ES2256028T3 - Deteccion e identificacion de cepas bacterianas. - Google Patents
Deteccion e identificacion de cepas bacterianas.Info
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Abstract
Procedimiento para la detección de bacterias, que comprende las siguientes etapas: a) acoplamiento de bacteriófagos y/o de proteínas de bacteriófagos mediante unión directa a un portador o mediante unión directa de los bacteriófagos y/o de las proteínas de bacteriófagos a un polipéptido inmovilizado en un portador, b) incubación del portador acoplado con los bacteriófagos y/o con las proteínas de bacteriófagos con una muestra, c) dado el caso, retirada de la muestra y de las bacterias de la muestra no unidas a los bacteriófagos y/o a las proteínas de bacteriófagos, d) dado el caso, adición de sustancias que permeabilizan o destruyen la membrana de las bacterias, y e) detección de las bacterias de la muestra que están unidas a los bacteriófagos y/o a las proteínas de bacteriófagos, no sometiéndose las bacterias unidas a ninguna etapa de cultivo.
Description
Detección e identificación de cepas
bacterianas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la detección de bacterias, que comprende las
siguientes etapas: acoplamiento de bacteriófagos y/o proteínas de
bacteriófagos a un portador, incubación del portador acoplado con
bacteriófagos y/o proteínas de bacteriófagos con una muestra, dado
el caso, retirada de la muestra y de las bacterias de la muestra no
unidas a los bacteriófagos y/o las proteínas de bacteriófagos, dado
el caso, adición de sustancias que permeabilizan o destruyen la
membrana de las bacterias, y detección de las bacterias de la
muestra que están unidas a los bacteriófagos y/o a las proteínas de
bacteriófagos, no sometiendo las bacterias unidas a ninguna etapa
de cultivo.
La detección rápida y exacta de bacterias es la
primera etapa necesaria para el diagnóstico y el tratamiento de una
infección bacteriana en el ser humano y en animales, así como para
tomar medidas preventivas. Además, la detección sirve para el
control de la higiene y de la calidad de materias primas y alimentos
elaborados, así como para el control de la higiene y de la calidad
de agua potable y agua de uso industrial y de la calidad del agua
de balnearios públicos. Además, la detección sirve para la
monitorización y la optimización de procesos, así como para el
control de calidad en el análisis del medio ambiente. En contraste
con la mayoría de los procedimientos usados hasta ahora, el
procedimiento aquí descrito también posibilita una detección
sencilla del objeto que se ha de examinar en el lugar donde se
encuentra.
La detección de bacterias en muestras biológicas,
la mayoría de las veces, se efectúa con la ayuda de una combinación
de procedimientos de cultivo, con el seguimiento de actividades
metabólicas. En una tipificación de cepas bacterianas de una
especie de bacterias mediante fagos, se acoplan procedimientos de
cultivo con la sensibilidad de bacterias con bacteriófagos de
tipificación. En una placa de agar de la muestra que se ha de
examinar, se superpone una suspensión de bacteriófagos en agar
blando a una densa población de bacterias, que se ha obtenido por
aislamiento de una colonia individual y por multiplicación
subsiguiente de la misma. El resultado se obtiene por el recuento
de las placas y el control de la morfología de las placas, después
de una incubación durante la noche, a la temperatura óptima para el
crecimiento de las bacterias, que usualmente asciende en la mayoría
de las veces a 37ºC. Una variante de la tipificación prevé la
medición de la adenilatoquinasa, después de la lisis celular
mediada por los fagos. Para esto, se diluye con un tampón un cultivo
de una noche de las bacterias que se han de analizar, se mezcla con
fagos y se mide la lisis por fagos específicos, mediante la
actividad de la adenilatoquinasa.
En todos los procedimientos descritos hasta
ahora, se espera la lisis antes de efectuar la detección, o se
efectúa la detección mediante la lisis. De esta manera, pueden
seguirse fuentes de agentes infecciosos y pueden descubrirse
fuentes de infección. Esta tipificación está establecida desde hace
años para una serie de bacterias, como Salmonella typhi,
Salmonella paratyphi B, Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, así como un gran número de otras bacterias. Sin
embargo, estos procedimientos de detección establecidos sólo proveen
los resultados por lo general después de varios días. Por cierto,
justamente la determinación rápida y exacta de la especie de
bacterias (tipificación) muchas veces es de gran importancia para
una reacción rápida.
El documento WO93/17129 describe un procedimiento
para la detección de determinadas bacterias en una muestra, en el
que se detectan las bacterias mediante un bacteriófago que es capaz
de unirse a la bacteria, y al que está fijado un asociado de unión
de un par de unión de dos partes. El segundo asociado de unión del
par de unión de dos partes está unido a un portador sólido,
insoluble en agua, que puede suspenderse en agua. Las bacterias, si
están presentes en la muestra, son unidas por los bacteriófagos, que
entonces, a través de los asociados de unión, se unen al portador
sólido.
Últimamente, también se usan procedimientos de
detección más rápidos de biología molecular, por ejemplo, la
reacción en cadena de la polimerasa, que, sin embargo, tienen la
desventaja de ser más susceptibles a la contaminación. También con
estos procedimientos, el resultado usualmente sólo está a
disposición después de un día.
Además, para una identificación del género de
bacterias, en algunos casos es necesario enviar muestras a
laboratorios de referencia altamente especializados, lo que
igualmente representa un factor que consume tiempo y costes.
Por ello, la invención se basa en el objetivo de
proporcionar un procedimiento rápido y económico para detectar
bacterias que, por un lado, pueda llevarse a cabo en el laboratorio
por personas con conocimientos microbiológicos especiales, y, por
el otro lado, pueda llevarse a cabo en una forma simplificada en el
mismo lugar en que se encuentra la muestra, y sin conocimientos
previos correspondientes.
Se alcanza el objetivo mediante el objeto
definido en las reivindicaciones.
Por ello, un aspecto de la presente invención es
un sistema de detección rápido y exacto para bacterias, que provee
información acerca de la especie de bacterias, acerca de la cepa de
bacterias y, dado el caso, permite una cuantificación de las
bacterias, y consiste en el reconocimiento de estas bacterias
mediante bacteriófagos o proteínas de bacteriófagos.
Los procedimientos usuales de detección de
bacterias basados en bacteriófagos contienen etapas de cultivo que
consumen mucho tiempo, y la lisis celular mediada por bacteriófagos.
Aunque el procedimiento conforme a la invención aprovecha
igualmente el reconocimiento específico de células mediante
bacteriófagos, en contraste con los procedimientos descritos hasta
ahora, a continuación de la etapa de reconocimiento celular
específico, después de la separación de bacterias unidas de forma
inespecífica, se efectúa directamente un ensayo correspondiente de
unión, por ejemplo, una medición de una modificación de señal
espectroscópica (por ejemplo, por absorción, fluorescencia,
bioluminiscencia o quimioluminiscencia, o dicroísmo circular) o
eléctrica (por ejemplo, por medición de capacidad o modificación de
la conductividad eléctrica). De esta manera, ya se posibilita una
detección de las bacterias después de pocos minutos, en lugar de
después de horas o incluso, de días. Por un acoplamiento selectivo,
especialmente, una fijación covalente de bacteriófagos a estructuras
portadoras apropiadas, por ejemplo, a placas de microtitulación,
tiras de ensayo, portaobjetos, obleas, materiales filtrantes o
cámaras celulares de flujo, se favorece la etapa de procedimiento
del ensayo de unión mediante la reducción del fondo no específico y
se posibilita una amplia aplicación para todas las bacterias. Las
estructuras portadoras pueden estar constituidas, por ejemplo, por
poliestireno, polipropileno, policarbonato, PMMA, acetato de
celulosa, nitrocelulosa, vidrio, obleas de silicio. Además, el uso
del procedimiento conforme a la invención también posibilita el uso
de bacteriófagos lisogénicos para la detección de bacterias.
Por ello, un aspecto de la presente invención
consiste en proporcionar un procedimiento para la detección de
bacterias que comprende las siguientes etapas: acoplamiento de
bacteriófagos y/o proteínas de bacteriófagos a un portador,
incubación del portador acoplado con los bacteriófagos y/o las
proteínas de bacteriófagos con una muestra, dado el caso, retirada
de la muestra y de las bacterias de la muestra no unidas a los
bacteriófagos y/o las proteínas de bacteriófagos, dado el caso,
adición de sustancias que permeabilizan o destruyen la membrana
bacteriana, y detección de las bacterias de la muestra, unidas a los
bacteriófagos y/o las proteínas de bacteriófagos, no sometiéndose
las bacterias unidas a ninguna etapa de cultivo.
Se prefiere un procedimiento en el que la
detección se efectúa mediante una detección colorimétrica de
componentes celulares y/o de productos de la reproducción de fagos,
mediante una detección de ADN y/o de ARN, o mediante una detección
inmunológica. Además, se prefiere un procedimiento en el que los
bacteriófagos y/o las proteínas de bacteriófagos están acoplados a
los portadores mediante adsorción o mediante un enlace químico.
Además, se prefiere un procedimiento en el que los bacteriófagos y/o
las proteínas de bacteriófagos presentan modificaciones. Además, se
prefiere un procedimiento en el que se usan al menos dos
bacteriófagos y/o proteínas de bacteriófagos distintos, que
reconocen al menos dos especies y/o géneros distintos de bacterias.
Además, se prefiere un procedimiento en el que el portador es, por
ejemplo, una placa de microtitulación, tiras de ensayo,
portaobjetos, obleas, material filtrante o una cámara celular de
flujo y, por ejemplo, está constituido por poliestireno,
polipropileno, policarbonato, PMMA, acetato de celulosa,
nitrocelulosa, vidrio u oblea de silicio.
Para la detección, se usan bacteriófagos que son
específicos para las bacterias deseadas que se han de detectar. Los
fagos no necesitan ser específicos para una especie de bacterias,
sino que también pueden ser específicos para varias especies de
bacterias o para un género de bacterias. Qué fagos se usan para la
detección depende de cuáles sean las bacterias que se han de
detectar. Además, también pueden usarse dos o más fagos en un
procedimiento de detección, para detectar simultáneamente varias
especies de bacterias o para tipificar exactamente un género de
bacterias. Los bacteriófagos usados pueden ser bacteriófagos que
pueden obtenerse comercialmente, de colecciones de cepas como, por
ejemplo, DSM o ATCC, o ser bacteriófagos aislados expresamente para
este fin. Pueden usarse tanto bacteriófagos líticos como
lisogénicos, prefiriéndose fagos líticos. Las propiedades
morfológicas no limitan la selección de fagos, sin embargo, se
prefieren Myoviridae (fagos similares a T4),
Siphoviridae (fagos similares a \lambda) o
Podoviridae (fagos similares a T7, P22).
Los fagos se unen a los receptores
correspondientes de las bacterias. Aquí se produce una interacción
proteína-proteína o proteína-hidrato
de carbono o proteína-lípido. Después de reconocer
con alta especificidad a su hospedador, el fago inyecta su
información genética (ADN o ARN mono- o bicatenario) en la célula, y
se encuentra en forma lisógena o, en el caso de la lisis, produce
nuevas partículas de fago. Con la inyección del ácido nucleico del
fago, se fija la unión de las bacterias a los fagos, en la mayoría
de los casos, de forma irreversible. Después de finalizada la etapa
de reconocimiento, en el procedimiento conforme a la invención se
efectúa la detección de las bacterias. Este procedimiento, en
principio, puede usarse para todas las bacterias para las que están
descritos fagos o puedan aislarse estos. Las bacterias preferidas
son aquéllas que son relevantes para la industria de los alimentos,
en la medicina o en el análisis del medio ambiente como, por
ejemplo, bacterias lácticas, por ejemplo, Leuconostoc,
Pseudomonas y enterobacterias, por ejemplo, E. coli,
Salmonella. La etapa de reconocimiento puede llevarse a cabo
a cualquier temperatura en el intervalo de 0º a 90ºC,
preferentemente, a una temperatura en el intervalo de 4º a 45ºC,
muy preferentemente, a una temperatura en el intervalo de 15 a 37ºC,
de forma especialmente preferente, a una temperatura en el intervalo
de 20 a 37ºC, especialmente, a temperatura ambiente.
Además, es posible aislar y usar para la
detección, en lugar de fagos completos, proteínas individuales de
fagos, por ejemplo, receptores o adhesinas de fagos, o partes de
estas adhesinas, por ejemplo, p12 de T4 o espoina de cola p9 de
P22, o variantes de estas proteínas. Se prefieren a este respecto
adhesinas que se unan de forma irreversible con bacterias, o cuya
bolsa de unión a las bacterias fuera modificada correspondientemente
por ingeniería genética o en químicamente para lograr una unión
irreversible. Un ejemplo de proteínas de fago modificadas por
ingeniería genética son las "mutantes de sitio activo" de la
espina de cola de P22 (véase Baxa y col., Biophys. J. Vol. 71,
2040-2048: 1996). Las proteínas de fagos pueden
usarse igual que los bacteriófagos para el procedimiento conforme a
la invención.
Los bacteriófagos y/o las proteínas de
bacteriófagos usados para el procedimiento conforme a la invención
pueden adaptarse a las estructuras del portador mediante una
mutagénesis selectiva o aleatoria (al azar) de su especificidad de
hospedador o de sus propiedades de unión. Mediante mutagénesis, se
introducen mutaciones que pueden ser adiciones, deleciones,
sustituciones de aminoácidos o modificaciones químicas. Estas
mutaciones generan una modificación de la secuencia de aminoácidos
en la región de unión de los fagos o de las proteínas de fagos, con
la meta de adecuar la especificidad y la afinidad de unión a las
necesidades del ensayo, por ejemplo, hacer irreversible la unión de
las bacterias a las proteínas de fagos aisladas, para mejorar las
posibilidades de lavado. Además, puede realizarse una modificación
de las proteínas de fagos mediante ingeniería genética o bioquímica
con la meta de suprimir la actividad enzimática, presente dado el
caso, para mejorar de este modo la unión o volverla
irreversible.
Para la detección conforme a la invención, se
inmovilizan los fagos o las proteínas de fagos sobre estructuras
portadoras apropiadas, por ejemplo, placas de microtitulación, tiras
de ensayo, portaobjetos, obleas, materiales filtrantes o cámaras
celulares de flujo. Las estructuras portadoras, por ejemplo, pueden
estar constituidas por poliestireno, polipropileno, policarbonato,
PMMA, acetato de celulosa, nitrocelulosa, vidrio, obleas de
silicio. La inmovilización puede lograrse mediante adsorción o unión
covalente, prefiriéndose la unión covalente. Aquí es importante una
inmovilización funcional, es decir, que los fagos o las proteínas de
fagos, a pesar de la unión al material portador, dispongan de
estructuras accesibles para las bacterias.
Para reprimir una reacción inespecífica de las
bacterias que se han de examinar con el material portador, puede
efectuarse un bloqueo con seroalbúmina bovina o Tween 20, o
sustancias similares, usadas en el ámbito de ELISA, por ejemplo,
leche en polvo. Además, para aumentar la eficiencia de la adsorción,
los sistemas portadores pueden recubrirse previamente con proteínas
apropiadas (por ejemplo, anticuerpos específicos contra proteínas de
fagos o proteínas inespecíficas como, por ejemplo, seroalbúmina
bovina), péptidos, sacáridos (por ejemplo, monosacáridos,
oligosacáridos o polisacáridos), o detergentes (por ejemplo, Tween
20 u octilglucósido). Estos recubrimientos pueden efectuarse, o
bien, durante una noche, a una temperatura en el intervalo de
4-20ºC, o bien durante 2 a 4 h a
30-65ºC. A continuación, se retira el exceso de
líquido y se seca la estructura portadora a aproximadamente
60-70ºC. El recubrimiento básico, por un lado, debe
garantizar una adsorción de fagos o proteínas de fagos funcionales
y, por el otro lado, deben impedir una adsorción inespecífica de las
bacterias de ensayo a la estructura portadora, para aumentar la
eficiencia del ensayo.
A continuación del recubrimiento básico, se
aplican los fagos o las proteínas de fagos. Para ello, se aplica
una disolución acuosa tamponada de los fagos o de las proteínas de
fagos sobre la estructura portadora previamente tratada. Después de
una adsorción a 4-20ºC durante una noche, o a
30-65ºC durante 2 a 4 h, se retira la disolución de
recubrimiento y se seca la estructura portadora como está descrito
anteriormente. Para un aumento de la eficiencia de recubrimiento,
posteriormente puede llevarse a cabo una fijación covalente de los
fagos o de las proteínas de fagos con reticulantes químicos como,
por ejemplo, glutaraldehído.
Para mejorar la inmovilización funcional en los
fagos usados, por ejemplo, Myoviridae, Siphoviridae y
Podoviridae, puede usarse una preparación de presentación en
fagos (véase Gene, 1998, 215, 439-444), en la que se
expresan péptidos en las proteínas de la cabeza de fagos o de
cápsidas que disponen de propiedades de unión definidas para
determinados sistemas portadores.
La inmovilización de los fagos y de las proteínas
de fagos sobre el material portador mediante adsorción puede
llevarse a cabo mediante la incubación de una disolución de fagos en
tampón acuoso, por ejemplo, Tris 100 mM, pH 7,3 o fosfato de sodio
100 mM, pH 7,5, durante varias horas o durante a noche, a 5ºC hasta
45ºC, preferentemente, a 15ºC hasta 37ºC, muy preferentemente, a
20ºC hasta 37ºC, de especial preferencia, a temperatura
ambiente.
Además, los fagos o las proteínas de fagos no
necesitan inmovilizarse directamente sobre el portador, sino pueden
unirse a polipéptidos, que a su vez fueron inmovilizados sobre el
portador. Estos polipéptidos pueden ser anticuerpos, lectinas,
receptores o anticalinas, específicos de los fagos o de las
proteínas de fagos.
En la inmovilización de los fagos y de las
proteínas de fagos mediante acoplamiento covalente, debido a las
condiciones más restrictivas de lavado, pueden eliminarse mejor las
bacterias unidas de forma inespecífica. En el acoplamiento
covalente, pueden acoplarse los fagos y las proteínas de fagos, por
ejemplo, a través de grupos amino primarios o grupos carboxilo a
materiales portadores ya activados por el fabricante, por ejemplo,
placas de microtitulación de Nunc, Xenobind o Costar, en condiciones
estándar, por ejemplo, -NH_{2} mediante cloruro de cianurilo
(Russian Chemical Rev., 1964, 33:92-103),
o
-COO- mediante EDC (1-etil-3'-[3'-dimetilaminopropil]carbodiimida) (Anal. Biochem. 1990, 185:131-135). Además, los materiales portadores pueden activarse directamente mediante procedimientos apropiados. Una posibilidad que se prefiere por su aplicabilidad para un amplio espectro de materiales portadores es la silanización del material portador. Por ejemplo, la silanización del poliestireno puede efectuarse mediante pirólisis por llama. A continuación, se aplican mediadores de adherencia apropiados que posibiliten un acoplamiento, por ejemplo, a través de grupos amino primarios o grupos carboxilo.
-COO- mediante EDC (1-etil-3'-[3'-dimetilaminopropil]carbodiimida) (Anal. Biochem. 1990, 185:131-135). Además, los materiales portadores pueden activarse directamente mediante procedimientos apropiados. Una posibilidad que se prefiere por su aplicabilidad para un amplio espectro de materiales portadores es la silanización del material portador. Por ejemplo, la silanización del poliestireno puede efectuarse mediante pirólisis por llama. A continuación, se aplican mediadores de adherencia apropiados que posibiliten un acoplamiento, por ejemplo, a través de grupos amino primarios o grupos carboxilo.
Para lograr una inmovilización selectiva al
portador, por ejemplo, en los fagos T4 un acoplamiento a través de
la "cabeza", pueden usarse polímeros hinchables, también
mezclas de alquiltioles de distinta longitud con poros de tamaño
definido, o sobre superficies metálicas.
Para la unión de las bacterias que se han de
examinar a los bacteriófagos o las proteínas de fagos, se pone en
contacto la muestra de ensayo en forma acuosa con los fagos o las
proteínas de fagos y se incuban. La incubación se efectúa a una
temperatura en el intervalo de 4º a 90ºC, preferentemente, a una
temperatura en el intervalo de 4º a 45ºC, muy preferentemente, a
una temperatura en el intervalo de 15º a 37ºC, de especial
preferencia, a una temperatura en el intervalo de 20º a 37ºC,
especialmente, a temperatura ambiente, durante hasta 6 horas,
preferentemente, durante hasta 4 horas, muy preferentemente, durante
2 horas, especialmente, durante 1 hora, de especial preferencia, de
1 a 20 minutos. Por ejemplo, la incubación puede efectuarse durante
2 a 120 min a 4º hasta 37ºC, preferentemente, durante 20 a 30 min a
25ºC o 37ºC, muy preferentemente, durante 35 min a 37ºC. Mediante
la adición de inhibidores de traducción, como rifampicina, puede
prolongarse la duración de la incubación, para aumentar la
eficiencia de unión. Después del reconocimiento específico y de la
unión fuerte de las bacterias, puede separarse el material unido de
forma inespecífica mediante el lavado con tampón acuoso, por
ejemplo, con PBS o PBS-Tween, preferentemente, a
valor de pH neutro, por ejemplo, con fosfato de sodio 50 mM, pH
7,0. Para aumentar la eficiencia del lavado, dado el caso, pueden
añadirse detergentes a los tampones usados, por ejemplo, Tween 20,
Triton X 100 ó agentes caotrópicos, por ejemplo, clorhidrato de
guanidinio o urea. Esta etapa de lavado puede repetirse varias
veces, dependiendo del material de la muestra.
Después de separar el material unido de forma
inespecífica, puede permeabilizarse la membrana de las bacterias
unidas o, si es necesario, destruirse (dependiendo del ensayo de
detección usado), mediante la adición de detergentes (por ejemplo,
dodecilsulfato de sodio, octilglucósido), sustancias químicas (por
ejemplo, polimixina B), polipéptidos formadores de poros (por
ejemplo, nisina, holina, melitina) o proteínas (por ejemplo,
lisozima). Esta permeabilización de membrana puede efectuarse
durante 5 a 10 min a una temperatura en el intervalo de 10º a
50ºC. A continuación, se detectan las bacterias unidas.
Si se pone en contacto la muestra con los fagos o
las proteínas de fagos inmovilizados, por ejemplo, en una cámara de
flujo o en un filtro, después de la unión de las bacterias a los
fagos o a las proteínas de fagos, no debe separarse necesariamente
antes de realizarse la detección.
La detección de las bacterias unidas con los
fagos o con las proteínas de fagos también puede efectuarse mediante
el uso de un ensayo colorimétrico. Aquí se detecta, por ejemplo,
NADH (Bergmeyer & Berna; Methoden der enzymatischen Analyse,
Bergmeyer, U. VCH, Weinheim 1974), actividad
\beta-galactosidasa (Apte y col., 1995, Wat. Res.
29, 1803-1806), o fosfato inorgánico
(Lanzetta y col., 1979, Anal. Biochem., 100,
95-97). Estos ensayos posibilitan la detección de
al menos 10^{4} células por ml; por el uso de colorantes
fluorescentes puede mejorarse la sensibilidad a 10^{2} hasta
10^{3} células por ml. Los ensayos colorimétricos pueden usarse en
general para la detección de la actividad de enzimas
intracelulares, enzimas de la membrana, o enzimas periplasmáticas,
o de componentes celulares o de productos de la reproducción de
fagos, por ejemplo, proteínas de fagos o ácidos nucleicos de fagos.
Además, los ácidos nucleicos de fagos pueden estar modificados
mediante la clonación de un ácido nucleico exógeno, por ejemplo, un
gen para la peroxidasa del rábano picante, en el genoma del fago.
Después de la inyección del ácido nucleico del fago en la bacteria
unida, se expresa el gen exógeno y la actividad del producto génico
puede ser detectada mediante procedimientos usuales. Además, el
ácido nucleico exógeno puede codificar cualquier polipéptido
extraño a la bacteria, que entonces puede detectarse.
Los ensayos colorimétricos pueden ser iguales
para todas las bacterias que se han de examinar, pero también
pueden ser específicos para determinadas combinaciones de
bacteria/fago. La medición de la actividad enzimática de enzimas
citoplasmáticas o periplasmáticas se lleva a cabo después de una
permeabilización de la membrana de las bacterias unidas.
Preferentemente, se detecta la actividad de enzimas ubicuas como,
por ejemplo, lactato deshidrogenasa o proteína disulfuroisomerasa.
La selección de enzimas puede adecuarse al respectivo género de
bacterias analizadas o al respectivo planteamiento específico de
género. Para los sistemas de ensayo colorimétricos, según la
sensibilidad que se necesite, se usan procedimientos de detección
químicos o de bioluminiscencia, de absorción, de fluorescencia o de
dicroísmo circular.
Además, la detección de las bacterias unidas a
los fagos o a proteínas de los fagos puede efectuarse a través de
la detección de ADN y/o ARN. Para ello, pueden usarse sustancias que
se unen a ADN y/o ARN. La unión a ADN y/o a ARN puede efectuarse
directamente, basado en una difusión a través de una membrana o,
como alternativa, mediante una permeabilización de membrana. Aquí
puede recurrirse a marcadores de fluorescencia adquiridos como, por
ejemplo, bromuro de etidio, naranja de acridina,
4',6'-diamidino-2-fenilindoles
(DAPI) o verde I de SYBR, y pueden usarse los protocolos
correspondientes de detección descritos en la bibliografía
especializada.
Además, la detección de las bacterias unidas a
los fagos o a las proteínas de fagos puede llevarse a cabo mediante
la detección de nuevos ADN y/o ARN producidos. Para ello, en los
nuevos ADN y/o ARN producidos a partir de fagos, pueden introducirse
nucleótidos marcados por fluorescencia, permeables a través de la
membrana.
Otro procedimiento de detección, es la
hibridación con oligonucleótidos altamente conservados del ARNr 16S
(secuencia de Shine-Dalgarno), marcados con
fluorescencia, y la detección de la señal de hibridación por
fluorescencia. Se prefiere el procedimiento de detección con el uso
de proteínas de fagos o de "fantasmas" de fagos ("envolturas
vacías de fagos", exentas de nucleótidos), porque de esta manera
se reduce la señal de fondo de ADN o ARN de fagos.
La detección de las bacterias unidas a los fagos
o a las proteínas de fagos, además, puede llevarse a cabo usando
polipéptidos, por ejemplo, anticuerpos, a los que se acopla un
marcaje, por ejemplo, FITC o fosfatasa alcalina, contra estructuras
de superficie celular de las bacterias, o lectinas contra
estructuras de superficie celular, siguiéndose el desarrollo de
señales de, por ejemplo, un anticuerpo acoplado con peroxidasa, de
forma fotométrica. Las superficies celulares de las bacterias
reconocidas por los anticuerpos o las lectinas, por ejemplo, pueden
ser lipopolisacáridos o proteínas de membrana. Además, los
polipéptidos pueden ser proteínas de fagos que sean idénticas a las
proteínas inmovilizadas de fagos, o distintas de éstas. Además, la
detección puede llevarse a cabo usando fagos completos, que pueden
ser idénticos a los fagos inmovilizados o ser distintos de
estos.
El procedimiento de detección conforme a la
invención, de esta manera, puede prescindir del uso de un segundo
anticuerpo. En contraste con los procedimientos de ELISA
tradicionales, en los que las bacterias que se han de examinar se
acoplan a un portador y, a continuación, se efectúa la detección
mediante anticuerpos primarios o secundarios, mediante el uso de
partículas de fagos acoplados a sistemas portadores se lleva a cabo
un enriquecimiento previo y una selección. De esta manera, puede
mejorarse la sensibilidad del procedimiento ELISA, pudiéndose
reducir notablemente la cantidad necesaria actual de gérmenes, de
10^{4}-10^{6} por ml (Blasco y col., 1998; J.
Appl. Microbiol. 84, 661-666).
Según sea necesario, se detectan, por ejemplo,
fluorescencia, luminiscencia, absorción o dicroísmo circular,
conductividad o modificaciones de capacidad de las respectivas
muestras en los aparatos de medición estándar correspondientes.
Para una determinación exacta de la concentración de las bacterias,
puede confeccionarse una recta de calibración con moléculas patrón
correspondientes. Para alcanzar una determinación exacta del género
de bacterias, puede recurrirse a una serie de esquemas de
tipificación ya descritos en la bibliografía especializada. Si es
necesario, se construyen y se usan nuevos esquemas de tipificación,
es decir, combinaciones apropiadas de diferentes fagos, para la
determinación exacta de la cepa.
El uso del procedimiento conforme a la invención
posibilita una detección rápida y sensible de bacterias. Mediante
el acoplamiento a estructuras portadoras apropiadas, descritas
anteriormente, se posibilita una determinación rápida y económica
de un gran número de cepas bacterianas, una determinación muy exacta
del género bacteriano y/o una cuantificación de las bacterias, en
un único ensayo. Entre otras cosas, en el diagnóstico médico, la
determinación exacta del género bacteriano también es importante
para la caracterización epidemiológica de los agentes
patógenos.
El procedimiento conforme a la invención puede
usarse para la detección rápida, altamente sensible y económica de
bacterias en todas las muestras deseadas, especialmente, en la
medicina, en la industria y el análisis alimentarios, en la cría de
animales, en el análisis de agua potable y del medio ambiente. La
fácil aplicabilidad del procedimiento posibilita tanto disoluciones
envasadas para las combinaciones bacterianas más importantes, como
disoluciones sistemáticas adecuadas a las necesidades del cliente, y
de esta manera, un uso universal del procedimiento conforme a la
invención. Además, la presente invención permite una automatización
completa del procedimiento conforme a la invención. Además, el
procedimiento puede usarse para todas las bacterias para las cuales
haya fagos apropiados, o que se aíslen en el futuro, o para
bacterias para las que puedan producirse por selección fagos o
proteínas de fagos correspondientes para su tipificación. Además, el
procedimiento conforme a la invención brinda la posibilidad de su
uso en kits de detección de bacterias para "cualquiera", para
uso doméstico.
Por lo tanto, otro aspecto de la invención se
refiere a un kit para la detección de bacterias, que comprende un
portador con fagos o proteínas de fagos inmovilizados y las
disoluciones necesarias para la detección de las bacterias unidas
con reactivos de ensayo. Los portadores pueden ser todos los
portadores descritos anteriormente, sobre los que están
inmovilizados los fagos o las proteínas de fagos, como fue descrito
anteriormente. Las disoluciones con los reactivos de ensayo
corresponden igualmente a las sustancias que están descritas para
la detección de las bacterias en el procedimiento conforme a la
invención. Además, dado el caso, el kit puede contener disoluciones
lavadoras, así como enzimas o detergentes necesarios para la
apertura de la membrana bacteriana.
Los siguientes ejemplos explican la invención y
no deben entenderse como limitantes. Si no se indica de otra
manera, se usaron procedimientos estándar de biología molecular,
como los que están descritos, por ejemplo, en Sambrook y col.,
1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York.
Se efectuó la purificación de los fagos de E.
coli T4, T7, Q\beta y PhiX174, después del cultivo de los
fagos sobre las bacterias hospedadoras de E. coli
correspondientes, indicadas por DSM, mediante procedimientos
conocidos. Para lograr una separación completa de las bacterias y
restos de bacterias, se centrifugó la suspensión de fagos a baja
velocidad (5000 x g, durante 30 min). Para la concentración y el
aislamiento de los fagos, se efectuó una ultracentrifugación
preparativa usual y una precipitación con polietilenglicol. Se
controló el éxito de la separación de las bacterias mediante un
experimento en placa y, a continuación, se almacenaron los fagos
enfriados (4º-8ºC), o congelados (-20º o -80ºC).
Se separaron las estructuras de receptores de
fagos a partir de fagos intactos mediante procedimientos de
separación estándar usuales de química de proteínas, o se produjeron
de forma recombinante, y fueron igualmente purificadas mediante
procedimientos de separación estándar de la química de proteínas, y
se almacenaron como las partículas completas de fagos.
Se inmovilizaron directamente
10^{8}-10^{12} fagos/ml en tampón acuoso (Tris
100 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, gelatina al 0,03% (p/v) o fosfato de
sodio 50 mM, pH 7,0), o bien durante varias horas a 37ºC, o bien
durante una noche a 20ºC, sobre placas Nunc Maxisorb, mediante
adsorción. A continuación, se eliminaron los fagos no unidos,
mediante cuatro lavados o bien, con Tris 100 mM, pH 7,3, o bien con
fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5.
A continuación, para reprimir reacciones
secundarias inespecíficas de las bacterias en el material del
sistema portador, se llevó a cabo una etapa de bloqueo. Para ello,
se incubó el sistema portador tratado con fagos con disolución
bloqueante de PBS (KH_{2}PO_{4} 4 mM, Na_{2}PO_{4} 16 mM,
NaCl 115 mM) y adición de 0,05-1,0% de Tween 20, 1%
de seroalbúmina bovina durante una noche, en un intervalo de
temperaturas de 4ºC, o durante 2 h a 37ºC, se retiró el líquido
sobrenadante y, a continuación, se secó el sistema portador, como se
describió anteriormente.
Se activaron placas de poliestireno Nunc
(CovaLink^{TM}) y Costar (con grupos NH_{2}), de forma
correspondiente al protocolo del fabricante, con cloruro de
cianurilo (48 mg en 3 ml de acetona, 45 ml de fosfato de sodio 100
mM, pH 7,0). Para ello, en el transcurso de dos minutos, se
pipetearon 100-200 \mul de cloruro de cianurilo
en los pocillos de la placa y se incubó durante cinco minutos a
temperatura ambiente. A continuación, se lavó tres veces con
fosfato de sodio 100 mM, pH 7,0 y se secó durante más de 30 minutos
a 50ºC. Para el acoplamiento, se incubaron los fagos durante una
noche a temperatura ambiente en carbonato de sodio 100 mM, pH 10,0
en los pocillos. Mediante lavado triple con fosfato de sodio 50 mM,
pH 7,0, se eliminaron fagos no unidos. Se secaron las placas listas
o, hasta su uso, se recubrieron con una capa de tampón acuoso y se
almacenaron a 4º-20ºC.
Se incubaron las muestras de bacterias (200
\mul de muestra/pocillo) durante 35 min a 37ºC. A continuación, se
separaron bacterias unidas de forma inespecífica mediante triple
lavado o bien, respectivamente con 200 \mul de Tris 100 mM, pH
7,0, o bien con tampón fosfato, pH 7,0. Para el ensayo
colorimétrico, se añadieron 200 \mul de tampón de lavado con
MgCl_{2} y mercaptoetanol, así como 66 \mul de ONPG
(o-nitrofenil-\beta-D-galactopiranósido,
4 mg/ml). Se incubó la preparación de ensayo a 37ºC, y se siguió
espectrofotométricamente el transcurso de la reacción a 405 nm
durante varias horas (2-5).
Claims (10)
1. Procedimiento para la detección de bacterias,
que comprende las siguientes etapas:
- a)
- acoplamiento de bacteriófagos y/o de proteínas de bacteriófagos mediante unión directa a un portador o mediante unión directa de los bacteriófagos y/o de las proteínas de bacteriófagos a un polipéptido inmovilizado en un portador,
- b)
- incubación del portador acoplado con los bacteriófagos y/o con las proteínas de bacteriófagos con una muestra,
- c)
- dado el caso, retirada de la muestra y de las bacterias de la muestra no unidas a los bacteriófagos y/o a las proteínas de bacteriófagos,
- d)
- dado el caso, adición de sustancias que permeabilizan o destruyen la membrana de las bacterias, y
- e)
- detección de las bacterias de la muestra que están unidas a los bacteriófagos y/o a las proteínas de bacteriófagos, no sometiéndose las bacterias unidas a ninguna etapa de cultivo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la detección se efectúa mediante una detección colorimétrica de
componentes celulares y/o productos de la reproducción de fagos,
mediante una detección de ADN y/o ARN, o mediante una detección
inmunológica.
3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 ó
2, en el que los bacteriófagos y/o las proteínas de bacteriófagos
unidos directamente a un portador están acoplados al portador
mediante adsorción o mediante unión química.
4. Procedimiento según las reivindicaciones 1 ó
2, en el que los polipéptidos inmovilizados sobre el portador son
anticuerpos, lectinas, receptores o anticalinas específicos.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que los bacteriófagos y/o las
proteínas de bacteriófagos presentan modificaciones.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que se usan al menos dos bacteriófagos
y/o proteínas de bacteriófagos distintos, que reconocen al menos
dos especies y/o géneros de bacterias distintos.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el portador es una placa de
microtitulación, una tira de ensayo, un portaobjetos, una oblea,
material filtrante o una cámara celular de flujo y está constituido
por poliestireno, polipropileno, policarbonato, PMMA, acetato de
celulosa, nitrocelulosa, vidrio u oblea de silicio.
8. Uso del procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, para detectar bacterias en la medicina, en
la industria y el análisis alimentarios, en la cría de animales, en
el análisis de agua potable y del medio ambiente.
9. Kit para llevar a cabo el procedimiento según
una de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende un portador con
fagos o proteínas de fagos inmovilizados y reactivos analíticos para
detectar las bacterias unidas.
10. Kit según la reivindicación 9, que además
comprende disoluciones lavadoras y/o sustancias que permeabilizan o
destruyen la membrana de las bacterias.
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