CN102099371B - 新的噬菌体粘附蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合革兰氏阴性细菌的O-抗原的噬菌体粘附蛋白，其缺乏结合噬菌体和水解脂多糖的能力。本发明还涉及核酸分子，其包括编码本发明蛋白质的序列。另外，本发明涉及用来产生本发明噬菌体粘附蛋白的方法。本发明还涉及所述蛋白质的用途以及检测、纯化和富集细菌的方法。

Description

新的噬菌体粘附蛋白
技术领域
本发明涉及一种结合革兰氏阴性细菌O-抗原的噬菌体粘附蛋白，其缺少结合噬菌体和水解脂多糖的能力。本发明还涉及一种核酸分子其包括编码本发明蛋白质的序列。此外，本发明涉及产生本发明的噬菌体粘附蛋白的方法。本发明还涉及所述蛋白质的用途以及检测、纯化和富集细菌的方法。
发明背景
噬菌体是高度特异的病毒，其仅侵染细菌。侵染时，噬菌体利用粘着结构来与它们的细菌宿主结合。噬菌体的特异性由其自身的一系列蛋白质来定义，所述一系列的蛋白质对于与目标细胞的结合是重要的。噬菌体-细菌体系在自然界中已经进化了相当长的时间，因此噬菌体以高特异性的方式识别它们的宿主细菌，并且具有高水平的结合亲和性。
噬菌体特异地结合到细菌上是由于噬菌体粘附蛋白所引起的。噬菌体粘附蛋白特异地结合到位于细菌表面的不同的一群受体上。这些细菌表面受体可以为脂多糖成分，特别是革兰氏阴性细菌中的O-抗原或LPS核以及革兰氏阴性细菌表面的是荚膜多糖的K-抗原，革兰氏阳性细菌中的肽聚糖或磷壁酸或脂磷壁酸质成分，细菌的膜结合型蛋白，特殊细菌的突起物例如鞭毛、菌毛或伞部，或胞外成分例如被膜或粘液层，糖类，多糖基质，表面蛋白质层或细胞壁结合型蛋白。一些噬菌体粘附蛋白有酶活性，例如O-抗原或K-抗原结合蛋白，而另外一些没有酶活性，例如噬菌体粘附蛋白结合膜结合型细菌蛋白质。
脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌外膜的一部分，其由脂质A、核心区和O-抗原形成。O-抗原是细菌脂多糖最外表面暴露的部分，其由寡糖的重复单元形成，脂质A为锚定在外膜或革兰氏阴性细菌内的区域。与脂质A和核心区相比，O-抗原是细菌脂多糖中变化最多的部分。O-抗原结构中的巨大变化(几百种变体)提供了将对细菌的检测深入到血清群(serogroup)水平的一种根据。传统的细菌检测利用抗体来区分接近地相关菌株。例如，目前在本领域中，利用不同的抗血清已经将沙门氏菌属分为具有67种不同的O-抗原的46种血清群(一些血清群被定义为多于一种的O-抗原的组合)。大肠杆菌数据库(ECODAB；Stenutzetal.，2006，FEMSMicrobiol.Rev.30，382-403)列出了178种不同的O-抗原。通常通过利用大肠杆菌的抗血清的经典凝集方法来鉴定大肠杆菌的血清型。天然存在的噬菌体利用细菌表面上的不同的受体来吸附到细菌细胞上。
噬菌体粘附蛋白包括至少两个功能域，其中N-端区域与噬菌体结合，C-端区域与细菌表面的受体结合。当噬菌体粘附蛋白有酶活性，例如水解细菌的O-抗原或K-抗原时，该C-端区域也包含活性位点。然而，噬菌体粘附蛋白常包括多个域的模块式排列，经常可以观察到不同功能部分的同源性有不同。
在结合之后，结合O-抗原的噬菌体粘附蛋白显示出水解脂多糖O-抗原的水解活性。所述脂多糖的水解是噬菌体侵染时多糖层侵入过程中的一部分。涉及噬菌体侵染的另一个过程是所谓的“表面行走(surfacewalk)”过程。正在侵染的细菌进行所述的“表面行走”以找到适合于DNA注入的位于细菌表面的位点。上述两个生物学过程(多糖侵入和“表面行走”)均包括噬菌体的反复结合和释放。因此，所述噬菌体粘附蛋白和细菌表面的O-抗原的结合是由所述噬菌体粘附蛋白的水解活性所引起的可逆的结合。
高水平的结合亲和性使得噬菌体粘附蛋白可以用作“生物吸附剂”，实现无论是在自然界中存在的复杂环境中，还是在生物学样品例如食品中均可以特异性地结合细菌。
到目前为止，已经有不同的针对噬菌体粘附蛋白用作生物吸附剂的实际应用，例如检测和鉴定单一菌株或细菌群，或者纯化细菌细胞和细胞成分。
快速和准确的检测细菌是用来诊断和治疗人类和动物中的细菌传染，以及启动预防措施的第一主要步骤。另外，所述检测对于控制原料和已加工食品的卫生和质量是有用的，并且对于监控饮用水、工业用水和公共浴室用水的卫生和质量方面是有用的。此外，所述检测对于过程监控和最优化，以及环境分析中的质量控制也是有用的。
EP1198713A2和EP1356080A1描述了用于检测和鉴定单一菌株和细菌群的方法，其中将整个噬菌体或噬菌体蛋白质偶联在支撑物上。在对偶联的噬菌体或噬菌体蛋白质与测试样品进行温育后，可以检测出结合到噬菌体或噬菌体蛋白质上的样品中的细菌。
当用在微生物检测体系时，在细菌检测和鉴定方面，噬菌体粘附蛋白提供了大量优于其它生物吸附剂(例如抗体)的优点，例如优异的特异性和出众的结合性。特异性越高越可以降低假阳性和假阴性的数量，并且目标结合性越好可以提供的信号比噪音的比值越好。另外，噬菌体粘附蛋白可以被固定于任何表面并且可以容易地与其它分子(例如荧光标记)偶联。已经证实了噬菌体粘附蛋白在多种不同的应用中可以提供良好的表现，即使是面对要求最为严格和复杂的食品领域。
此外，细菌细胞和细胞成分的纯化对于几乎任何后续加工、分析或细胞成分的分离均是非常重要的。EP1399551A2描述了用于纯化细菌细胞和细胞成分的方法，其中含有细菌细胞或细胞成分的样品与整个噬菌体或噬菌体蛋白质接触。然后，所述细菌细胞或细胞成分以及噬菌体或噬菌体蛋白质的样品与固体支撑物一起温育。温育之后，固体支撑物可以从样品中分离，从而也将细菌细胞或细胞成分分离，该细菌细胞或细胞成分结合在噬菌体或噬菌体蛋白质上，而噬菌体或噬菌体蛋白质结合在固体支撑物上。
如EP1399551A2所述借助噬菌体或噬菌体蛋白质对细菌细胞和细胞成分进行纯化，除了其它优点之外，该方法还可以自动地进行，并且因此可以整合到自动分析或分离方法(例如质粒的纯化)中。
然而，在天然存在的噬菌体或噬菌体蛋白质以及细菌之间存在结合平衡，这归因于由噬菌体粘附蛋白的水解活性而产生的噬菌体粘附蛋白的可逆的结合。这个效果降低了这类基于噬菌体的细菌分析方法的灵敏度。
在本领域中已知的基于噬菌体的细菌分析方法中，噬菌体粘附蛋白通常是非常大的蛋白，由多于1000个氨基酸的多肽链构成，其中所述噬菌体粘附蛋白由提供不同功能的数个结构部分组成。噬菌体粘附蛋白的这种大小和数个结构部分的特点导致难以表达、纯化，分离并且保存所述的噬菌体粘附蛋白。噬菌体粘附蛋白的模块区域排列还具有对蛋白酶解敏感的风险，蛋白酶可以在噬菌体粘附蛋白的不同功能模块之间降解。这样的蛋白酶降解引起噬菌体粘附蛋白性质的变化，并伴有蛋白质活性的丧失。
因此，本发明的目的在于提供噬菌体粘附蛋白，其用于更有效地结合、富集、移除、捕获和检测革兰氏阴性细菌。
在权利要求书中限定的发明主题解决了上述目的。
附图说明
下面的附图用来说明本发明。
图1为示出大肠杆菌O111:B4的LPS的化学结构的示意图。标记出代表LPS的三个部分，即：脂质A、核心区和O-抗原，n＝重复单元的数量；Hep＝L-甘油-D-甘露糖-庚糖；Gal＝半乳糖；Glc＝葡萄糖；KDO＝2-酮基-3-脱氧辛酸；NGa＝N-乙酰基-半乳糖胺；NGc＝N-乙酰基葡糖胺。
图2示出了P22尾部刺突(tailspike)和Det7尾部刺突(SBP1)的氨基酸序列的比对。相同的氨基酸残基用“*”表示，具有密切相关侧链的氨基酸残基用“:”表示，不太密切相关的氨基酸残基用“.”表示。两个序列之间显示高度同源性的氨基酸序列用下划线标出。用黑体字体指出Det7尾部刺突的S152，其为N-端截短变体(N-terminallytruncatedvariant)的第一个氨基酸残基，参与活性位点的三个氨基酸残基用斜黑体来表示。
图3示出了ε15尾丝和Det7ORF790公认尾部蛋白(SBP2)的氨基酸序列的比对。相同的氨基酸残基用“*”表示，具有密切相关侧链的氨基酸残基用“:”表示，不太密切相关的氨基酸残基用“.”表示。两个序列之间显示高度同源性的氨基酸序列用下划线标出。用黑体字体指出Det7ORF790公认尾部蛋白的S252，其为N-端截短变体的第一个氨基酸残基。参与活性位点的D485用斜黑体来表示。
图4示出了P22尾部刺突和噬菌体14尾部刺突的氨基酸序列的比对。相同的氨基酸残基用“*”表示，具有密切相关侧链的氨基酸残基用“:”表示，不太密切相关的氨基酸残基用“.”表示。两个序列之间显示高度同源性的氨基酸序列用下划线标出。用黑体字体指出噬菌体14尾部刺突的K108，其为N-端截短变体的第一个氨基酸残基。参与失活作用的酸性氨基酸残基E171、D433和D435用斜黑体来表示。
图5示出了ε15尾丝和O157_BP1的氨基酸序列的比对。相同的氨基酸残基用“*”表示，具有密切相关侧链的氨基酸残基用“:”表示，不太密切相关的氨基酸残基用“.”表示。两个序列之间显示高度同源性的氨基酸序列用下划线标出。用黑体字体指出O157_BP1的V163，其为N-端截短变体的第一个氨基酸残基。参与活性位点的D463用斜黑体来表示。
图6示出了HK620尾部刺突和O111_BP1的氨基酸序列的比对。相同的氨基酸残基用“*”表示，具有密切相关侧链的氨基酸残基用“:”表示，不太密切相关的氨基酸残基用“.”表示。两个序列之间显示高度同源性的氨基酸序列用下划线标出。用黑体字体指出O111_BP1的K108，其为N-端截短变体的第一个氨基酸残基。与酶失活相关的D204、D277、D302、D332、E337、D345、E354、E357、E415、D471、E476、D477、E482和D492用斜黑体来表示。
图7为银染色的Tris-Tricin梯度凝胶，其示出了wt-Det7ORF790与N-端截短且失活的变体Det7ORF790(Δ2-251，D485N)对列克星敦沙门氏菌(SalmonellaLexington)LPS的水解结果的比较。M为多肽分子量标记，LPS表示分离的、且未加入噬菌体尾部蛋白的脂多糖，wt表示分离的、且加入了有酶活性的野生型Det7ORF790尾部刺突的脂多糖，Det7ORF790(Δ2-251，D485N)表示分离的、且加入了具有失活突变D485N的N-端截短变体的脂多糖。各自的温育时间用其下方标注的小时数来表示。“1”表示噬菌体粘附蛋白的条带，“2”表示在制备LPS过程的蛋白质杂质的条带。
图8为考马斯染色的SDS凝胶，其示出了Det7尾部刺突SBP1的三个N-端截短失活变体在表达、可溶性和SDS稳定性组合测试中的结果。“M”表示的泳道为分子量标记，分子量的大小在左边的空白处给出。“P”表示不可溶的沉淀组分，“-”表示在上样之前未被煮沸的可溶的蛋白质组分。“+”表示在上样之前被煮沸的可溶的蛋白质组分。凝胶上方给出了表达温度30℃或37℃，以及样品经IPTG诱导(+IPTG)或未经IPTG诱导(-IPTG)。在右边的空白处表示出蛋白条带属于单体(-M)或抗SDS三聚体(-T)。泳道1～8表示突变体SBP1(Δ2-151)E406Q，道9～16表示突变体SBP1(Δ2-151)D437N，泳道17～24表示突变体SBP1(Δ2-151)D44ON。
图9为考马斯染色的SDS凝胶，其示出了融合了不同N-端标签的O157_BP1的截短和失活形式在表达、可溶性和SDS稳定性组合测试中的结果。“M”表示的泳道为分子量标记，分子量的大小在左边的空白处给出。“P”表示不可溶的沉淀组分，“-”表示在上样之前未被煮沸的可溶的蛋白质组分。“+”表示在上样之前被煮沸的可溶的蛋白质组分。所有的蛋白质均为截短Δ2-162，且具有氨基酸突变D463N。泳道2～4表示未经诱导的大肠杆菌蛋白质背景，泳道5～7表示具有N-端Strep-标签的O157BP1，泳道8～10表示具有N-端JS-标签的O157_BP1，泳道11～13表示具有N-端Cys-标签的O157_BP1，所有均经IPTG诱导。两个箭头标记出噬菌体粘附蛋白的SDS抗性寡聚形式(上箭头)和噬菌体粘附蛋白的单体形式(下箭头)的位置。
图10为示出利用Det7尾部刺突SBP1(Δ2-151；D437N)特异性捕获血清群D1和B的沙门氏菌属菌株的细菌细胞的结果的图。数据棒示出使用环氧偶联SBP1的磁珠(白色数据棒)或甲苯磺酰基偶联SBP1的磁珠(深色数据棒)从样品中捕获的细胞的百分数。
图11为示出利用O157_BP1按与ELISA形式类似的分析方法对大肠杆菌O157细胞进行检测的结果的图。用细菌细胞的比色检测数据(405nm处的吸光度)对样品中细菌细胞的浓度(微量滴定板每孔的cfu)作图。显示了在添加了1μg的O157_BP1作为特异的噬菌体粘附蛋白的样品温育90分钟后的颜色变化(黑色数据棒)，并用未添加O157_BP1的微量滴定板的背景吸光度作为对照(灰色数据棒)。
图12为银染色的Tris-Tricin梯度凝胶，其示出了wt-O111_BP1与N-端截短和失活变体O111_BP1(Δ2-107)对大肠杆菌O111LPS的LPS水解结果的比较，变体O111_BP1(Δ2-107)包括如下突变：D204N或D277N或E337Q或E415Q或D471N或E482Q或D492N或双突变E476Q/D477N。M为多肽分子量标记，LPS表示分离的、且未加入脂多糖噬菌体尾部蛋白的脂多糖，wt表示分离的、且加入了有酶活性的野生型O111_BP1的脂多糖。“+LPS”表示在样品中存在分离的脂多糖和噬菌体粘附蛋白，“-LPS”表示仅存在噬菌体粘附蛋白的对照。还标注了它们各自的温育时间(用小时表示)。
图13为SDS-聚丙烯酰胺凝胶，其示出了于37℃用蛋白酶K水解1小时Det7ORF790(D485N)的有限蛋白酶解的结果。“M”为分子量标记。道1～6表示经蛋白酶降解的结果，其中蛋白酶K以如下比例加入：蛋白酶K比噬菌体粘附蛋白的摩尔比为3×10-5∶1；3×10-4∶1；3×10-2∶1；0.3∶1或3∶1。“-1”标注出全长噬菌体粘附蛋白条带的位置，“-2”标注出经有限蛋白酶解产生的N-端截短变体的条带，其通过N-端测序被确定为Det7ORF790(Δ2-320；D485N)。
图14示出了使用经噬菌体粘附蛋白涂覆的磁珠或经抗体涂覆的磁珠捕获沙门氏菌属细胞的效率的比较。图中给出了利用Det7尾部刺突SBP1(Δ2-151，D437N)(黑色数据棒)或利用抗体涂覆的Dynabead抗沙门氏菌型(灰色数据棒)的相对捕获效率。“1”表示鼠伤寒沙门氏菌(SalmonellaTyphimurium)(血清群B)，“2”表示勃兰登堡沙门氏菌(SalmonellaBrandenburg)(血清群B)，“3”表示海德尔堡沙门氏菌(SalmonellaHeidelberg)(血清群B)，以及“4”表示肠炎沙门氏菌(SalmonellaEnteritidis)(血清群D1)。
图15为示出利用O111_BP1wt和O111_BP1(Δ2-107)的比色法大肠杆菌O26检测分析方法的结果的图。该oNPG(邻-硝基苯基-βD-吡喃半乳糖苷)测试利用大肠杆菌自身的β-半乳糖苷酶活性来进行检测。图中给出了利用O111_BP1涂覆的磁珠捕获细胞的信号除以利用未涂覆的磁珠捕获细胞的信号得到的信号比率(测定425nm处的吸光度)。黑色的数据棒代表用O111_BP1(Δ2-107)涂覆的磁珠，灰色数据棒代表用O111_BP1wt涂覆的磁珠。数据棒下方的数字表示来自不同的大肠杆菌O26菌株的PROFOS培养物的菌株编号。
图16示出了属于组P22、epsilon15和Det7的不同尾部刺突蛋白的比对结果。白色棒表示已经被除去的同源壳体结合域。灰色棒表示LPS-结合域(实验显示或预测的)。黑色棒表示三聚化的域。LPS-结合域中的黑线表示用于除去水解活性的突变的位点。基于同源性和在P22tsp、14tsp、O111Bp9、E15、O157BP1、Det7tspSBP1和Det7ORF790SBP2中的有效突变的位置，预测了新家族成员O103，O26和O145的突变区域(背景中的暗灰色区域)。
发明内容
用于本文的术语“噬菌体(bacteriophage或phage)”表示仅可以在细菌中感染并繁殖的病毒。
用于本文的术语“噬菌体粘附蛋白(bacteriophageadhesionprotein)”表示特异地结合细菌表面受体的噬菌体蛋白质。
噬菌体粘附蛋白至少包括两个功能域，其中一个功能域为与噬菌体结合的噬菌体结合域，第二个域与细菌表面受体结合。噬菌体粘附蛋白中的一些有酶活性，例如O-抗原或K-抗原结合蛋白，其它的一些没有酶活性，例如与膜结合型细菌蛋白结合的噬菌体粘附蛋白。具有酶活性的噬菌体粘附蛋白的酶活性位于与细菌表面受体结合的功能域中。该酶活性优先为水解活性。噬菌体粘附蛋白包括噬菌体尾部刺突(tailspike)、尾丝(tailfiber)、尾钉(tailpin)和参与结合细菌表面的其它尾部蛋白。然而，术语噬菌体粘附蛋白不包括不参与细菌结合的结构性尾部蛋白，例如尾鞘蛋白、铰链区的尾部蛋白、基片蛋白、颈蛋白。
用于本文的术语“细菌表面受体”是指脂多糖成分，特别是指革兰氏阴性细菌中的O-抗原或LPS核；革兰氏阳性细菌中的肽聚糖或磷壁酸或脂磷壁酸的成分；细菌的膜结合型蛋白；特殊的细菌突起物(protrusion)例如鞭毛、菌毛或伞毛；或胞外成分例如包膜或粘液层、糖类、多糖基质(polysaccharidematrices)、表面蛋白质层或细胞壁结合型蛋白。一些革兰氏阴性细菌在其表面也展示K抗原(为荚膜多糖)，其也属于术语“细菌表面受体”。
用于本文的术语“O-抗原”是指革兰氏阴性细菌的细胞表面上的菌体抗原。该O-抗原是细菌脂多糖在最外表面暴露的部分。其由重复的具有不同长度的寡糖单元组成，每个单元通常具有2～7个糖分子(sugarmoiety)。
用于本文的术语“野生型(wild-type)”或“wt”是指蛋白质或核酸天然存在的形式，其没有经人为介入修饰。术语野生型主要是指多肽或核酸序列。
用于本文的术语“噬菌体结合域(bacteriophagebindingdomain)”是指野生型噬菌体粘附蛋白的域，其负责噬菌体粘附蛋白与噬菌体的结合。
用于本文的术语“大肠菌(coliform)”是指肠细菌(enterobacteria)的亚组，其显著的特征在于它们分别利用乳糖以及表达酶β-半乳糖苷酶。
用于本文的术语“变体”是指核苷酸或氨基酸序列，其指野生型序列展示有以一个或多个氨基酸或核苷酸的缺失、取代、增加、翻转和/或化学修饰形式的修饰。例如，连接蛋白质的术语“Δ2-107”表示氨基酸2～107的缺失。原始蛋白质的氨基酸108是蛋白质变体在专性甲硫氨酸(起始密码子)之后的第一个氨基酸。就取代和突变而言，分别地，例如术语“D204N”表示将位于204位的原始氨基酸D替换为位于蛋白质变体中的204位的N，其中，除非另外说明，位置204是指在野生型序列中的氨基酸位置。
用于本文的术语“片段”是指氨基酸序列和核苷酸序列的一部分，其编码只要显示出根据本发明的包含氨基酸序列的多肽的生物学功能的那些氨基酸序列。
用于本文的术语“特异性(specificity)”是指噬菌体粘附蛋白仅识别和结合单一的属、种、或亚种、或细菌细胞的血清型或菌株、或细胞成分。
用于本文的术语“捕获(capture)”、“富集(enrichment)”或“纯化(purification)”是指从含水溶液中特异分离细菌细胞或细胞成分，例如从培养基(其中含有细菌细胞或细胞成分)，或存在于自然界中的环境样品，或生物学样品例如食品中特异分离。捕获、纯化或富集可以借助于固体支撑物来进行，例如磁性颗粒、玻璃颗粒、琼脂糖颗粒、胶乳颗粒、反应管、移液管吸头、微量滴定板、膜、过滤介质、色谱介质，或通过离心来进行。
用于本文的术语“细菌细胞成分”是指细菌的所有成分包括细菌脂多糖或细菌O-抗原或它们的片段，例如由重复的O-抗原单元形成的多糖或寡糖。
本发明涉及特异性结合革兰氏阴性细菌的O-抗原的噬菌体粘附蛋白，其中，与其野生型相比所述噬菌体粘附蛋白缺少与噬菌体结合的能力和水解脂多糖的能力。所述噬菌体粘附蛋白可以包括突变和/或缺失。所述缺失可以包括噬菌体结合域和/或酸性氨基酸突变为非酸性氨基酸，特别是1～7、1～6、1～5、1～4、1～3或1～2个酸性氨基酸突变为非酸性氨基酸，以及更具体的是一个酸性氨基酸突变为非酸性氨基酸。
本发明还涉及噬菌体粘附蛋白，其包含标志物分子(markermoiety)(优选生物素或链霉抗生物素)或标签(tag)(优选HA-标签、His-标签、Strep-标签、Avi-标签、Myc-标签、GST-标签、JS-标签或半胱氨酸-标签)。优选地，所述噬菌体粘附蛋白具有SEQIDNO：2、4、5、7、9、11～14、36～42、56或58的氨基酸序列。
本发明的噬菌体粘附蛋白
本发明的噬菌体粘附蛋白优选特异地结合革兰氏阴性细菌的O-抗原，并且与其野生型相比，其缺乏与噬菌体结合的能力以及显示出降低的水解脂多糖的能力。
尤其优选这样的噬菌体粘附蛋白，其与革兰氏阴性细菌特异性结合，所述革兰氏阴性细菌为下述包括人类或动物的治病菌株的细菌群(group)、科、属或种的细菌，例如：肠杆菌科(埃希氏菌属(尤其是大肠杆菌)、沙门氏菌属、志贺氏菌属、柠檬酸杆菌属、爱德华氏菌属、肠杆菌属、哈夫尼菌属、克雷伯氏菌属、摩根氏菌属、变形菌属、普罗威登斯菌属、沙雷氏菌属、耶尔森氏菌属)；假单胞菌科(假单胞菌属、伯克霍尔德氏菌属、寡养单胞菌属、希瓦氏菌属、鞘氨醇单胞菌属、丛毛单胞菌属)；奈瑟氏球菌属；莫拉氏菌属；弧菌属；气单胞菌属；布鲁氏菌属；弗朗西丝菌属；博德特氏菌属；军团菌属；巴尔通氏体属；考克斯氏体属；嗜血菌属；巴斯德氏菌属；溶血性曼氏杆菌属(Mannheimia)；放线杆菌属；加德纳氏菌属；螺旋体科(密螺旋体属和疏螺旋体属)；钩端螺旋体科；弯曲杆菌属；螺杆菌属；螺菌属；链杆菌属；拟杆菌科(拟杆菌属、梭杆菌属、普雷沃氏菌属；卟啉单胞菌属)。最优选特异结合大肠杆菌或沙门氏菌属的噬菌体粘附蛋白。尤其优选特异结合沙门氏菌属的噬菌体粘附蛋白，例如SEQIDNO：1、3、6和55的经修饰的蛋白质。优选特异结合大肠杆菌的噬菌体粘附蛋白有SEQIDNO：8、10、60、62、64、66、68、70、72和74的经修饰的蛋白质。
优选的噬菌体粘附蛋白来源于感染上述革兰氏阴性细菌的噬菌体的野生型噬菌体粘附蛋白，特别优选来自下组的噬菌体：短尾噬菌体科(podoviridae)、肌尾噬菌体科(myoviridae)和长尾噬菌体科(siphoviridae)，更具体来说优选的噬菌体为：P22、ε15、Sf6、HK620、T1、T5、T7、噬菌体14、gifsy、P2、phiV10、APSE-1、A1、A18a、ST104、ST64T、JK106或Gifsy。
进一步优选的噬菌体粘附蛋白来源于具有N-端同源性的噬菌体的野生型噬菌体粘附蛋白，即氨基酸序列的N-端部分，在多于至少50个连续的氨基酸残基上，与下列噬菌体的噬菌体粘附蛋白的序列同源性至少为30％，优选为60％，更优选为70％、80％、90％、95％和98％，上述噬菌体为：噬菌体P22、ε15、Sf6、HK620、T1、T7、噬菌体14、PhiV10、APSE-1、A1、A18a、ST104、ST64T、JK106、Det7、O157、O111或Gifsy，并且其与各噬菌体粘附蛋白在不涉及噬菌体结合的蛋白质的C-端部分的氨基酸序列上，同源性小于30％。还优选噬菌体粘附蛋白来源于具有C-端同源性的噬菌体的野生型噬菌体粘附蛋白，即氨基酸序列的C-端部分，在多于至少150个连续的氨基酸残基上，与下列噬菌体的噬菌体粘附蛋白的序列同源性至少为30％，优选为60％，更优选为70％、80％、90％、95％和98％，上述噬菌体为：噬菌体P22、ε15、Sf6、HK620、T1、T7、噬菌体14、PhiV10、APSE-1、A1、A18a、ST104、ST64T、JK106、Det7、O157、O111或Gifsy，并且其与各噬菌体粘附蛋白在不涉及噬菌体结合的蛋白质的N-端部分的氨基酸序列上，同源性小于30％。还优选的噬菌体粘附蛋白与下述噬菌体的噬菌体粘附蛋白在全部氨基酸序列上的序列同源性为至少30％，优选为60％或更优选为70％、80％、90％、95％、98％，上述噬菌体为：噬菌体P22、ε15、Sf6、HK620、T1、T7、噬菌体14、PhiV10、SPSE-1、A1、A18a、ST104、ST64T、JK106、Det7、O157、O111或Gifsy。
在本发明的一个实施方式中，噬菌体粘附蛋白与噬菌体P22或ε15具有如上所述的N-端同源性。优选的噬菌体粘附蛋白与SEQIDNO：53的p22尾部刺突的野生型噬菌体粘附蛋白具有如上所述的N-端同源性，或者与SEQIDNO：55的ε15侧尾丝(sidetailfiber)的野生型噬菌体粘附蛋白具有如上所述的N-端同源性。
特别优选的噬菌体粘附蛋白来源于表1列出的野生型噬菌体粘附蛋白。
表1：
噬菌体结合域的截短
本发明的噬菌体粘附蛋白优选与它们野生型相比是被截短的。特别的本发明的噬菌体粘附蛋白为N-端截短的。优选截去负责将噬菌体粘附蛋白结合至噬菌体的氨基酸残基。因此，优选的噬菌体粘附蛋白缺少噬菌体结合域。另一个优选的噬菌体粘附蛋白仅缺少噬菌体结合域的一部分，其中被截短的一部分噬菌体结合域对下述事实负责：即本发明的噬菌体粘附蛋白不能与噬菌体结合。因此，本发明噬菌体粘附蛋白的噬菌体结合域由于截短而失活。
为了确定噬菌体结合域是否由于野生型噬菌体粘附蛋白的截短而失活，可以用分离的噬菌体粘附蛋白来重组缺少各自噬菌体粘附蛋白的噬菌体颗粒。仅重组有包含功能性噬菌体结合域的噬菌体粘附蛋白的噬菌体产生侵染性的噬菌体颗粒，反之，重组有缺少噬菌体结合域或失活的噬菌体结合域的噬菌体粘附蛋白的噬菌体产生无侵染性的噬菌体颗粒。已经有文献针对P22尾部刺突描述了阻抑者tRNA控制下的噬菌体粘附蛋白进行的适合的分析(Schwarz和Berget，1989，J.Biol.Chem.26420112-20119，Schwarz和Berget，1989，Genetics121635-649)。
优选在N-端或C-端的截短，特别优选在N-端的截短。进一步优选截短约50～约400个范围的氨基酸残基，特别优选截短约100～约350个范围的氨基酸残基。截短的确切长度取决于各个噬菌体粘附蛋白中的噬菌体结合域。
一种确定待截短而使噬菌体结合域失活的氨基酸序列的长度的方法为分析目标蛋白质与本领域中其它序列已知的噬菌体粘附蛋白的同源性。本领域已知的噬菌体粘附蛋白的噬菌体结合域的适合的同源性为在至少50个连续的氨基酸残基上氨基酸序列的序列同源性至少为30％，优选为约60％，更优选为约70％、80％、90％、95％和98％，优选在N-端部分。本领域中已知的适合用于同源性分析的噬菌体粘附蛋白的实例为噬菌体P22、ε15、Sf6、HK620、T1、T7、噬菌体14、PhiV10、APSE-1、A1、A18a、ST104、ST64T、JK106、Det7、O157、O111或Gifsy的噬菌体粘附蛋白。例如，序列相似性可以利用在NCBI上的BLAST程序(BasicLocalAlignmentSearchTool，Altschul等人，JournalofMolecularBiology215，403-410(1990))来研究，通过blastp(蛋白质-蛋白质BLAST)运算法则并利用BLOSUM62评分矩阵。
多个蛋白质功能域通过无特殊功能的氨基酸残基彼此偶联。这样的氨基酸序列被称为接头。为了更准确确定用于截短功能域的序列，可以通过该序列各个部分的接头预测来进行。本领域技术人员知道如何寻找和预测域接头序列，例如George和Heringa，2003，ProteinEng.15，871-879或Bae等人，2005，Bioinformatics，21，2264-2270中所描述的。
本发明的另一个定位截短的方法为：进行噬菌体粘附蛋白的有限蛋白酶解，并随后对各更稳定的蛋白酶解产物优选N-端酶解产物进行测序。对于P22尾部刺突的描述参见Danner等人，1993，Eur.J.Biochem.2L5，653-661。
本发明优选的噬菌体粘附蛋白为野生型蛋白质Det7尾部刺突SBP1(Det7尾部刺突SBP1(野生型)；(SEQIDNO：1))的经修饰的尾部刺突蛋白。该Det7尾部刺突SBP1(野生型)是长度708个氨基酸残基的多肽，其与P22尾部刺突在其的C-端部分同源，相反在N-端部分没有发现同源性。从两个尾部刺突蛋白的比对可以明显看出C-端部分从Det7尾部刺突的氨基酸残基E160开始显示高度的同源性。因此，对于N-端截短，截短的最大长度为Δ2-159。本发明优选的噬菌体粘附蛋白Det7尾部刺突SBP1(Δ2-151，D437N)(SEQIDNO：2)显示的N-端截短从氨基酸残基2直到氨基酸151(Δ2-151)。另外的本发明的噬菌体粘附蛋白显示的截短是从氨基酸残基2直到氨基酸残基138最高至氨基酸残基158(Δ2-138最高至Δ2-158)。
本发明还优选的噬菌体粘附蛋白为Det7噬菌体ORF790的公认的尾部蛋白(Det7ORF790SBP2(野生型)；SEQIDNO：3)的经修饰的蛋白质。Det7ORF790SBP2(野生型)是长度为803个氨基酸残基的多肽，其与ε15尾丝在其C-端部同源，相反在N-端部分没有发现同源性。从两个尾部刺突蛋白的比对可以明显看出C-端部分从Det7_ORF790公认尾部蛋白的氨基酸残基N264开始显示高度的同源性。ε15尾丝与Det7ORF790的公认尾部蛋白相比显示C-端额外延长约300个氨基酸残基。因此，对于N-端截短根据序列同源性的比较，截短的最大长度明显为Δ2-263。然而根据Det7ORF790SBP2的有限的蛋白酶解，额外的截短、从氨基酸残基G321开始为SDS抗性片段和三聚体片段因此缺失最高至氨基酸残基K320也是可以的。优选噬菌体粘附蛋白Det7ORF790(Δ2-251；D485N)(SEQIDNO：4)和Det7ORF790(Δ2-320；D485N)(SEQIDNO：5)的N-端截短是从氨基酸残基2直到氨基酸残基251(Δ2-251)或从氨基酸残基2直到氨基酸残基320(Δ2-320)。根据接头预测分析，另外优选本发明的噬菌体粘附蛋白的截短是从氨基酸残基2直到氨基酸残基239最高至262(Δ2-239最高至Δ2-262)。
本发明还优选的噬菌体粘附蛋白为噬菌体14尾部刺突(噬菌体14尾部刺突(野生型)；SEQIDNO：6)的经修饰的蛋白质。噬菌体14尾部刺突是长度为586个氨基酸残基的多肽。噬菌体14尾部刺突特异地结合存在血清群C1的O-抗原的沙门氏菌属菌株。N-端部分与P22尾部刺突显示高度的同源性，相反在C-端部分没有发现同源性。从两个尾部刺突蛋白的比对可以明显看出显示高度同源性的N-端部分截止到噬菌体14尾部刺突的氨基酸残基R115。因此对于N-端截短，截短的最大长度为Δ2-114。本发明优选的噬菌体粘附蛋白噬菌体14尾部刺突(Δ2-107；D433N)(SEQIDNO：7)的N-端截短是从氨基酸残基2直到氨基酸残基107(Δ2-107)。
本发明还优选的噬菌体粘附蛋白为O157结合蛋白(O157_BP1(野生型)；SEQIDNO：8)经修饰后的蛋白质。该O157_BP1(野生型)是长度为875个氨基酸残基的多肽，其与ε15尾丝在其N-端部分同源，相反在C-端部分没有发现同源性。从两个尾部刺突蛋白的比对可以明显看出显示高度同源性的N-端部分截止到O157_BP1的氨基酸残基A219。因此对于N-端截短，截短的最大长度为Δ2-219。本发明优选的噬菌体粘附蛋白O157BP1(Δ2-162；D463N)(SEQIDNO：9)的N-端截短是从氨基酸残基2直到氨基酸残基162(Δ2-162)，这是通过接头预测分析找到的。另外本发明的噬菌体粘附蛋白的截短是从氨基酸残基2直到氨基酸残基149最高至191(Δ2-149最高至Δ2-191)。
本发明还优选的噬菌体粘附蛋白为O111结合蛋白(O111_BP1(野生型)，SEQIDNO：10)经修饰后的蛋白质。该O111BP1(野生型)是长度为645个氨基酸残基的多肽，其与HK620尾部刺突在其N-端部分同源，相反在C-端部分没有发现同源性。从两个尾部刺突蛋白的比对可以明显看出显示高度同源性的N-端部分截止到O111_BP1的氨基酸残基R115。因此对于N-端截短，截短的最大长度为Δ2-115。本发明优选的噬菌体粘附蛋白O111BP1(Δ2-107；D204N)(SEQIDNO：11)或O111BP1(Δ2-107；D277N)(SEQIDNO：12)的N-端截短是从氨基酸残基2直到氨基酸残基107(Δ2-107)。另外本发明的噬菌体粘附蛋白的截短是从氨基酸残基2直到氨基酸残基70最高至114(Δ2-69最高至Δ2-114)。
本发明还优选的噬菌体粘附蛋白为根据SEQIDNO：53的ε15侧尾丝的经修饰后的蛋白质。该ε15侧尾丝(野生型)是长度为1070个氨基酸残基的多肽。本发明优选的噬菌体粘附蛋白ΔNε15侧尾丝(Δ2-220；D449N)(SEQIDNO：56)的N-端截短是从氨基酸残基2直到氨基酸残基220(Δ2-220)。
本发明还优选的噬菌体粘附蛋白是根据SEQIDNO：60的2954_O103_E15的经修饰后的蛋白质。该2954_O103_E15(野生型)是长度为697个氨基酸残基的多肽，其与ε15侧尾丝在其N-端部分同源。本发明优选的2954_O103_E15的经修饰的蛋白质的N-端截短是从氨基酸残基2直到氨基酸残基161(Δ2-161)。
本发明还优选的噬菌体粘附蛋白是根据SEQIDNO：62的2956_O103_E15的经修饰后的蛋白质。该2956_O103_E15(野生型)是长度为697个氨基酸残基的多肽，其与ε15侧尾丝在其N-端部分同源。本发明优选的2956_O103_E15的经修饰的蛋白质的N-端截短是从氨基酸残基2直到氨基酸残基161(Δ2-161)。
本发明还优选的噬菌体粘附蛋白是根据SEQIDNO：64的2961_O103_E15的经修饰后的蛋白质。该2961_O103_E15(野生型)是长度为684个氨基酸残基的多肽，其与ε15侧尾丝在其N-端部分同源。本发明优选的2961_O103_E15的经修饰的蛋白质的N-端截短是从氨基酸残基2直到氨基酸残基161(Δ2-161)。
本发明还优选的噬菌体粘附蛋白是根据SEQIDNO：66的2959_O145_E15的经修饰后的蛋白质。该2959_O145_E15(野生型)是长度为711个氨基酸残基的多肽，其与ε15侧尾丝在其N-端部分同源。本发明优选的2959_O145_E15的经修饰的蛋白质的N-端截短是从氨基酸残基2直到氨基酸残基156(Δ2-156)。
本发明还优选的噬菌体粘附蛋白是NS2957_O145_P22的经修饰的蛋白质。SEQIDNO：68描述的NS2957_O145_P22的氨基酸序列是已经截短的野生型噬菌体粘附蛋白。SEQIDNO：68的氨基酸序列是通过截短N-端的从氨基酸残基2直到氨基酸残基107(Δ2-107)而获得的。各全长的野生型蛋白质在其N-端部分与p22尾部刺突同源。
本发明还优选的噬菌体粘附蛋白是根据SEQIDNO：70的2316_O026_E15的经修饰的蛋白质。该2316_O026_E15(野生型)是长度为873个氨基酸残基的多肽，其与ε15侧尾丝在其N-端部分同源。本发明优选的2316_O026_E15的经修饰的蛋白质的N-端截短是从氨基酸残基2直到氨基酸残基169(Δ2-169)。
本发明还优选的噬菌体粘附蛋白是根据SEQIDNO：72的2314_O026_P22的经修饰的蛋白质。该2314_O026_P22(野生型)是长度为718个氨基酸残基的多肽，其与p22尾部刺突在其N-端部分同源。本发明优选的2314_O026_P22的经修饰的蛋白质的N-端截短是从氨基酸残基2直到氨基酸残基107(Δ2-107)。
本发明还优选的噬菌体粘附蛋白是根据SEQIDNO：74的2625_O026_P22的经修饰的蛋白质。该2625_O026_P22(野生型)是长度为707个氨基酸残基的多肽，其与p22尾部刺突在其N-端部分同源。本发明优选的2625_O026_P22的经修饰的蛋白质的N-端截短是从氨基酸残基2直到氨基酸残基107(Δ2-107)。
发现缺少噬菌体结合域的噬菌体粘附蛋白显示出更快的表达速率，更高的纯化等级以及可以储存更长的时间。另外，噬菌体结合域的截短提供了产生噬菌体粘附蛋白的可能，而其无法以野生型被重组表达。例如，可以表达缺少噬菌体结合域的Det7ORF790(Δ2-251；D485Q)(SEQIDNO：4)，相反各自全长的野生型噬菌体粘附蛋白无法重组表达。
另外的，发现噬菌体结合域的截短使得噬菌体粘附蛋白与各自细菌的结合得到增强，例如Det7ORF790(Δ2-251；D485Q)(SEQIDNO：4)与Det7ORF790(全长；D485Q)相比或O111_BP1(Δ2-107；D204N)(SEQIDNO：11)与O111BP1(野生型)(SEQIDNO：10)相比。
进一步，发现本发明的噬菌体粘附蛋白噬菌体结合域的截短对各个噬菌体粘附蛋白的稳定性和/或可溶性具有正效果。因此，本发明的噬菌体粘附蛋白具有更高程度的长期稳定性。另外，它们聚集的能力下降。由于在技术应用中已知噬菌体粘附蛋白的聚集会降低活性的噬菌体粘附蛋白的量，因此本发明的噬菌体粘附蛋白在技术应用中更为有效。
水解脂多糖能力的降低
本发明的噬菌体粘附蛋白显示优选地降低使脂多糖水解活性失活的能力。优选，噬菌体粘附蛋白具有突变。所述突变优选属于野生型噬菌体粘附蛋白活性位点的酸性氨基酸残基的突变。优选本发明的噬菌体粘附蛋白与其野生型相比，包括1～7个酸性氨基酸残基(天冬氨酸(D)或谷氨酸(E))突变为非酸性氨基酸残基，特别优选1～6个、1～5个、1～4个、1～3个或1～2个酸性氨基酸残基突变为非酸性氨基酸残基。最为优选一个酸性氨基酸残基突变为非酸性氨基酸残基。所述非酸性氨基酸残基优选为天冬酰胺(N)、丙氨酸(A)或谷氨酰胺(Q)。特别优选天冬氨酸(D)到天冬酰胺(N)或丙氨酸(A)的突变和/或谷氨酸(E)到谷氨酰胺(Q)或丙氨酸(A)的突变。
噬菌体粘附蛋白水解脂多糖的能力可以通过LPS水解试验来确定，在试验中，显示不同LPS-变体的降解，所述LPS-变体携带被特异性噬菌体粘附蛋白结合的O-抗原变体。LPS的降解可以通过银染色的SDS-凝胶来观察，其中LPS的完整分子和片段以不同的迁移速度移动，所述片段是通过具有酶活性的噬菌体粘附蛋白对O-抗原进行水解之后产生的。另一分析方法是利用生色基质3，5-二硝基水杨酸对噬菌体粘附蛋白水解多糖和寡糖所产生的还原端进行定量(Danner等人，1993，Eur.J.Biochem.215，653-661)。测定O-抗原结合型噬菌体粘附蛋白的酶活性的另一可能性是：利用反相HPLC在酶促水解之前和之后分析底物寡糖和反应产物来定量荧光标记的寡糖(Baxa等人，1996，BiophysicalJournal，71.2040-2048)。可以利用这种分析方法对不同的噬菌体粘附蛋白水解脂多糖的能力进行比较。水解的时间跨度从几秒到几小时甚至到几天，这取决于噬菌体粘附蛋白的活性，以及分析过程中的温度。分析优选的时间跨度为1最高至48小时，以及温度的范围为从室温最高至37℃。本发明的噬菌体粘附蛋白显示降低的水解脂多糖的能力，与其野生型比较其残余的活性小于约1％，优选小于约0.1％，最优选小于约0.01％。对于显示LPS水解降低的噬菌体粘附蛋白的工业应用来说，重要的是，在检测细菌的捕获试验中，在细菌细胞或细胞成分的温育时间内各个噬菌体粘附蛋白的LPS水解水平低。优选在分析期间LPS水解小于约50％，优选小于约10％，最优选小于约1％。
功能分析是来比较野生型噬菌体粘附蛋白和失活的噬菌体粘附蛋白的捕获效率(细胞结合分析)。由于失活的噬菌体粘附蛋白结合它们各自的细菌宿主细胞，且没有释放，因此捕获效率优于具有酶活性的噬菌体粘附蛋白。
如果噬菌体结合域残基在N-端，所述氨基酸突变优选发生在接续该截短的约前500个N-端氨基酸残基内，特别优选在约50～约400个氨基酸残基内。如果噬菌体结合域残基在C-端，所述氨基酸残基突变优选发生在接续该截短的约前500个C-端氨基酸残基内，特别优选在约50～约400个氨基酸残基内。优选突变在噬菌体粘附蛋白的LPS结合域内进行。合适用于突变的氨基酸残基的减毒可以例如是基于同源性分析(例如，借助于比对)来预测，以及确定在其它噬菌体粘附蛋白中有效突变的位置，所述噬菌体粘附蛋白例如SEQIDNO：53的p22尾部刺突，SEQIDNO：55的ε15侧尾丝，SEQIDNO：1的Det7尾部刺突SBP1，SEQIDNO：3的Det7ORF790SBP2，SEQIDNO：6的噬菌体14尾部刺突，SEQIDNO：8的O157BP1，或SEQIDNO：10的EcoO111tsp。确定合适用于突变的氨基酸残基的基本步骤如图16所示。
本发明的噬菌体粘附蛋白Det7尾部刺突SBP1(Δ2-151，D437N)(SEQIDNO：2)，与Det7尾部刺突SBP1(野生型)相比，显示为D437突变。所述突变通过与P22尾部刺突蛋白进行比较的同源性分析而找到。P22尾部刺突蛋白具有三个属于酶的活性位点(由X-射线结构可知)的酸性氨基酸残基(Steinbacher等人，1996)。P22尾部刺突和Det7尾部刺突SBP1(野生型)的比对确定在Det7尾部刺突SBP1(野生型)中E404、D437和D440对应于活性位点的氨基酸残基。因此，本发明另外的噬菌体粘附蛋白具有E404到任何除D之外的其它氨基酸残基的突变，或者D437或D440到任何非酸性氨基酸残基的突变，其中优选E到Q以及D到N的突变。优选的噬菌体粘附蛋白如SEQIDNO：13所示。
本发明的噬菌体粘附蛋白Det7-ORF790SBP2(Δ2-251；D485N)(SEQIDNO：4)显示出D485突变为N。本发明另外的噬菌体粘附蛋白显示为D485突变为任何非酸性氨基酸残基，特别是突变为丙氨酸(A)或谷氨酰胺(Q)。
本发明优选的噬菌体粘附蛋白噬菌体14尾部刺突(Δ2-107；D433N)(SEQIDNO：7)显示为D433到N的突变。本发明另外的噬菌体粘附蛋白显示为D433到任何非酸性氨基酸残基的突变。本发明还优选的噬菌体粘附蛋白噬菌体14尾部刺突显示为E171到Q或任何除D之外的其它氨基酸残基的突变，或D435到N或任何除E之外的其它氨基酸残基的突变，或在位置E171，D433和D435的两个或三个或推荐的突变的组合。优选的噬菌体粘附蛋白如SEQIDNO：14所述。
本发明的噬菌体粘附蛋白O157_BP1(Δ2-162；D463N)(SEQIDNO：9)显示为D463到N的突变。本发明另外的噬菌体粘附蛋白显示为D463到任何其它的非酸性氨基酸残基的突变，特别是到丙氨酸(A)或谷氨酰胺(Q)的突变。
本发明的噬菌体粘附蛋白O111_BP1(Δ2-107；D204N)(SEQIDNO：11)和O111_BP1(Δ2-107；D277N)(SEQIDNO：12)显示为D204到N或D277到N的突变。发现D204、D277、D302、D332、E337、D345、E354、E357、E415、D471、E476、D477、E482和D492是O111_BP1(野生型)推测活性位点的氨基酸。因此，本发明另外的噬菌体粘附蛋白显示为D204或D277或D302或D332或D345或D471或D477或D492到任何除E之外的其它氨基酸残基的突变，优选为到N的突变，或E337或E354或E357或E415或E476或E482到任何除D之外的其它氨基酸残基的突变，优选为到Q的突变。本发明另外的噬菌体粘附蛋白显示为上述单个氨基酸残基的组合，从至少两个氨基酸残基被交换最高至全部7个氨基酸残基被交换。特别优选的本发明的噬菌体粘附蛋白具有D204N突变，以及本发明的噬菌体粘附蛋白具有D277到N的突变。本发明还优选的噬菌体粘附蛋白是SEQIDNO：58的噬菌体粘附蛋白EcoO111tsp(Δ2-107；D302N，E354Q，E357Q)，其具有D302到N、D354到Q以及E357到Q的突变。另外还优选的噬菌体粘附蛋白为具有D302到N和D354到Q的突变的噬菌体粘附蛋白EcoO111tsp(Δ2-107；D302N，E354Q)。
本发明的噬菌体粘附蛋白ε15侧尾丝(Δ2-220；D449N)(SEQIDNO：56)显示为D449到N的突变。本发明另外的噬菌体粘附蛋白显示为D449到任何非酸性氨基酸残基的突变，特别是到丙氨酸(A)或谷氨酰胺(Q)的突变。
本发明还优选的噬菌体粘附蛋白为SEQIDNO：60的2954_O103_E15的经修饰的蛋白质，其显示为从氨基酸残基2直到氨基酸残基161的N-端截短(Δ2-161)以及至少一个酸性氨基酸残基突变为非酸性氨基酸残基，所述突变在氨基酸残基332～519的范围内。2954_O103_E15的推测活性位点的氨基酸(本领域技术人员可以确定，如图16所示)为D332、D341、D345、E365、D381、E392、D402、D405、E411、D417、D428、D431、E444、E456、D459、E483、E500、E518和D519。因此，本发明另外的噬菌体粘附蛋白显示为上述这些推测活性位点的氨基酸中的一个到任何非酸性氨基酸残基的突变，特别是到天冬酰胺(N)、丙氨酸(A)或谷氨酰胺(Q)的突变。特别优选的是至少D332到N、D341到N、D345到N、E365到Q、D381到N、E392到Q、D402到N、D405到N、E411到Q、D417到N、D428到N、D431到N、E444到Q、E456到Q、D459到N、E483到Q、E500到Q、E518到Q或D519到N的一个突变。本发明另外的噬菌体粘附蛋白显示为上述单个氨基酸残基的组合，从至少两个氨基酸残基被交换到最高至全部19个氨基酸残基被交换。特别优选3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个上述单个氨基酸残基交换的组合。
本发明还优选的噬菌体粘附蛋白是SEQIDNO：62的2956_O103_E15的经修饰的蛋白质，其显示为从氨基酸残基2直到氨基酸残基161的N-端截短(Δ2-161)以及至少一个酸性氨基酸残基突变为非酸性氨基酸残基，所述突变在氨基酸残基332～519的范围内。2956_O103_E15的推测活性位点的氨基酸(本领域技术人员可以确定，如图16所示)为D332、D341、D345、E365、D381、E392、D402、D405、E411、D417、D428、D431、E444、E456、D459、E483、E500、E518和D519。因此，本发明另外的噬菌体粘附蛋白显示为上述这些推测活性位点的氨基酸中的一个到任何非酸性氨基酸残基的突变，特别是到天冬酰胺(N)、丙氨酸(A)或谷氨酰胺(Q)的突变。特别优选是至少D332到N、D341到N、D345到N、E365到Q、D381到N、E392到Q、D402到N、D405到N、E411到Q、D417到N、D428到N、D431到N、E444到Q、E456到Q、D459到N、E483到Q、E500到Q、E518到Q和D519到N的一个突变。本发明另外的噬菌体粘附蛋白显示为上述单个氨基酸残基的组合，从至少两个氨基酸残基被交换到最高至全部19个氨基酸残基被交换。特别优选3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个上述单个氨基酸残基交换的组合。
本发明还优选的噬菌体粘附蛋白是SEQIDNO：64的2961_O103_E15的经修饰的蛋白质，其显示为从氨基酸残基2直到氨基酸残基161的N-端截短(Δ2-161)以及至少一个酸性氨基酸残基突变为非酸性氨基酸残基，所述突变在氨基酸残基340～518的范围内。2961_O103_E15的推测活性位点的氨基酸(本领域技术人员可以确定，如图16所示)为D340、D344、E364、D380、E391、D401、D404、E410、D416、D427、D430、E443、E455、D458、E482、E499、E517和D518。因此，本发明另外的噬菌体粘附蛋白显示为为上述这些推测活性位点的氨基酸中的一个到任何非酸性氨基酸残基的突变，特别是到天冬酰胺(N)、丙氨酸(A)或谷氨酰胺(Q)的突变。特别优选是至少D340到N、D344到N、E364到Q、D380到N、E391到Q、D401到N、D404到N、E410到Q、D416到N、D427到N、D430到N、E443到Q、E455到Q、D458到N、E482到Q、E499到Q、E517到Q或D518到N的一个突变。本发明另外的噬菌体粘附蛋白显示为上述单个氨基酸残基的组合，从至少两个氨基酸残基被交换到最高至全部18个氨基酸残基被交换。特别优选3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个上述单个氨基酸残基交换的组合。
本发明还优选的噬菌体粘附蛋白是SEQIDNO：66的2959_O145_E15的经修饰的蛋白质，其显示为从氨基酸残基2直到氨基酸残基156的N-端截短(Δ2-156)以及至少一个酸性氨基酸残基突变为非酸性氨基酸残基，所述突变在氨基酸残基329到523的范围内。2959_O145_E15的推测活性位点的氨基酸(本领域技术人员可以确定，如图16所示)为E329、D351、D358、E375、E377、D383、D385、E393、E401、D446、E468、D487、E494、D495、D496、E503、E518和D523。因此，本发明另外的噬菌体粘附蛋白显示为上述这些推测活性位点的氨基酸中的一个到任何非酸性氨基酸残基的突变，特别是到天冬酰胺(N)、丙氨酸(A)或谷氨酰胺(Q)的突变。特别优选是至少E329到Q、D351到N、D358到N、E375到Q、E377到Q、D383到N、D385到N、E393到Q、E401到Q、D446到N、E468到Q、D487到N、E494到Q、D495到N、D496到N、E503到Q、E518到Q或D523到N的一个突变。然而，本发明另外的噬菌体粘附蛋白显示为上述单个氨基酸残基的组合，从至少两个氨基酸残基被交换到最高至全部18个氨基酸残基被交换。特别优选3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个上述单个氨基酸残基交换的组合。
本发明还优选的噬菌体粘附蛋白是SEQIDNO：68的NS2957_O145_P22的经修饰的蛋白质，其具有至少一个酸性氨基酸残基到非酸性氨基酸残基的突变，在SEQIDNO：68的氨基酸序列的氨基酸残基180～357的范围内。NS2957_O145_P22的推测活性位点的氨基酸(本领域技术人员可以确定，如图16所示)为D180、D186、D190、D211、D241、E246、D254、D261、D263、D265、E266、D301、E324、D333、E334、E336、D339和D357。因此，本发明另外的噬菌体粘附蛋白显示为上述这些推测活性位点的氨基酸中的一个到任何非酸性氨基酸残基的突变，特别是到天冬酰胺(N)、丙氨酸(A)或谷氨酰胺(Q)的突变。特别优选是至少D180到N、D186到N、D190到N、D211到N、D241到N、E246到Q、D254到Q、D261到N、D263到N、D265到N、E266到Q、D301到N、E324到Q、D333到N、E334到Q、E336到Q、D339到Q或D357到N的一个突变。本发明另外的噬菌体粘附蛋白显示为上述单个氨基酸残基的组合，从至少两个氨基酸残基被交换到最高至全部18个氨基酸残基被交换。特别优选3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个上述单个氨基酸残基交换的组合。
本发明还优选的噬菌体粘附蛋白是SEQIDNO：70的2316_O26_E15的经修饰的蛋白质，其显示为从氨基酸残基2直到氨基酸残基169的N-端截短(Δ2-169)以及至少一个酸性氨基酸残基突变为非酸性氨基酸残基，所述突变在氨基酸残基344～636的范围内。2316_O26_E15的推测活性位点的氨基酸(本领域技术人员可以确定，如图16所示)为D344、D345、E351、E356、D362、D398、E405、D408、D412、E425、E432、D435、D452、E498、D509、E511、D529、E534、E538、E547、D554、D567、D573、D595、E609、D615和D636。因此，本发明另外的噬菌体粘附蛋白显示为上述这些推测活性位点的氨基酸中的一个到任何非酸性氨基酸残基的突变，特别是到天冬酰胺(N)、丙氨酸(A)或谷氨酰胺(Q)的突变。特别优选是至少D344到N、D345到N、E351到Q、E356到Q、D362到N、D398到N、E405到Q、D408到N、D412到N、E425到Q、E432到Q、D435到N、D452到N、E498到Q、D509到N、E511到Q、D529到N、E534到Q、E538到Q、E547到Q、D554到N、D567到N、D573到N、D595到N、E609到Q、D615到N或D636到N的一个突变。本发明另外的噬菌体粘附蛋白显示为上述单个氨基酸残基的组合，从至少两个氨基酸残基被交换到最高至全部27个氨基酸残基被交换。特别优选3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个上述单个氨基酸残基交换的组合。
本发明还优选的噬菌体粘附蛋白是SEQIDNO：72的2314_O26_P22的经修饰的蛋白质，其显示为从氨基酸残基2直到氨基酸残基107的N-端截短(Δ2-107)以及至少一个酸性氨基酸残基突变为非酸性氨基酸残基，所述突变在氨基酸残基178～470的范围内。2314_O26_P22的推测活性位点的氨基酸(本领域技术人员可以确定，如图16所示)为D178、D179、E185、E190、D196、D232、E239、D242、D246、E259、E266、D269、D286、E332、E345、D363、E368、E372、E381、D388、D401、D407、D429、E443、D449和D470。因此，本发明另外的噬菌体粘附蛋白显示为上述这些推测活性位点的氨基酸中的一个到任何非酸性氨基酸残基的突变，特别是到天冬酰胺(N)、丙氨酸(A)或谷氨酰胺(Q)的突变。特别优选是至少D178到N、D179到N、E185到Q、E190到Q、D196到N、D232到N、E239到Q、D242到N、D246到N、E259到Q、E266到Q、D269到N、D286到N、E332到Q、E345到Q、D363到N、E368到Q、E372到Q、E381到Q、D388到N、D401到N、D407到N、D429到N、E443到Q、D449到N或D470到N的一个突变。本发明另外的噬菌体粘附蛋白显示为上述单个氨基酸残基的组合，从至少两个氨基酸残基被交换到最高至全部26个氨基酸残基被交换。特别优选3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个上述单个氨基酸残基交换的组合。
本发明还优选的噬菌体粘附蛋白是SEQIDNO：74的23625_O26_P22的经修饰的蛋白质，其显示为从氨基酸残基2直到氨基酸残基107的N-端截短(Δ2-107)以及至少一个酸性氨基酸残基突变为非酸性氨基酸残基，所述突变在氨基酸残基178～470的范围内。23625_O26_P22的推测活性位点的氨基酸(本领域技术人员可以确定，如图16所示)为D178、D179、E185、E190、D196、D232、E239、D242、D246、E259、E266、D269、D286、E332、E345、D363、E368、E372、E381、D388、D401、D407、D429、E443、D449和D470。因此，本发明另外的噬菌体粘附蛋白显示为上述这些推测活性位点的氨基酸中的一个到任何非酸性氨基酸残基的突变，特别是到天冬酰胺(N)、丙氨酸(A)或谷氨酰胺(Q)的突变。特别优选是至少D178到N、D179到N、E185到Q、E190到Q、D196到N、D232到N、E239到Q、D242到N、D246到N、E259到Q、E266到Q、D269到N、D286到N、E332到Q、E345到Q、D363到N、E368到Q、E372到Q、E381到Q、D388到N、D401到N、D407到N、D429到N、E443到Q、D449到N或D470到N的一个突变。本发明另外的噬菌体粘附蛋白显示为上述单个氨基酸残基的组合，从至少两个氨基酸残基被交换到最高至全部26个氨基酸残基被交换。特别优选3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个上述单个氨基酸残基交换的组合。
发现本发明的噬菌体粘附蛋白的失活会促进噬菌体粘附蛋白结合至细菌或使得该结合不可逆。
O-抗原-结合
本发明的噬菌体粘附蛋白与革兰氏阴性细菌的O-抗原结合。为了确定噬菌体粘附蛋白是否与革兰氏阴性细菌的O-抗原结合，对各自细菌菌株LPS-降解进行了分析，该分析与上述针对水解脂多糖的能力的分析类似。
与结合到更保守的LPS核，例如短尾丝T4p12、K3p12或T2p12的噬菌体粘附蛋白相比，结合O-抗原的本发明的噬菌体粘附蛋白显示出更狭窄的宿主特异性，这是因为O-抗原在相接近的相关细菌菌株之间的变化更多。例如，在大肠杆菌中观察到多于180个不同的O-抗原，但仅观察5个核种类。这种提高的特异性为细菌检测以及例如不同细胞成分(例如具有特异O-抗原的脂多糖)的纯化的一些应用提供了有利条件。在细菌物种大肠杆菌中，例如存在许多无害的物种如通常的人降解道菌群的大肠杆菌。另一方面，也存在极其有害的细菌例如肠出血性大肠杆菌(EHEC)。这些病原体菌株通常表达特异的O-抗原，以大肠杆菌:O157、大肠杆菌:O111或大肠杆菌:O26作为经常出现的病原体物种的公知的实例。仅O-抗原特异的噬菌体粘附蛋白可以按照与特异性抗体类似的方式来检测或捕获上述这些菌株，而结合核的噬菌体粘附蛋白或结合其它细胞表面受体(例如蛋白质或胞外层)的噬菌体粘附蛋白则不行。
SDS抗性
优选所述本发明的噬菌体粘附蛋白为SDS抗性的。这表示于环境温度加入SDS噬菌体粘附蛋白不会解离为单体。SDS抗性的蛋白质在加热和蛋白酶条件下是稳定的。因此，与非SDS抗性的蛋白质相比，它们具有更长期的稳定性。此外，它们可以在比非SDS抗性的蛋白质更高的温度下使用，因此更适合于需要高温或在高温下更为高效的过程。
寡聚物结构
本发明的噬菌体粘附蛋白是寡聚物，优选为三聚体，更优选为同型三聚体。优选本发明的噬菌体粘附蛋白折叠成三聚的、右手的、平行的β-螺旋。本发明的噬菌体粘附蛋白的结构可以利用分析性超速离心或分析性凝胶过滤色谱来进行分析，这些方法是本领域技术人员所知晓的(例如参考Seckler等人，1989，J.Biol.Chem，26411750-11763)。
标签
在另一个优选的实施方式中，本发明的噬菌体粘附蛋白包括额外的标志物分子，例如生物素或链霉抗生物素或标签，例如HA-标签、His-标签、Strep-标签、Avi-标签、Myc-标签、GST-标签、JS-标签、半胱氨酸-标签或其它本领域已知的标签。优选标签偶联到本发明噬菌体粘附蛋白的C-端或N-端，更优选连接到N-端。
优选通过重组DNA技术将标签和本发明的噬菌体粘附蛋白偶联或连接。产生的核酸分子包含本发明的噬菌体粘附蛋白和标签的序列，并且表达产物的生产是本领域中的常规方法，在这一点上不需要对所述生产进行详细描述。本发明的另一个方面是核酸分子，其包括编码本发明噬菌体粘附蛋白和下述标签的核苷酸序列，所述标签为：HA-标签、His-标签、Strep-标签、Avi-标签、Myc-标签、GST-标签、JS-标签、半胱氨酸-标签或其它本领域已知的标签。
优选的噬菌体粘附蛋白包括JS-标签。所述JS-标签涉及的氨基酸序列包括SEQIDNO：14-32所示的序列或它们的衍生物。该JS-标签来源于肺炎克雷伯氏菌草酰乙酸脱羧酶(oxalacetatdecarboxylase)的α-亚基的生物素-受体-域，并且包含共有序列MKM。在体内通过生物素连接酶蛋白和共有序列的氨基酸残基K可以生物素化该JS-标签。与完整的肺炎克雷伯氏菌草酰乙酸脱羧酶的α-亚基相比，该JS-标签是被截短的。JS-标签可能最短的序列包括肺炎克雷伯氏菌的草酰乙酸脱羧酶的氨基酸529～594的66个氨基酸，如SEQIDNO：15所示。JS-标签的衍生物是具有与SEQIDNO：15至少有约80％、90％、95％或98％同源性的序列。上述这样的衍生物的例子如SEQIDNO：16-32所示。
本发明的另一个方面是具有标签的本发明的噬菌体粘附蛋白，所述标签展示用于特异性定点生物素化的表面暴露的半胱氨酸，例如SEQIDNO：33-35的标签。另外，所述受控的生物素化可以通过合适的间隔臂或接头调控。
半胱氨酸-标签的序列
MACWSGA SEQ ID NO：33
MACWSHPQFEKGAS SEQ ID NO：34
MASWSHPQFEKGAC SEQ ID NO：35
可以被修饰例如通过生物素化被修饰的半胱氨酸用下划线标出。
优选噬菌体粘附蛋白包括SEQIDNO：36-42所示的标签。
修饰
本发明的噬菌体粘附蛋白可以显示为修饰的。本发明的噬菌体粘附蛋白、它们的变体或片段可以通过简单的重组方式大量的生产和分离。因此，本发明的噬菌体粘附蛋白不仅限于SEQIDNO：2、4、5、7、9、11-14、36-42、56和58的具体的实施方式，还包括进行了修饰的它们的衍生物。修饰的实例为氨基酸残基的翻译后修饰，例如乙酰化作用、生物素化或氨基酸残基功能基团的其它衍生作用或加入聚乙二醇(PEGylation)、糖的连接(carbohydrateattachment)或荧光报道基团的共价连接，以及GFP或适合用于检测的酶例如碱性磷酸酶或或辣根过氧化物酶的连接。
特别优选下列经修饰的具有SEQIDNO：2、4、5、7、9、11-14、36-42、56或58的氨基酸序列的噬菌体粘附蛋白。
本发明的另一个方面是核酸分子，其包含编码本发明噬菌体粘附蛋白的核苷酸序列。优选的核酸分子包括SEQIDNO：43-51的核苷酸序列。本另一个方面是包含所述核苷酸序列的载体。本发明的又一个方面是转化了所述核酸分子或所述载体的宿主细胞。
本发明的另一个方面是产生本发明的噬菌体粘附蛋白的方法。所述方法包括下述步骤：
(a)识别噬菌体粘附蛋白的噬菌体结合域；
(b)从包含编码步骤(a)的噬菌体粘附蛋白的序列的核酸分子中删除步骤(a)识别的噬菌体结合域；
(c)利用突变使噬菌体粘附蛋白的水解活性失活。
在步骤(a)中，识别噬菌体粘附蛋白的噬菌体结合域优选通过所述噬菌体粘附蛋白和另一种噬菌体粘附蛋白的同源性分析来进行。具体来说，通过上述两种噬菌体粘附蛋白的同源性分析来识别噬菌体结合域，具体涉及N-端的同源性分析。所述同源性分析可以包括对所述噬菌体粘附蛋白的N-端对比另一种噬菌体粘附蛋白进行氨基酸的比对和后续的测定。在本发明的一个实施方式中，所述另一种噬菌体粘附蛋白是噬菌体P22或ε15的噬菌体粘附蛋白。优选SEQIDNO：53的噬菌体粘附蛋白p22尾部刺突以及SEQIDNO：55的ε15侧尾丝。
备选地，步骤(a)识别噬菌体结合域可以利用适合用于同源性钓鱼(homologyfishing)引物。优选的引物适合用于噬菌体粘附蛋白的噬菌体结合域的同源性钓鱼。因此，利用下述引物扩增编码噬菌体结合域的核酸序列来对噬菌体结合域进行识别，所述引物是借助于另一个噬菌体粘附蛋白的已知的噬菌体结合域而产生的。所述另外的噬菌体粘附蛋白可以是如上述涉及本发明的噬菌体粘附蛋白的N-端同源性所列出的任何噬菌体粘附蛋白。特别优选参考SEQIDNO：53的p22尾部刺突的N-端噬菌体结合域或SEQIDNO：55的ε15侧尾丝的噬菌体结合域来设计引物。设计和产生上述这样的引物以适合用于同源性fishing是本领域技术人员所熟知的。
本发明方法步骤(b)中所识别的噬菌体结合域的缺失可以如上所述来进行。
步骤c)的失活优选通过上述非酸性氨基酸突变为非酸性氨基酸来实现。具体来说，步骤c)可以包括多于1个酸性氨基酸突变为非酸性氨基酸，例如1～7、1～6、1～5、1～4、1～3或1～2个酸性氨基酸突变为非酸性氨基酸。
在本发明方法的了另一个实施方式中，步骤(c)在步骤(a)或步骤(b)之前进行。
本发明的另一个方面是本发明的噬菌体粘附蛋白用于结合、富集、除去、捕获和检测革兰氏阴性细菌的用途。
本发明的另一个方面是提供用于检测细菌的方法，该方法包括下述步骤(一步法)：
(a)使本发明的噬菌体粘附蛋白与支撑物偶联；
(b)温育偶联有所述噬菌体粘附蛋白的支撑物和样品；
(c)任选除去样品以及该样品中未结合所述噬菌体粘附蛋白的细菌；
(d)任选加入透化或破坏细菌膜的物质；以及
(e)检测样品中与所述噬菌体粘附蛋白结合的细菌。
本发明的另一个方面是提供用于检测细菌的方法，该方法包括下述步骤(两步法)：
(a)使含有细菌细胞或细胞成分的样品与本发明的噬菌体粘附蛋白接触，优选温育时间为约1秒～约20分钟；
(b)随后温育所述样品和固体支撑物，所述样品含有细菌细胞或细胞成分以及所述噬菌体粘附蛋白，优选温育约1～60分钟；
(c)任选除去样品以及该样品中未结合所述噬菌体粘附蛋白的细菌；
(d)任选从样品中分离结合了细菌细胞或细胞成分的固体支撑物，其中细菌细胞或细胞成分通过所述噬菌体粘附蛋白结合到所述固体支撑物上；
(e)任选加入透化或破坏细菌膜的物质；以及
(f)检测样品中与所述噬菌体粘附蛋白结合的细菌。
期望将对待检测细菌特异的本发明的噬菌体粘附蛋白用于本发明的检测方法。本发明方法中的待检测细菌可以来源于例如肠杆菌科。优选检测的细菌来自下述菌属：埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、变形菌属、沙雷氏菌属、摩根氏菌属、普罗威登斯菌属、耶尔森氏菌属、哈夫尼菌属和/或爱德华氏菌属，特别优选来自埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属和/或柠檬酸杆菌属。还优选待检测的细菌来自下述菌种：埃希氏菌属菌种、沙门氏菌属菌种、志贺氏菌属菌种、克雷伯氏菌属菌种、肠杆菌属菌种、柠檬酸杆菌属菌种、变形菌属菌种、沙雷氏菌属菌种、摩根氏菌属菌种、普罗威登斯菌属菌种、耶尔森氏菌属菌种、哈夫尼菌属菌种、爱德华氏菌属菌种、和/或假单胞菌属菌种。优选，本发明的噬菌体粘附蛋白特异识别具有特殊O-抗原的细菌或由其O-抗原定义的细菌的血清群例如沙门氏菌属的血清群。
另外，两种或多种本发明的噬菌体粘附蛋白可以用于本发明的单一检测方法中以同时检测几种类型的细菌。
关于本发明方法的样品可以是被认为是细菌或含有细菌的任何材料，这是因为细菌是检测的目标。样品可以是食品或饲料，表面材料或人用或兽用诊断探针。
对于本发明的方法，该本发明的噬菌体粘附蛋白被固定在适合的支撑结构上，例如微量滴定板、测试带、载玻片、薄片、过滤材料、反应管、磁铁、玻璃或胶乳颗粒、移液管吸头或流通的细胞室。支撑结构可以由例如聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、PMMA、乙酸纤维素、硝化纤维素、玻璃、硅薄片、胶乳组成。所述固定化可以通过吸附、共价结合或进一步通过蛋白质来完成，其中优选共价结合。相应的，固定化是具有功能的固定化，也就是说，所述噬菌体粘附蛋白尽管与支撑材料结合，但其显示出的结构对于细菌是能够到达的。
为了抑制待测细菌与支撑材料之间的非特异反应，可以通过牛血清白蛋白或吐温20或如用于ELISA中的物质，例如奶粉来进行阻断。另外，为了增加吸附的效率，可以用合适的蛋白质(例如噬菌体粘附蛋白的特异性抗体或非特异的蛋白质例如BSA)、肽、糖(例如单、寡或多糖)或表面活性剂(例如吐温20或辛基糖苷(octylglucoside))对支撑系统进行预涂覆。上述这些涂覆可以在温度范围约4～20℃下过夜进行或在温度约30～65℃进行约2～4小时。随后，除去多余的液体，并在约60～70℃对支撑结构进行干燥。基础涂覆(basiccoating)是为了确保功能性噬菌体粘附蛋白的吸附，另一方面，还是为了防止测试细菌与支撑结构之间的非特异性吸附，从而增加分析方法的效率。在基础涂覆之后，通过施加所述噬菌体粘附蛋白的含水缓冲溶液到经预处理的支撑结构中，从而施用本发明的噬菌体粘附蛋白。在约4～20℃过夜吸附或在约30～65℃进行约2～4小时吸附之后，除去涂覆溶液以及如上所述对支撑结构进行干燥。为了增加涂覆效率，可以随后利用化学交联剂(例如戊二醛)进行所述噬菌体粘附蛋白的共价固定。
随后，进行本发明的噬菌体粘附蛋白的底涂覆。为了上述目的，将所述噬菌体粘附蛋白的含水缓冲溶液施加到经预处理的支撑结构中。在例如约4～20℃过夜吸附或约30～65℃吸附约2～4小时之后，除去涂覆溶液并如上所述对支撑结构进行干燥。为了增加涂覆效率的水平，可以随后用化学交联剂(例如戊二醛)进行所述噬菌体粘附蛋白的共价固定。
借助吸附将本发明的噬菌体粘附蛋白固定在支撑材料上的过程可以利用下述方法完成：在含水缓冲液中温育噬菌体粘附蛋白溶液多于数小时或过夜，缓冲液例如为100mMTris，pH7.3或100mM磷酸钠，pH7.5，温度为约5℃～45℃，优选约15℃～37℃，特别优选约20℃～37℃，格外优选环境温度。
除此之外，本发明的噬菌体粘附蛋白不需要直接固定在支撑物上，而是可以结合在固定于支撑物的多肽上。这些多肽可以是对所述噬菌体粘附蛋白特异的，可以是抗体，受体或anticalins。另外，所述噬菌体粘附蛋白可以与低分子量物质连接，例如生物素(其依次可以结合到其它物质如多肽上)，例如链霉抗生物素(其可以被固定在支撑物上)。在这一方面，如上所述，关于所述噬菌体粘附蛋白，其它多肽可以结合到支撑体上。在本发明方法的一个实施方式中，所述噬菌体粘附蛋白可以被生物素化以及通过链霉抗生物素或抗生物素蛋白变体连接。
关于共价偶联，可以通过下述方式偶联本发明的噬菌体粘附蛋白：例如通过伯氨基(primaryaminogroup)或羧基偶联到已经由制造者活化的材料上，例如微量滴定板(来自Nunc、Xenobind或Costar)，利用标准的条件，例如-NH2，利用氰尿酰氯(RussianChemicalRev.，1964，33：92-103)，或-COO-，利用EDC(1-乙基-3′[3′-二甲基氨基丙基]碳二亚胺)(Anal.Biochem.1990，185：131-135)，或通过甲苯磺酰基-或环氧-偶联至活化的表面。另外，可以直接通过合适的程序来活化支撑材料。针对支撑材料的广泛性，根据适用性功效优选的一种可能是支撑材料的硅烷化。例如，在聚苯乙烯的情况下，硅烷化可以通过火焰热解来实现。然后施用合适的结合试剂，其可以允许通过例如伯氨基或羧基来进行偶联。
为了将待测细菌结合到经固定的本发明噬菌体粘附蛋白上，将待测样品加入到含水体系中从而与所述噬菌体粘附蛋白接触并且温育。温育在温度约4°～90℃的范围发挥作用，优选的温度范围在约4°～45℃，尤其优选的温度范围在约15°～37℃，特别优选的温度范围在约20°～37℃，更具体来说于环境温度，温育最高至6小时，优选最高至4小时，特别优选最高至2小时，特别优选1小时，特别优选1～20分钟。例如，在约4°～37℃，温育约2～120分钟可以完成，优选于约25℃～37℃温育约20～30分钟，特别优选于37℃温育35分钟。
在细菌的特异性识别和牢固结合之后，可以用含水缓冲液清洗从而除去非特异性结合的材料，所述含水缓冲液例如PBS或PBS-吐温，优选在中性pH值进行，例如利用50mM的磷酸钠，pH7.0。为了增加清洗的效率，可以将表面活性剂加入到使用的缓冲液中，例如加入吐温20、TritonX100或离液序列高的试剂，例如盐酸胍或尿素。所述清洗步骤可以重复多次，这取决于样品材料。
在分离非特异性结合材料之后，可以通过加入下述物质来透化已结合细菌的膜或根据需要将该膜破坏(取决于使用的检测分析方法)，所述物质例如表面活性剂(例如十二烷基硫酸钠、辛基糖苷、Triton-X-100)，化学试剂(例如多粘菌素B、氯仿)，成孔(pore-forming)多肽(例如乳链菌肽、穴蛋白、吉尔多肽(mellitin))或蛋白质(例如溶菌酶、内溶素、自溶素)。上述膜的透化(permeabilisation)操作可以进行约2～120分钟，于约10°～80℃的温度范围。然后检测结合的细菌。
在本发明方法的一个实施方式中，所述结合至本发明的噬菌体粘附蛋白的细菌不经过任何培养步骤。
在本发明检测方法的另一个实施方式中，用于检测细菌的方法包括在除去未结合到噬菌体粘附蛋白上的样品和样品细菌之后的预培养步骤或培养步骤。在除去未结合到噬菌体粘附蛋白上的样品和样品细菌之后的预培养步骤培养步骤，在当待检测或捕获的细菌浓度非常低时对于增加灵敏度可能是有用的。在细菌的检测或捕获之前的预培养步骤可以按照下述方法进行：在适合各个待检测或捕获的细菌菌种生长的温度下温育样品。预培养步骤还可以在适合各个待检测或捕获的细菌菌种生长的选择性或非选择性富集培养基上进行。优选预培养步骤进行约1小时最高达约48小时，更优选约2小时最高达约8小时。除去未结合到噬菌体粘附蛋白上的样品和样品细菌之后的培养步骤也可以在选择性或非选择性的富集培养基上进行，该培养基适合于各个待检测或捕获的细菌菌种的生长。优选，上述这样的培养步骤进行约1小时最高达约48小时，更优选约2小时最高达约8小时。在利用本发明的细菌粘着蛋白从样品中除去细菌细胞之后的具体的培养步骤的一个实例为：将与固定在磁珠的细菌粘着蛋白结合的细菌细胞平板培养从而确定细菌细胞结合的捕获效率。
若样品与固定化的本发明噬菌体粘附蛋白在例如流通的室或滤膜上接触，没有严格要求在将细菌结合到所述噬菌体粘附蛋白上之后，将其除去，再进行检测。
为了检测结合到本发明的噬菌体粘附蛋白上的细菌，可以利用特异性抗体、多肽、噬菌体、噬菌体粘附蛋白或本发明的噬菌体粘附蛋白。优选使用本发明的噬菌体粘附蛋白。用于检测的噬菌体粘附蛋白可以与固定化的本发明的噬菌体粘附蛋白相同或者与所述固定化的噬菌体粘附蛋白不同。
为了进行检测，将标记(例如FITC、过氧化物酶或碱性磷酸酶)偶联到抗体、多肽、噬菌体、噬菌体粘附蛋白或本发明的噬菌体粘附蛋白上，其中标记的信号形成可以通过在加入底物后追踪光度测定的数据。可以将噬菌体蛋白质的基因克隆到合适的表达载体上，以及根据各自涉及的用途按照下述方式额外地对其进行修饰，例如通过与检测酶融合的方式。另外，检测可以利用(细菌的)细胞酶(例如在大肠杆菌类的情况下为β-半乳糖苷酶，或在沙门氏菌属的情况下为磷酸酶)来进行，或还可以利用其它细胞成分例如核酸、蛋白质、脂质或糖成分来进行。
根据需要，在适合的标准测量装置中可以测定在各个探针中涉及的例如荧光、发光、吸收或圆二色性、导电率或容量变化。校正直线可以利用适合的标准分子针对精确测定的细菌浓度来得到。
检测结合到本发明的噬菌体粘附蛋白上的细菌还可以利用比色法测试来进行。在这种情况下，例如检测NADH、β-半乳糖苷酶活性、磷酸酶活性或无机磷酸盐。上述这些测试允许的检测为至少每毫升104个细胞，利用荧光染料灵敏度水平可以被提高至每毫升102和103个细胞之间。该比色法测试通常可以用于检测胞内、膜的或周质酶或细胞成分。
比色法测试对于所有待测细菌可以相同，但它们也可以针对给定的细菌/噬菌体粘着蛋组合为特异性的。标记的选择，例如酶或荧光标志物的选择可以根据在测试的各个细菌属或细菌菌种来改变。
检测结合到本发明的噬菌体粘附蛋白上的细菌还可以借助检测DNA和/或RNA来实现。为了这个目的，可以使用结合DNA和/或RNA的物质。与DNA和/或RNA的结合可以基于膜扩散直接发生，或供选的，以膜透化为基础。可市购的荧光标志物例如溴化乙啶、吖啶橙、4′，6′-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)或SYBRgreenI，并且可以利用在说明书中描述的它们各自的检测方法。
根据本发明优选的方法，其中检测步骤借助对各个待检测的革兰氏阴性细菌细胞特异的DNA和/或RNA探针的检测(基于PCR分析方法、NASBA(基于核酸序列的扩增)、杂交技术、Southern印迹、Northern印迹、斑点印迹的全部类型)来实现。
根据本发明还优选的方法，其中检测步骤按照与免疫测定类似的分析方式来进行，然而，用特异性结合的本发明的噬菌体粘附蛋白来代替抗体。本领域中已知的实例性分析方式有ELISA、RIA、ELFA(酶联荧光分析)、IMS(免疫磁珠分离)、Western印迹或类似的免疫测定多种类型。特别优选的方法为VIDAS，是一种自动的免疫测定系统，按照ELFA原理以三明治ELISA形式运行。在原始的分析方式中，将捕获抗体固定在专用的移液管洗头上，并将检测抗体偶联在碱性磷酸酶偶联物(conjugate)中。将细菌样品直接转移到VIDAS仪器中并在仪器中直接进行固定化、加热、清洗以及检测步骤。结果发现捕获抗体以及检测抗体或它们两者均可以由本发明的噬菌体粘附蛋白来代替，并从而改善涉及灵敏度和假阳性结果的检测方面的结果。
根据本发明，在另外的与噬菌体粘附蛋白结合的细菌的检测中，直接施用外源凝集素到细菌的细胞表面结构上，其中通过光度来监测例如过氧化物酶偶联抗体信号的形成。利用外源凝集素识别的细菌的细胞表面可以是例如脂多糖或膜蛋白。
本发明方法可以实现快速和灵敏的细菌检测。偶联到上述合适的支撑结构上使得能够快速和经济地测定多种菌株，在单一分析中，可以非常精确地测定细菌属和/或定量细菌。另外，不同的细胞成分例如具有特异的O-抗原的脂多糖可以通过本发明方法来检测。其中，细菌菌种的精确测定对于下述领域是重要的：医疗诊断以及食品工业和分析、牲畜饲养、有关病原的流行病学特征的新鲜水(freshwater)或环境分析。
本发明方法可以用于在任何样品中快速、高灵敏度和经济的检测细菌，特别是以下领域：医药、食品工业和分析、牲畜饲养、新鲜水(freshwater)或环境分析。对该方法的简单认识就能够使用于最重要的细菌组合的成套溶液以及系统溶液两者均适应顾客的期望，因此可以普遍使用本发明的方法。另外本发明可以实现本发明方法的完全自动化。此外，该方法可以适用于所有下述的细菌，所述细菌其合适的根据本发明的噬菌体粘附蛋白是可利用的或者在将来可以产生。另外，本发明方法满足用于试剂盒中，以针对“任何人”针对家庭用途来检测细菌。
本发明的另一个方面涉及用于细菌检测的试剂盒，其包括固定了本发明的噬菌体粘附蛋白的支撑物以及具有检测试剂的溶液，其对于结合细菌的检测是必须的。所述支撑物可以是全部上述的支撑物，在其上如上所述固定有本发明的噬菌体粘附蛋白。具有检测试剂的溶液也相应于在本发明方法中描述的用于细菌检测的物质。该试剂盒还可以任选包括清洗溶液和酶或表面活性剂，需要它们来破坏细菌的膜。
本发明的另一个方面涉及选择性纯化细菌细胞或细胞成分的方法，其包括以下步骤：(两步法)
(a)使含有细菌细胞或细胞成分的样品与本发明的噬菌体粘附蛋白接触，优选温育时间约1～20分钟；
(b)随后温育所述样品和固体支撑物，其中所述样品含有细菌细胞或细胞成分和所述噬菌体粘附蛋白，优选温育约1～60分钟；
(c)从样品中分离结合了细菌细胞或细胞成分的固体支撑物，其中细菌细胞或细胞成分通过所述噬菌体粘附蛋白结合到所述固体支撑物上。
利用本发明方法可以选择性地富集细菌细胞或细胞成分，例如从不同菌种的混合培养物或单一菌种的培养物中选择性地富集。经富集的细胞成分可以是例如脂多糖、内毒素、完整的O-抗原或它们的片段，例如寡糖重复单元。选择合适的本发明的噬菌体粘附蛋白可以获得方法的灵敏性。优选，用于本发明方法的本发明的噬菌体粘附蛋白对于待检测的细菌是特异的。
在本发明优选的实施方式中，所述样品与两种或更多不同的本发明的噬菌体粘附蛋白接触。两种或更多不同的噬菌体粘附蛋白与两种或更多不同类型和/或属的细菌结合。
在两步法中，为了将待纯化的细菌和/或细胞成分与本发明的噬菌体粘附蛋白结合，将样品例如过夜的培养物，与所述噬菌体粘附蛋白相接触，优选进行温育。温育在约4℃～90℃的温度范围，优选在约4℃～45℃的温度范围，更优选在约15℃～37℃的温度范围，进一步优选在约20℃～37℃的温度范围，特别是在常温下，进行最高达6小时，优选最高达4小时，更优选2小时，尤其优选1小时，特别优选1秒～20分钟，格外优选1～5分钟。例如，温育可以进行约2～120分钟，在约4℃～37℃的条件下，优选进行约20～30分钟，在约25℃～37℃的条件下，更优选进行约10秒～5分钟，在约37℃的条件下。
随后，所述样品与固体支撑物接触以及温育。固体支撑物可以为，例如磁性颗粒(顺磁性的或铁磁体)、玻璃颗粒、琼脂糖颗粒、发光材料颗粒、移液管吸头、反应管、膜、过滤器材料或微量滴定板。
在使用磁性颗粒时，随后将该磁性颗粒加入到样品中。所述磁性颗粒与噬菌体粘附蛋白-细菌/细胞成分复合物结合，并可以简单地利用磁性装置从样品中分离出，然后可以将其纯化。磁性装置可以位于容器的外部，即可为了富集打开该磁性装置从而将磁性颗粒收集在容器壁上，也可沿着容器壁的外部滑动从而收集磁性颗粒，例如容器的底部。优选利用永久磁铁来进行富集。磁性装置也可以浸渍到容器和样品中从而使得磁性颗粒沉积在磁性装置上(磁性装置可以被移液管吸头覆盖或相对可自由使用的)。与离心和过滤技术相比，细菌仅遭受最小的剪切速率因此如果需要可以活性的/存活的方式高收率地富集细菌。易于操作促进了简单和快速的缓冲液/溶液交换，并且均可能简单地大规模进行，并且实现良好的自动化。
所述磁性颗粒具有的直径允许每个颗粒结合充足量的细胞或细胞成分。优选磁性颗粒显示出的直径范围为约0.5～约4μm，特别优选的范围为约0.5～约2μm，更优选的范围为约0.8～约1.8μm，最优选约1μm。
噬菌体粘附蛋白-细菌/细胞成分复合物与固体支撑物(例如磁性颗粒)之间的结合，优选通过适合的偶联基团来实现，特别优选多肽和/或低分子量物质。上述这些多肽还可以是对本发明的噬菌体粘附蛋白特异的抗体、受体或anticalins。
为了结合所述复合物，使磁性颗粒与噬菌体粘附蛋白-细菌/细胞成分复合物相接触且优选进行温育。温育在约4℃～90℃的温度范围，优选在约4℃～45℃的温度范围，更优选在约15℃～37℃的温度范围，特别优选在约20℃～37℃的温度范围，特别是在常温下，进行最高达6小时，优选最高达4小时，更优选2小时，尤其优选1小时，特别优选1秒～20分钟，格外优选1～5分钟。例如，温育可以进行约2～120分钟，在约4℃～37℃的条件下，优选进行约20～30分钟，在约25℃～37℃的条件下，更优选进行约10秒～5分钟，在约25℃的条件下。
本发明方法也可以利用其它的固体支撑物来进行，其也可以相似的方式加入到样品中。单一的温育条件和分离步骤应当随不同的固体支撑物而变化。这可以在测试系列中简单地进行并且对于本领域技术人员来说不需要任何进一步的解释。
供选的，可以进行两步法因此涂覆的固体支撑物也可以不加入到样品中，但是其中将样品加到固体支撑物上或加入到固体支撑物中，例如反应管、移液管吸头、磁性颗粒、玻璃颗粒、琼脂糖颗粒、胶乳颗粒、反应管、微量滴定板、膜、过滤介质或色谱介质。为了上述这样的目的，在步骤a)之后加入样品，例如加入到微量滴定板各孔中，并在其中被温育，特别温育约20～30分钟，其它余下的条件如上所述。微量滴定板的孔或反应管的内壁可以具有与上述用于固体支撑物的相同的涂层。
细菌细胞和/或细胞成分的富集和纯化，分别还可以以下述方法来进行，所述方法包括下述步骤(一步法)：
a)使含有细菌细胞和/或细胞成分的样品与固体支撑物相接触，在所述固体支撑物的表面涂覆有本发明的噬菌体粘附蛋白，优选温育约10秒～60分钟；
b)从样品中分离结合有细菌细胞和/或细胞成分的磁性支撑物。
本发明的噬菌体粘附蛋白可以通过共价偶联而被固定在磁性支撑物上。这可以实现与磁性支撑物牢固的结合，并且因此能够施用剧烈的清洗条件以对细胞进行清洗，这可能对于富集的细胞的进一步处理来说是必须的。通过吸附偶联所述噬菌体粘附蛋白是非常简单和成本效率高的方法。借助于利用生物素/链霉抗生物素或相当的配体/受体系统偶联所述噬菌体粘附蛋白，一步法以及两步法是可能的。在这样的方法中使用的链霉抗生物素可以通过吸附以及化学偶联来固定。在涂覆方法中功能性的固定是重要的，这意味着尽管它们与固体支撑物结合，但所述噬菌体粘附蛋白仍显示出细菌能够接近的结构。
本发明的噬菌体粘附蛋白可以通过共价偶联偶联到磁性支撑物上，所述磁性支撑物已经经制造者活性化，例如Merck、Estapor等的磁性颗粒，通过标准条件，例如-NH2，利用氰尿酰氯(RussinaChemicalRev.，1964，33：92-103)，或-COO-，利用EDC(1-乙基-3’[3’二甲基氨基丙基]碳二亚胺)(Anal.Biochem.1990，185：131-135)或通过甲苯磺酰基-或环氧-偶联。另外，可以直接通过合适的程序来活化支撑材料。此外，通过马来酰亚胺或碘代乙酰基(iodoacetyl)间隔区，例如N-端导入半胱氨酸来完成偶联。
通过吸附将本发明的噬菌体粘附蛋白固定到磁性支撑物上，可以通过在含水缓冲液中温育噬菌体粘附蛋白溶液来进行，所述含水缓冲液例如100mMTrispH7.3、或100mM磷酸钠pH7.5、PBS(10mM磷酸钠pH7.4，150mM氯化钠)，温育进行数小时或过夜进行在约4℃～45℃的条件下，优选在约15℃～37℃的条件下，更优选在约20℃～37℃的条件下，格外优选在约37℃或常温条件下，特别优选在约30℃～65℃温育约10分钟～2小时。在吸附之后弃掉所述涂覆溶液，并将支撑物结构储存在含水溶液中，任选储存在缓冲溶液中。
两步法与一步法相比，其技术特征在于在两步法中在样品加入之前没有噬菌体粘附蛋白与固体支撑物的预温育。作为不同，在与细菌细胞或细胞成分相接触时，噬菌体粘附蛋白没有被固定，而是在溶液中游离。在两步法中，噬菌体粘附蛋白和细菌细胞或细胞成分的复合物被固定在固体支撑物上，相反在一步法中，细菌细胞或细胞成分被直接固定在细菌粘着蛋白上，所述细菌粘着蛋白被固定在固体支撑物上。每种方法都具有其各自的优点和缺点，这取决于具体的分析方法的形式和使用的条件。本领域技术人员在进行分析时可以利用两种方法从而决定在不同的分析中哪一种方法进行的更好，他希望使用。
可以使用本发明的方法(一步法和两步法)，例如作为在自动的细菌细胞纯化中的离心的供选方法。这可以实现例如基因组分析(即从细菌培养物的接种直到序列的测定)自动化。另外，可以使用的本发明方法，例如用来分离细胞成分，特别是脂多糖、内毒素、完整的O-抗原或它们的片段如寡糖重复单元。
本发明的另一个方法涉及用于富集细菌细胞和/或细胞成分的试剂盒，其包括本发明的固体支撑物以及包括用于富集细菌和/或细胞成分所必须的试剂，所述固体支撑物例如磁性颗粒、玻璃颗粒、琼脂糖颗粒、胶乳颗粒、反应管、移液管吸头、微量滴定板、膜、过滤介质或色谱介质。本发明的试剂盒还还优选包括清洗溶液和/或透化或破坏细菌膜的物质。
实施例
下面的实施例意在说明本发明而不是限制本发明。除非另有指明，使用分子生物学标准方法，例如Sambrock等人，1989，分子克隆(MolecularCloning)：ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborLaboratory出版，ColdSpringHarbor，NewYork中所述描述的方法。
实施例1.利用硫代(sulfo)-NHS-生物素-酯(NHS-生物素化)对噬菌体粘附蛋白进行化学生物素化。
硫代(sulfo)-NHS-LC-LC-生物素(硫代(sulfo)-琥珀酰亚胺基-6-(生物素氨基)-6-己氨基-己酸酯(sulfo-succinimidyl-6-(biotinamido)-6-hexanamido-hexanoate))于硫代(sulfo)-NHS-(N-羟基琥珀酰亚胺)-酯上与多肽氨基酸(例如Lys)的伯氨基形成稳定的酰胺成分。浓度约1.5mg/ml的噬菌体粘附蛋白与1～20倍摩尔过量的硫代-NHS-LC-LC-生物素室温温育15分钟至最多120分钟。用10μl的1MTris/HCL，pH8.0在不同的时间终止50μl溶液的偶联反应。经偶联的蛋白质样品用0.1M磷酸钠缓冲液，pH7.4来进行透析。
实施例2.用全长和N-端截短型Der7ORF790尾部刺突的失活突变体捕获血清群E的沙门氏菌属细胞的比较。
将属于血清群E1和E4的不同血清型的沙门氏菌属细胞在经缓冲的蛋白胨水中培养过夜至OD600为1后，按照1∶5稀释。在PBST缓冲液(pH8.0)中将细胞浓度稀释为104cfu/ml。在体积500μl样品中，加入5μg/ml化学生物素化(利用NHS-生物素化)的噬菌体粘附蛋白(全长Det7ORF790(D485N)和N-端截短Det7ORF790(Δ2-251，D485N))，混合10秒，加入50μg/mlRAS磁珠(链霉抗生物素涂覆的磁珠，Roche)。将噬菌体粘附蛋白、沙门氏菌属细胞和磁珠在摇床(rollator)中室温温育20分钟。利用磁性分离收集磁珠-噬菌体粘附蛋白-细菌细胞-复合物并用1ml的PBST缓冲液进行清洗。将所述磁珠-噬菌体粘附蛋白-细菌细胞-复合物重悬到原始的样品体积，并涂覆在XLD-琼脂平板上，过夜温育并对菌落进行计数。与样品中存在的细胞比较来确定经捕获的细胞。通过未加入噬菌体粘附蛋白的对照来确定非特异性结合链霉抗生物素涂覆的磁珠的细胞。观察到的非特异性结合的范围最高至1.5％。
表1.利用Det7ORF790尾部刺突的全长形式和N-端截短形式的失活突变体捕获血清群E的沙门氏菌属细胞
韦尔泰夫利丁沙门氏菌(Salmonella Weltevreden) E1 57 97
克雷菲尔德沙门氏菌(Salmonella Krefeld) E4 8 59
克雷菲尔德沙门氏菌(Salmonella Krefeld) E4 7 65
克雷菲尔德沙门氏菌(Salmonella Krefeld) E4 17 86
利物浦沙门氏菌(Salmonella Liverpool) E4 12 78
里多沙门氏菌(Salmonella Rideau) E4 11 91
森夫顿堡沙门氏菌(Salmonella Senftenberg) E4 3 80
森夫顿堡沙门氏菌(Salmonella Senftenberg) E4 15 65
森夫顿堡沙门氏菌(Salmonella Senftenberg) E4 14 55
森夫顿堡沙门氏菌(Salmonella Senftenberg) E4 15 78
维斯比沙门氏菌(Salmonella Visby) E4 14 83
观察到Det7ORF790尾部刺突特异性地结合属于血清群E1和E4的菌株的沙门氏菌属细胞。本发明的N-端截短的Det7ORF790(Δ2-251，D485N)结合来自血清群E1的细菌细胞，特异结合效率很高，为90％以上，大部分高于95％，全长-Det7ORF790(D485N)的结合效率低，大部分在50％结合的范围。来自血清群E4的沙门氏菌属细胞主要以低效率进行结合。本发明的N-端截短的Det7ORF790(Δ2-251，D485N)以50～90％的效率结合血清群E4，全长-Det7ORF790(D485N)结合效率低于20％。这表明：与天然发现的全长形式相比，本发明的Det7ORF790截短形式以更高的效率捕获和检测宿主细胞。
实施例3.从革兰氏阴性细菌细胞制备LPS(EDTA提取)。
从处于对数生长期的培养物中取出细菌细胞(50ml)，并离心(20分钟，4000rpm，4℃)，将细胞沉淀重悬在包含10mMTris，50mMEDTA的10ml的缓冲液(pH8)中。在室温温育悬浮液10分钟并涡旋数次。再次离心细胞(20分钟，4000rpm，4℃)，将含有提取出的LPS的上清液转移到新的试管中。加入丙酮使得体积达到50ml，并在-20℃温育上述试管30分钟。沉淀物(提取的LPS)在台式离心机中在4000rpm，4℃离心60分钟。弃掉上清液并将沉淀物在超声浴中溶解在10ml水中。再次用丙酮进行沉淀，并在真空干燥器中干燥沉淀物(提取出的LPS)2小时。然后将LPS-沉淀重新溶解到1ml水中。
实施例4.LPS水解测定。
LPS水解测定是用来测定噬菌体粘附蛋白的酶活性的测试。利用EDTA提取方法从革兰氏阴性细菌细胞中分离含有O-抗原的LPS。LPS与噬菌体粘附蛋白(浓度按照示出的)于水解缓冲液(50mM磷酸钠，pH7.5)中，室温温育数小时(如图中所示)。酶反应通过加入SDS-上样缓冲液来终止，煮沸样品然后将其上样到Tris-Tricin-聚丙烯酰胺凝胶中。“0h”表示将噬菌体粘附蛋白加入到分离的LPS中，并且该反应在加入SDS-上样缓冲液并混合后被立即终止(该过程小于20秒)，并煮沸样品。因为噬菌体粘附蛋白是SDS-抗性的，则直到蛋白质通过煮沸而变性时，LPS水解才可能发生。这个步骤可能持续约1分钟(样品体积为20μl)。为了分离LPS和其水解产物如不同长度的O-抗原片段，在Tris-Tricin缓冲液中对Tris-Tricin梯度凝胶(4～12％丙烯酰胺)电泳。按照银染色程序对该凝胶进行染色，相对于蛋白质该银染色优先对LPS和多糖进行染色，参见Hitchcock和Brown，1983，J.Bacteriology，154，269-277。观察到的未水解的LPS是从高分子量级分直到低分子量级分的模糊区带，这是因为经EDTA提取的LPS含有不同大小的分子。水解的LPS不含有高分子量级分，这是因为噬菌体粘附蛋白在重复单元的特异性的糖键处接连水解O-抗原，从而得到特征性的“梯型”条带。
利用列克星敦沙门氏菌(血清群E1)的分离的LPS进行LPS水解测定，比较了wt-Det7-ORF790尾部刺突和本发明的变体，即Det7-ORF790(Δ2-251，D485N)的活性。相比未加入噬菌体粘附蛋白的分离的LPS显示为不同长度的持续模糊的多糖条带，加入噬菌体粘附蛋白(每个样品0.2mg蛋白质)之后的样品显示出LPS水解从而得到特征性的梯形条带。可以看出，在加入wt-Det7-ORF790之后，经过数秒后(“0h”)大部分LPS已经被水解，没有观察到较大分子量的条带，水解继续进行因此在温育4小时和30小时之后，仅观察到2条主要条带。相反，使用失活突变体Det7-ORF790(Δ2-251，D485N)，野生型蛋白质经过数秒就已经观察到的水解程度，本发明的失活突变体需要温育30小时才能达到。温育达到30小时的时候，仍然存在高分子量的片段。可以说，尽管突变体Det7-ORF790(Δ2-251，D485N)不是完全失活的，但水解速率至少降低了1000倍。
用大肠杆菌O111菌株的分离的LPS进行类似的LPS水解测定，比较wt-O111_BP1与本发明的N-端截短且失活的变体的活性，所述变体是O111_BP1(Δ2-107)且包括D204N或D277N或E337Q或E415Q或D471N或E482Q或D492N突变、或E476Q/D477N双突变。未加入噬菌体粘附蛋白的上述细菌菌株的分离的LPS在低分子量区域显示出特征性的梯形条带，在高分子量区域显示模糊条带。在室温条件下温育4小时后，野生型O111_BP1显示出几乎完全的LPS水解，在低分子区域留下一些低分子量的条带，在“0h”温育之后也显示出明显的裂解，这时模糊条带或高分子量条带仍然可见。根据本发明的突变体的LPS水解，与野生型相比明显被降低，特别是在变体O111_BP1(Δ2-107，D204N)、O111_BP1(Δ2-107，D277N)、O111_BP1(Δ2-107，E337Q)中，也在变体O111_BP1(Δ2-107，D471N)、O111_BP1(Δ2-107，E482Q)、O111_BP1(Δ2-107，D292N)和O111_BP1(Δ2-107，E476Q/D477N)中。变体O111_BP1(Δ2-107，E415Q)显示出与野生型相当的水解活性，因此不太优选。
实施例5.测试噬菌体粘附蛋白的表达、可溶性和面对SDS时的稳定性。
在25mlLB-培养基(任选含有抗生素)中接种1～100大肠杆菌表达菌株的过夜培养物，所述大肠杆菌表达菌株具有表达不同噬菌体粘附蛋白的相应质粒。在所示表达温度培养所述细菌，使得OD600达到0.5～0.7，用1mMIPTG诱导4小时。对照样品取样测定未经诱导的蛋白质表达。4小时之后，取样1ml样品，并且在台式离心机中13000rpm离心大肠杆菌细胞10min。将细胞沉淀重悬到300μl细胞破碎缓冲液(50mMTris，25mMEDTA，pH8.0)中。超声破碎细胞2×20s。细胞破碎样品在13000rpm离心15分钟，得到不可溶的沉淀级分(将其重悬在300μl细胞破碎缓冲液中)，还得到含有可溶蛋白质的上清液级分。12μl沉淀部分以及上清液级分分别与3μl5×浓缩的SDS-上样缓冲液(终浓度2％SDS，10％甘油，10％2-巯基乙醇，0.004％溴酚蓝，0.125MTris，pH6.8)混合，并在上样到SDS-凝胶之前，煮沸5分钟从而使蛋白质变性以及破坏蛋白质寡聚物。另外12μl的上清液级分也与3μl5×浓缩的SDS-上样缓冲液混合，但不进行煮沸直接上样到SDS-凝胶上。如果目标蛋白质对于SDS具有抗性，则不会解离形成单体，但在SDS-凝胶中还按照寡聚物的迁移率移动。对于常见的非SDS-抗性蛋白质，这种行为仅仅在利用不含有SDS的天然凝胶时观察到。
SBP1的截短形式(Δ2-151)和失活形式(单一氨基酸突变D437N、D440N、E406Q)，在30℃和37℃表达之后，显示为可溶的、SDS-抗性的三聚体型的噬菌体蛋白质。本发明的所有的SBP1变体均在30℃和37℃良好表达，但在30℃表达之后，蛋白质的可溶性明显增加。当蛋白质在进行SDS-凝胶电泳之前未被煮沸时，几乎所有的蛋白质按照三聚体的迁移率移动。上述结果说明，这些噬菌体粘附蛋白采用了天然的SDS-抗性寡聚形式。
在30℃进行表达之后，截短且失活的O157BP1(Δ2-162，D463N)表达为可溶的、SDS-抗性的寡聚噬菌体蛋白质。观察到在所有构建体中，仅小部分O157BP1见于不可溶的沉淀级分中，该蛋白质的大部分以可溶形式表达。在SDS-上样缓冲液中煮沸后，该蛋白质按照单体的分子量(约70～85kDa，取决与标签的大小)移动。未煮沸时，该蛋白质在SDS-上样缓冲液(2％SDS)中稳定，并按照寡聚物，可能是三聚体的分子量移动。
实施例6.利用与Det7尾部刺突SBP1的特异性结合捕获血清种B和D1的沙门氏菌属细胞。
根据厂商的说明书，N-端截短的失活的变体Det7尾部刺突SBP1(Δ2-151)D437N通过蛋白质中的氨基-或巯基被共价偶联到环氧(epoxy)-或甲苯磺酰基(tosyl)活化的磁性聚苯乙烯珠(DynabeadsM-270环氧型，DynabeadsM-280甲苯磺酰基活化型，Dynal)上。来自血清群B和D1的不同菌株的沙门氏菌属细胞(浓度～104cfu/ml)与SBP1涂覆的磁珠室温温育20分钟。在磁性分离器中收集磁珠，并用PBST缓冲液清洗两次。将结合有沙门氏菌属细胞的磁珠涂覆在沙门氏菌属特异的XLD-琼脂平板，确定与样品中存在的细胞数量相比被捕获的细胞的数量。
N-端截短的失活的变体Det7尾部刺突(Δ2-151)D437N特异性地结合血清群B和D1的多种沙门氏菌属菌株的细胞。根据一步法。经环氧基或甲苯磺酰基共价偶联的噬菌体粘附蛋白起到相同的良好作用。
实施例7.与Dynabead抗沙门氏菌型(一步法)相比，利用特异地结合至涂覆有Det7尾部刺突SBP1(Δ2-151)D437N的磁珠捕获血清型B和Dl的沙门氏菌属细胞。
根据厂商的说明书，N-端截短的失活的变体Det7尾部刺突SBP1(Δ2-151)D437N通过蛋白质中存在的氨基-或巯基被共价偶联到甲苯磺酰基活化的磁性聚苯乙烯珠(DynabeadsM-280甲苯磺酰基活化型，Dynal)上。Dynabeads抗沙门氏菌型(Dynal)是可市购的涂覆有沙门氏菌属抗体的磁珠。来自血清群B和D1的不同菌株的沙门氏菌属细胞(浓度～104cfu/ml)与涂有SBP1的磁珠或Dynabeads抗沙门氏菌型(磁珠浓度2.5～3.0×107磁珠/ml)在PBST缓冲液中室温温育20分钟。在磁性分离器中收集磁珠并用PBST缓冲液清洗两次。结合有沙门氏菌属细胞的磁珠涂覆在沙门氏菌属特异的XLD-琼脂平板上，以确定与样品中存在的细胞数量相比被捕获的细胞的数量。
结果发现：属于血清群B或D1的不同菌株的沙门氏菌属细胞，当利用共价偶联有Det7尾部刺突SBP1(Δ2-151)D437N的甲苯磺酰基活化的磁性聚苯乙烯磁珠时，可以以50％-70％的效率捕获，当利用Dynabead抗沙门氏菌型时，可以以30％-60％的效率捕获。每种情况下，与利用抗体涂覆的磁珠相比，利用噬菌体粘附蛋白涂覆的磁珠的捕获效率均更好。
实施例8.利用0157_BP1按照与ELISA方式相似的分析方式检测大肠杆菌0157。
大肠杆菌O157过夜培养物用LB培养基1∶5稀释，并培养直到OD600＝1(这相当于每毫升5×108个细胞)。细胞在4℃，13000rpm离心10分钟。将该细菌细胞沉淀重悬到PBS缓冲液(10mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH7.4)中，进行系列稀释，直到107cfu/ml。微量滴定板(Nunc，MaxiSorb)的各孔中加入不同浓度的100μl的细菌细胞溶液。细菌细胞在37℃结合1h。各孔除去样品溶液，用200μl的清洗缓冲液(10mMTris，171mMNaCl，0.1％吐温20，pH7.2)洗三次。加入200μl的PBST-BSA缓冲液作为阻断溶液并在37℃温育1小时。除去PBST-BSA溶液。加入在100μlPBST-BSA缓冲液(10mM磷酸钠，150mM氯化钠，0.1％吐温20，0.5％BSA，pH7.4)中的生物素化O157_BP1，使得浓度为每个孔1μg蛋白质。使O157_BP1与细菌细胞在37℃结合1小时。利用移液管除去溶液。各孔用200μl清洗缓冲液洗三次，除去未结合的O157_BP1。加入100μl的streptactin-HRP(辣根过氧化物酶)-偶联物(0.02％)作为检测分子，并在室温温育1小时。各孔除去溶液，用200μl清洗缓冲液洗三次从而除去未结合的streptactin-HRP-偶联物。加入100μlABTS-染色溶液(0.085M磷酸钠，0.048M柠檬酸盐，pH4.6，0.2％ABTS(2，2连氮基-二(3-乙基)苯基噻唑啉(benzthiazoline)6-磺酸)，5‰H2O2)，通过在120分钟内测量405nm处的吸光度，在室温监控显色反应。作为对照，测量加入细菌细胞但未加O157_BP1入的样品，从而监测没有streptactin-HRP-偶联物与生物素化O157_BP1特异性结合时的背景信号。为了确定该测试中大肠杆菌的真实细胞数量，将100μl系列稀释液涂覆在琼脂平板上，并在第二天对菌落进行计数。
在用1μgO157_BP1进行的类似于ELISA形式的大肠杆菌O157检测试验中，利用O157_BP1与细菌细胞的特异性结合，以及streptactin-HRP-偶联物与生物素化O157_BP1-细菌细胞复合物的特异性结合，通过比色法，可靠地检测到了105cfu或更高的细菌浓度。
实施例9.O157_BP1对细菌细胞的特异性结合的包含试验和排除试验(一步法)。
所有使用的测试菌株均事先在37℃过夜培养。在细菌捕获之前，预培养物在mTSB-培养基(改良的TSB培养基，Oxoid)中1∶5稀释，并生长直到OD600为1。稀释细胞使得细菌细胞的浓度为108-104cfu/ml。在PBST缓冲液(2.25mMNaH2PO4，7.75mMNa2HPO4，150mMNaCl，0.05％吐温，pH6.7)中细菌浓度为104cfu/ml时进行捕获，样品体积500μl。将0.3μg的O157_BP1固定到10μlMCB45磁珠(Microcoat，经链霉抗生物素预涂覆的磁珠，浓度10mg/ml)上15分钟，并将其加入到细菌样品中，在室温下在旋转温箱(rollingincubator)中温育。20分钟温育之后，在磁性分离器中收集细菌-O157_BP1-磁珠复合物，并用PBST缓冲液清洗两次。然后，将包括细菌-O157_BP1-磁珠复合物的100μl样品涂覆在Caso-琼脂平板上，并在37℃温育过夜。使用利用了链霉抗生物素包覆的磁珠但而未加入O157_BP1的样品作为非特异性结合的对照。计算特异性结合的细菌级分，与在测试中使用的细菌细胞的数量相比，后一种细菌在稀释后直接涂覆在Caso-琼脂平板上。
表2.利用O157_BP1特异性捕获大肠杆菌O157菌株。
大肠杆菌菌株的编号来自PROFOS培养中心。
O157_BP1能够结合全部的26种经测试的大肠杆菌O157EHEC菌株，以及27种经测试的大肠杆菌O157非EHEC菌株，并且特异性结合效率非常高，能结合样品中90％以上的细胞，大部分甚至达到95％以上的效率。在EHEC菌株和非EHEC菌株之间结合效率没有区别，而且只要存在O157抗原，在提呈或不提呈H7-抗原的菌株(H7相对H-)之间的结合效率也没有区别。这说明O157_BP1对于O157抗原是特异的。
表3.利用O157_BP1特异性捕获非O157大肠杆菌菌株。
血清型 大肠杆菌菌株 ％特异性捕获
O(rough):H20 686 0
O6:H10 693 0
O8:H45 689 0
O26:H- S2318 1
O26:H11 S2320 1
O26:H11 S2316 0
O26:H11 S2314 0
O38:H8 506 5
O55:H7 719 0
O56:K+:H- S2497 0
O63:H6 503 0
O73:H31 507 0
O86:H2 690 0
O86:H35 505 0
O87:H32 684 0
O91:H- S2306 0
O99:H33 508 0
O103:H- S2311 0
O103:H2 S2303 0
O103:H3 S2308 2
O111:H- S2303 0
O118:H8 502 1
O144:H4 683 0
O145:H- S2313 0
O145:H34 S2315 3
O149:H- 511 0
O159:H21 510 0
O167:H5(rough) 512 0
O9:H- 509 4
O145:H- S2317 1
O145:H34 S2322 0
大肠杆菌菌株的编号来自PROFOS培养中心。
在检测的31种非O157大肠杆菌菌株中，特异性捕获效率都不超过5％，甚至大部分的捕获效率为0％特异性。这表明O157_BP1不与特异于大肠杆菌细菌细胞的常见表面受体结合，但特异性地结合O157抗原。
表4.利用O157_BP1特异性捕获非大肠杆菌菌株。
城市种(N) 78
内伊梅根种(N) 64
莫尔黑德种(N) 61
马妥潘尼种(N) 59
城市种(N) 81
城市种(N) 79
城市种(N) 85
策伦多夫种(N) 87
肯塔基种(C2-C3) 3
病牛种(C2-C3) 0
葡萄球菌属 金黄色种 0
还测试了O157_BP1是否特异性结合除大肠杆菌O157之外的其它细菌。33种经测试的菌株主要来自其它的革兰氏阴性细菌属，以及一种来自革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)，仅具有O157抗原的柠檬酸杆菌属菌株和属于血清群N的沙门氏菌属菌株显示出与O157_BP1的明显结合。在本领域中已知(Samuel等人，2004，J.Bacteriology186.6536-6543)：沙门氏菌属血清群N具有的其主抗原O:30与大肠杆菌O157表现为相同的抗原，在柠檬酸杆菌属中有一些代表性菌也具有与大肠杆菌中的O157抗原相同的O-抗原，在用抗体进行免疫测试时引起交叉污染。O157抗原重复单元具有化学结构→2)αDPer4NAc(1→3)αLFuc(1→4)βDGlc(1→3)αDGalNAc(1→，这在肠沙门氏菌O-抗原O30和弗氏柠檬酸杆菌F90O-抗原中也观察到。这些柠檬酸杆菌属和沙门氏菌属菌株很少见，但是它们也是潜在的象大肠杆菌O157菌株一样的病原体。因此，在希望捕获所有具有O157抗原的潜在病原体的试验中，或者在希望纯化O157抗原的试验中，上述这些非大肠杆菌O157的菌株不会干扰。为了特异性检测大肠杆菌O157或柠檬酸杆菌属O157或沙门氏菌属血清群N，必须采用菌株特异性检测试验，象PCR或用有利于一种细菌物种而不利于其它细菌物种的培养基进行的预培养。
实施例10.利用有限的蛋白酶解产生Det7ORF790(D485N)的截短变体。
30μl的Det7ORF790(D485N)蛋白质溶液(浓度约1mg/ml)与30μl蛋白酶K在缓冲液(0.1M磷酸钠，pH7.4)中的溶液混合。按照下述蛋白酶K比噬菌体粘附蛋白的摩尔比例加入蛋白酶K∶3×10-5∶1、3×10-4∶1、3×10-2∶1、0.3∶1或3∶1。在37℃温育蛋白酶降解样品1小时。通过加入SDS上样缓冲液以及煮沸样品来终止蛋白酶的降解。在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中对样品进行电泳并用考马斯亮蓝进行染色。蛋白酶K相对于噬菌体粘附蛋白三倍摩尔过量所产生的蛋白质片段的电泳条带经N-端测序显示，蛋白质以序列GKKLVLN开始，这是始于全长Det7ORF790尾部蛋白的氨基酸G321。截短变体Det7ORF790(Δ2-251；D485N)经相同蛋白酶的有限降解所产生的变体Det7ORF790(Δ2-320；D485N)表明，这可能是最短的具有N-端截短的稳定变体。具有长度在全长Det7ORF790尾部蛋白和变体Det7ORF790(Δ2-320)之间的数个片段都被视为中间体，因为经同源性比较提示的其它截短变体也是结构上可被发现的。
实施例11.用大肠杆菌自身的β-半乳糖苷酶活性进行检测的oNPG(邻-硝基苯基-βD-吡喃半乳糖苷)-试验(两步法)。
大肠杆菌细胞经1mMIPTG诱导后的过夜培养物在LB培养基中1∶10稀释。将5μg包含strep-标签或生物素的噬菌体粘附蛋白移液到微量滴定板的一个孔中。加入200μl经稀释的细菌细胞悬浮液并在室温温育15分钟。用PBST缓冲液以1∶1稀释链霉抗生物素包覆的磁珠(Merck)，并将5μl磁珠的悬浮液加入到每个孔中。该溶液含有噬菌体粘附蛋白、细菌细胞和磁珠，在室温下温育该溶液20分钟至最多45分钟。利用磁块在孔的底部收集磁珠，除去包括未结合细胞的上清液并用200μlPBST缓冲液清洗两次。将含有磁珠-噬菌体粘附蛋白-细菌细胞复合物的沉淀重悬在200μl的oNPG反应溶液中，并在37℃温育1小时。40ml的oNPG反应溶液含有5ml的0.5M磷酸钠，pH7.0，2.5ml的Ringer’s溶液(NaCl8g/l，CaCl20.2g/l，KCl0.2g/l，NaHCO31g/l)，27.5ml的H2O，以及5ml的oNPG标准溶液。oNPG标准溶液具有如下组成：15mg的oNPG在1mlH2O中，4μl1MTris/HCl，pH9.5，13μl0.1NHCl，0.08％TritionX-100，5μl/ml多粘菌素B溶液10mg/ml。通过加入50μl碳酸盐缓冲液(碳酸钠28g/l，碳酸二氢钠12g/l，柠檬酸钠100g/l)以及冷却到4℃来终止β-半乳糖苷酶反应。再次在孔的底部收集磁珠复合物，并将每孔150μl的上清液转移到聚苯乙烯微量滴定板中，用于检测425nm处的吸光度。用620nm处测定的背景吸光度来校正比色信号。将未加入噬菌体粘附蛋白的样品作为细菌细胞非特异性磁珠或微量滴定板的对照。将在具有噬菌体粘附蛋白的样品与没有加入蛋白质的样品中测定的吸光度的比例作为各个噬菌体粘附蛋白特异性结合细菌细胞的信号。
oNPG-测试用于大肠杆菌O26的比色法检测，利用O111_BP1wt和截短变体O111_BP1(Δ2-107)。两种噬菌体粘附蛋白均显示出N-端strep-标签，以有效地结合链霉抗生物素涂覆的磁珠。A425信号比为2以上表示各个细菌细胞的特异性细胞捕获。结果发现，上述两种噬菌体粘附蛋白均适合于特异性检测多种大肠杆菌O26菌株。仅菌株编号2680提供较弱的信号。结果还发现，使用N-端缩短的变体O111_BP1(Δ2-107)的特异性细胞结合总是优于使用含有噬菌体头部结合域的野生型蛋白质的特异性细胞结合。
实施例12.P22tsp(Δ2-108；D392N)和Det7tsp(Δ2-151；D437N)对血清群B和D1的沙门氏菌属细胞的特异性细胞结合。
利用NHS-生物素化方法对两种噬菌体粘附蛋白，P22tsp(Δ2-108；D392N)和Det7尾部刺突SBP1(Δ2-151；D437N)进行化学生物素化。通过两步法，利用浓度30μg/ml的噬菌体粘附蛋白，每毫升104个沙门氏菌属细胞，以及50μg/mlRAS磁珠(链霉抗生物素涂覆的磁珠，Roche)来进行细胞捕获。在室温下，细菌细胞与噬菌体粘附蛋白结合1分钟，与磁珠结合20分钟。收集的磁珠、细菌细胞和噬菌体粘附蛋白的复合物用双倍样品体积洗一次。细胞捕获用参与试验的细胞的百分比来确定。作为非特异性结合的对照，使用没有蛋白质涂覆的RAS磁珠。未涂覆的磁珠的非特异性细胞结合为0％～2％。表5所示的细胞捕获值是，用两种不同蛋白质纯化所得的两种噬菌体粘附蛋白进行4次测定，而且双份测定捕获效率的平均值。
表5.P22tsp(Δ2-108；D392N)和Det7tsp(Δ2-151；D437N)对血清群B和D1的沙门氏菌属细胞的特异性细胞结合
乙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi B) B 74.4 93.6
乙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi B) B 51.2 94.4
乙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi B) B 70.6 88.4
乙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi B) B 64.3 89.7
乙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi B) B 8.9 29.2
乙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi B) B 64.6 93.6
乙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi B) B 71.4 94.7
乙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi B) B 77.5 96.1
乙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi B) B 59.6 90.4
乙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi B) B 64.6 97.4
里丁沙门氏菌(S.Reading) B 52.3 41.8
圣保罗沙门氏菌(S.Saintpaul) B 30.2 91.3
圣保罗沙门氏菌(S.Saintpaul) B 87.4 81.3
圣保罗沙门氏菌(S.Saintpaul) B 88.2 81.8
圣保罗沙门氏菌(S.Saintpaul) B 64.7 55.5
施瓦曾格隆得沙门氏菌(S.Schwarzengrund) B 0.3 0.4
斯坦利沙门氏菌(S.Stanley) B 57.5 83.2
鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium) B 65.6 93.7
鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium) B 69.8 91.5
鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium) B 55.9 89.3
鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium) B 62.2 90.5
鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium) B 36.8 83.3
鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium) B 47.4 72.9
贝塔沙门氏菌(S.Berta) D1 56.2 83.3
贝塔沙门氏菌(S.Berta) D1 62.5 91.7
贝塔沙门氏菌(S.Berta) D1 63.8 92.8
都柏林沙门氏菌(S.dublin) D1 28.0 89.8
肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis) D1 35.8 93.2
肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis) D1 53.0 86.2
肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis) D1 36.3 83.5
肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis) D1 35.4 95.0
肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis) D1 29.9 90.2
肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis) D1 37.1 87.4
鸡沙门氏菌(S.Gallinarum) D1 34.6 71.3
爪哇岛沙门氏菌(S.Javiana) D1 25.9 21.9
爪哇岛沙门氏菌(S.Javiana) D1 90.0 77.3
爪哇岛沙门氏菌(S.Javiana) D1 13.6 13.0
爪哇岛沙门氏菌(S.Javiana) D1 27.0 21.6
莫斯科沙门氏菌(S.Moscow) D1 51.5 78.5
巴拿马沙门氏菌(S.Panama) D1 46.81 85.8
伤寒沙门氏菌(S.Typhi) D1 9.6 72.7
伤寒沙门氏菌(S.Typhi) D1 8.7 43.0
伤寒沙门氏菌(S.Typhi) D1 2.5 13.9
伤寒沙门氏菌(S.Typhi) D1 0.4 2.0
伤寒沙门氏菌(S.Typhi) D1 5.1 44.6
伤寒沙门氏菌(S.Typhi) D1 3.6 22.3
伤寒沙门氏菌(S.Typhi) D1 12.4 65.6
伤寒沙门氏菌(S.Typhi) D1 3.2 21.6
伤寒沙门氏菌(S.Typhi) D1 10.2 60.6
巴尔通沙门氏菌(S.Baildon) D2 0.8 0.9
韦尔尼格罗德沙门氏菌(S.Wernigerode) D2 0.5 0.7
梅代沙门氏菌(S.Mayday) D2 1.0 0.5
沙门氏菌SII D3 1.8 2.0
沙门氏菌SII D3 0.6 0.4
两种噬菌体粘附蛋白优先结合属于血清群B和D1的沙门氏菌属细胞，但是不结合属于血清群D2或D3的沙门氏菌属细胞。血清群B的特征在于以O-抗原1、4和12作为主要抗原，而血清群D1的特征在于以O-抗原1、9和12作为主要抗原。因此，假定两种噬菌体粘附蛋白与沙门氏菌属的O-抗原1或12或它们两者结合。由于具有O-抗原9和12，但是缺少O-抗原1的伤寒沙门氏菌通常以较低的效率结合，特别是通过P22tsp(Δ2-108；D392N)结合时，故O-抗原1很可能起重要的作用，但是不唯一的O-抗原结合。所检测的56种属于血清群B和D1的沙门氏菌属血清种中，仅有3种被Det7tsp(Δ2-151；D437N)结合的效率低于10％，有10种血清种被P22tsp(Δ2-108；D392N)结合的效率低于10％。在测试的几乎全部血清种中，与P22tsp(Δ2-108；D392N)相比，Det7tsp(Δ2-151；D437N)的结合明显具有更高的效率，从而看出Det7tsp(Δ2-151；D437N)比P22tsp(Δ2-108；D392N)更适合于本发明的应用。

Claims (23)

1.噬菌体粘附蛋白，其由SEQIDNO：4的氨基酸序列构成。
2.核酸分子，其编码根据权利要求1所述的噬菌体粘附蛋白。
3.载体，其编码权利要求1的噬菌体粘附蛋白。
4.宿主细胞，其被权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的载体转化。
5.产生权利要求1的噬菌体粘附蛋白的方法，其包括以下步骤：
(a)识别噬菌体粘附蛋白的噬菌体结合域；
(b)从包含编码步骤(a)的噬菌体粘附蛋白的序列的核酸分子中删除步骤(a)识别的噬菌体结合域；
(c)利用突变使噬菌体粘附蛋白的水解活性失活。
6.权利要求5所述的方法，其中在步骤(a)中，所述噬菌体结合域通过先进行氨基酸比对，再确定所述噬菌体粘附蛋白相比另一种噬菌体粘附蛋白的N-端来识别，
或其中所述噬菌体结合域通过用适于同源性钓取噬菌体结合域的引物扩增编码该噬菌体结合域的核酸序列来识别。
7.权利要求1所述的噬菌体粘附蛋白用于制造用于结合、富集、移除、捕获和检测革兰氏阴性细菌的试剂的用途。
8.检测细菌的方法用于制备用于检测细菌的试剂盒的用途，其包括以下步骤：
(a)使权利要求1所述的噬菌体粘附蛋白与支撑物偶联；
(b)将偶联有所述噬菌体粘附蛋白的支撑物与样品一起温育；以及
(e)检测样品中与所述噬菌体粘附蛋白结合的细菌。
9.根据权利要求8所述的用途，其还包括：
(c)除去样品以及该样品中未结合所述噬菌体粘附蛋白的细菌。
10.根据权利要求8所述的用途，其还包括：
(d)加入透化或破坏细菌膜的物质。
11.检测细菌的方法用于制备用于检测细菌的试剂盒的用途，其包括以下步骤：
(a)使含有细菌细胞或细胞成分的样品与权利要求1的噬菌体粘附蛋白接触；
(b)然后将含有细菌细胞或细胞成分和所述噬菌体粘附蛋白的样品与固体支撑物一起温育；以及
(e)检测样品中与所述噬菌体粘附蛋白结合的细菌。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述步骤(a)为温育含有细菌细胞或细胞成分的样品与权利要求1的噬菌体粘附蛋白1秒～20分钟。
13.根据权利要求11所述的用途，其中所述步骤(b)的温育时间为1～60分钟。
14.根据权利要求11所述的用途，其还包括：
(c)除去样品以及该样品中未结合所述噬菌体粘附蛋白的细菌。
15.根据权利要求11或14所述的用途，其还包括：
(d)加入透化或破坏细菌膜的物质。
16.根据权利要求15所述的用途，其在所述步骤(c)和步骤(d)之间任选从样品中分离结合了细菌细胞或细胞成分的固体支撑物，其中细菌细胞或细胞成分通过所述噬菌体粘附蛋白结合到所述固体支撑物上。
17.权利要求8-16中任一项所述的方法用于制造用于检测在医药、食品工业和分析、牲畜饲养、新鲜水或环境分析中的细菌的试剂的用途。
18.选择性纯化细菌细胞或细胞成分的方法，其包括以下步骤：
a)使含有细菌细胞或细胞成分的样品与权利要求1所述的噬菌体粘附蛋白接触；
b)随后将所述样品与固体支撑物一起温育，其中所述样品含有细菌细胞或细胞成分和所述噬菌体粘附蛋白；
c)从样品中分离出结合有细菌细胞或细胞成分的固体支撑物，其中细菌细胞或细胞成分通过所述噬菌体粘附蛋白结合到所述固体支撑物上。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述步骤(a)为温育含有细菌细胞或细胞成分的样品与权利要求1所述的噬菌体粘附蛋白1～20分钟。
20.根据权利要求18所述的方法，其中，所述步骤(b)的温育时间为1～60分钟。
21.富集和纯化细菌细胞和/或细胞成分的方法，其包括下述步骤：
a)使含有细菌细胞和/或细胞成分的样品与磁性支撑物相接触，在所述磁性支撑物的表面有权利要求1的噬菌体粘附蛋白；
b)从样品中分离出结合有所述细菌细胞和/或细胞成分的磁性支撑物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述步骤(a)温育含有细菌细胞和/或细胞成分的样品与磁性支撑物1～60分钟，在所述磁性支撑物的表面有权利要求1的噬菌体粘附蛋白。
23.一种试剂盒，其用来进行权利要求8、11、18或21所述的方法，所述试剂盒包括权利要求1的噬菌体粘附蛋白，支撑物和用于检测、纯化或富集革兰氏阴性细菌和/或细胞成分的检测试剂。
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