种的分子标记CAPS-799，所述CAPS-799的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：GCTATTTGTACTGAGCGTTGTCTGAATTCTGAAGTTATTTTCCTTTGTTTCTGTGACAACCATTTCATGCACCTAATCCTTCATGAAAATTTCTTCATGTTTCCTATATTAGAACCAAACAACTTTTAATACATATCCCTTGTTTGCAGTTCATGTAGAATTCAAGTCAAATAACACAAAGTACAAGACATGTTTAACACCATCCACCTAATCCTTCAACAAAATTTCCTAATCCTTTAAGAAAAATTCTAGGTTTTTCCTGTGCTAGAACCAAGCAATTTCTATGCAGATTCCCGTGTTCTCTATTCATGTAGAATTCAAAATTGTATGGCATCACAATTCTACATTTTTGGCTATGCATTTTTAGTATCACGTGGACCAACGAGACCCTTAATCTTTATGTTTATTTGTTTGTATACTATATATAAAAAACTATAAATGTTCTGAAACATGTGGGTGGTGCATTCTATTTTGTTCTGAAACGTATCTGAATTCTGAAATTGGGTTTAGCAAGCGTTGAAGAACAATTTCAAACATCGTATTTGTATGACAAGCTATCTCAAAAATACTGAAAAGACCGTATGTGGCTATGTCTGGAGGACCTAGCACTGCATATCCATTTATCATCAAAATTCTGTATTTTCTTGCTTTCCTCTTGGCCTACCGAAACCGGCGGTGCGCTTACCTTCTTCCTGCCATGCCA。本发明所述分子标记CAPS-799位于磷吸收优异单倍型启动子内，不能被限制性内切酶Fun4HI识别并切开，利用该特性能够快速、准确地筛选出磷高效利用小麦品种。

本发明还提供一种用于检测上述分子标记CAPS-799的引物组，所述引物组的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：GCTATTTGTACTGAGCGTTGT；所述引物组的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示：TGGCATGGCAGGAAGAAGGT。

本发明还提供了上述分子标记CAPS-799或上述引物组在筛选磷高效利用小麦品种中的应用。本发明所述分子标记CAPS-799位于磷吸收优异单倍型启动子内，通过检测所述分子标记CAPS-799能够快速、准确地筛选出磷高效利用小麦品种。

本发明还提供了一种筛选磷高效利用小麦品种的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括上述的引物组。在本发明中，所述试剂或试剂盒优选还包括限制性内切酶Fun4HI；所述限制性内切酶Fun4HI优选购自New England Biolabs(NEB)公司。

本发明还提供了一种筛选磷高效利用小麦品种的方法，包括以下步骤：

本发明利用上述引物组对小麦样本基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物。在本发明中，所述PCR扩增的反应体系优选为：以50μL计，25μL2×KOD OneTM PCRMasterMix，上下游引物各0.3μM，DNA模板200ng和剩余ddDH₂O。

所述PCR反应程序优选为：94℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸3min，循环32次；68℃延伸5min。本发明对所述小麦样本基因组DNA的提取方法没有限定，采用本领域技术人员所熟知的提取方法即可。

得到扩增产物后，本发明将所述扩增产物经Fun4HI酶切，根据酶切结果进行判断；当酶切后含有分子标记CAPS-799的小麦样本为磷高效利用小麦品种。在本发明中，所述分子标记CAPS-799的判断方法优选包括电泳或测序；进一步优选为电泳，通过电泳判断分子标记CAPS-799时，所述分子标记CAPS-799的电泳条带为703bp。本发明通过磷高效利用小麦样本基因组DNA扩增得到的分子标记CAPS-799相对于其他扩增产物，不含有可以被限制性内切酶Fun4HI识别的酶切位点，利用该特性，对扩增产物经Fun4HI酶切后，可以根据酶切结果筛选磷高效利用小麦样本；另外，本发明对酶切结果进行电泳的判断方法，只有分子标记CAPS-799酶切后的电泳条带仍为703bp，通过该方法能够快速、准确地筛选出磷高效利用小麦品种，且成本更低，非常适用于生产实践。

本发明还提供了上述分子标记CAPS-799或上述引物组或上述述试剂或试剂盒或上述方法在分子标记辅助选育磷高效利用小麦新品种中的应用。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例和附图对本发明提供的一种筛选磷高效利用小麦的分子标记CAPS-799、引物组和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

TaPHT1；9-4B磷吸收优异单倍型启动子的筛选

1、材料

本发明选用41份本实验室(河南农业大学农学院第一实验楼南317实验室)保存的普通小麦品种(市售的现代栽培种)，详细信息见表1。

表1本发明所用六倍体小麦品种

用于PCR扩增的高保真PCR酶KOD OneTM PCR Master Mix购自于东洋纺生物公司，平末端克隆载体pEASY-Blunt购自于全式金生物公司，Fnu4HI限制性内切酶购自于大连宝生物公司，4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷酸(4-MUG)、4-甲基伞形酮(4-MU)和X-Glu购自于上海生工生物公司，其他药品为国产分析纯。pCAMBIA1301-GUS载体用于启动子活性分析。

2、引物设计

首先根据TaPHT1；9基因的三拷贝4A、4B、4D在小麦基因组数据库中的序列差异，设计4B特异的启动子扩增引物TaPHT1；9-4B-Promoter-SF:TCCCGCCGAGAATGTTTTAA(SEQ IDNO：4)TaPHT1和9-4B-Promoter-SR:CGTCTTGGCAACGTCCAGTG(SEQ ID NO：5)和编码区扩增引物TaPHT1；9-4B-CDS-SF:TACATTATCTCCTTGCCTT(SEQ ID NO：6)和TaPHT1；9-4B-CDS-SR:GCCGGGAAGAATGTGCGAATGG(SEQ ID NO：7)。引物合成与测序由河南尚亚生物技术公司完成。

3、小麦总DNA的提取

采用CTAB法提取小麦总DNA。首先将小麦叶片或其他组织液氮速冻研磨，加入1mL预热的CTAB抽提液，65℃水浴1h。然后12000g离心后，取上清加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)混合液振荡。12000g离心10min，将上清转移至新管，加入2倍体积无水乙醇混匀，-20℃静置30min。再离心去上清，用75％乙醇洗涤两遍，晾干后，加入100μL无菌水溶解DNA。

4、TaPHT1；9-4B基因启动子与编码区的扩增与测序

使用高保真PCR酶KOD OneTM PCR Master Mix扩增目的片段。利用TaPHT1；9-4B-Promoter-SF/R与TaPHT1；9-4B-CDS-SF/R这两对引物，以41个六倍体小麦DNA为模板来扩增TaPHT1；9-4B的启动子与编码域序列。PCR体系中包含：25μLKOD OneTM PCRMasterMix(2×)，上下游引物各0.3μL(10μM)，200ngDNA模板，补充ddH₂O至总体积50μL。PCR反应程序为：94℃预变性3min；98℃变性10s，56℃退火30s，68℃延伸3min，32个循环；68℃延伸5min。扩增结果如图1所示，TaPHT1；9-4B的启动子扩增片段为1500bp，所述TaPHT1；9-4B的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示：ACGATGATATAATGCCGCAGCTATATTATGAGCTGTGATTCGCCGGCCGGACCGATTGCAATTTGGCAAAGAGAAACGAAGAAAGTGGGAGGATGCAAGACAACAATTTAAATAGTACGGAGCACGGCTTTCCATGCTGTGCTCTTGCTGCTTAATCTGCATATGTTTAGGAGTAGTTTGTTACAAAAAACTGTTTAGTACTGTAGTTCATATTTCAAATGACCAATGTTTATATGGCTGCTGTTGCTATTTGTACTGAGCGTTGTCTGAATTCTGAAGTTATTTTCCTTTGTTTCTGTGACAACCATTTCATGCACCTAATCCTTCATGAAAATTTCTTCATGTTTCCTATATTAGAACCAAACAACTTTTAATACATATCCCTTGTTTGCAGTTCATGTAGAATTCAAGTCAAATAACACAAAGTACAAGACATGTTTAACACCATCCACCTAATCCTTCAACAAAATTTCCTAATCCTTTAAGAAAAATTCTAGGTTTTTCCTGTGCTAGAACCAAGCAATTTCTATGCAGATTCCCGTGTTCTCTATTCATGTAGAATTCAAAATTGTATGGCATCACAATTCTACATTTTTGGCTATGCATTTTTAGTATCACGTGGACCAACGAGACCCTTAATCTTTATGTTTATTTGTTTGTATACTATATATAAAAAACTATAAATGTTCTGAAACATGTGGGTGGTGCATTCTATTTTGTTCTGAAACGTATCTGAATTCTGAAATTGGGTTTAGCAAGCGTTGAAGAACAATTTCAAACATCGTATTTGTATGACAAGCTATCTCAAAAATACTGAAAAGACCGTATGTGGCTATGTCTGGAGGACCTAGCACTGCATATCCATTTATCATCAAAATTCTGTATTTTCTTGCTTTCCTCTTGGCCTACCGAAACCGGCGGTGCGCTTACCTTCTTCCTGCCATGCCATGTAGGTACGGAGGAGAGACAAATCACCAAATCCATGCTTGTAGTGAGAACATAAGATACAGATCATCGTATGATCTTGACCTTTTCTCCCAAAGCTTGCTTGTGTCTGTACAGTCTGTTCCTTTCAGGTATATTCGCAGCATAACCATGGTCTGGTTTCAGTATTTTCCTCCACACAATTCTATAGTGCGGAAACTCAAAGGTCAAACCTGAATACTAAAAGTTGGCATTTCTTAACAATAGTTCTAACAATAGAAATGTACATAGCTGTTGCTGTCAAGGCAAGACATTTGACCCTTGGGTATATTTTTGTAGGAACCATCCTGATATGTACAATCCGTTGTACTTGTAAGCGATGCCGTAATAGGCAATTTTATACTTACAACTAGCAATGTTGGATTGGCATAGTACATTATCTCCTTGCCTTTATGCCTTCACCGTGAATTATGCCTATATATACGTAGCAGAAGCACCTAACAAAGCACACAGGCTAGAGAGCAACAGAAGAAAGATAGAAAGGAGCAGAGTTTAGCTGACAGCTCGCCGGCGGCC；

编码区扩增片端为1566bp，所述TaPHT1；9-4B的编码区的核苷酸序列如SEQ IDNO：9所示：

ATGGCGACTGAACAGCTCAACGTGTTGAAAGCACTGGACGTTGCCAAGACGCAGTTGTACCATTTCAAGGCGGTCGTGATCGCCGGCATGGGCTTCTTCACGGACGCCTACGACCTCTTCTGCATCGCCCTCGTCACCAAGCTGCTGGGGCGCATCTACTACACCGACCCTGCCCTCAACGAGCCCGGCCACCTCCCGGCAAATGTGTCGGCCGCCGTGAACGGCGTGGCCCTGTGTGGCACACTTGCCGGCCAGCTCTTCTTCGGCTGGCTCGGTGACAAGCTCGGCCGCAAGAGCGTCTACGGCTTCACGCTCATTCTCATGGTCCTCTGCTCCATCGCGTCTGGGCTCTCGTTTGGACACGAGGCCAAGGGCGTAATGGGCACGCTATGTTTCTTCCGCTTCTGGCTCGGCTTCGGCGTCGGCGGTGACTACCCTCTGAGCGCCACAATCATGTCGGAGTATGCTAACAAGAAGACCCGCGGCACCTTTATCGCCGCCGTGTTTGCCATGCAGGGGTTTGGCATCCTATTTGGTACTATCGTCACCATCATCGTCTCGTCTGCATTCCGACATGCATTCCCTGCACCGCCATTCTACATTGACGCCGCAGCGTCCATTGGCCCAGAGGCCGACTACGTGTGGCGCATCATCGTCATGTTCGGCACCATCCCGGCCGCCCTGACCTACTACTGGCGCATGAAGATGCCCGAAACTGCGCGGTACACAGCACTCATCGCCGGCAACACGAAGCAAGCCACATCAGACATGTCCAAGGTGCTCAACAAGGAGATCTCAGAGGAGGATGTGCAGGGTGAGCGGGCCACTGGTGATACATGGGGCCTCTTCTCCCGACAGTTCATGAAGCGTCACGGGGTGCACTTGCTAGCGACCACAAGCACTTGGTTCCTGCTCGATGTGGCCTTCTATAGCCAGAACCTGTTCCAGAAGGACATCTTCACCAAGATCGGGTGGATCCCGCCAGCCAAGACTATGAATGCATTGGAGGAGTTGTACCGCATCGCCCGCGCCCAAGCGCTCATCGCGCTCTGCGGCACCGTGCCCGGCTACTGGTTCACCGTCGCCTTCATCGACATCATTGGGAGGTTTTGGATCCAGCTTATGGGATTCACCATGATGACCATTTTCATGCTCGCAATCGCCATACCTTACGACTACTTGGTGAAGCCAGGGCACCACACCGGCTTCGTCGTGCTCTACGGGCTCACTTTCTTCTTCGCCAACTTCGGGCCCAACAGCACGACCTTCATTGTGCCAGCCGAGATTTTCCCTGCGAGGCTCCGATCCACATGTCATGGTATCTCTGCCGCTACCGGTAAGGCAGGCGCGATCATTGGCGCGTTCGGGTTCCTGTATGCGTCCCAGGACCAGAAGAAGCCCGAGACCGGTTACTCACGAGGAATCGGCATGCGCAACGCACTCTTCGTGCTCGCAGGCACAAATTTCCTGGGCCTGCTCTTTTCCCTGCTGGTGCCGGAGTCCAAGGGCAAGTCACTGGAGGAGCTCTCCAAGGAGAACGTCGGCGACGATGGCATCGAAGCTTAG。分别回收各品种的PCR扩增目的片段，并与pEASY-Blunt克隆载体连接，转化大肠杆菌，挑取三个以上阳性克隆，用通用引物M13-F/R测序。

5、TaPHT1；9-4B基因启动子与编码区的序列比对与单倍型分析

使用DNAMAN软件(http://www.lynnon.com)对测序结果进行拼接并进行序列比对。发现在41个小麦品种中的TaPHT1；9-4B编码区中(1bp～1566bp)存在两个SNP(54G/A和1155C/A)，但不会引起编码氨基酸的改变，属于无义突变位点。在启动子区域(-1513bp～-1bp)存在9个SNP多态性变异位点，通过DnaSP 5.10软件(http://www.ub.edu/DnaSP)对启动子进行单倍型鉴定，结果发现这9个SNP紧密连锁形成四种单倍型，分别命名为TaPHT1；9-4B-Hap1、TaPHT1；9-4B-Hap2、TaPHT1；9-4B-Hap3和TaPHT1；9-4B-Hap4(以下简称Hap1、Hap2、Hap3和Hap4)，以Hap1为对照，Hap2、Hap3和Hap4分别包含4、2和1个SNP(图2)。

6、基因枪转化小麦籽粒GUS染色及活性测定

为检测不同TaPHT1；9-4B单倍型启动子活性的差异，使用引物TaPHT1；9-4B-promoter-GUS-F:CTATGACATGATTACGAATTCTCCCGCCGAGAATGTTT TA(SEQ ID NO：10)和TaPHT1；9-4B-promoter-GUS-R：TTACCCTCAGATCTACCATGGCGTCTTGGCAACGTCCAGTG(SEQ IDNO：11)；将来自不同单倍型小麦品种的启动子(1513bp)片段替换pCAMBIA1301载体中GUS报告基因编码区前的35S启动子，构建TaPHT1；9-4B启动子驱动的GUS表达载体，同时将35S启动子驱动的GUS报告基因pCAMBIA1301-GUS作为阳性对照(图3中a)。利用基因枪将不同载体分别转化小麦籽粒后，进行GUS染色并定量测定GUS活性(Wang K,ZhangX,ZhaoY,Chen F,Xia G.2013.Structure,variation and expression analysis ofglutenin genepromoters from Triticum aestivum cultivar Chinese Spring shows the distalregion of promoter 1Bx7 is key regulatory sequence.Gene 527:484–490；Yang Q,Deng M,Zhang LL,Zhang XW,Wang LN,Chen H,Ma J,Qi PF,Jiang QT,Lan XJ,etal.2016.A super twin T-DNA vector that allows independent gene expressionduring Agrobacterium-mediated transformation.Plasmid 87–88:58–64)。具体操作如下：

(1)基因枪转化：小麦成熟籽粒消毒后在无菌水中浸泡12h，并发芽至露白。然后将大小均一、发芽一致的小麦籽粒放于培养皿中央，每个培养皿放置10粒左右，基因枪将裹有重组质粒的金粉轰击小麦籽粒，将被轰击过的籽粒放置于MS培养基上，在25℃条件下培养2d。

(2)GUS染色：将上述小麦籽粒分别置于2mL离心管中，加入GUS染色液(0.5mg/mLX-Glu、100mMNaH₂P0₄、10mM Na₂EDTA、0.5mM亚铁氰化钾、0.5mM铁氰化钾、1％Triton-X-100)，37℃染色12h以上，梯度乙醇脱色后，用体视显微镜下观察，拍照。

(3)GUS活性测定：小麦籽粒GUS活性测定采用

等(1995)的方法。分别提取上述小麦籽粒的粗蛋白，以4-MUG为底物加入粗蛋白(GUS蛋白)进行催化反应，通过酶标仪测定4-MU的含量。然后计算单位蛋白在单位时间内催化4-MUG生成4-MU的量来评价不同启动子的活性。

GUS染色结果发现，转化35S启动子的小麦籽粒呈现出最深的蓝色，转化Hap3启动子的籽粒蓝色比Hap1和Hap4的蓝色深，Hap2蓝色最浅(图3中b)。GUS活性定量测定发现除了35S启动子，Hap3启动子驱动的GUS活性最高，Hap1和Hap4活性次之，Hap2活性最低，并且Hap2和Hap3与其它单倍型的差异达到显著水平(p<0.05)(图3中c)。这些结果表明在这四种单倍型中，Hap3启动子具有最高的转录活性。

7、不同单倍型小麦品种在低磷胁迫条件下TaPHT1；9-4B的转录水平与磷含量测定

在不同TaPHT1；9-4B启动子单倍型小麦品种中各选择四个品种(He1-He16)，详细信息见表1，将两叶一心期小麦幼苗培养在低磷(50μM Pi)霍格兰营养液中。培养10d后，提取根系RNA并反转录合成cDNA。根据TaPHT1；9A、TaPHT1；9B和TaPHT1；9D三拷贝的基因组序列，设计4B特异的定量引物：TaPHT1；9-4B-F:CCGAGACCGGTTACTCACGA(SEQ ID NO：12)和TAPHT1；9-4B-R:AAAGAAACGCTGCAATGAAAATC(SEQ ID NO：13)。以上述16种cDNA为模板，通过qRT-PCR测定TaPHT1；9-4B单拷贝的转录水平，操作如下：以cDNA为模板，在QuantStudio5Real-time PCR System(Applied biosystems，USA)中进行20μL体系qPCR反应，反应体系包含10μL SYBR Green Realtime PCRMasterMix、上下游引物(10μM)各0.5μL、模板200ng，加ddH₂O至终体积为20μL。反应程序如下：95℃，10min，一个循环；95℃，10s；56℃，15s；72℃，20s，45个循环；熔解曲线分析程序：95℃，15s；55℃，15s；94℃，1min。以TaActin基因作为内参基因，采用2^-ΔΔCT方法计算不同样品间基因相对表达量。同时将上述小麦幼苗烘干，用H₂SO₄-H₂O₂进行消化，消化完成后，采用钼锑抗比色法测定磷浓度，计算全株的磷含量。结果如图4所示，在低磷条件下，TaPHT1；9-4B的转录水平在Hap3单倍型小麦品种中最高，显著大于其它3种单倍型小麦品种(图4中a)；Hap3单倍型小麦品种植株积累的磷含量显著大于其他单倍型小麦品种植株(图4中b)。可表明Hap3为磷吸收优异单倍型，这与启动子的活性分析结果相一致。

实施例2

CAPS分子标记开发

由于TaPHT1；9-4B四种单倍型启动子之间的差异是单碱基的差异(SNP)，根据这些差异可以开发酶切扩增多态性(CAPS)分子标记。利用dCAPS Finder2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)对Hap3优异单倍型启动子与三种单倍型启动子的序列差异进行分析，Hap3与其它单倍型之间的两个SNP：-799(C/G)和-796(C/G)位于序列GGCTGCT(Hap1、Hap2、Hap4)和GGGTGGT(Hap3)内。GGCTGCT可以被限制性内切酶Fun4HI识别并切开，而GGGTGGT不能被切开(图5)。根据该处序列差异，可以开发CAPS分子标记用于区别Hap3与其它单倍型，并将该标记命名为CAPS-799，所述CAPS-799的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示：

GCTATTTGTACTGAGCGTTGTCTGAATTCTGAAGTTATTTTCCTTTGTTTCTGTGACAACCATTTCATGCACCTAATCCTTCATGAAAATTTCTTCATGTTTCCTATATTAGAACCAAACAACTTTTAATACATATCCCTTGTTTGCAGTTCATGTAGAATTCAAGTCAAATAACACAAAGTACAAGACATGTTTAACACCATCCACCTAATCCTTCAACAAAATTTCCTAATCCTTTAAGAAAAATTCTAGGTTTTTCCTGTGCTAGAACCAAGCAATTTCTATGCAGATTCCCGTGTTCTCTATTCATGTAGAATTCAAAATTGTATGGCATCACAATTCTACATTTTTGGCTATGCATTTTTAGTATCACGTGGACCAACGAGACCCTTAATCTTTATGTTTATTTGTTTGTATACTATATATAAAAAACTATAAATGTTCTGAAACATGTGGGTGGTGCATTCTATTTTGTTCTGAAACGTATCTGAATTCTGAAATTGGGTTTAGCAAGCGTTGAAGAACAATTTCAAACATCGTATTTGTATGACAAGCTATCTCAAAAATACTGAAAAGACCGTATGTGGCTATGTCTGGAGGACCTAGCACTGCATATCCATTTATCATCAAAATTCTGTATTTTCTTGCTTTCCTCTTGGCCTACCGAAACCGGCGGTGCGCTTACCTTCTTCCTGCCATGCCA。

在CAPS标记识别的SNP上下游设计引物CAPS-F：GCTATTTGTACTGAGCGTTGT(SEQ IDNO：2)和CAPS-R：TGGCATGGCAGGAAGAAGGT(SEQ ID NO：3)。

实施例3

一种筛选磷高效利用小麦品种的方法

1、不同单倍型小麦品种(每个单倍型挑选5个品种)基因组DNA的提取：

2、PCR扩增反应

以实施例2设计的引物对上述小麦样本基因组DNA进行扩增；

所述PCR扩增的反应体系为：25μL2×KOD OneTM PCR Master Mix(TOYOBO)，上下游引物各0.3μM，DNA模板200ng，补充ddDH₂O至总体积为50μL。

所述PCR反应程序为：94℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸3min，循环32次；68℃延伸5min。

扩增结果为：扩增不同单倍型小麦中的TaPHT1；9-4B启动子片段(-1260bp～-553bp)，均能获得单一扩增条带(703bp)。

3、酶切

使用Fun4HI酶(购自New EnglandBiolabs公司)对纯化的PCR产物进行酶切。

电泳检测结果发现Hap3单倍型小麦品种扩增产物经酶切后仍为单一的703bp的条带，而Hap1、Hap2和Hap4单倍型材料的扩增产物经酶切后则变为两个片段，分别为457bp和246bp(图5)。

因此，CAPS-799分子标记能够区分Hap3与其它单倍型，可被应用于磷高效小麦新品种的分子设计育种。

综上所述，本发明提供的分子标记CAPS-799能够快速、准确地筛选出磷高效利用小麦品种。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 一种筛选磷高效利用小麦的分子标记CAPS-799、引物组和应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 703

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

gctatttgta ctgagcgttg tctgaattct gaagttattt tcctttgttt ctgtgacaac 60

catttcatgc acctaatcct tcatgaaaat ttcttcatgt ttcctatatt agaaccaaac 120

aacttttaat acatatccct tgtttgcagt tcatgtagaa ttcaagtcaa ataacacaaa 180

gtacaagaca tgtttaacac catccaccta atccttcaac aaaatttcct aatcctttaa 240

gaaaaattct aggtttttcc tgtgctagaa ccaagcaatt tctatgcaga ttcccgtgtt 300

ctctattcat gtagaattca aaattgtatg gcatcacaat tctacatttt tggctatgca 360

tttttagtat cacgtggacc aacgagaccc ttaatcttta tgtttatttg tttgtatact 420

atatataaaa aactataaat gttctgaaac atgtgggtgg tgcattctat tttgttctga 480

aacgtatctg aattctgaaa ttgggtttag caagcgttga agaacaattt caaacatcgt 540

atttgtatga caagctatct caaaaatact gaaaagaccg tatgtggcta tgtctggagg 600

acctagcact gcatatccat ttatcatcaa aattctgtat tttcttgctt tcctcttggc 660

ctaccgaaac cggcggtgcg cttaccttct tcctgccatg cca 703

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

gctatttgta ctgagcgttg t 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

tggcatggca ggaagaaggt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

tcccgccgag aatgttttaa 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 5

cgtcttggca acgtccagtg 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 6

tacattatct ccttgcctt 19

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 7

gccgggaaga atgtgcgaat gg 22

<210> 8

<211> 1500

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 8

acgatgatat aatgccgcag ctatattatg agctgtgatt cgccggccgg accgattgca 60

atttggcaaa gagaaacgaa gaaagtggga ggatgcaaga caacaattta aatagtacgg 120

agcacggctt tccatgctgt gctcttgctg cttaatctgc atatgtttag gagtagtttg 180

ttacaaaaaa ctgtttagta ctgtagttca tatttcaaat gaccaatgtt tatatggctg 240

ctgttgctat ttgtactgag cgttgtctga attctgaagt tattttcctt tgtttctgtg 300

acaaccattt catgcaccta atccttcatg aaaatttctt catgtttcct atattagaac 360

caaacaactt ttaatacata tcccttgttt gcagttcatg tagaattcaa gtcaaataac 420

acaaagtaca agacatgttt aacaccatcc acctaatcct tcaacaaaat ttcctaatcc 480

tttaagaaaa attctaggtt tttcctgtgc tagaaccaag caatttctat gcagattccc 540

gtgttctcta ttcatgtaga attcaaaatt gtatggcatc acaattctac atttttggct 600

atgcattttt agtatcacgt ggaccaacga gacccttaat ctttatgttt atttgtttgt 660

atactatata taaaaaacta taaatgttct gaaacatgtg ggtggtgcat tctattttgt 720

tctgaaacgt atctgaattc tgaaattggg tttagcaagc gttgaagaac aatttcaaac 780

atcgtatttg tatgacaagc tatctcaaaa atactgaaaa gaccgtatgt ggctatgtct 840

ggaggaccta gcactgcata tccatttatc atcaaaattc tgtattttct tgctttcctc 900

ttggcctacc gaaaccggcg gtgcgcttac cttcttcctg ccatgccatg taggtacgga 960

ggagagacaa atcaccaaat ccatgcttgt agtgagaaca taagatacag atcatcgtat 1020

gatcttgacc ttttctccca aagcttgctt gtgtctgtac agtctgttcc tttcaggtat 1080

attcgcagca taaccatggt ctggtttcag tattttcctc cacacaattc tatagtgcgg 1140

aaactcaaag gtcaaacctg aatactaaaa gttggcattt cttaacaata gttctaacaa 1200

tagaaatgta catagctgtt gctgtcaagg caagacattt gacccttggg tatatttttg 1260

taggaaccat cctgatatgt acaatccgtt gtacttgtaa gcgatgccgt aataggcaat 1320

tttatactta caactagcaa tgttggattg gcatagtaca ttatctcctt gcctttatgc 1380

cttcaccgtg aattatgcct atatatacgt agcagaagca cctaacaaag cacacaggct 1440

agagagcaac agaagaaaga tagaaaggag cagagtttag ctgacagctc gccggcggcc 1500

<210> 9

<211> 1566

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 9

atggcgactg aacagctcaa cgtgttgaaa gcactggacg ttgccaagac gcagttgtac 60

catttcaagg cggtcgtgat cgccggcatg ggcttcttca cggacgccta cgacctcttc 120

tgcatcgccc tcgtcaccaa gctgctgggg cgcatctact acaccgaccc tgccctcaac 180

gagcccggcc acctcccggc aaatgtgtcg gccgccgtga acggcgtggc cctgtgtggc 240

acacttgccg gccagctctt cttcggctgg ctcggtgaca agctcggccg caagagcgtc 300

tacggcttca cgctcattct catggtcctc tgctccatcg cgtctgggct ctcgtttgga 360

cacgaggcca agggcgtaat gggcacgcta tgtttcttcc gcttctggct cggcttcggc 420

gtcggcggtg actaccctct gagcgccaca atcatgtcgg agtatgctaa caagaagacc 480

cgcggcacct ttatcgccgc cgtgtttgcc atgcaggggt ttggcatcct atttggtact 540

atcgtcacca tcatcgtctc gtctgcattc cgacatgcat tccctgcacc gccattctac 600

attgacgccg cagcgtccat tggcccagag gccgactacg tgtggcgcat catcgtcatg 660

ttcggcacca tcccggccgc cctgacctac tactggcgca tgaagatgcc cgaaactgcg 720

cggtacacag cactcatcgc cggcaacacg aagcaagcca catcagacat gtccaaggtg 780

ctcaacaagg agatctcaga ggaggatgtg cagggtgagc gggccactgg tgatacatgg 840

ggcctcttct cccgacagtt catgaagcgt cacggggtgc acttgctagc gaccacaagc 900

acttggttcc tgctcgatgt ggccttctat agccagaacc tgttccagaa ggacatcttc 960

accaagatcg ggtggatccc gccagccaag actatgaatg cattggagga gttgtaccgc 1020

atcgcccgcg cccaagcgct catcgcgctc tgcggcaccg tgcccggcta ctggttcacc 1080

gtcgccttca tcgacatcat tgggaggttt tggatccagc ttatgggatt caccatgatg 1140

accattttca tgctcgcaat cgccatacct tacgactact tggtgaagcc agggcaccac 1200

accggcttcg tcgtgctcta cgggctcact ttcttcttcg ccaacttcgg gcccaacagc 1260

acgaccttca ttgtgccagc cgagattttc cctgcgaggc tccgatccac atgtcatggt 1320

atctctgccg ctaccggtaa ggcaggcgcg atcattggcg cgttcgggtt cctgtatgcg 1380

tcccaggacc agaagaagcc cgagaccggt tactcacgag gaatcggcat gcgcaacgca 1440

ctcttcgtgc tcgcaggcac aaatttcctg ggcctgctct tttccctgct ggtgccggag 1500

tccaagggca agtcactgga ggagctctcc aaggagaacg tcggcgacga tggcatcgaa 1560

gcttag 1566

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 10

ctatgacatg attacgaatt ctcccgccga gaatgtttta 40

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 11

ttaccctcag atctaccatg gcgtcttggc aacgtccagt g 41

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 12

ccgagaccgg ttactcacga 20

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 13

aaagaaacgc tgcaatgaaa atc 23

Claims

1.一种筛选磷高效利用小麦品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用引物组对小麦样本基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；所述引物组的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述引物组的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

将所述扩增产物经Fun4HI酶切，根据酶切结果进行判断；当酶切后含有分子标记CAPS-799的小麦样本为磷高效利用小麦品种；所述CAPS-799的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分子标记CAPS-799的判断方法包括电泳或测序。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，通过电泳判断分子标记CAPS-799时，所述分子标记CAPS-799的电泳条带为703bp。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：以50μL计，25μL 2×KOD OneTM PCR MasterMix，上下游引物各0.3μM，DNA模板200ng和剩余dddH₂O。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR反应程序为：94℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸3min，循环32次；68℃延伸5min。

6.权利要求1～5任一项所述方法在分子标记辅助选育磷高效利用小麦新品种中的应用。