JPH0253500A - バクテリオファージの検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は発酵工業、発酵食品工業の製造に火打′ｓを与
えるバクテリオファージの検出方法に関し、また人間ま
たは動植物にとって有用または有害な淡水性または海洋
性細菌に作用するバクテリオファージの探索に適用でき
るバクテリオファージの検出方法に関する。

〔従来の技術〕

細菌を用いる発酵工業、発酵食品の製造分野におけるバ
クテリオファージ（以下ファージという）の汚染は、発
酵製品の製造を妨げ、その損害も致命的となるため大き
な間頌である。実際多くの発酵製品でファージ汚染が知
られている。例えば、チーズ・ヨーグルト製品分野では
サツカロマイセス・タレモリス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓｃｒｅｍｏｒｉｓ）　、サツカロマイセス・ラク
テイス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　１ａｃｔｉｓ）
　　等、清酒の分野ではラクトバチルス・プレビス（Ｌ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｇ）　、レウコノ
ストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ
　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｔｄｅｓ）等、糸引納豆の分野で
はバチルス・ナラトウ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｎａｔｔｏ
）、Ｌ−グルタミン酸発酵の分野ではマイクロバクテリ
ウム・アンモニアフィルム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）　　等、抗生物質製
造の分野ではストレプトマイセス−グリセラム（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃ　ｅｓｇｒｉｓｅｕｓ）　　等の宿主菌
全溶菌させるファージによる汚染がある。

これに対し、これまでのファージ汚染対策はもっばら予
防的なもので、積極的にファージを不活性化する方法や
薬剤は未だ開発されていない。ファージに感染したもの
を途中でその溶菌を止めることは不可能であるし、宿主
菌の増殖と共にファージも増殖するので、培養条件など
を変えてファージの増殖のみを押えることは不可能であ
る。結局工場全体あるいは製造現場を熱湯により？＊浄
にし、器具や容器の殺菌を完全にするといった雑菌対策
がファージ対策の中心である。

ファージ汚染を回避する最も実用的な方法はいわゆるロ
ーテーション法である。即ち、ファージに抵抗性を有す
る菌株をあらかじめ選んでおき、ファージ汚染が起きた
ら直ちにそのファージに抵抗性を有する菌株に変えてい
く方法である。しかしこの方法はファージに抵抗性を有
する菌株のない７１ｉＪｉｌ（例えば納豆菌の場合）で
は、ファージはその種の全ての菌株全便すのでこの方法
を用いることはできない。

このようなＭＢ菌の場合は如何に早くファージ汚染全検
知するかというファージ予察と、どの工程で感染が起き
たかとつきとめるいわゆる感染源の探索によって迅速に
ファージ汚染防止対策ｔ−講じることがローテーション
法同様重要である。

従来、平板培養法によるファージの検出可能な下限濃度
は１７ｍ１である。ところが、ファージ汚染をいち早く
検知し、感染源の量的指標全把握するためにはできるだ
け低いファージ濃度を検知することが望ましい。そこで
半定量的ではあるが１０７ｍ１水準のファージ濃度を定
量する簡易定量法（加菌法）が提案されている。

この方法は概ね次のとおりである。

宿主菌濃度１０／Ｍ以上の菌液に少なくともファージを
１個含むように試料水全顎えて適当時間培養する。つさ
゛に、菌液を混和した寒天培地を固めた平板表面上に上
記培養液全画線し、適当時間培養後、画線に沿った溶菌
斑の有無を確認する。

この方法では、上記のように、少なくとも１個のファー
ジ粒子が含まれた試料水を混合できる量は、高々１００
０プであり、このためファージ濃度の定量下限は１０　
／―にすぎない。

Ｃ発明が解決しようとする課題〕 通常、食品゛または発酵工場で使用される用水又は発生
する排水は製造規模によって異なるが一日数ｍ３〜数百
ｍ３になる。通常、用水は機器洗浄に用いられる前には
十分な殺菌操作全経る念めファージ汚染の原因となるこ
とは稀れである。一方、排水には常時発酵に用いられる
菌が機器の洗浄に伴って流入するためファージの存在す
る不可避性が高い。排水からのファージの定量は、感染
源となる７アージの探索と共に、その工場に２けるファ
ージ汚染の指標となるものであるから、実際のファージ
汚染の有無にかかわらず定期的に精度よ〈実施すること
が重要である。

しかし、従来の方法によるファージ下限濃度の１０″″
５／ｒｎｔ水準の精度でも必ずしも十分でない。例えば
１０−’／ｍＪの７ア一ジ濃度の場合、１　ｍ３中には
１００個のファージが含まれることになるため、排水の
管理を怠れば排水の飛沫、従来者の衣服、ぐっ、手足等
への排水の付着からファージによる汚染が起り得るから
である。

また−日数ｍ３〜数百ｍ３の排水から高々ｉｏｏ。

ｄ程度の採取であるためファージの検出可能な水準は高
くない。

そこで本発明者らは大量の試料水からｗ！、ｔのファー
ジ全失活°させることなく捕捉・濃縮させる方法全光に
提案した（特願昭６２−２１８０２７および特願昭６２
−２１８０２８）。

本発明は、これらの方法に代わる経済的な方法を継続し
て鋭意研究し本発明を完成するに至ったものである。

〔課題を解決するための手段〕 本発明は大量の試料水から微量のファージを失活させる
ことなく捕捉・濃縮する手段として、三重酸セルロース
又は三重酸セルロースをファージ吸着剤に使用する点を
新規とするもので、本発明はバクテリオファージを検出
すべき試料水と三重酸セルロースまたは三重酸セルロー
スを接触させてバクテリオファージを該物質に吸着させ
た後増殖させ、バクテリオファージヲ検出することを特
徴とするバクテリオファージの検出方法である。

二酢酸セルロース及び三酢酸セルロースは工業的に次の
ようにして製造され、プラスチック、アセテート人絹、
フィルムなどの原料として利用されている。

Ｃ６Ｈ７０２（ＯＨ）５　＋３（ＣＨ３ＣＯ）２０−＋
（セルロース）　　　（無水酢酸） Ｃ６Ｈ７０２（ＣＨ３ＣＯ２）３＋３ＣＨ３ＣＯＯＨ（
三酢酸セルロース） 次に三酢酸セルロース全加水分解することにより結合酢
酸基の一部を分離し、二酢酸セルロースとする Ｃ６Ｈ，０２（ＣＨ３ＣＯ２）３　＋　（３−ｘ）Ｈ２
Ｏ→（三酢酸セルロース Ｃ６Ｈ７０□（ＯＯＣＨ３）ｘ（ＯＨ）３−エ＋　（ｊ
−ｘ）ａＨ３ｃｏｏＨ（二酢酸七ルロース） 〔作用〕 試料水中の微量のファージを失活させることなぐ吸着剤
に吸着担持させたまま宿主菌とともに培養し、ファージ
の溶菌斑を形成させて、ファージを検出する。この点を
更に詳述すると、ファージは核酸とタンパク質のみから
なジ、それ自体では増殖せず、特定の細菌（宿主菌）に
寄生・増殖し最終的にはその細菌を溶菌する特性を有す
る。ファージの外股構成物質はタンパク質であり、二酢
酸セルロース又は三酢酸セルロースはこのようなタンパ
ク質をよく吸着する。

特に、ファージの頭部は細菌に吸着作用を有する吸着器
官に比べて比較的大きいため、大部分のファージはその
頭部が二酢酸セルロース又は三酢酸セルロースに吸着さ
れる。即ちファージは細菌を溶菌させる活性を有したま
まで当該物質に吸着されていることになる。この二酊酸
セルロース又は三酢酸セルロースに吸着したファージは
宿主菌に作用し、遊離した子ファージ全放出し、さらに
その近傍の宿主菌に感染し、溶菌させる。この反応は寒
天内に菌が固定された状態で生じるため、二酢酸セルロ
ース又は三酢酸セルロースを中心に溶菌された透明な斑
点が肉眼で観察されることンζなる。

糸引き納豆工場の排水を例にとって、本発明の実施例全
以下に説明する。糸引き納豆工場で使用されている納豆
菌（Ｂａｃｌｌｌｕｓ　ｎａｔｔｏ）　　とその工場排
水を用いてあらかじめ納豆菌ファージ全分離精製し以下
の試験に供した。

〔実施例１〕 無菌水１００ｒｎｔＶｃあらかじめ納豆菌ファージを１
０８／ｒｎｌとなるように注加し試料水分調製した。あ
らかじめ７０％エタノールで洗浄滅菌した二酢酸セルロ
ース（以下ＤＣＡと略称する）および三酢酸セルロース
（以下’Ｉ’ＣＡと略称する）２１＃づつ（乾燥重量と
して）、それぞれ試料水に入れ２ＤＣ，２４時間混合し
接触させた後、この粉末を無菌的にｆ遇し、２種の上澄
液を得た。この上澄液を適当倍希釈し念液と、納豆菌を
あらかじめＬＢ培地（バクトドリグトン１０９、酵母エ
キス５１１．　ＮａＣ／　　５１．蒸留水１２、−７．
０〜７．５）で５０Ｇ、３２時間培養した菌数（前培養
液）１ｍｔｉあらかじめ溶解して４８Ｃに保った１、５
多寒天を含むＬＢ培地に共に注加してプレート全作成し
、上澄液中のファージ粒子ａｋそれぞれ測定した。その
結果全第１表に示す。

つぎに上述の上澄液から戸別されたＤＣＡおよびＴＣＡ
粉末１．９′ｔ−それぞれ沢過膜（１μのグラスファイ
バフィルター）上で５形の無菌水によって洗浄した。そ
してあらかじめ溶解して４８Ｃに保った１、５チ寒天を
含むＬＢ培地に上記前培養液１ゴを注加して固定した平
板上に、上記の洗浄したＤＣＡおよび’ｒＣＡ粉末を適
当少量スポットし、３０Ｃ，１＜５〜２４時間培養した
。その結果、ＤＣＡおよびＴＣＡ粉末周辺に溶菌斑が発
生していた。即ちファージは失活することな（ＤＣＡお
よびＴＣＡ粉末に吸着していることが確認された。

第１表 〔実施例２〕 無菌水１０１にあらかじめ納豆菌ファージを１ｏ−’／
ｒｎｌとなるように注加し試料水を調製した。この試料
水とあらかじめ７０チエタノールに浸漬し滅菌したＤＣ
ＡおよびＴＣＡをそれぞれ５０Ｉを２０Ｃ，２４時間混
合し、接触させた後ＤＣＡおよびＴＣＡを無菌的Ｖｃ濾
過し試料水を除いた。この操作によジ納豆菌ファージは
ＤＣＡおよびＴＣＡＫ吸着された。

ついで納豆菌をあらかじめＬＢ培地で３０Ｃ１３２時間
培養した前培養液全新たなＬＢ培地３００ｒｎｌに菌数
か１０／ＩＩ！Ｊ以上となるように注加し、上記のファ
ージを吸着しているＤＣＡおよびＴＣＡを加えて、室温
で１５分間静置し、２０Ｃ，１６〜２４時間振とう培養
後、その液１−をあらかじめ溶解して４８ｃに保った１
、５幅寒天を含むＬＢ培地に前培養１Ｍと共に注加して
プレートを作成した。そのグレートラ２０Ｃ１１６〜２
４時間培養後にグレート上の溶菌斑の有無を観察した。

同様にしてこのようなグレートを５枚作成し観察した。

その結果を第２表に示す。

〔比較例〕

従来法と同様に、実施例２の試料水全各々１０ゴ、１０
０ｍＪ、　　１０ｎ　Ｏｍｊづつ分注し、それぞれに納
豆菌の前培養を菌数が１０／ｄ以上となるように注加し
た後、２０Ｃ，１６〜２４時間培養した。その液の１Ｍ
を用いて実施例２と同様にしてグレー）４作成し溶菌斑
の有無を観察した。その結果を第２表に示す。

第２表 注）十：溶菌斑１〜１０個発生 ：溶菌炎発生せず 〔発明の効果〕 （１１従来の方法ではファージの検出可能な濃度が１０
　／―であるのに対し、本発明では１０−’／ｄ迄高め
ることができる。

（２）　　ファージの検出可能な濃度が向上することに
より、工場のファージ汚染をいち早く察知することが可
能となり迅速な対応策を講することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. バクテリオファージを検出すべき試料水と二酢酸セルロ
   ースまたは三酢酸セルロースを接触させてバクテリオフ
   ァージを該物質に吸着させた後増殖させ、バクテリオフ
   ァージを検出することを特徴とするバクテリオファージ
   の検出方法。