ES2263598T3 - Deteccion e identificacion de grupos de bacterias. - Google Patents
Deteccion e identificacion de grupos de bacterias.Info
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Abstract
Procedimiento para la detección simultánea de diferentes bacterias, que comprende los pasos siguientes: a. acoplamiento de una o varias clases de proteínas de la cola de bacteriófagos a un soporte, b. incubación del soporte acoplado con las proteínas de la cola de bacteriófagos con una muestra, c. dado el caso eliminación de la muestra y de las bacterias de la muestra que no se han unido a la proteína de la cola de bacteriófagos, d. puesta en contacto de las bacterias unidas a la proteína de la cola de bacteriófagos con los bacteriófagos y/o proteínas de bacteriófagos unidos específicamente a las bacterias que se tienen que detectar, e. eliminación de los bacteriófagos y/o proteínas de bacteriófagos que no se han unido a bacterias, f. realización de la reacción de detección mediante un enzima acoplado a los bacteriófagos y/o proteínas de bacteriófagos de unión específica o mediante detección inmunológica.
Description
Detección e identificación de grupos de
bacterias.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la detección simultánea de diferentes bacterias,
que comprende los pasos siguientes: acoplamiento de una o varias
clases de proteínas de la cola de bacteriófagos a un soporte,
incubación del soporte acoplado con las proteínas de la cola de
bacteriófagos con una muestra, dado el caso eliminación de la
muestra y de las bacterias de la muestra que no se han unido a la
proteína de la cola de bacteriófagos, puesta en contacto de las
bacterias unidas a la proteína de la cola de bacteriófagos con los
bacteriófagos y/o proteínas de bacteriófagos unidos específicamente
a las bacterias que se tienen que detectar, eliminación de los
bacteriófagos y/o proteínas de bacteriófagos que no se han unido a
bacterias, realización de la reacción de detección mediante un
enzima acoplado a los bacteriófagos y/o proteínas de bacteriófagos
de unión específica o mediante detección inmuno-
lógica.
lógica.
La detección rápida y exacta de bacterias es
imprescindible para los controles de higiene y calidad de materias
primas y productos alimentarios procesados, así como para el control
de la higiene y calidad del agua doméstica e industrial y de la
calidad del agua de los lugares de baño públicos. Además, la
detección sirve para el seguimiento y optimización de procesos, así
como los controles de calidad en análisis medioambiental.
A pesar del enorme interés económico, hasta el
momento los procedimientos de análisis usados, como los métodos
"BAM" (Bacteriological Analytical Manual) requieren de mucho
tiempo, personal y equipamiento. Los gérmenes potencialmente
patógenos se enriquecen secuencialmente en medios selectivos y no
selectivos y se detectan en medios de cultivo apropiados. Por regla
general incluye controles bioquímicos y serológicos, de modo que el
procedimiento completo requiere de 3 a 4 días. Para determinados
estudios, por ejemplo, en el seguimiento de la higiene, puede ser
necesario detectar grupos enteros de bacterias en lugar de especies
particulares de bacterias. Aunque también puede ser importante que,
por ejemplo, la proporción de bacterias patógenas en un grupo sea
muy grande. Los ensayos sólo pueden ser realizados por personal
entrenado en microbiología, en laboratorios equipados
correspondientemente. Esto tiene como consecuencia que actualmente
las grandes empresas sólo analizan bacterias coliformes en sus
instalaciones, aunque envían fuera todos los ensayos necesarios,
entre otros la detección de gérmenes patógenos. La detección de
coliformes se emplea esencialmente como seguimiento de la higiene, y
por regla general se realiza mediante procedimientos clásicos de
cultivo y por tanto dura al menos dos días.
La detección de bacterias se realiza a partir de
muestras biológicas, la mayoría de veces con ayuda de una
combinación de métodos de cultivo. Especialmente para una
caracterización precisa se recurre además a la técnica de la
tipificación con fagos (en inglés:
"phage-typing"). De este modo se combinan los
métodos de cultivo con la sensibilidad de las bacterias frente a los
bacteriófagos de tipificación. Los bacteriófagos se emplean desde
hace unos 80 años en la tipificación con fagos, pudiéndose
determinar con ayuda de fagos de clasificación especiales cepas de
bacterias según esquemas estandarizados. Sobre una placa de agar una
capa gruesa de bacterias de la muestra a investigar, que se obtuvo
mediante el aislamiento de colonias individuales y a continuación el
crecimiento de las mismas, se cubre con suspensión de bacteriófagos
en agar blando. El resultado se obtiene tras incubación durante la
noche a la temperatura de crecimiento óptima para las bacterias, que
normalmente asciende a 37ºC en la mayoría de casos, mediante
recuento de las placas y los controles de la morfología de las
placas.
Los métodos alternativos más nuevos, sin
utilizar medios de cultivo, se basan sobretodo en tecnologías de ADN
y anticuerpos. En el enfoque mencionado en primer lugar las
bacterias se unen a filtros y se híbrida el ADN de las bacterias con
sondas de ADN apropiadas que emiten una señal de medida o bien el
ADN bacteriano amplificado se secuencia directamente por PCR. Por
ejemplo, la publicación de Bennet y col., Journal of Applied
Microbiology 1977, 83 259-265, trata sobre las
salmonelas, que mediante bacteriófagos específicos de las
salmonelas, que se inmovilizaron sobre un soporte, se pueden
enriquecer a partir de una muestra y detectarse por PCR.
En la patente WO 93/17129 se da a conocer un
procedimiento, con el que se detectan bacterias en una muestra,
uniéndose un bacteriófago a la bacteria que se tiene que detectar.
Los bacteriófagos se unen con una primera mitad de un par específico
de unión. La segunda mitad del par de unión está unido a un soporte.
La detección de las bacterias específicas se realiza entonces a
través de la unión de la primera y la segunda mitad del par de
unión, de manera que entonces las bacterias se detectan mediante un
marcador, que a su vez está acoplado al bacteriófago o al
soporte.
En la tecnología ELISA se unen bacterias o
partes de bacterias con ayuda de anticuerpos monoclonales y se
detectan mediante sondas enzimáticas que se acoplan a un anticuerpo
secundario. Ambos métodos requieren asimismo gastos técnicos
elevados y se debe realizar previamente un paso de enriquecimiento
para conseguir las 10^{4} a 10^{6} células por ml necesarias.
Con ello, el ahorro de tiempo en comparación con los métodos
convencionales es tan pequeño que los métodos mencionados apenas se
aplican.
El uso de bacteriófagos como
"bio-sorbentes" para la unión de las bacterias
que se tienen que detectar tiene algunas ventajas decisivas frente
al nuevo procedimiento. Los sistemas fagos-bacterias
han evolucionado en la naturaleza durante largos periodos de tiempo,
de manera que los fagos reconocen sus bacterias huésped de forma
altamente específica y con elevada afinidad de unión, incluso en
entornos complejos como los que existen en la naturaleza, e incluso
en productos alimenticios. Mediante el nuevo procedimiento descrito
aquí, resultan innecesarios los cultivos de enriquecimiento costosos
en tiempo en los que frecuentemente también se enriquecen gérmenes
no deseados para la detección, como por ejemplo cultivos vacuna. Sin
embargo, en los sistemas descritos hasta ahora para la detección de
bacterias basados en fagos, es desventajoso que la mayor parte de
veces reconozcan especies particulares de bacterias de forma
altamente específica y por tanto no se puedan utilizar para una
detección de grupos, familias o varias especies de bacterias.
Por eso, la invención se basa en el objetivo de
proporcionar un procedimiento de detección para bacterias con el
que se puedan detectar simultáneamente diferentes especies de
bacterias. Otro objetivo de la invención consiste en la preparación
de proteínas de la cola de bacteriófagos, que presentan una unión de
bacterias más ventajosa para el procedimiento de detección.
El objetivo se alcanza mediante el objeto
definido en las reivindicaciones de la patente.
La invención se explica mediante las siguientes
figuras.
La Fig. 1A y B muestra esquemáticamente una
detección específica para grupos. (1A): La proteína de la cola de
bacteriófagos (1) se une mediante la biotina (2) a la estreptavidina
(3) en una unión covalente con la matriz (4). Las bacterias de los
grupos que se tiene que reconocer (5) se unen específicamente a las
proteínas de la cola de bacteriófagos (1). (1B): Tras un paso de
lavado se detectan las bacterias unidas (5) mediante la misma
proteína de la cola de bacteriófagos (1), aunque esta vez se acopla
a un enzima (6), por ejemplo peroxidasa. hv significa la emisión de
señal que se puede seguir, por ejemplo, por absorción.
La Fig. 2A y B muestra esquemáticamente una
detección específica para grupos. (2A): La proteína de la cola de
bacteriófagos (1) se une mediante la biotina (2) a la estreptavidina
(3) en una unión covalente con la matriz (4). Las bacterias de los
grupos que se tiene que reconocer (5) se unen específicamente a las
proteínas de la cola de bacteriófagos (1).(2B): Tras un paso de
lavado se detectan las bacterias unidas (5) mediante bacteriófagos
específicos de cada cepa (7, 8, 9), que se acoplan con un enzima
(6), por ejemplo peroxidasa. hv significa la emisión de señal que se
puede seguir, por ejemplo, por absorción.
La Fig. 3A muestra la secuencia de ADN de las
fibras cortas de la cola (p12) de la cepa de fagos T4D (ID. SEC. Nº:
2). La Fig. 3 B muestra la secuencia de aminoácidos de esta variante
(ID. SEC. Nº: 1). La secuencia de ácidos nucleicos según ID. SEC.
Nº: 4 y la secuencia de aminoácidos según ID. SEC. Nº: 3 están
subrayadas. En la secuencia de ácidos nucleicos las mayúsculas
representan cambios de bases frente a la secuencia salvaje T4 p12
número de acceso Swiss-Prot. P10930).
La expresión "coliforme" usada aquí designa
un subgrupo de entero-bacterias que se caracterizan
por utilizar lactosa o expresar el enzima
\beta-galactosidasa.
La expresión "grupo de bacterias" usada
aquí designa una agrupación de determinadas bacterias que pueden
estar dentro de una familia, o un género o una especie, etc. aunque
también se pueden superponer.
La expresión "derivado" usada aquí designa
secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos, que frente a la
secuencia de comparación presentan modificaciones en forma de una o
varias deleciones, sustituciones, adiciones, inserciones y/o
inversiones.
La expresión "fragmentos" usada aquí
designa partes de secuencias de aminoácidos así como las secuencias
de ácidos nucleicos que codifican para estas secuencias de
aminoácidos, mientras presenten la función biológica de las
secuencias de aminoácidos según la invención.
Por eso un aspecto de la presente invención
consiste en la preparación de un procedimiento para la detección
simultánea de diferentes bacterias, que comprende los pasos
siguientes: acoplamiento de una o varias clases de proteínas de la
cola de bacteriófagos a un soporte, incubación del soporte acoplado
con las proteínas de la cola de bacteriófagos con una muestra, dado
el caso eliminación de la muestra y de las bacterias de la muestra
que no se han unido a la proteína de la cola del bacteriófago,
puesta en contacto de las bacterias unidas a la proteína de la cola
del bacteriófago con los bacteriófagos y/o proteínas de
bacteriófagos unidos específicamente a las bacterias que se tienen
que detectar, eliminación de los bacteriófagos y/o proteínas de
bacteriófagos que no se han unido a bacterias, realización de la
reacción de detección mediante un enzima acoplado a los
bacteriófagos y/o proteínas de bacteriófagos de unión específica o
mediante detección inmunológica.
Para el procedimiento según la invención se usan
proteínas de la cola de bacteriófagos, que son específicas para las
bacterias deseadas que se tienen que detectar. Las proteínas de la
cola de bacteriófagos son específicas para varias especies de
bacterias. Las bacterias que se tienen que detectar pueden ser
familias enteras de bacterias, uno o varios géneros completos de
bacterias, especies determinadas de bacterias de un género
bacteriano, especies determinadas de bacterias de varios géneros
bacterianos o similares. Las bacterias que se pueden detectar con el
procedimiento según la invención pueden proceder, por ejemplo, de la
familia de las Enterobakteriaceae. Con preferencia se detectan
bacterias del género Escherichia, Salmonella, Shigella,
Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Proteus, Serratia,
Morganella, Providencia, Yersinia, Hafnia y/o
Edwardsiella, con especial preferencia Escherichia,
Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter y/o Citrobacter.
Con preferencia las bacterias que se tienen que detectar son de las
especies, Escherichia spec., Salmonella spec., Shigella spec.,
Klebsiella spec., Enterobacter spec., Citrobacter spec., Proteus
spec., Serratia spec., Morganella spec., Providencia spec., Yersinia
spec., Hafnia spec., Edwardsiella spec. y/o Pseudomona
spec.
A modo de ejemplo, para el usuario, por ejemplo,
de la industria lechera o de bebidas, es irrelevante caracterizar
las contaminaciones bacterianas serológicamente y por cepas
específicas. Sólo es importante la información general, por ejemplo,
si en el transcurso de la producción aparecen gérmenes extraños en
la instalación o si los procesos de eliminación de gérmenes han
tenido éxito. Las bacterias coliformes sirven por regla general como
indicador de la higiene. Así, una forma de realización especial del
procedimiento según la invención es la detección de bacterias
coliformes, especialmente de los géneros Escherichia, Salmonella,
Shigella, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Proteus, Serratia,
Morganella, Providencia, Yersinia, y/o Hafnia
Edwardsiella.
Las proteínas de la cola de bacteriófagos que se
usan dependen de qué especies, grupos o familias de bacterias se
deban detectar. Para la detección específica de grupos según la
invención se emplean proteínas de la cola de bacteriófagos que
reconocen y se unen a receptores específicos de grupos. Así se puede
usar cualquier proteína de la cola del fago que presenta un espectro
de reconocimiento correspondiente. Son preferibles proteínas de la
cola de bacteriófagos de la familia Myoviridae, Podoviridae y
Siphoviridae, especialmente las proteínas cortas de la cola de fagos
de "fagos T pares", por ejemplo, T4, T2 o K3, especialmente las
proteínas cortas de la cola de fagos p12 de T4, p12 de T2 (número de
acceso GenBank X56555), p12 de K3 (véase Burda y col., 2000, Biol.
Chem., Vol. 381, pág. 255 - 258,) o las proteínas de la cola de
bacteriófagos del fago Felix 01, P1 o PB1. Se unen por ejemplo las
proteínas cortas de la cola de bacteriófagos de los fagos T4 (p12) y
P1 a coliforme, la proteína corta de la cola de fagos de Felix 01 a
salmonelas y la proteína corta de la cola de fagos de PB1 a
pseudomonas. Por ejemplo, el fago de salmonelas Felix 01
(F01) reconoce hasta el 99% de todas las salmonelas y se puede usar
para la detección de salmonelas de un grupo específico. Las
proteínas de la cola de bacteriófagos del PB1 se pueden usar para
una detección de pseudomonas de un grupo específico.
Cómo se deben unir las proteínas de la cola de
bacteriófagos con las bacterias individuales se explica aquí a modo
de ejemplo en los "fagos T pares", por ejemplo, T4, T2, K3. En
este grupo, en el lado del huésped hay dos componentes que son
reconocidos por los fagos: en primer lugar una proteína de
superficie específica para fagos individuales, en segundo lugar el
lipopolisacárido (LPS) que poseen todas las bacterias gram negativas
en forma modificada. Las fibras largas de la cola de los "fagos T
pares" juegan un papel en el reconocimiento específico de las
bacterias huésped, mientras el LPS sirve de receptor para las fibras
cortas de la cola. En los fagos T4 de E. coli se sabe que la
interacción específica con la bacteria huésped a través de las
fibras largas de la cola es irreversible, en cuanto las fibras
cortas de la cola también se hayan unido a la superficie de las
bacterias. La fibra corta de la cola no es responsable de la
especificidad precisa dentro del grupo de bacterias huésped y por
eso se puede intercambiar entre los diferentes "fagos T
pares".
Las fibras cortas de la cola, junto con los
"Tail Pins" toman parte en el llamado paso de "Pinnning",
en el que tiene lugar la unión irreversible del fago en LPS sobre la
superficie del huésped. Para la unión al LPS, p12 requiere una
estructura de heptoazúcares con al menos una glucosa \alpha unida,
como la que se encuentra en la zona del núcleo interno de la pared
celular de enterobacterias. Las diferentes fosforilaciones de los
azúcares que aparecen frecuentemente, la disponibilidad de
sustituciones con pirofosfatidiletanolamina o también las
ramificaciones de la región heptosa no parecen jugar ningún papel.
Aunque los lipoposacáridos de las cepas individuales de bacterias se
diferencian mucho en las cadenas laterales
O-específicas -lo que se utiliza para la
tipificación serológica- pero también en las regiones externas del
núcleo, la variancia en la zona interna del núcleo es mucho menos
acentuada. Todas las regiones del núcleo enterobacteriano presentan
a modo de ejemplo los dos siguientes azúcares: ácido
3-desoxi-D-mano-octurónico
(Kdo) y
L-glicero-D-mano-heptopiranosa
(Hep), que constituyen el siguiente oligosacárido característico en
la zona interna del núcleo:
La heptosa central está sustituida por regla
general en O3 y lleva entre otros en Escherichia coli, así
como en Salmonella entérica, Shigella spp., Hafnia spp.,
Citrobacter spp. y Erwinia spp. Una
\alphaD-glucosa unida en 1,3. En esa posición
Klebsiella, Proteus y Yersinia presentan o bien galactosa o una
N-acetilfucosamina y no son reconocidas por p12. Sin
embargo, Klebsiella es reconocida, por ejemplo, por la proteína
corta de la cola de bacteriófago del fago P1.
Las proteínas de la cola de bacteriófagos, sus
derivados, variantes o fragmentos se pueden producir y aislar
fácilmente en grandes cantidades por recombinación. Sin embargo,
para el procedimiento según la invención no sólo pueden usarse las
proteínas de la cola de bacteriófagos que se encuentran en la
naturaleza, sino también sus variantes. La expresión
"variantes" en el sentido de la presente invención significa
que las proteínas de la cola de bacteriófagos presentan una
secuencia de aminoácidos cambiada frente a la secuencia salvaje. Las
variante existentes en la naturaleza se pueden encontrar mediante
los procedimientos de screening habituales. Entre las variantes se
cuentan además proteínas de la cola de bacteriófagos preparadas
sintéticamente. Los polipéptidos preparados sintéticamente se pueden
preparar por ejemplo mediante mutagénesis dirigida o aleatoria.
Mediante la mutagénesis se pueden introducir modificaciones, que
pueden ser adiciones, deleciones, sustituciones, inversiones o
inserciones de aminoácidos. Las proteínas de la cola de
bacteriófagos pueden presentar además modificación química, como por
ejemplo mutilaciones o acetilaciones. Las modificaciones pueden
tener como resultado una especificad por el huésped modificada,
especialmente mejorada, y también una propiedad de unión con la
matriz mejorada, por ejemplo, incrementar o hacer irreversible la
unión de las bacterias a las proteínas de fagos aisladas, para
mejorar las posibilidades de lavado.
Además, en un procedimiento de detección se
pueden emplear una o varias proteínas de la cola de bacteriófagos,
si las bacterias que se tienen que detectar no se pueden detectar
mediante una única proteína de la cola del bacteriófago. Por
ejemplo, las proteínas cortas de la cola de bacteriófagos del fago
T4 (p12) y P1 que poseen un espectro de huésped insignificantemente
distinto se pueden usar para detectar simultáneamente, además de los
géneros de bacterias Escherichia, Salmonella, Shigella,
Citrobacter y Erwinia reconocidos por ambas proteínas de la
cola de bacteriófagos, el género Hafnia reconocido solamente por T4
p12, y los géneros Klebsiella y Enterobacter sólo
reconocidos por la proteína corta de la cola de bacteriófagos del
fago P1. Además, puede ser ventajoso para la detección de salmonelas
utilizar la proteína corta de la cola de fagos de Felix 01 con otras
proteínas de la cola de bacteriófagos, ya que hasta ahora se han
descrito 2500 serovares de salmonelas (subtipos de bacterias que
pueden ser diferentes según las características serológicas, por
ejemplo, variaciones de LPS en el antígeno O). Las proteínas de la
cola de bacteriófagos que se usan para la detección dependen
finalmente de qué especies, grupos o familias de bacterias se
deban
detectar.
detectar.
Con preferencia, la proteína de la cola de
bacteriófagos es una variante de la proteína salvaje p12 según ID.
SEC. Nº: 1, con especial preferencia según ID. SEC. Nº: 3. La
invención describe además las secuencias de ácidos nucleicos según
ID. SEC. Nº: 2 y 4.
ID. SEC. Nº: 1 representa la secuencia de
aminoácidos de la variante de p12 que existe en la naturaleza,
llamada T4D p12. Esta proteína de la cola de bacteriófagos presenta
una estabilidad muy elevada frente al calor (Punto medio de
desnaturalización: 78ºC) y los medios desnaturalizantes químicos
(Burda y col., 2000, Biol. Chem., Vol. 381, pág. 255 - 258).
Sorprendentemente se ha encontrado que un
fragmento resistente a la proteasa de esta variante p12, se une
aproximadamente 10 veces más rápido a las células bacterianas en
comparación con las proteínas p12 completas. Además, la variante p12
completa se descompone mediante la digestión de la proteasa del
extremo N sensible a la temperatura, de manera que el fragmento
resistente a la proteasa presenta, entre otras cosas, una gran
estabilidad a largo plazo. La secuencia de aminoácidos del fragmento
resistente a la proteasa se indica en ID. SEC. Nº: 3, la secuencia
de ácidos nucleicos en ID. SEC. Nº: 4. Un aspecto de la presente
invención describe la secuencia de aminoácidos según ID. SEC. Nº: 3
o sus derivados, y la secuencia de ácidos nucleicos según ID. SEC.
Nº: 4 o sus derivados. Otro aspecto de la presente invención
describe además fragmentos y sus derivados de ID. SEC. Nº: 1, con
preferencia con la secuencia de residuos de aminoácidos
1-500, 1-450,
40-500, 40-450,
270-400, 270-390,
280-400 y 280-390, con especial
preferencia el fragmento según la ID. SEC. Nº: 3, así como las
secuencias de ácidos nucleicos que codifican las respectivos
fragmentos y derivados.
Otro aspecto de la presente invención describe
anticuerpos poli- y monoclonales frente a la secuencia de
aminoácidos según ID. SEC. Nº: 3.
Para la detección según la invención, las
proteínas de la cola de bacteriófagos se inmovilizan sobre
estructuras de soporte apropiadas, por ejemplo, placas de
microtitración, aros de ensayo, portaobjetos, obleas, materiales de
filtro o cámaras de células de infiltración. Las estructuras de
soporte pueden consistir, por ejemplo, en poliestireno,
polipropileno, policarbonato, PMMA, acetato de celulosa,
nitrocelulosa, vidrio, obleas de silicio. La inmovilización se puede
conseguir, por ejemplo, por adsorción o enlace covalente. Es
importante una inmovilización funcional, es decir, pese a la unión
con el material de soporte, las proteínas de la cola de
bacteriófagos disponen de estructuras accesibles para las
bacterias.
Para la supresión de una reacción inespecífica
de las bacterias que se tienen que investigar con los materiales de
soporte se puede realizar un bloqueo con albúmina sérica bovina o
Tween 20 o similares de las sustancias, por ejemplo Milch en polvo,
conocidos en la técnica ELISA. Además, para aumentar la eficiencia
de la adsorción, los sistemas de soporte se pueden recubrir
previamente con proteínas apropiadas (por ejemplo, anticuerpos
específicos frente a proteínas de fagos o proteínas inespecíficas,
como por ejemplo albúmina sérica bovina), péptidos, sacáridos (por
ejemplo, mono-, oligo-, o polisacáridos) o detergentes (por ejemplo,
Tween 20 u octilglucósido). Estos recubrimientos se pueden realizar
por ejemplo o bien durante la noche a una temperatura en el
intervalo de 4-20ºC o en 2-4 h a
30-65ºC. A continuación se extrae el líquido
sobrante y la estructura de soporte se seca a aproximadamente
60-70ºC. Por un lado, el recubrimiento base debe
garantizar una adsorción de las proteínas de la cola de
bacteriófagos y por otro lado debe impedir una adsorción
inespecífica de las bacterias estudiadas en la estructura de
soporte, para aumentar la eficiencia del ensayo.
Las proteínas de la cola de bacteriófagos se
disponen junto al recubrimiento base. Para ello se aplica una
disolución acuosa tamponada de las proteínas de la cola de
bacteriófagos sobre la estructura de soporte
pre-tratada. Tras la adsorción, por ejemplo a
4-20ºC durante la noche o a 30-65ºC
durante 2-4 h, se extrae la disolución de
recubrimiento y se seca la estructura de soporte como se describe
arriba. Para aumentar la eficiencia del recubrimiento se puede
realizar posteriormente una fijación covalente de las proteínas de
la cola de bacteriófagos con crosslinkers como por ejemplo
glutaraldehído.
La inmovilización de proteínas de la cola de
bacteriófagos en el material de soporte mediante adsorción se puede
realizar por incubación de una disolución de fagos en tampón acuoso,
por ejemplo Tris 100 mM pH 7.3 o fosfato sódico 100 mM pH 7.5,
durante varias horas o durante la noche a 5ºC hasta 45ºC, con
preferencia a 15ºC hasta 37ºC, con especial preferencia a 20ºC hasta
37ºC, en el mejor de los casos a temperatura ambiente.
Además, las proteínas de la cola de
bacteriófagos no se tienen que inmovilizar directamente sobre el
soporte, sino que se pueden unir a polipéptidos que se inmovilizan
por su parte sobre el soporte. Estos polipéptidos pueden ser
anticuerpos, lectinas, receptores o anticalinos específicos para las
proteínas de la cola de bacteriófagos. Además, las proteínas de la
cola de bacteriófagos pueden estar unidas a sustancias de bajo peso
molecular, por ejemplo biotina, para unirse a polipéptidos, por
ejemplo estreptavidina, a través de estas sustancias de bajo peso
molecular, que por su parte se han inmovilizado sobre el soporte. De
este modo los otros polipéptidos se pueden unir al soporte, como se
describe anteriormente para las proteínas de la cola de
bacteriófagos.
Mediante el acoplamiento covalente las proteínas
de la cola de bacteriófagos se pueden acoplar, por ejemplo, mediante
grupos amino o grupos carboxilo primarios en materiales de soporte
ya activados por el fabricante, por ejemplo placas de microtitración
de Nunc, Xenobind o Costar, mediante condiciones estándar, por
ejemplo -NH2, mediante cloruro de cianurilo (Russian Chemical Rev.,
1964, 33: 92-103), o -COO^{-} mediante EDC
(1-etil-3'[3'dimetilaminopropil]carbodiimida
(Anal. Biochem. 1990, 185: 131-135). Además,
los materiales de soporte se pueden activar con procedimientos
apropiados. Una posibilidad, que es preferible a causa de la
aplicabilidad para un amplio espectro de materiales de soporte, es
la silanización del material de soporte. Por ejemplo, se puede
realizar la silanización en poliestireno mediante pirólisis de
llama. A continuación se aplican adhesivos apropiados que permiten
un acoplamiento a través de, por ejemplo, grupos amino o carboxilo
primarios.
Para la unión de las bacterias que se investigan
sobre las proteínas de la cola de bacteriófagos inmobilizadas, la
muestra de estudio en forma acuosa se pone en contacto y se incuba
con las proteínas de la cola de bacteriófagos. La incubación se
realiza en un intervalo de temperatura de 4 a 90ºC, con preferencia
a una temperatura en el intervalo de 4 a 45ºC, con especial
preferencia a una temperatura en el intervalo de 15 a 37ºC, en el
mejor de los casos a una temperatura en el intervalo de 20 a 37ºC,
especialmente a temperatura ambiente, durante 6 horas, con
preferencia hasta 4 horas, con especial preferencia 2 horas, en
especial 1 hora, en el mejor de los casos 1 a 20 minutos. Por
ejemplo, la incubación se puede realizar en 2 a 120 min a 4ºC hasta
37ºC, con preferencia durante 20 a 30 minutos a 25ºC o 37ºC, con
especial preferencia durante 35 minutos a 37ºC. Tras el
reconocimiento específico y la unión estable de las bacterias, el
material no unido se puede eliminar por lavado con agua tampón, por
ejemplo, con PSB p PBS-Tween, con preferencia a
valor de pH neutro, por ejemplo en fosfato sódico 50 mM pH 7,0. Al
tampón usado se pueden añadir, dado el caso para el aumento de la
eficiencia de lavado, detergentes, por ejemplo Tween 20, Tritón X
100 o agentes caotrópicos, por ejemplo, clorhidrato de guanidinio o
urea. Este paso de lavado se puede realizar varias veces,
dependiendo del material de
ensayo.
ensayo.
Para la detección de las bacterias unidas a las
proteínas de la cola de bacteriófagos se usan bacteriófagos o
proteínas de la cola de bacteriófagos. Para la detección se pueden
usar bacteriófagos específicos o una combinación de diferentes
bacteriófagos, cuando se deben detectar específicamente una o varias
especies de bacterias. Por ejemplo, las bacterias coliformes
existentes en una muestra se unen mediante las proteínas de la cola
de bacteriófagos inmovilizadas. Mediante bacteriófagos específicos
se pueden detectar especies particulares de bacterias o mediante una
combinación de diferentes bacteriófagos se pueden detectar varias
especies de bacterias. Con especial preferencia se usan que se han
inmovilizado en la matriz para unir las bacterias que se tiene que
detectar. Para la detección al anticuerpo, bacteriófago o proteína
de la cola de bacteriófagos se le acopla un marcador, por ejemplo
FITC, peroxidasa o fosfatasa alcalina, pudiéndose seguir el
desarrollo de la señal del marcador tras añadir un sustrato
fotométrico. Los genes para la proteína de la cola de bacteriófagos
se pueden clonar en vectores de expresión apropiados y de este modo
se pueden modificar adicionalmente según la aplicación, por ejemplo,
mediante la fusión con un enzima de detec-
ción.
ción.
Según sea necesario, se detecta por ejemplo por
fluorescencia, luminiscencia, absorción o dicroísmo circular,
conductividad o variaciones de capacidad de las muestras respectivas
en los correspondientes aparatos de medida estándar. Para una
determinación exacta de la concentración de bacterias se puede
realizar una recta de calibración con las correspondientes moléculas
estándar.
La detección de las bacterias unidas a las
proteínas de la cola de bacteriófagos se puede realizar además
usando un ensayo colorimétrico. Así se detecta, por ejemplo, el
NADH, la actividad \beta-galactosidasa o el fosfato
inorgánico. Estos ensayos permiten la detección de al menos 10^{4}
células por ml, mediante el uso de colorantes de fluorescencia la
sensibilidad se puede mejorar hasta 10^{2} a 10^{3} células por
ml.
Los ensayos colorimétricos pueden ser iguales
para todas las bacterias que se estudian, aunque también pueden ser
específicos para determinadas combinaciones de bacterias/ proteínas
de la cola de bacteriófagos. La selección del marcador, por ejemplo,
del enzima empleado o el marcador de fluorescencia se puede ajustar
a los respectivos géneros o especies de bacterias estudiados.
Por lo tanto, otro aspecto de la invención se
refiere a un kit para la detección de bacterias, que comprende un
soporte con proteínas de la cola de bacteriófagos inmovilizadas y
las disoluciones necesarias con los reactivos de ensayo para la
detección de las bacterias unidas. Los soportes pueden ser todos los
descritos anteriormente, en los que se inmovilizan las proteínas de
la cola de bacteriófagos como se describe anteriormente. Las
disoluciones con los reactivos de ensayo se corresponden asimismo
con las que se han descrito para la detección de bacterias en el
procedimiento según la invención. El kit puede contener además, dado
el caso, disoluciones de lavado, así como los enzimas o detergentes
necesarios para la apertura de la membrana bacteriana.
Los ejemplos siguientes explican la invención y
no se deben considerar limitantes. Mientras no se indique lo
contrario, se usan métodos estándar de biología molecular, como por
ejemplo, los descritos por von Sambrook y col., 1989, Molecular
cloning: A Laboratory Manual 2ª edición, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York.
Ejemplo
1
T4D p12, K3 p12 y T2 p12 se aislaron y clonaron
como se describe en Burda y col., 2000, Biol. Chem., Vol. 381, pág.
255 258. T4D p12 se limpió correspondientemente y se empleó con
adyuvante de Freud para la inmunización de conejos. El antisuero
policlonal obtenido reconoció tanto T4D p12 como dominios
resistentes a la proteasa.
Ejemplo
2
Mediante digestión con proteasa a diferentes
temperaturas (véase Chen & King, 1991, Danner y col., 1993) se
obtuvieron los dominios de p12 resistentes a la proteasa y a
continuación se purificaron mediante una cromatografía de gel
filtración normal. La terminación N se determinó por degradación de
Edman y se analizó la terminación C por espectroscopia de masas.
Para la secuencia de ADN de los dominios obtenidos se proyectaron
los primers discontinuos con un codón de inicio y uno de parada. En
un PCR normal con ADNc de la variante T4D p12 se amplificó ADNc de
los dominios resistentes a la proteasa y a continuación se clonó en
un vector. Este mutante se expresó a continuación en E. coli
BL21 DE3 como trímero nativo y se aisló de la fracción de membrana
por extracción con EDTA (véase Burda & Miller, 1999, Eur. J.
Biochem. 265, 771-778), realizándose las
extracciones en presencia de al menos EDTA 100 mM.
Ejemplo
3
Para ello se inmoviliza p12 (300 ng/pocillo en
150 \mul de PBS 100 mM (KH_{2}PO_{4} 4 mM, Na_{2}PO_{4}
16 mM, NaCl 115 mM); placa de 96 pocillos) sobre un sistema de
soporte, una placa de microtitración de poliestireno por adsorción a
37ºC en diferentes periodos de tiempo (1 h, 2 h, 4 h, 16 h, 48 h) y
a continuación el portador se bloquea con BSA 1%, Tween 20 0,5% en
PBS 100 mM durante 60 min. Con ello, se incubaron (60 min, 37º)
diferentes sustancias de muestra con bacterias (E. coli
spec., Citrobacter spec., en medio LB, Milch o Gülle), a
continuación se eliminó la muestra mediante lavado con PBS
(3-4x con PBS 100 mM, Tween 20 0,5%, cada 250
\mul para medio LB, Milch, para Gülle 4-6x)
y las bacteria unidas se detectaron mediante la propia
\beta-galactosidasa bacteriana con
\beta-gal-luminol (Tropix, Applied
Biosystems) según las indicaciones del fabricante. El ensayo
permite, según la selección del sustrato, una sensibilidad por
debajo de 100 células/ml en total en menos de 4 horas.
Ejemplo
4
Para ello se inmoviliza p12 (300 ng/pocillo en
150 \mul de PBS 100 mM (KH_{2}PO_{4} 4 mM, Na_{2}PO_{4} 16
mM, NaCl 115 mM); placa de 96 pocillos) sobre un sistema de soporte,
una placa de microtitración de poliestireno por adsorción a 37ºC en
diferentes periodos de tiempo (1 h, 2 h, 4 h, 16 h, 48 h) y a
continuación el portador se bloquea con BSA 1%, Tween 20 0,5% en PBS
100 mM durante 60 min. Con ello, se incubaron (60 min, 37º)
diferentes sustancias de muestra con bacterias (E. coli
spec., Citrobacter spec., en medio LB, Milch o Gülle), a
continuación se eliminó la muestra mediante lavado con PBS
(3-4x con PBS 100 mM, Tween 20 0,5%, cada 250 \mul
para medio LB, Milch, para Gülle 4-6x). A
continuación se acopló la proteína de la cola de fagos biotinilada
con peroxidasa acoplada con estreptavidina. Este complejo se
introdujo en las bacterias unidas y se incubó durante periodos de
tiempo diferentes (10 min, 20 min, 30 min, 60 min). Tras lavar,
3-4x con PBS 100 mM, Tween 20 0,5%, cada 250 \mul,
se detectaron las bacterias unidas usando el kit ECL de Amersham
según las indicaciones del fabricante. De esta manera se detectaron
por debajo de 1000 células por ml.
<110> PROFOS GmbH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Detección e identificación de grupos
de bacterias
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PRO-002 PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<140> XX
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-02-01
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patent in ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 527
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago T4D
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1578
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago T4D
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 317
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: fragmento de polipéptido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 951
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: ADN
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (10)
1. Procedimiento para la detección simultánea de
diferentes bacterias, que comprende los pasos siguientes:
- a.
- acoplamiento de una o varias clases de proteínas de la cola de bacteriófagos a un soporte,
- b.
- incubación del soporte acoplado con las proteínas de la cola de bacteriófagos con una muestra,
- c.
- dado el caso eliminación de la muestra y de las bacterias de la muestra que no se han unido a la proteína de la cola de bacteriófagos,
- d.
- puesta en contacto de las bacterias unidas a la proteína de la cola de bacteriófagos con los bacteriófagos y/o proteínas de bacteriófagos unidos específicamente a las bacterias que se tienen que detectar,
- e.
- eliminación de los bacteriófagos y/o proteínas de bacteriófagos que no se han unido a bacterias,
- f.
- realización de la reacción de detección mediante un enzima acoplado a los bacteriófagos y/o proteínas de bacteriófagos de unión específica o mediante detección inmunológica.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
acoplándose las proteínas de la cola de bacteriófagos al soporte
mediante adsorción, enlace químico o mediante otras proteínas.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 2, uniéndose las proteínas de la cola de
bacteriófagos biotiniladas y mediante estreptavidina o variantes
estreptavidina/avidina.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, siendo las proteínas de la cola de
bacteriófagos T4 p12, T2 p12, K3 p12 o las proteínas cortas de la
cola de bacteriófagos de los fagos Felix 01, P1 o PB1 o sus
derivados o fragmentos.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, presentando las proteínas de la cola de
bacteriófagos la secuencia de aminoácidos según ID. SEC. Nº:1 ó
3.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, presentando modificaciones las proteínas de
la cola de bacteriófagos.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6, reconociendo las proteínas de la cola de
bacteriófagos de una única especie o varias especies de fagos, al
menos dos especies y/o géneros de bacterias diferentes.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, siendo el soporte una placa de
microtitración, un aro de ensayo, portaobjetos, obleas, material de
filtro o una cámara de células de infiltración y componiéndose de
poliestireno, polipropileno, policarbonato, PMMA, acetato de
celulosa, nitrocelulosa, vidrio, obleas de silicio.
9. Uso del procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 8 para la detección de bacterias en medicina,
industria alimentaria y análisis alimentario, alimentación animal,
análisis de agua potable o medio ambiental.
10. Kit para la realización del procedimiento
según una de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende un soporte
con proteínas de la cola de bacteriófagos inmovilizadas, además los
bacteriófagos y/o proteínas de bacteriófagos que se unen
específicamente a las bacterias que se tienen que detectar y otros
reactivos de ensayo para la detección de las bacterias unidas.
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