ES2334236T3 - Procedimiento para la deteccion de endotoxinas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la detección de endotoxinas que comprende las etapas de: a) la puesta en contacto de una muestra que contiene endotoxinas con una superficie recubierta con una sustancia de unión a endotoxina, a continuación b) la incubación de proteínas de cola de bacteriófago o proteínas de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o de proteínas de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola en endotoxinas inmovilizadas sobre la superficie, y c) la detección de proteínas de cola de bacteriófago o proteínas de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o de proteínas de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola mediante procedimientos espectroscópicos, ELISA, reacciones de detección química o enzimática de endotoxinas o componentes escindidos de endotoxinas o mediante medida de la capacidad.
Description
Procedimiento para la detección de
endotoxinas.
La presente invención se refiere a
procedimientos para la detección de endotoxinas en una muestra.
Endotoxina (ET) designa una familia de
lipopolisacáridos que, junto con proteínas y fosfolípidos, forman la
pared celular externa de bacterias gramnegativas. Las endotoxinas
aparecen exclusivamente en este grupo de bacterias y desempeñan un
papel importante en la organización, estabilidad y función de
barrera de la membrana externa. Numerosos bacteriófagos aprovechan
las endotoxinas o lipopolisacáridos generales para el reconocimiento
específico de sus bacterias hospedadoras.
Todas las variantes de endotoxina están
compuestas por un heteropolisacárido que está unido covalentemente
a lípido A. El lípido A ancla la endotoxina en la membrana
bacteriana externa. El heteropolisacárido, que está compuesto por
un oligosacárido central y el antígeno O, se muestra en la
disolución circundante y determina la identidad serológica de la
bacteria. El antígeno O está compuesto por unidades oligosacáridas
repetidas cuya composición es específica de cepa. Los
constituyentes característicos del oligosacárido central son ácido
2-ceto-3-desoxioctulosónico
(KDO) y
L-glicero-D-manoheptosa
(Hep).
La parte más conservada de la endotoxina de
distintos géneros es el lípido A. Está igualmente conservada que el
lípido A la región central interna, la región central externa
presenta ya una mayor variación. La región central interna, el KDO
y el lípido A portan por sí mismos varios grupos fosfato como
sustituyentes y son por tanto responsables de la carga negativa de
la endotoxina. Además, los grupos fosfato en el lípido A y la
región central pueden estar sustituidos variablemente con arabinosa,
etanolamina y fosfato. Los constituyentes sacáridos individuales
del antígeno O están acetilados, sializados o glucosilados. El
antígeno O varía además respecto al número de unidades repetidas,
por lo que la población de endotoxinas de cada bacteria presenta
cierta heterogeneidad.
Las endotoxinas son biomoléculas que, sin las
correspondientes medidas de precaución, se encuentran prácticamente
en todas las disoluciones acuosas. Las endotoxinas pueden conducir
en hombres y animales a sepsis, una fuerte reacción adversa del
sistema inmunitario. Por tanto, por ejemplo en la preparación de
proteínas farmacológicas, han de detectarse exactamente las
impurezas con endotoxina y a continuación eliminarse completamente.
Las endotoxinas representan un problema en medicamentos preparados
por ingeniería genética, productos terapéuticos genéticos o
sustancias que se inyectan en hombres o animales (por ejemplo,
tratamiento veterinario o en ensayos animales). Sin embargo, no
sólo en aplicaciones médicas, sino también en investigación como en
experimentos de transfección de células de mamífero, puede
observarse una inhibición o una reducción de la eficacia de
transfección por
endotoxinas.
endotoxinas.
Para poder utilizar proteínas en el marco de
estudios clínicos, las farmacopeas europea y estadounidense
requieren que las proteínas no superen determinados valores límite
de carga de endotoxina (por ejemplo, inmunoglobulina sérica \leq
0,91 UE/ml, esto corresponde a \leq 5 UE/kg de peso corporal y
hora (dosis = UE/kg\cdoth); UE = unidad de endotoxina; "FDA
(Food and Drug Administration): Guideline on Validation of LAL as
End Product)". En caso de que un medicamento o las proteínas en
él contenidas presenten una carga alta de endotoxinas, ésta puede
conducir a la muerte del sujeto de ensayo. La defensa inmunitaria
mal dirigida daña al paciente por una sobrerreacción. Esto puede
conducir a inflamaciones de tejido, caída de la presión sanguínea,
taquicardia, trombosis, choque, etc. Ya una exposición de larga
duración a endotoxinas en cantidades de picogramos puede conducir a
efectos secundarios crónicos como, por ejemplo, inmunodeficiencias,
síntomas sépticos, etc. Por tanto, en el marco de la preparación de
sustancias, particularmente generadas en procesos en condiciones de
"Good Manufacturing Practice (Buenas Prácticas de Fabricación)
(GMP)", las endotoxinas se empobrecen lo más posible. Sin
embargo, la eliminación de endotoxinas en proteínas, polisacáridos y
ADN es problemática. Precisamente en proteínas, hay grandes
problemas por sus propiedades intrínsecas como estado de carga o
hidrofobicidad, que pueden impedir casi la eliminación de
endotoxinas o conducir a grandes pérdidas de producto en el
procedimiento de eliminación.
Actualmente, se han descrito cuatro
procedimientos para la detección de endotoxina en disoluciones
biológicos, en los que sólo los dos primeros están admitidos por la
FDA. 1. "Ensayo de pirógenos en conejos": Un procedimiento en
el que se inyecta a un conejo vivo una disolución de endotoxina y se
desencadena por tanto una reacción inmunitaria. Esta respuesta
inmunitaria causada por endotoxina se detecta mediante el desarrollo
de fiebre. 2. Es claramente mejor estandarizable el ensayo de
"Lisado de amebocitos de Limulus (LAL)", que actualmente
es el ensayo más frecuentemente usado (BioWhittaker, Inc., Charles
River, Inc., Associates of Cape Cod, Inc., todos los EE.UU.). En
este procedimiento, se mide la aglutinación de la sangre de cangrejo
de herradura (Limulus polyphemus) después de contacto con
endotoxina. 3. El ensayo de pirógenos in vitro basado en la
detección de interleucina 1\beta en sangre humana, que participa
en la inducción de fiebre. El ensayo está compuesto por una etapa
de incubación de sangre humana con la disolución a analizar y la
posterior detección de la interleucina mediante anticuerpos. 4. Es
una posibilidad adicional el empleo de un sistema de cultivo celular
especial (Sterogene Inc., EE.UU.) con el que sigue la activación de
monocitos mediante la generación de determinadas citocinas.
Los dos procedimientos citados en primer lugar
son sin embargo muy caros y cuestionables no por último por razones
de protección de animales por la gran necesidad de animales de
ensayo o de sangre de los muy escasos cangrejos de herradura. El
ensayo LAL puede ciertamente miniaturizarse y automatizarse también,
pero debido a la baja estabilidad de los componentes tiene enormes
desventajas en su aplicación. Una disolución de LAL una vez abierta
debe procesarse directamente y aplicarse, ya que los componentes
agregan al cabo de pocas horas. El ensayo de pirógenos in
vitro requiere sangre humana lo más fresca posible y es
relativamente largo, ya que la producción de la interleucina
requiere de aproximadamente 10 a 24 horas. Además de endotoxinas,
pueden reconocerse con el ensayo de pirógenos también otros
pirógenos. Este ensayo se usa sin embargo en primera línea como
sustitución del "ensayo de pirógenos en conejos". Para todos
los procedimientos de ensayo es necesario personal entrenado y los
procedimientos son muy sensibles a interferencias porque, por
ejemplo, el sistema inmunitario de los conejos puede reaccionar de
forma completamente distinta a la misma dosis de endotoxina. El
procedimiento de cultivo celular de la compañía Sterogene es
igualmente muy costoso, como todos los procedimientos de cultivo
celular, y presenta problemas de estandarización.
En conjunto, puede comprobarse que no hay un
procedimiento sencillo, manejable y económico para la detección de
endotoxina y que los procedimientos utilizados actualmente presentan
una serie de desventajas. Existe por tanto la necesidad de un
procedimiento que evite estas desventajas.
Por tanto, la invención se basa en el objetivo
de procurar un procedimiento que pueda detectar endotoxinas más
rápidamente, más sencillamente y de forma más estandarizada en
disoluciones y muestras.
Los objetivos se consiguen mediante el objeto
definido en las reivindicaciones.
Las siguientes figuras ilustran la
invención.
La Fig. 1 muestra una vista esquemática de la
estructura química de la endotoxina de E. coli
0111:B4.
Hep = L-glicero-D-manoheptosa; Gal = galactosa; Glc = glucosa; KDO = ácido 2-ceto-3-desoxioctulosónico;
NGa = N-acetilgalactosamina; NGc = N-acetilglucosamina.
Hep = L-glicero-D-manoheptosa; Gal = galactosa; Glc = glucosa; KDO = ácido 2-ceto-3-desoxioctulosónico;
NGa = N-acetilgalactosamina; NGc = N-acetilglucosamina.
La Figura 2 muestra los resultados de medidas de
resonancia de plasmón de superficie. (A) Curvas de resonancia que se
han medido como respuesta a la inyección de distintas
concentraciones de p12 (cada una en \mug/ml: 100; 25; 6,25; 4;
1,56; 0,4) (_). La unión se realiza en la endotoxina de E.
coli D21f1, que se ha inmovilizado sobre un chip de HPA
hidrófobo. Se marca la inyección de p12 y EDTA (5 mM) mediante una
barra sobre las curvas. Tampón: Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0. (B)
Se midieron los valores de resonancia de equilibrio para la unión de
p12 a endotoxina inmovilizada aproximadamente 600 s después del
inicio de la inyección de p12 y se aplicaron frente a la
correspondiente concentración de p12. La línea continua muestra el
ajuste de isoterma de adsorción de Langmuir (UR =
URmáx\cdot[p12]/([p12]+K_{d})) en los datos. (C) Unión de
E. coli a p12 biotinilada que se ha inmovilizado sobre chips
de estreptavidina. E. coli D21eS (_), cuya región central
interna está completa, se une a p12. Por el contrario, E.
coli D21f2 (- - - -), que posee una región
central altamente acortada, no se une a p12. Las medidas se llevaron
a cabo en PBS.
La Figura 3 muestra esquemáticamente la
estructura de la región central de endotoxina de distintos mutantes
de E. coli.
La Figura 4 muestra en un diagrama de barras el
comportamiento de unión de la proteína de cola de bacteriófago p12 a
endotoxina que se había unido mediante polimixina B a columnas de
cromatografía (0,5 ml). Se aclararon respectivamente dos columnas de
polimixina B con endotoxina de E. coli 055:B5 (10^{6}
UE/ml) (+LPS, barra negra) y se lavaron dos columnas con agua (-
LPS, barra rayada). Se aplicó la cantidad de proteína de cola de
bacteriófago p12 frente a las fracciones de elución cromatográfica.
Cada barra muestra el valor medio que se estableció a partir de dos
eluciones cromatográficas paralelas. El primer par de barras (A)
muestra la cantidad de p12 aplicada y el segundo la fracción 1 (F1),
una fracción de control antes de la aplicación de p12 sobre la
columna. La flecha marca la aplicación de p12 sobre la columna. Se
combinaron las fracciones 2-5 después de la
aplicación. Se estableció la concentración de p12 mediante medida de
absorción a 280 nm. El volumen de fracción para las fracciones
1-4 ascendía a 1 ml y a 2 ml para la fracción 5. La
regeneración de la columna en la fracción 5 se realizó mediante la
adición de EDTA 2 mM al tampón de elución (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM,
CaCl_{2} 0,1 mM pH 7,5). Se retuvo la proteína de cola de
bacteriófago p12 en las columnas que se habían cargado antes con
endotoxina, mientras que por las columnas que no contenían
endotoxina eluyó sin retardo.
Las Figuras 5A y B muestran en una gráfica la
reducción de fluorescencia del mutante de T4p12 W359_283Y tras la
adición de endotoxina-polisacárido (de Salmonella
thyphimurium). A) Se midió la fluorescencia del mutante de p12
W359_283Y (40 \mug/ml) en el intervalo de 305-450
nm después de excitación a 295 nm. Después de la adición de 3 \mul
de polisacárido (10 mg/ml) (curva gris) a 120 \mul de disolución
con el mutante de p12 W359_283Y, pudo observarse en comparación con
la muestra no tratada (curva negra) una reducción de la
fluorescencia. Las curvas se corrigieron frente a las medidas de
control sin el mutante de p12. La Figura B) muestra la reducción
porcentual de la fluorescencia del mutante de p12 W359_283Y
dependiendo de la concentración de
endotoxina-polisacárido aplicada. La longitud de
onda de excitación era de 295 nm y la longitud de onda de emisión de
350 nm. Se dispuso el mutante de p12 W359_283Y (200 \mug/ml o 3,6
\muM) y se tituló con endotoxina-polisacárido. Se
aplican al eje X las concentraciones finales de
endotoxina-polisacárido. Se corrigieron los valores
de medida frente a las medidas de control sin el mutante de p12
W359_283Y. A partir de una concentración de polisacárido de 500 nM,
pudo medirse una clara reducción de la fluorescencia.
\newpage
La Figura 6 muestra la unión de un anticuerpo
anti-lípido A a lipopolisacárido que se ha unido
mediante T4p12 a una superficie. La unión se observó mediante la
medida de la señal de resonancia de plasmón de superficie con un
Biacore J. En primer lugar, se inmovilizó covalentemente T4p12 sobre
una célula de flujo continuo (chip CM-5 de Biacore)
mediante los grupos amino primarios correspondientemente a las
instrucciones del fabricante. A continuación, se inyectó
lipopolisacárido de E. coli O55:B5 (LPS, 0,1 mg/ml). Se
marcan las fases de inyección mediante barras sobre la curva de
medida. El aumento de la señal de resonancia muestra la unión de
lipopolisacárido a T4p12. También después de terminada la inyección,
la señal de resonancia permanece elevada y por tanto el
lipopolisacárido unido a la superficie. A continuación, se
inyectaron tres veces un anticuerpo (AK) contra lipopolisacárido (2
\mug/ml, anticuerpo policlonal contra lípido A de Accurate
Chemical & Scientific Corporation). El aumento de la señal de
resonancia en cada inyección muestra la unión del anticuerpo.
Mediante la adición de EDTA (EDTA), pudo disociarse la unión de
lipopolisacárido a T4p12. La señal de resonancia vuelve al nivel de
partida. Una segunda célula de flujo continuo permaneció sin tratar
y sirvió como referencia. La curva representada muestra la
diferencia de señal de la célula de medida y la célula de
referencia.
La Figura 7 muestra una comparación de distintas
proteínas de cola de bacteriófago p12 a nivel de aminoácidos. Las
proteínas proceden de fagos de la familia Myrovidiae y poseen
una homología de al menos un 60% con T4p12. Las proteínas p12 usadas
para la comparación proceden de los fagos T2 (nº de acceso al banco
de datos NCBI CAA39905; SEC ID NO: 9), T4 (AAD42417; SEC ID NO: 10),
PP01 (BAD20635; SEC ID NO: 11), RB69 (AAP76072; SEC ID NO: 12) y AR1
(AAN03609; SEC ID NO: 13). Las proteínas de los fagos K3 (Btuda M.R.
y col., Biol. Chem. (2000) 381, 225-258),
RB32-33 y Ox2 presentan una homología similar con
los fagos anteriormente citados.
El término "material de muestra" o
"muestra" como se usa aquí comprende disoluciones enteras en
las que deben detectarse endotoxinas. Son ejemplos de disoluciones
la siguiente enumeración: disoluciones acuosas y mezclas de agua y
disolventes orgánicos, sangre, productos sanguíneos, plasma, suero,
orina y medios. Son además ejemplos de disoluciones aquellas en que
se han disuelto sustancias sólidas para analizar o sustancias de
bajo peso molecular y/o alto peso molecular para purificar, por
ejemplo, azúcares, sales, antibióticos, proteínas, ADN, ARN,
alimentos, medicamentos, vacunas o productos químicos orgánicos e
inorgánicos como, por ejemplo, NaCl, MgCl_{2}, purinas o
pirimidinas.
El término "endotoxina" como se usa aquí
designa el lipopolisacárido bacteriano que es componente de la
membrana externa de bacterias gramnegativas. Endotoxina designa no
sólo el lipopolisacárido completo, sino también los componentes
individuales, por ejemplo el lípido A, la región central interna o
externa.
El término "proteína de cola de
bacteriófago" como se usa aquí designa aquellas proteínas que
aparecen en bacteriófagos y pueden unirse a endotoxinas.
Habitualmente, estas proteínas se localizan en la cola de
bacteriófagos, pero pueden localizarse también en la cabeza de
bacteriófagos o en bacteriófagos sin cola sobre la cubierta de
bacteriófago normal. El término proteína de cola de bacteriófago
comprende tanto proteínas de cola de bacteriófago cortas como
largas. Así, los bacteriófagos con una placa base (por ejemplo
Myoviridae como fagos similares a T4) pueden presentar
diferentes proteínas de cola de bacteriófago, las denominadas
proteínas de cola de bacteriófago largas o cortas, que poseen
también distinta especificidad por estructuras de las membranas
bacterianas.
El término "homología" aquí usado designa
una similitud significativa de una secuencia de aminoácidos con una
secuencia comparativa o partes de la misma. La homología de una
secuencia se determina con la ayuda del algoritmo de similitud
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul y col.,
Journal of Molecular Biology 215, 403-410
(1990). Se designan como significativamente similares, como se usa
aquí, secuencias que presentan una homología de al menos un 60% o
que, por ejemplo, usando parámetros estándar en el servicio BLAST
del NCBI, presentan un nivel de significancia (valor de E o
probabilidad) de P < 10^{-5} cuando se comparan con las
secuencias comparativas.
El término "inmovilización inespecífica" o
"inmovilización no dirigida" como se usa aquí significa que el
acoplamiento de una proteína con una superficie se realiza por
restos de proteína (por ejemplo aminas primarias) que pueden estar
distribuidos por toda la superficie proteica. La selección del grupo
usado para el acoplamiento de la molécula de proteína particular es
al azar.
El término "superficie" o "portador"
como se usa aquí comprende todos los materiales en los que es
posible un acoplamiento o adhesión de una molécula de proteína
como, por ejemplo, superficies de vidrio, materiales de
cromatografía, por ejemplo, agarosa o Sepharose, superficies de
plástico, por ejemplo, poliestireno o polipropileno y materiales de
filtro, por ejemplo, celulosa.
El término "inmovilización dirigida" como
se usa aquí significa que el acoplamiento se realiza mediante restos
de aminoácidos u otros restos (por ejemplo, glucosilaciones de
proteína) cuya posición en la proteína (por ejemplo, N- o
C-terminal) es conocida. La selección de estos
grupos para el acoplamiento se realiza mediante la selección de las
parejas/ligadores de reacción adecuados que reaccionan
preferiblemente con estos restos (por ejemplo, acoplamiento de
restos sulfhidrilo con restos yodoacetato; el yodoacetato reacciona
mil veces más rápido con restos sulfhidrilo que con restos
amino).
Un aspecto se refiere a un procedimiento para la
detección de endotoxina que comprende las etapas de:
a) incubación de una muestra con proteínas de
cola de bacteriófago y a continuación
b) detección de endotoxina unida a proteínas de
cola de bacteriófago mediante procedimientos espectroscópicos,
ELISA, reacción de detección química o enzimática de endotoxinas o
componentes escindidos de endotoxinas, o mediante medida de la
capacidad.
Dado el caso, se introduce después de la etapa
a) y antes de la etapa b) una etapa adicional a') de separación del
complejo de proteína de cola de
bacteriófago-endotoxina de la muestra.
La detección mediante procedimientos
espectroscópicos puede llevarse a cabo, por ejemplo, con emisión de
fluorescencia, polarización de fluorescencia, absorción o dicroísmo
circular, la detección mediante medida de la capacidad puede
llevarse a cabo, por ejemplo, mediante señales eléctricas. Las
detecciones citadas pueden combinarse además con una detección
competitiva.
Preferiblemente, se describe un procedimiento en
el que después de la separación del complejo de proteína de cola de
bacteriófago-endotoxina formado en la etapa a) de la
muestra, se realiza la detección de las endotoxinas mediante
reacciones inmunológicas, químicas o enzimáticas. Para ello, pueden
unirse las proteínas de cola de bacteriófago con ayuda de ligandos
especiales como, por ejemplo, biotina, marcador Strep o marcador
His, a los correspondientes portadores, por ejemplo, Sepharose o
perlas magnéticas que están recubiertas con estreptavidina o
Streptactine. A continuación, puede realizarse, si se desea, una
separación del portador de grano grueso mediante filtración,
centrifugación o separación magnética de la muestra. Se desea la
separación, particularmente, cuando el complejo de proteína de cola
de bacteriófago-endotoxina está fijado a una
superficie que no puede utilizarse en las detecciones usadas.
La detección inmunológica se realiza, por
ejemplo, mediante la unión de anticuerpos específicos de endotoxina
a las endotoxinas, la unión de un anticuerpo secundario al
anticuerpo primario y la posterior detección mediante una reacción
enzimática que se cataliza mediante una enzima fusionada con un
anticuerpo secundario (ELISA).
La detección de endotoxina puede realizarse
también después de la escisión química de la endotoxina mediante
ácido o base y posterior detección de los componentes de endotoxina
individuales, como ácido 2-cetodesoxioctulosónico,
heptosas (Lee C.-H., Tsai C.-M., Analytical Biochemistry,
1999; 267: 161-168) o ácidos hidroxigrasos (Lyngby
J., Olsen L.H., Eidem T., Lundanes E., Jantzen E., Biologics,
2002; 30: 7-13).
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la detección de endotoxina que comprende las
etapas de:
a) la puesta en contacto de una muestra que
contiene endotoxinas con un portador, a continuación
b) la incubación de proteínas de cola de
bacteriófago en endotoxina inmovilizada sobre el portador, y
c) la detección de proteínas de cola de
bacteriófago mediante procedimientos espectroscópicos, ELISA,
reacciones de detección química o enzimática de endotoxinas o
componentes escindidos de endotoxinas o mediante medida de la
capacidad.
Dado el caso, se lleva a cabo después de la
etapa b) una etapa b') adicional de separación de las proteínas de
cola de bacteriófago unidas de la endotoxina.
Se prefieren particularmente las proteínas p12
de los fagos K3, T2, T4, Ox2, RB32-33, AR1, PP01 o
RB69.
Se prefiere un procedimiento en el que, después
de la unión de endotoxina a una superficie que porta ligandos de
unión a endotoxina como polimixina B,
poli-L-lisina, quitosano y
similares, se unen las proteínas de cola de bacteriófago a las
endotoxinas inmovilizadas y se detectan estas proteínas de cola de
bacteriófago mediante una reacción enzimática a continuación. Las
proteínas de cola de bacteriófago pueden detectarse mediante ELISA
que es específica de proteína de cola de bacteriófago, o mediante
enzimas que se fusionan con la proteína de cola de bacteriófago por
ingeniería genética o se unen mediante reacciones químicas. En las
enzimas, se trata, por ejemplo, de fosfatasa alcalina, peroxidasa u
otras.
Preferiblemente, antes de la etapa de incubación
del procedimiento según la invención, se ajusta la composición
iónica de los iones difuncionales, por ejemplo, Ca^{2+}, Mg^{2+}
y/o el valor de pH para obtener una unión de
endotoxina-proteína de cola de bacteriófago óptima.
Además, se prefiere en o después de la incubación un
"desenmascaramiento" de la endotoxina unida mediante la adición
de detergentes y/o sales, por ejemplo, Tween, Triton, NaCl o
sulfato de amonio u otras sustancias, por ejemplo, quitosano,
azúcares o lípidos, que aceleran la disociación de las endotoxinas
de, por ejemplo, proteínas o ácidos nucleicos.
La proteína de cola de bacteriófago usada para
la detección de endotoxina puede ser de origen natural o modificada
por biología molecular o bioquímica. Se prefieren particularmente
proteínas de bacteriófago que se unen a zonas muy conservadas de
endotoxina, a saber, a la región central de LPS o a lípido A. se
prefieren particularmente las proteínas de cola de bacteriófago
cortas, preferiblemente de fagos de Myoviridae. Sin embargo,
pueden usarse también las proteínas de unión a endotoxina de una
cabeza de bacteriófago o las cubiertas de bacteriófago normales de
bacteriófagos sin cola. Se prefieren muy especialmente proteínas de
cola de bacteriófago con una homología de al menos un 60% a nivel
de aminoácidos con la proteína p12 de T4. La proteína de cola de
bacteriófago puede estar modificada por distintas razones por
ingeniería genética y/o bioquímica. Para los procedimientos según
la invención, pueden usarse sin embargo no sólo las proteínas de
cola de bacteriófago de origen natural, sino también sus variantes.
Variantes significa en el sentido de la presente invención que las
proteínas de cola de bacteriófago presentan una secuencia de
aminoácidos modificada. Estas pueden obtenerse mediante cribado de
las variantes de origen natural o mediante mutagénesis aleatoria o
mutagénesis dirigida, pero también mediante modificación química.
Las proteínas de cola de bacteriófago usadas para los procedimientos
según la invención pueden adaptarse en su especificidad o
propiedades de unión a las estructuras portadoras mediante una
mutagénesis dirigida o aleatoria. Esta unión al portador puede
realizarse fuertemente, por ejemplo covalente o mediante una
biotinilización inespecífica o no específica, o también
reversiblemente, por ejemplo mediante un puente disulfuro
reducible. Además, la estabilidad puede elevarse mediante una
modificación. Mediante mutagénesis de biología molecular o química,
se introducen mutaciones que pueden ser adiciones, deleciones,
sustituciones de aminoácidos o modificaciones químicas. Estas
mutaciones pueden causar una alteración de la secuencia de
aminoácidos en la región de unión de las proteínas de cola de
bacteriófago, con el fin de adaptar la especificidad y afinidad de
unión a las necesidades del ensayo, por ejemplo, para elevar o hacer
irreversible la unión de endotoxinas a las proteínas de cola de
bacteriófago para mejorar la detección. Además, puede llevarse a
cabo una modificación por ingeniería genética o bioquímica de las
proteínas de fago con el fin de desconectar la actividad enzimática
presente dado el caso para mejorar así la unión o hacerla
irreversible. Además, puede llevarse a cabo una modificación por
ingeniería genética o química de las proteínas de fago para adaptar
las propiedades físicas presentes de la proteína como solubilidad,
termoestabilidad y demás en el sentido del procedimiento según la
invención.
Además, puede realizarse una conexión de las
proteínas de cola de bacteriófago con proteínas activas enzimáticas
para poder detectar las proteínas de cola de bacteriófago más
sensiblemente. Las proteínas activas enzimáticas como fosfatasa
alcalina o peroxidasa de rábano picante, para las que hay sustratos
comerciales, pueden conectarse mediante procedimientos de
acoplamiento químico o mediante fusión por ingeniería genética con
las proteínas de cola de bacteriófago. La reacción enzimática que
se introduce mediante estas proteínas eleva claramente la
sensibilidad de la detección.
Los trabajos para elucidar la estructura
tridimensional de p12 de T4 han mostrado que a temperatura elevada
pueden producirse fragmentos de 33 kDa y 45 kDa que están acortados
de forma N- y C-terminal (33 kDa) o sólo
N-terminal (45 kDa). En contraposición con el
fragmento de 33 kDa, el fragmento de 45 kDa es todavía capaz de
unirse a bacterias (Thomassen, E., y col., Mol. Biol.; 331:
361-373, 2003). Por lo tanto, el extremo C
participa en la unión celular. Por tanto, mediante una modificación
N-terminal puede llevarse a cabo una unión dirigida
a la superficie y así por último optimizar indirectamente la unión
de endotoxina. Además, es posible una optimización directa de la
unión de endotoxina.
La modificación puede tener además
particularmente el fin de posibilitar una detección directa, por
ejemplo mediante la medida de la fluorescencia de triptófano. Por
ejemplo, la p12 de T4 posee cinco restos de triptófano. El espectro
de fluorescencia de la proteína nativa sugiere que estos restos
están lo más posible inaccesibles al disolvente. A partir de una
pluralidad de trabajos científicos, es conocido que casi siempre los
aminoácidos aromáticos participan en la unión de restos de azúcar,
como se presentan también en endotoxinas. La unión de restos de
azúcar a la proteína puede seguirse mediante la inactivación de la
fluorescencia de triptófano o dado el caso también adicionalmente
mediante una alteración del máximo de fluorescencia. Los trabajos
propios permiten suponer que la distribución desventajosa de los
fluoróforos de p12 natural impide el aprovechamiento de las
propiedades de fluorescencia de p12 para la medida de la unión. Las
propiedades de fluorescencia de p12 están regidas por los cinco
restos de triptófano, cuya fluorescencia no cambia mensurablemente
por la adición de endotoxina. Estos datos permiten esperar que los
restos de tirosina, más que los restos de triptófano, participen en
la unión, cuya alteración de señal no puede hacerse visible ante el
alto fondo del triptófano. Basándose en los resultados de la
proteólisis, se tienen en cuenta seis tirosinas en el extremo C de
p12 para el kit de detección de endotoxina, que pueden hacerse
"visibles" correspondientemente. Mediante un intercambio de
biología molecular selectivo de los cinco restos de triptófano por
tirosinas, se alteran selectivamente en una primera etapa las
propiedades espectroscópicas de modo que la unión a endotoxina sea
mensurable mediante una alteración de la señal de fluorescencia de
un resto de triptófano individual. A continuación, se eleva
significativamente la intensidad de la señal mensurable mediante un
intercambio selectivo respectivamente de una de las seis tirosinas
en la zona C-terminal por un resto de triptófano,
para obtener el desarrollo de diferencias de señal atractivas para
un kit de detección de endotoxina. Como se muestra para la proteína
p12 de T4, pueden modificarse también correspondientemente otras
proteínas de cola de bacteriófago cortas como, por ejemplo,
aquellas de fagos Myoviridae como T4, T2, K3, Ox2,
RB32-33 o RB69. También aquí pueden usarse sin
embargo igualmente las proteínas de unión a endotoxina de una cabeza
de bacteriófago o la cubierta de bacteriófago normal de
bacteriófagos sin cola, particularmente de PhiX 174.
Cuáles proteínas de cola de bacteriófago usar
depende de cuáles endotoxinas deban detectarse. Ya ahora está a
disposición un gran número de bacteriófagos conocidos para la
mayoría de las bacterias descritas hasta ahora y pueden usarse para
el procedimiento según la invención. Los fagos y las
correspondientes bacterias hospedadoras son obtenibles, entre
otras, a partir de las siguientes colecciones de cepas: ATCC
(EE.UU.), DSMZ (Alemania), UKNCC (Reino Unido), NCCB (Holanda) y
MAFF (Japón); o pueden aislarse mediante procedimientos
microbiológicos estándar a partir de muestras ambientales. Las
proteínas de bacteriófago pueden proceder de la familia de
Myoviridae, o sea, ser proteínas de cola cortas,
particularmente del grupo de fagos
Pseudo-T-Even,
Schizo-T-Even o
T-Even. Preferiblemente, se usan para la detección
según la invención las proteínas de cola de bacteriófago cortas de
los fagos K3, T2, T4, Ox2, RB32-33, AR1, PP01 y RB69
o las proteínas de unión a endotoxina de bacteriófagos sin cola, por
ejemplo, de PhiX 174.
Preferiblemente, las proteínas de cola de
bacteriófago para el procedimiento según la invención provienen de
bacteriófagos cuyas bacterias hospedadoras tienen importancia médica
o biotecnológica relevante como, por ejemplo E. coli, que se
usa en la producción de proteínas recombinantes o de ácidos
nucleicos para terapia génica. Se prefieren especialmente proteínas
de cola de bacteriófago que se unen a zonas fuertemente conservadas
de la endotoxina como, por ejemplo, la región central o el lípido A.
Se prefieren particularmente T4p12 y proteínas de cola de
bacteriófago similares a T4p12, por ejemplo, T2-p12,
K3-p12 (Burda M.R., Hindennach I., Miller S.,
Biol. Chem. 2000; 381: 255-258). En una
combinación de impurezas de endotoxina de distintas bacterias
hospedadoras, puede utilizarse para las detecciones o
empobrecimientos según la invención una combinación de las
correspondientes proteínas de cola de bacteriófago reconocidas por
endotoxina.
La detección de la endotoxina en o de una
muestra se realiza mediante la unión de endotoxina a proteínas de
cola de bacteriófago. Esta unión puede detectarse, por ejemplo,
mediante medida directa mediante procedimientos espectroscópicos,
por ejemplo, mediante emisión de fluorescencia, polarización de
fluorescencia, absorción o dicroísmo circular. Además, la unión
puede hacerse visible mediante señales eléctricas, por ejemplo, una
medida de capacidad. Además, la unión de endotoxina a proteínas de
cola de bacteriófago puede detectarse también indirectamente
mediante experimentos de desplazamiento.
Además, la unión de proteínas de cola de
bacteriófago a endotoxina puede detectarse inmovilizando en primer
lugar sobre una superficie la endotoxina sobre otras sustancias de
unión a endotoxina o también mediante una segunda proteína de cola
de bacteriófago, y uniendo a continuación otra proteína de cola de
bacteriófago a la endotoxina. Después de la eliminación por lavado
de la proteína de cola de bacteriófago en exceso, se cuantifica a
continuación la cantidad de la otra proteína de cola de bacteriófago
unida. Esto se realiza mediante anticuerpos contra la otra proteína
de cola de bacteriófago (el denominado ELISA) o mediante una
reacción enzimática que se cataliza mediante una proteína que está
fusionada con la otra proteína de cola de bacteriófago. La
superficie puede recubrirse por tanto previamente con sustancias de
unión a endotoxina como, por ejemplo, polimixina B, histidina,
histamina, poli-L-lisina, DEAE,
polietilenimina, ácido desoxicólico,
poli-\gamma-aminometil-L-glutamina,
poli(alcohol vinílico),
poli-N,N-dimetilaminopropilacrilamida, dextrano, quitosano y
similares. Además, puede usarse también una proteína de cola de
bacteriófago para la inmovilización de endotoxina. La detección de
la endotoxina se realiza entonces con una segunda proteína de cola
de bacteriófago que posee otras propiedades de unión a endotoxina
que la proteína de cola de bacteriófago empleada para la
inmovilización. La inmovilización de sustancias de unión a
endotoxina se realiza a este respecto mediante adhesión,
acoplamiento covalente o unión mediante grupos de inmovilización
especiales como biotina, estreptavidina, marcador Strep, marcador
His y grupos comparables. La detección de la proteína de cola de
bacteriófago puede realizarse también mediante la disociación de la
proteína de la superficie.
Para las detecciones según la invención, pueden
acoplarse las proteínas de cola de bacteriófago, en caso de
necesitar una separación del complejo de proteína de cola de
bacteriófago-endotoxina de la muestra, con
superficies adecuadas, por ejemplo, partículas imantadas,
partículas de Sepharose, partículas de agarosa, placas de
microvaloración, materiales de filtro o cámaras celulares de flujo
continuo (detección indirecta). Las estructuras portadoras pueden
estar compuestas, por ejemplo, por poliestireno, polipropileno,
policarbonato, PMMA, acetato de celulosa, nitrocelulosa, vidrio,
silicio o agarosa. El acoplamiento puede conseguirse, por ejemplo,
mediante adsorción o unión covalente.
Es importante a este respecto un acoplamiento
funcional, es decir, que las proteínas de cola de bacteriófago
dispongan de estructuras o puntos de unión accesibles para la
endotoxina a pesar de la unión al material portador. El
acoplamiento de las proteínas de cola de bacteriófago puede
realizarse inespecíficamente o también preferiblemente de forma
dirigida, por ejemplo, mediante una biotinilización selectiva, o
acoplado mediante un espaciador o ligador.
Para ello, pueden conectarse las proteínas de
cola de bacteriófago con sustancias de bajo peso molecular, por
ejemplo biotina, para unirse mediante estas sustancias de bajo peso
molecular a polipéptidos, por ejemplo, estreptavidina, que a su vez
se han inmovilizado sobre el portador. En lugar de biotina, puede
usarse además el denominado marcador Strep (Skerra, A. y Schmidt,
T. G. M. Biomolecular Engineering 16 (1999),
79-86), que es una secuencia de aminoácidos corta
que se une a estreptavidina. Además, puede usarse el marcador His,
que puede unirse mediante iones bifuncionales (cinc o níquel) o un
anticuerpo específico del mismo (Qiagen GmbH, Hilden) a un material
portador. El marcador Strep así como el marcador His se unen
preferiblemente mediante tecnología de ADN recombinante a proteínas
de bacteriófago preparadas recombinantemente. Este acoplamiento
puede realizarse dirigido, por ejemplo al extremo N o C o a otras
posiciones en la proteína de cola de bacteriófago. El acoplamiento
dirigido se realiza mediante un aminoácido adecuado reactivo de
forma natural en proteínas de fago no expuesto a superficie
frecuentemente como la cisteína, que se ha introducido
selectivamente en los sitios adecuados. Ya que las proteínas de
cola de fago se sintetizan en el citoplasma, no hay que contar con
puentes disulfuro. Preferiblemente, sin embargo, pueden acoplarse
directamente mediante otros aminoácidos, o también indirectamente
como en cisteína mediante un "espaciador" o "reticulante"
(monofuncional o bifuncional).
En el acoplamiento de cisteína, son posibles
todos los reticulantes bifuncionales con grupos reactivos NH y SH
con y sin espaciador intermedio, por ejemplo,
sulfo-NHS del ácido
11-maleimidoundecanoico o
4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxi-[6-amido]caproato
de succinimidilo. En caso de no estar presente ningún espaciador,
pueden insertarse espaciadores de 8-12 átomos de C
con grupos NH terminales. Preferiblemente, se realiza el
acoplamiento mediante una biotinilización específica de la
cisteína, por ejemplo, mediante biotina activada con
EZ-Link-PEO-maleimida
Biotin (Pierce).
Los iones divalentes, por ejemplo Ca^{2+} o
Mg^{2+}, son importantes para la unión de endotoxinas a proteínas
de cola de bacteriófago como p12 de T4 o las proteínas de fibra de
cola cortas de los fagos K3, T2, Ox2, RB32-33, AR1,
PP01 o RB69. Mediante la adición de quelantes adecuados como, por
ejemplo, EDTA o EGTA, puede disociarse sin embargo esta unión. Se
prefieren para la unión concentraciones de Ca^{2+} en el intervalo
de aproximadamente 0,1 \mum a aproximadamente 100 mM, con
especial preferencia en el intervalo de aproximadamente 0,1 \muM
a aproximadamente 10 mM, con particular preferencia en el intervalo
de aproximadamente 0,1 \muM a aproximadamente 1 mM y además con
particular preferencia en el intervalo de aproximadamente 10 \muM
a 1 mM. Se prefieren además para la unión concentraciones de
Mg^{2+} en el intervalo de aproximadamente 0,1 \muM a
aproximadamente 10 mM, con especial preferencia en el intervalo de
aproximadamente 0,1 \muM a aproximadamente 1 mM, con particular
preferencia en el intervalo de aproximadamente 10 \muM a 1 mM. Si
se reduce la concentración de iones bifuncionales mediante la
adición de EDTA 1 mM por debajo de 100 nM, se disocia la unión de
endotoxina a p12. Concentraciones de Mg^{2+} superiores a 10 mM
empeoran la unión de endotoxina a p12, lo que se observa por una
elevación de la constante de disociación. Sin la adición de
Mg^{2+}, resulta un valor de K_{d} de 50 nM, y en un tampón con
Mg^{2+} 10 mM, se midió un valor de K_{d} de 1 \muM. El cinc
mostró un efecto inhibidor aún más fuerte. El Zn 1 mM eleva el
valor de K_{d} a 10 \muM. Puede realizarse un ajuste de la
concentración de iones bifuncionales u otros (por ejemplo:
Cu^{2+}, Al^{3+}, Zn^{2+}, Fe^{2+}, Ca^{2+}, Ba^{2+},
Mg^{2+}, Cd^{2+}) a un intervalo óptimo para la unión mediante
sustancias como HEDTA, NTA o quelantes/tampones generales (ADA:
ácido
N-[2-acetamido]-2-iminodiacético;
5-AMP: 5'-monofosfato de adenosina;
ADP: 5'-difosfato de adenosina; ATP:
5'-trifosfato de adenosina; Bapta: ácido
1,2-bis-(2-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético;
citrato: ácido cítrico; EDTA: ácido etilendiaminotetraacético;
EGTA: ácido
etilenglicolbis-(\beta-aminoetileter)-N,N,N',N'-tetraacético;
HEDTA: ácido N-hidroxietiletilendiaminotriacético; NTA:
ácido nitrilotriacético; SO_{4}: sulfato), que pueden emplearse
como tampón para iones bifuncionales.
Los procedimientos según la invención pueden
comprender por tanto además etapas de lavado. Dependiendo de si la
detección directa o indirecta necesita una separación de muestra y
proteínas de cola de bacteriófago, pueden incorporarse etapas de
lavado. Ya que el Ca^{2+} u otros iones metálicos (por ejemplo
Mg^{2+}) son esenciales para la unión, puede disociarse la unión
de endotoxina, por ejemplo a p12 (por ejemplo, las proteínas de
fibra de cola cortas de los fagos K3, T2, T4, Ox2,
RB32-33, AR1, PP01 y RB69) mediante etapas de
lavado adecuadas. Dependiendo del fin, si la endotoxina debe quedar
unida a la proteína de cola de bacteriófago, por ejemplo, p12 (por
ejemplo las proteínas de fibra de cola cortas de los fagos K3, T2,
T4, Ox2, RB32-33, AR1, PP01 y RB69), se lava con
tampón exento de EDTA; si la unión debe disociarse, con tampón que
contiene EDTA, encontrándose las concentraciones de EDTA en el
intervalo de al menos 0,05 mM a más de 10 mM, preferiblemente en el
intervalo de 2 mM a 5 mM.
Ya que las interacciones iónicas son en
principio siempre influenciables mediante alteraciones de la fuerza
iónica, pueden influir también elevaciones o reducciones de otras
sales en disolución como, por ejemplo, NaCl o KCl, en la unión de
endotoxina a las proteínas de cola de bacteriófago.
Para hacer visible directa o indirectamente la
unión en procedimientos de detección, puede alterarse también la
proteína por biología molecular o bioquímica, para posibilitar la
medida o para mejorarla. Para hacer directamente visible la unión
de endotoxina, por ejemplo, p12 de T4 o las proteínas de fibra de
cola cortas de los fagos K3, T2, T4, Ox2, RB32-33,
AR1, PP01 o RB69 o las proteínas de unión a endotoxina de
bacteriófagos sin cola, puede llevarse a cabo un intercambio por
biología molecular de restos de tirosina por triptófano. Para una
reducción del señal de fondo, puede ser necesario a este respecto
intercambiar los triptófanos contenidos originalmente por
tirosinas. Para poder medir también en disoluciones que contienen
proteína, puede modificarse químicamente además p12 de T4 o las
proteínas de fibra de cola cortas de los fagos K3, T2, T4, Ox2,
RB32-33, AR1, PP01 o RB69 después de la
introducción de triptófano. A este respecto, se alteran restos de
triptófano mediante el reactivo de Koshland (bromuro de
2-hidroxi-5-nitrobencilo)
respecto a sus propiedades espectroscópicas. En experimentos de
desplazamiento, puede desplazarse, por ejemplo, por endotoxina
marcada con fluorescencia (por ejemplo de Sigma) la endotoxina que
se encuentra en la muestra, por ejemplo, de p12 de T4 o las
proteínas de fibra de cola cortas de los fagos K3, T2, T4, Ox2,
RB32-33, AR1, PP01 o RB69 o, por ejemplo, PhiX 174 y
determinarse la concentración de endotoxina fluorescente libre.
Con el procedimiento según la invención, puede
detectarse endotoxina de y en todas las disoluciones acuosas. Estas
disoluciones pueden contener proteínas, ADN de plásmido, ADN
genómico, ARN, peptidoglicanos, polisacáridos, complejos de
proteína-ácido nucleico como, por ejemplo, fagos o virus, sacáridos,
vacunas, medicamentos, tampones de reacción, disoluciones tampón
generales, medios, tampón de diálisis (medicina), sales, sangre,
componentes sanguíneos u otras sustancias de contaminadas por unión
a endotoxina.
Son otro aspecto de la invención proteínas de
bacteriófago a las que se acoplan los denominados marcadores, por
ejemplo, el marcador Strep o el marcador His, preferiblemente en el
extremo N o C de la proteína, con especial preferencia el extremo
C. Se prefiere el acoplamiento o conexión del marcador con las
proteínas de bacteriófago mediante tecnología de ADN recombinante.
La preparación de ácidos nucleicos que comprenden la secuencia de
la proteína de bacteriófago y el marcador y la preparación del
producto de expresión son estado de la técnica y no tienen que
ilustrarse aquí separadamente. Es otro aspecto de la invención la
secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de
bacteriófago junto con el marcador Strep o His. Es una proteína de
bacteriófago modificada con el marcador Strep o His la proteína p12
del fago T4, pero se prefieren igualmente todas las demás proteínas
de bacteriófago que participan en el reconocimiento y unión de
bacterias o que son responsables de los mismos.
Para los procedimientos según la invención, se
usan preferiblemente proteínas de bacteriófago con un marcador que
presenta una cisteína expuesta en superficie para biotinilación
específica dirigida, por ejemplo, el marcador según las SEC ID NO:
5, 6 y 7. Es un ejemplo de p12 con marcador la secuencia de
aminoácidos indicada en la SEC ID NO: 8. Se prefiere una p12 con un
marcador, particularmente con un marcador con una cisteína expuesta
en superficie, particularmente una p12 con el marcador según las SEC
ID NO: 6 y 7. Esta biotinilación dirigida puede mediarse
adicionalmente mediante un espaciador o ligador adecuado.
Los procedimientos según la invención ofrecen
ventajas frente a los procedimientos de detección de endotoxina
actuales en el rendimiento de las correspondientes aplicaciones.
Además, la preparación de anticuerpos contra
LPS-oligosacáridos centrales es muy difícil, lo que
puede hacer muy caros los correspondientes procedimientos basados en
anticuerpos.
La presente invención se refiere además a un kit
de detección de endotoxina que comprende los componentes necesarios
para el procedimiento según la invención. El kit comprende
particularmente un portador recubierto con las proteínas de cola de
bacteriófago aquí descritas, un envase que contiene una endotoxina
de referencia para la creación y medida de una curva patrón, otro
envase con al menos otra proteína de cola de bacteriófago aquí
descrita que puede estar modificada dado el caso para la detección o
acoplada con una proteína activa como se describe aquí o un envase
con anticuerpos anti-lípido A para la detección de
endotoxina.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no han de considerarse limitantes. A menos que se indique otra
cosa, se han usado los procedimientos de biología molecular estándar
como se describen, por ejemplo, en Sambrook y col., 1989,
"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. Los
experimentos descritos a continuación se llevaron a cabo con
proteínas p12 de T4, T2 y K3. A menos que se declare explícitamente
de otro modo, se han indicado sólo los resultados para p12 de T4,
ya que los resultados de las tres proteínas son intercambiables
debido a la alta homología (Burda M.R., Hindenach I., Miller S.,
Biol. Chem. (2000) 381, 225-258) (Riede I.,
Mol. Gen Genet. Ene 1987; 206 (1): 110-115).
Esto se aplica igualmente a las otras proteínas indicadas en la
Figura 7.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la eliminación de endotoxinas, se
despirogenizaron todos los recipientes de vidrio mediante cocción a
200ºC (4 h) y se usaron exclusivamente materiales de plástico
exentos de pirógenos (por ejemplo, puntas de pipeta, placas de
microvaloración). Los demás dispositivos o recipientes no
termorresistentes se trataron con peróxido de hidrógeno al 3% o se
lavaron con desoxicolato de sodio al 1%. A continuación, se aclaró
con agua exenta de endotoxinas. Se prepararon los tampones a partir
de sustancias tampón ampliamente exentas de endotoxinas (Sigma) y
se cargaron en agua exenta de endotoxinas. Se cocieron (200ºC, 4 h)
las sales como, por ejemplo NaCl, que pueden calentarse a 200ºC. Se
desgasificó y filtró el tampón usado para purificaciones
cromatográficas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo detecciones de control de
endotoxina con un ensayo LAL cromogénico (ensayo de lisado de
amebocitos de Limulus, Charles-River
Endosafe, Charleston, EE.UU.) correspondientemente a las
indicaciones del fabricante. Para la determinación de la
concentración, se utilizó endotoxina patrón
(Charles-River Endosafe, Charleston, EE.UU.) en el
intervalo de 0,005-50 ó 0,02-50
UE/ml. La medida de absorción a 405 nm se realizó en un lector de
placas de microvaloración termorregulable (Genios, Tecan GmbH).
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó la detección de p12 en el
sobrenadante de muestras tratadas con perlas o en las fracciones de
cromatografía de afinidad mediante transferencias Western. Se
concentraron en parte las proteínas previamente mediante
precipitación con NaDOC/TCA (desoxicolato/tetracloroacetato de
sodio). Se separaron electroforéticamente así las muestras sobre
geles de SDS al 12% y se transfirieron a membranas de PVDF
(Immobilon, Millipore). Se lavaron las membranas con PBS durante 30
min, se bloquearon con leche en polvo al 5% (1 h) y a continuación
se incubaron con anticuerpos policlonales anti-p12
(1 h, dilución 1:1000). Después de incubar con un anticuerpo
secundario conjugado con fosfatasa alcalina (IgG de cabra
anti-conejo), se realizó el revelado de la muestra
con BCIP/NBT (fosfato de
5-bromo-4-cloroindolilo/sal
de nitroazul de tetrazolio).
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la purificación de endotoxina
según las instrucciones de Galanos, C., Lüderitz, O. y Westphal, O.
1969, Europ. J. Biochem. 9, 245-249.
\vskip1.000000\baselineskip
Para conseguir una unión dirigida de p12 a la
superficie, se sustituyó el aminoácido serina en posición 3 del
marcador Strep según la SEC ID NO: 5 por cisteína como en el ejemplo
12, y se inmovilizó la proteína mediante restos yodoacetilo que se
unen preferiblemente a restos sulfhidrilo libres. La p12 resultante
se denominó p12S3C.
Se vertió con 1 ml de gel de acoplamiento
Sulfolink (Pierce), se lavó con 6 ml de desoxicolato de sodio al 1%
y se equilibró con 6 ml de tampón de acoplamiento (Tris 50 mM, NaCl
150 mM, EDTA 5 mM, pH 8,5). A continuación, se inyectó 1 ml de
p12S3C (=N-StrepS3Cp12) (1-1,5 mg/ml
en tampón de acoplamiento), se agitó ligeramente la columna durante
15 min, se incubó otros 30 min sin agitación a temperatura ambiente,
se inyectó de nuevo 1 ml de p12S3C y se repitieron las etapas de
incubación. Se repitió este acoplamiento de p12S3C en total 4 veces
y a continuación se lavó la columna con 6 ml de tampón de
acoplamiento. Se combinaron los eluidos y se determinó la
concentración respectiva de p12S3C mediante medida de la absorción a
280 nm. Se unieron 2,2-2,8 mg de p12S3C por ml de
gel. A continuación, se bloquearon los restos de yodoacetilo en
exceso mediante incubación (45 min) con 1 ml de cisteína (50 mM en
Tris 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8,5). Después de lavar la columna con 16
ml de NaCl 1 mM y 16 ml de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5, la
columna estaba lista para el uso.
Se ensayó la capacidad de este gel de separar
endotoxina de las disoluciones de proteína con BSA
(2-4 mg/ml), anhidrasa carbónica
(1-2 mg/ml) y lisozima (3-4 mg/ml).
Se sembraron las disoluciones de BSA y lisozima con endotoxina de
E. coli O55:B5 (Charles-River Endosafe,
Charleston, EE.UU.) o E. coli HMS 174
(100-1000 UE/ml), mientras que la anhidrasa
carbónica no se mezcló con endotoxina adicional. Se añadieron
respectivamente 0,5 ml de disolución de proteína a la columna, se
incubó durante 1 hora a temperatura ambiente y a continuación se
lavó la columna con tampón. Se combinaron por fracciones las
proteínas y se determinó el contenido de endotoxina antes y después
de la columna mediante un ensayo LAL cromogénico
(Charles-River Endosafe, Charleston, EE.UU.).
Además, se estableció la recuperación de proteína mediante medidas
de absorción a 280 nm. Las endotoxinas podían separarse de las tres
disoluciones de proteína casi completamente
(93-99%), como se muestra en la Fig. 2A. Además,
las proteínas podían eluirse ampliamente de la columna
(80-99%, Fig. 2B). Se regeneró finalmente la
columna con EDTA 5 mM, Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5. Para
excluir de las impurezas de las fracciones de proteína la p12
disociada después de la elución por la columna, se analizó la p12 de
las fracciones mediante la técnica de transferencia Western. No pudo
detectarse p12 en las fracciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Se desplazaron con N-hidroxisuccinimida
(NHS) los restos amino primario de los compuestos y se empleó por
tanto para el acoplamiento de proteínas a superficies. Se lavaron en
primer lugar columnas de Sepharose activadas con NHS (HP activada
con NHS de HiTrap, 1 ml,
Amersham-Pharmacia-Biotech) con 6 ml
de ácido clorhídrico 1 mM enfriado con hielo. A continuación, se
bombearon circularmente por la columna a temperatura ambiente
10-15 ml de p12S3C (1,0-3,5 mg/ml)
en NaHCO_{3} 0,2 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3 (caudal 0,8 ml/min).
Después de 60 min, se combinó el eluido por fracciones y se lavó
la columna con 6 ml de tampón. Se separó de estas fracciones la NHS
mediante desalado de la disolución mediante columnas pequeñas de
desalado HiTrap (5 ml,
Amersham-Pharmacia-Biotech) y se
determinó a continuación la cantidad de p12 mediante medida de la
absorción a 280 nm. Se unieron 20-25 mg de p12S3C a
la columna. Se aclararon repetidamente las columnas después del
acoplamiento correspondientemente a las indicaciones del fabricante
con 6 ml respectivamente de tampón de bloqueo (etanolamina 0,5 M,
NaCl 0,5 M, pH 8,3) y tampón de lavado (acetato 0,1 M, NaCl 0,5 M,
pH 4,0). A continuación, se equilibró la columna con 6 ml de tampón
de uso (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 o Tris 20 mM, NaCl 150 mM,
pH 8,5).
Se ensayó la separación de endotoxina por estas
columnas con disoluciones de lisozima (3-4 mg/ml en
Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 o Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH
8,5). Se sembraron las disoluciones de lisozima con endotoxina de
E. coli HMS 174 (\sim500 UE/ml). Se añadieron 0,5 ml de
disolución de proteína a la columna, se incubó durante 1 hora a
temperatura ambiente y a continuación se lavó la columna con tampón.
Se combinó la lisozima por fracciones y se determinó la cantidad de
endotoxina antes y después de la columna mediante un ensayo LAL
cromogénico (Charles-River Endosafe, Charleston,
EE.UU.). Además, se estableció la recuperación de proteína mediante
medidas de absorción a 280 nm. Se eliminaron las endotoxinas de la
disolución al 85-90%, como se muestra en la Fig.
3A, y pudieron volver a eluirse de la columna el
85-90% de la lisozima mediante lavado con tampón de
uso (Fig. 3B). Se lavó a continuación la columna con 6 ml de EDTA 5
mM, Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 y 6 ml de NaCl 1 M. Para
excluir de las impurezas de las fracciones de proteína la p12
disociada después de la elución por la columna, se analizó la p12 de
las fracciones mediante la técnica de transferencia Western. No pudo
detectarse p12 en las fracciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Para conseguir una unión dirigida al material
portador de cromatografía, se unió un ligador bifuncional a
superficies activadas por NHS, lo que posibilitaba un acoplamiento
de p12S3C mediante su cisteína libre y los restos yodoacetilo del
ligador bifuncional.
Se lavaron en primer lugar las columnas de
Sepharose activadas con NHS (HP activada con NHS de HiTrap, 1 ml,
Amersham-Pharmacia-Biotech) con 6 ml
de ácido clorhídrico 1 mM enfriado con hielo, se inyectó después 1
ml de etilendiamina (10 mg/ml en NaHCO_{3} 0,2 M, NaCl 0,5, pH
8,3) y se incubó la columna durante 30 min a temperatura ambiente.
Después de bloquear los grupos NHS en exceso con etanolamina
(etanolamina 0,5 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3) y lavar (acetato 0,1 M,
NaCl 0,5 M, pH 4,0) la columna, se equilibró la columna con 6 ml de
tampón borato (borato de sodio 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, pH
8,3). A continuación, se aclaró circularmente la columna durante 30
min con 10 ml de yodoacetato de N-succinimidilo (SIA, Pierce,
200 \mul de disolución madre de SIA en 10 ml de tampón borato;
disolución madre de SIA: 1,4 mg de SIA en 1 ml de DMSO). Se lavó la
columna después con 6 ml de tampón borato y se aclaró la columna
durante 1 h con p12S3C (1 mg/ml, 50 ml en tampón borato). Se
saturaron los restos yodoacetilo en exceso con 1 ml de disolución de
cisteína (cisteína 5 mM en tampón borato, incubar 15 min a
temperatura ambiente) antes de equilibrar la columna con el tampón
de uso (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 ó Tris 50 mM, NaCl 150 mM,
pH 8,5). Se llevaron a cabo las reacciones de acoplamiento con SIA
en la oscuridad.
Se ensayó la eliminación de endotoxinas mediante
esta columna con disoluciones de lisozima (3-4 mg/ml
en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 ó Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH
8,5). Se sembraron las disoluciones de lisozima con endotoxina de
E. coli HMS 174 (\sim500 UE/ml). Se añadieron 0,5 ml de
disolución de proteína a la columna, se incubó durante 1 hora a
temperatura ambiente y se lavó a continuación la columna con tampón.
Se combinó la lisozima por fracciones y se determinó el contenido
de endotoxina antes y después de la columna mediante un ensayo LAL
cromogénico (Charles-River Endosafe, Charleston,
EE.UU.). Además, se estableció la recuperación de proteína mediante
medidas de absorción a 280 nm. Se eliminaron las endotoxinas al 90%
de la disolución y pudo volver a eluirse de la columna el
75-85% de la lisozima mediante lavado con tampón de
uso. Se lavó a continuación la columna con 6 ml de EDTA 5 mM, Hepes
20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 y 6 ml de NaCl 1 M. Para excluir de las
impurezas de las fracciones de proteína la p12 disociada después de
la elución por la columna, se analizó la p12 de las fracciones
mediante la técnica de transferencia Western. No pudo detectarse p12
en las fracciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Se acopló inespecíficamente Sepharose activada
con NHS Hi-Trap (Amersham Biosciences, Uppsala,
Suecia) con p12 según las instrucciones del fabricante mediante
grupos amino primario. A este respecto, se inmovilizaron
covalentemente 8 mg de p12 por ml de material de gel. La columna de
cromatografía de 1 ml así obtenida se equilibró a un caudal de 1
ml/min con 10 ml de tampón A (Hepes 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM,
CaCl_{2} 0,1 mM). A continuación, se aplicaron 4 ml de una
disolución de BSA (11,5 mg de BSA (Carl Roth GmbH, Alemania)/ml de
tampón A) (inyección: I) y se combinó el eluido (E) en fracciones de
2,5 ml. Se lavó a continuación la columna con 15 ml de tampón A y
se eluyó la endotoxina unida a la columna con 7 ml de tampón B
(Hepes 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM). En el lavado y
elución, se combinaron respectivamente fracciones de 2 ml. Después
de cada experimento, se regeneró la columna con 20 ml de tampón C
(Hepes 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, 0,1% de desoxicolato
de sodio). Se determinó la concentración de endotoxina mediante un
ensayo de lisado de amebocitos de Limulus cromogénico (LAL)
(Charles-River Endosafe, Charleston, EE.UU.) según
las instrucciones del fabricante. Se realizó la determinación de la
concentración de proteína mediante medida de la absorción UV. La
eficacia de eliminación de endotoxina ascendía a entre
95-99% y la pérdida de proteína ascendía a
aproximadamente 6-10%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se lavaron en primer lugar 20 ml de Sepharose
activada con NHS 4 FastFlow (Amersham Biosciences) con ácido
clorhídrico enfriado con hielo y a continuación se incubaron con 292
mg de p12 (7 mg/ml en citrato 25 mM, pH 7,0) durante 4 horas con
agitación a temperatura ambiente. A continuación, se lavó la
Sepharose con 7 x 80 ml de citrato 5 mM a pH 2,0 y se dializó
respectivamente 1 ml de las fracciones de lavado frente a citrato 5
mM a pH 2,0. Se emplearon estos dializados para cuantificar la p12
en exceso en las fracciones de lavado mediante medida de la
absorción a 280 nm. Se determinó una densidad de carga de 8,7 mg de
p12 por 1 ml de Sepharose. Se saturaron los restos de NHS no
reaccionados mediante incubación de 12 h de Sepharose con Tris 1 M
a pH 8,0. Se rellenaron columnas de 2 ml de volumen con este
material de columna y se almacenaron éstas a 4ºC en etanol al 20%
hasta su empleo. Se aplicaron en tres ensayos paralelos sobre una
columna respectivamente 4 ml de disolución de endotoxina (S). La
disolución de endotoxina estaba compuesta por E. coli O55:B5
(Charles-River Endosafe, Charleston, EE.UU.) en
tampón de equilibrado (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 0,1 mM,
pH 7,5). La concentración de endotoxina de esta disolución se
encontraba a 4,6 UE/ml. Se aclararon las columnas en primer lugar
con 12 ml de tampón de regeneración (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA
2 mM, pH 7,5) y a continuación con 12 ml de tampón de equilibrado.
A continuación, se añadió de nuevo tampón de equilibrado a la
columna y se fraccionó en 1 ml. Se aplicó la disolución de
endotoxina a la columna (I) y se combinaron fracciones de 5 ml y 2
ml. A continuación, se regeneró la columna con 4 ml de tampón de
regeneración (B). En las fracciones de elución no pudo detectarse
endotoxina, es decir, las impurezas de endotoxina pudieron
eliminarse totalmente en los tres experimentos. Este ejemplo muestra
claramente que también a bajas cantidades de endotoxina se realiza
una unión que corresponde a una detección de bajas cantidades de
endotoxina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubó p12 (3 mg/ml en PBS, 0,05% de Tween
20) con
sulfo-NHS-LC-LC-biotina
(Pierce) a una relación de 1:10 a 1:20 durante 1 hora a TA y a
continuación se dializó frente a tampón (por ejemplo, PBS o Hepes 20
mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, pH 7,5). La biotina activada con NHS se
une a este respecto a restos amino primario de p12. A continuación,
se añadieron a 1 ml de perlas de estreptavidina (MagPrep
Streptavidin Beads, Merck) 50 \mul de p12 biotinilada (1 mg/ml),
se agitó durante 2 h a temperatura ambiente y a continuación se
eliminó la p12 en exceso mediante cuatro lavados con 1,5 ml de Tris
20 mM, EDTA 10 mM, pH 7,5.
Se ensayó la eliminación de endotoxinas con
tampón (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) y disoluciones de proteína
(BSA 0,1 mg/ml, lisozima 0,1 mg/ml, anhidrasa carbónica 0,1 mg/ml
en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5). Se sembró el tampón así como
la disolución de BSA y lisozima con 5 UE/ml (endotoxina de E.
coli O55:B5, Charles-River Endosafe,
Charleston, EE.UU.). La disolución de anhidrasa carbónica recibió
aproximadamente 1 UE/ml. Se añadieron a 200 \mul de tampón o
disolución de proteína 25 \mul de perlas magnéticas con p12
inmovilizada, se mezclaron pipeteando y se incubaron durante 30 min
a temperatura ambiente. Se eliminaron las perlas de la disolución
con ayuda de un imán y se eliminó por pipeteo el sobrenadante. Se
determinó a continuación el contenido de endotoxina de muestras no
tratadas y muestras incubadas con perlas con el ensayo LAL y se
determinó la recuperación de proteína mediante la medida de
absorción a 280 nm. Puede eliminarse prácticamente del todo la
endotoxina del tampón (99,9% de eliminación de endotoxina) y
también en la disolución de proteína se empobreció la endotoxina al
70-92%. La recuperación de proteína se encontraba
entre 57% y 99% (BSA: 87%, anhidrasa carbónica: 99%, lisozima:
57%;
Fig. 4B).
Fig. 4B).
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubó p12 (3 mg/ml en PBS, 0,05% de Tween
20) con
sulfo-NHS-LC-LC-biotina
(Pierce) a una relación de 1:10 a 1:20 durante una hora a TA y a
continuación se dializó frente a tampón (por ejemplo, PBS o Hepes 20
mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, pH 7,5). La biotina activada con NHS se
une a este respecto a restos amino primario de p12. La p12
biotinilada se incuba a continuación durante 1 h a temperatura
ambiente con material de cromatografía cargado con estreptavidina
(estreptavidina inmovilizada ImmunoPure: perlas de agarosa
reticuladas al 6%) y se elimina la p12 en exceso mediante lavado con
PBS.
Se ensayó la eliminación de endotoxinas con
tampón (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0) y BSA (0,5 mg/ml en Tris
20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0). Se sembraron por cada 1 ml de tampón o
disolución de BSA 10 UE/ml, se añadieron 50 \mul de
p12-agarosa y se agitó durante 1 hora a temperatura
ambiente. Se centrifugó a continuación la
p12-agarosa y se midió la concentración de
endotoxina y proteína en el sobrenadante. Pudieron eliminarse del
tampón el 99% y de la disolución de BSA el 86% de endotoxina. La BSA
pudo recuperarse hasta el 90%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la unión de p12 a endotoxina o a
bacterias por lipopolisacáridos en la membrana celular externa
mediante medidas de resonancia de plasmón de superficie (Biacore J).
Para establecer la constante de disociación (K_{d}), se
inmovilizó endotoxina de E. coli O55:B5 (Sigma) sobre un chip
HPA hidrófobo correspondientemente a las instrucciones del
fabricante y se inyectó p12 a distintas concentraciones (Fig. 2A).
Se mide la unión en "unidades de respuesta" (UR) relativas,
los valores de equilibrio se aplican frente a las concentraciones
de p12 apropiadas (Fig. 2B). Mediante la adaptación de la isoterma
de adsorción de Langmuir (UR =
(URmáx\cdot[p12])/([p12]+K_{d})) a estos datos, se
establece del valor de K_{d} (Tabla 1). Para las medidas, se usó
un tampón exento de endotoxina. Para los valores de pH entre 6 y
10, se establecieron valores de K_{d} en el intervalo de 10^{-7}
a 10^{-9} M (Tabla 1). La unión se volvió a anular mediante la
inyección de EDTA 1 mM o 5 mM y se regeneró el chip.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para analizar la unión de bacterias a p12, se
inmovilizó p12 biotinilada sobre chips de estreptavidina y se
inyectaron distintas cepas de E. coli. Se suspendieron las
bacterias en PBS para las medidas. Se usaron cepas de E.
coli que poseen lipopolisacáridos con distintas proporciones de
polisacárido. La parte de polisacárido está compuesta por una
región "central" que está conectada con el lípido A y el
denominado antígeno O. El antígeno O varía mucho entre las
distintas especies bacterianas y también entre las cepas
bacterianas, mientras que la región "central" está fuertemente
conservada. Las cepas que poseen la región "central" y el
antígeno (por ejemplo E. coli), así como las cepas que poseen
una región "central" completa (E. coli D21) se unieron
a p12, mientras que las cepas con una región "central" muy
acortada (por ejemplo E. coli D21f2) no se reconocieron ya
por p12 (Fig. 2C). La unión pudo redisociarse mediante EDTA (5 mM) y
regenerarse el chip.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Construcción de p12 con marcador Strep
N-terminal
(N-Strep-p12): Se introdujo mediante
PCR en el extremo 5' del gen T4p12 la secuencia nucleotídica del
marcador Strep (patente de EE.UU. 5.506.121). Se construyó para
ello para el extremo 5' del gen p12 un cebador
(5'-GAA GGA ACT AGT CAT ATG GCT AGC TGG AGC CAC CCG
CAG TTC GAA AAA GGC GCC AGT AAT AAT ACA TAT CAA CAC
GTT-3' (SEC ID NO: 1)), que contiene la secuencia
nucleotídica del marcador Strep en su extremo 5' (en cursiva en la
secuencia) y posee un sitio de corte de restricción (NdeI,
subrayado en la secuencia) de modo que pueda utilizarse el gen en un
marco de lectura correcto en el plásmido de expresión. Para el
extremo 3' del gen p12, se construyó un cebador que introduce detrás
del gen p12 un sitio de corte de restricción BamHI (en cursiva en
la secuencia) (5'-ACG CGC AAA GCT TGT CGA CGG ATC
CTA TCA TTC TTT TAC CTT AAT TAT GTA GTT-3', (SEC ID
NO: 2)). Se llevó a cabo la PCR con 40 ciclos (1 min a 95ºC, 1 min
a 45ºC y 1 min a 72ºC). Se escindió la preparación de PCR con las
endonucleasas de restricción NdeI y BamHI y se utilizó el fragmento
deseado después de fraccionamiento por tamaño en un gel de agarosa
y elución del gel en el sitio NdeI y BamHI del plásmido de expresión
pET21a. Se comprobó la corrección de la secuencia del gen
N-Strep-p12 mediante secuenciación
de ADN. Se llevaron a cabo las etapas adicionales hasta el plásmido
pNS-T4p12p57 como se describe en Burda, M.R. y
Miller, S. (Eur. J. Biochem. 1999 265 (2),
771-778) para T4p12p57. Se transformó entonces el
plásmido pNS-T4p12p57 en la cepa de expresión BL21
(DE3).
2. Inserción de un resto de cisteína
N-terminal en
N-Strep-p12
(N-Strep-S3C-p12 y
N-Strep-S14C-p12):
Se llevó a cabo la inserción de un resto de cisteína
N-terminal como se describe en 1, construyendo para
ello dos nuevos cebadores para el extremo 5'. Para
N-Strep-S3C-p12, se
usó el cebador 5'-GAA GGA ACT AGT CAT ATG GCT TGT
TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC GCC AGT AAT AAT ACA TAT CAA CAC
GTT-3' (SEC ID NO: 3), para
N-Strep-S14C-p12,
se usó el cebador 5'-GAA GGA ACT AGT CAT ATG GCT AGC
TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC GCC TGT AAT AAT ACA TAT CAA CAC
GTT-3' (SEC ID NO: 4).
3. Purificación de la proteína
N-Strep-p12: Se cultivó la cepa
BL21(DE3) de E. coli con el plásmido
pNS-T4p12p57 en cultivos agitados de 2 l (medio LB
con ampicilina 100 \mug/ml) hasta una DO_{600} de
0,5-0,7 a 37ºC y se indujo la expresión de la
proteína N-Strep-p12 mediante la
adición de IPTG 1 mM (\beta-tiogalactopiranósido
de isopropilo). Después de incubar a 37ºC durante 4 h, se
recolectaron las células. Se suspendieron las células recolectadas
de un cultivo de 10 l en 50 ml de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2,
MgSO_{4} 2 mM, NaCl 0,1 M, se trituraron mediante tres
tratamientos en prensa French (137,9 MPa) y a continuación se
centrifugaron durante 30 min a 15.000 rpm (SS34). Después de dos
lavados con el mismo tampón, se extrajo la proteína
N-Strep-p12 del sedimento 3 veces
con agitación durante 30 min en Tris-HCl 40 mM, pH
8,0, EDTA 10 mM, se centrifugó la preparación durante 30 min a
15.000 rpm (SS34) y se almacenó la NS-p12 disociada
en el sobrenadante a 4ºC. Se repitió dos veces la extracción y se
aplicaron los sobrenadantes reunidos sobre una columna de afinidad
de Streptactine (15 ml), equilibrada con tampón "W"
(Tris-HCl 100 mM, pH 8, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM) (IBA
GmbH, Göttingen). Después de lavar con 5 volúmenes de columna de
tampón "W", se eluyó con 3 volúmenes de columna de tampón
"W" con destiobiotina 2,5 mM en tampón "W". Después de
múltiples diálisis frente a tampón "W" y concentración, se
establecieron mediante PAGE-SDS y espectroscopia UV
(Burda y col. 1999) la concentración y pureza de
N-Strep-T4p12. Se purificaron así de
10 l de cultivo aprox. 100 mg de
N-Strep-T4p12.
\vskip1.000000\baselineskip
Se rellenaron 4 columnas con 0,5 ml de volumen
cada una de Sepharose con polimixina B (Detoxi-Gel,
Pierce). Se lavaron las columnas con 3 ml cada una de tampón
fosfato de sodio (fosfato de sodio 20 mM, pH 12,0) y con 3 ml cada
una de tampón de regeneración (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM,
pH 7,5). A continuación, se aplicaron sobre dos de estas columnas 1
ml de LPS de E. coli O55:B5 (0,1 mg/ml en tampón Hepes,
10^{6} UE/ml). Se aclararon las otras dos columnas con 1 ml cada
una de tampón de regeneración. Se lavaron después todas las
columnas con 3 ml de tampón de equilibrado cada una (Hepes 20 mM,
NaCl 150 mM, CaCl_{2} 0,1 mM, pH 7,5) y a continuación se aplicó
de nuevo 1 ml de este tampón y se recogió como fracción 1. A
continuación, se aplicaron 0,5 ml de una disolución con la proteína
de cola de bacteriófago p12 (0,844 mg/ml en Hepes 20 mM, NaCl 150
mM, CaCl_{2} 0,1 mM) sobre las columnas y se lavó con 2,5 ml de
tampón de equilibrado y 2 ml de tampón de regeneración. Se recogió
el eluido en fracciones tres veces de 1 ml y una vez de 2 ml y se
determinó la concentración de la proteína de cola de bacteriófago
p12 en estas fracciones mediante medida de la absorción a 280 nm
(Figura 4). La proteína de cola de bacteriófago p12 se unía en gran
medida a las columnas que se habían tratado previamente con LPS, y
podía disociarse de estas columnas mediante la adición de tampón de
regeneración. En contraposición a esto, pasaba sin retardo por las
columnas que no se habían tratado con LPS.
\vskip1.000000\baselineskip
En el mutante de T4p12 usado, se sustituye en
las posiciones 359 y 283 el aminoácido triptófano por tirosina.
Para los análisis de fluorescencia, se usó un polisacárido (PM = 2
kDa) que procedía de endotoxina de Salmonella typhimurium.
Se disolvieron tanto el mutante de p12 (40 ó 200 \mug/ml) como
endotoxina-polisacárido en citrato 5 mM a pH 2. Se
determinó la fluorescencia en el intervalo de
305-450 nm mediante excitación a 295 nm. Se
dispusieron 120 \mul de una disolución con el mutante de p12 W359
Y W283Y en una cubeta de fluorescencia, se midió la fluorescencia y
se añadió a continuación por etapas polisacárido (concentración
final: 0,5-120.000 nM) y se midió de nuevo la
fluorescencia después de mezclar la muestra. Se llevó a cabo en
ensayos de control el mismo ensayo sin el mutante p12 y se
corrigieron las curvas de medida frente a estos datos. La unión de
endotoxina o endotoxina-polisacárido reduce la
fluorescencia de este mutante (Figura 5). Esto puede utilizarse para
la detección de endotoxina.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la detección, deben unirse en primer lugar
lipopolisacáridos de una disolución de muestra a una superficie y a
continuación detectarse estos lipopolisacáridos inmovilizados con la
ayuda de una segunda proteína que se une a lipopolisacáridos. Para
representar la factibilidad de este procedimiento de detección, se
construyó dicho "sándwich" sobre la superficie de un chip
Biacore y se siguió la unión de lipopolisacárido y un anticuerpo de
lípido A mediante medida de resonancia de plasmón de superficie.
Para ello, se acopló covalentemente en primer lugar T4p12 con la
superficie de un chip CM-5 (Biacore). Se activaron
los restos carboxilo de la superficie con una mezcla de EDC
(clorhidrato de
N-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida,
75 mg/ml) y NHS (N-hidroxisuccinimida, 11,5 mg/ml) y a
continuación se inyectó T4p12, cuyos restos amino primario
reaccionan con la superficie activada. Se dejó sin tratar la
superficie de una segunda célula de referencia. Pudo seguirse la
unión de 100 \mul de lipopolisacárido (E. coli O55:B5, 0,1
mg/ml) a T4p12 mediante el aumento de la señal de resonancia (véase
la Fig. 6). También después del final de la inyección, la señal de
resonancia permaneció a su nivel y mostró por tanto una unión
estable. Las inyecciones posteriores de un anticuerpo
anti-lípido A (2 \mug/ml, anticuerpo policlonal
contra lípido A de cabra de Accurate Chemical & Scientific
Corporation, nº de producto YVS6921) mostraron igualmente un
aumento de la señal de resonancia y por tanto una unión del
anticuerpo. La señal de resonancia pudo volver a reducirse al nivel
de partida mediante la inyección de EDTA (2 mM), que suprime la
unión de lipopolisacárido a T4p12. Esto significa que el aumento de
señal, que se ha inducido por la inyección del anticuerpo, se
realizaba mediante la unión a lipopolisacárido. Los experimentos se
llevaron a cabo en el siguiente tampón: Hepes 20 mM, NaCl 150 mM,
CaCl_{2} 0,1 mM, pH 7,5.
\vskip1.000000\baselineskip
Se clonó, expresó y purificó T2p12 análogamente
a T4p12. Para la detección, se unen en primer lugar
lipopolisacáridos de una disolución de muestra a una superficie y a
continuación se detectan estos lipopolisacáridos inmovilizados con
la ayuda de una segunda proteína que se une a lipopolisacárido. Para
representar la factibilidad de este procedimiento de detección, se
construyó dicho "sándwich" sobre la superficie de un chip
Biacore y se siguió la unión de lipopolisacárido y un anticuerpo de
lípido A mediante medida de la resonancia de plasmón de superficie.
Se acopló covalentemente para ello en primer lugar T2p12 con la
superficie de un chip CM-5 (Biacore). Se activaron
los restos carboxilo de la superficie con una mezcla de EDC
(clorhidrato de
N-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida,
75 mg/ml) y NHS (N-hidroxisuccinimida, 11,5 mg/ml) y a
continuación se inyectó T2p12, cuyos restos amino primario
reaccionaban con la superficie activada. Se dejó sin tratar la
superficie de una segunda célula de referencia. La unión de 100
\mul de lipopolisacárido (E. coli O55:B5, 0,1 mg/ml) a
T2p12 pudo seguirse mediante el aumento de la señal de resonancia.
También después del final de la inyección, permanecía la señal de
resonancia al mismo nivel, y demuestra por tanto una unión estable.
Las inyecciones posteriores de un anticuerpo
anti-lípido A (2,1 \mug/ml, anticuerpo policlonal
contra lípido A de cabra de Accurate Chemical & Scientific
Corporation, nº de producto YVS6921) mostraron igualmente un aumento
de la señal de resonancia y por tanto una unión del anticuerpo. La
señal de resonancia pudo volver a reducirse al nivel de partida
mediante la inyección de EDTA (2 mM), que suprime la unión de
lipopolisacárido a T4p12. Esto significa que el aumento de señal,
que se ha inducido por la inyección del anticuerpo, se realizaba
mediante la unión a lipopolisacárido. Los experimentos se llevaron a
cabo en el siguiente tampón: Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2}
0,1 mM, pH 7,5.
\vskip1.000000\baselineskip
Se clonó, expresó y purificó RB69p12
análogamente a T4p12. Para la detección, se unen en primer lugar
lipopolisacáridos de una disolución de muestra a una superficie y a
continuación se detectan estos lipopolisacáridos inmovilizados con
la ayuda de una segunda proteína que se une a lipopolisacárido. Para
representar la factibilidad de este procedimiento de detección, se
construyó dicho "sándwich" sobre la superficie de un chip
Biacore y se siguió la unión de lipopolisacárido y un anticuerpo de
lípido A mediante medida de la resonancia de plasmón de superficie.
Se acopló covalentemente para ello en primer lugar RB69p12 con la
superficie de un chip CM-5 (Biacore). Se activaron
los restos carboxilo de la superficie con una mezcla de EDC
(clorhidrato de
N-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida,
75 mg/ml) y NHS (N-hidroxisuccinimida, 11,5 mg/ml) y a
continuación se inyectó RB69p12, cuyos restos amino primario
reaccionaban con la superficie activada. Se dejó sin tratar la
superficie de una segunda célula de referencia. La unión de 100
\mul de lipopolisacárido (E. coli O55:B5, 0,1 mg/ml) a
RB69p12 pudo seguirse mediante el aumento de la señal de
resonancia. También después del final de la inyección, permanecía la
señal de resonancia al mismo nivel, y demuestra por tanto una unión
estable. Las inyecciones posteriores de un anticuerpo
anti-lípido A (2,1 \mug/ml, anticuerpo policlonal
contra lípido A de cabra de Accurate Chemical & Scientific
Corporation, nº de producto YVS6921) mostraron igualmente un aumento
de la señal de resonancia y por tanto una unión del anticuerpo. La
señal de resonancia pudo volver a reducirse al nivel de partida
mediante la inyección de EDTA (2 mM), que suprime la unión de
lipopolisacárido a RB69p12. Esto significa que el aumento de señal,
que se ha inducido por la inyección del anticuerpo, se realizaba
mediante la unión a lipopolisacárido. Los experimentos se llevaron a
cabo en el siguiente tampón: Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2}
0,1 mM, pH 7,5.
<110> PROFOS AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la detección de
endotoxina
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PRO-013 PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<140> desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
20-12-2004
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DE 10360844.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
20-12-2003
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgcgcaaag cttgtcgacg gatcctatca ttcttttacc ttaattatgt agtt
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
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<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> marcador strep
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> marcador strep
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> marcador strep
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 539
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> T4p12 con marcador strep
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 527
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína p12 del fago T2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 527
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína p12 del fago T4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 518
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína p12 del fago PP01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 516
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína p12 del fago RB69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 516
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína p12 del fago AR1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 527
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína p12 del fago K3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 516
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína p12 del fago
RB32-33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (14)
1. Procedimiento para la detección de
endotoxinas que comprende las etapas de:
a) la puesta en contacto de una muestra que
contiene endotoxinas con una superficie recubierta con una sustancia
de unión a endotoxina, a continuación
b) la incubación de proteínas de cola de
bacteriófago o proteínas de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos
con cola o de proteínas de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos
sin cola en endotoxinas inmovilizadas sobre la superficie, y
c) la detección de proteínas de cola de
bacteriófago o proteínas de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos
con cola o de proteínas de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos
sin cola mediante procedimientos espectroscópicos, ELISA, reacciones
de detección química o enzimática de endotoxinas o componentes
escindidos de endotoxinas o mediante medida de la capacidad.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende además después de la etapa b) y antes de la etapa c) la
etapa adicional de
b') separación de proteínas de cola de
bacteriófago o proteínas de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos
con cola o de proteínas de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos
sin cola de la endotoxina.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la sustancia de unión a endotoxina es una proteína de cola de
bacteriófago o proteína de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos
con cola o una proteína de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos
sin cola.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que la proteína de cola de
bacteriófago es una proteína de fibra de cola de bacteriófago
corta.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que la proteína de fibra de cola de bacteriófago corta se
selecciona de K3, T2, T4, Ox2, RB32-33, AR1, PP01 y
RB69.
6. Procedimiento según la reivindicación 4 ó 5,
en el que la proteína de cola de bacteriófago presenta una homología
a nivel de aminoácidos de al menos un 60% con la proteína T4p12.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que las proteínas de cola de
bacteriófago o proteínas de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos
con cola o las proteínas de cubierta de bacteriófago de
bacteriófagos sin cola están modificadas.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que las proteínas de cola de
bacteriófago o las proteínas de cabeza de bacteriófago de
bacteriófagos con cola o las proteínas de cubierta de bacteriófago
de bacteriófagos sin cola están unidas covalentemente con proteínas
activas enzimáticas.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que la proteína de cola de
bacteriófago o proteína de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos
con cola o la proteína de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos
sin cola presentan un marcador Strep o un marcador His.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que el marcador presenta una secuencia de aminoácidos según las
SEC ID NO. 5, 6 ó 7.
11. Procedimiento según la reivindicación 9 ó
10, en el que se usa como proteína de cola de bacteriófago la
proteína p12 de los fagos T4, K3, T2, Ox2, RB32-33,
AR1, PP01 o RB69.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que la concentración de
Ca^{2+} en la incubación asciende a 0,1 \muM a 10 mM y/o la
concentración de Mg^{2+} a 0,1 \muM a 10 mM.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que la endotoxina marcada se
desplaza por la unión con una proteína de cola de bacteriófago o
proteína de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o una
proteína de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola y a
continuación se detecta la endotoxina marcada.
14. Un kit de detección de endotoxina que
comprende un portador recubierto con sustancia de unión a
endotoxina, un recipiente que contiene una endotoxina de referencia
para la medida de una curva patrón y un recipiente con al menos una
proteína de cola de bacteriófago o proteína de cabeza de
bacteriófago de bacteriófagos con cola o una proteína de cubierta de
bacteriófago de bacteriófagos sin cola, o un anticuerpo
anti-lípido A.
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