ES2334236T3 - Procedimiento para la deteccion de endotoxinas. - Google Patents

Procedimiento para la deteccion de endotoxinas. Download PDF

Info

Publication number
ES2334236T3
ES2334236T3 ES04802964T ES04802964T ES2334236T3 ES 2334236 T3 ES2334236 T3 ES 2334236T3 ES 04802964 T ES04802964 T ES 04802964T ES 04802964 T ES04802964 T ES 04802964T ES 2334236 T3 ES2334236 T3 ES 2334236T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
bacteriophage
protein
tail
endotoxin
proteins
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES04802964T
Other languages
English (en)
Inventor
Roman Meyer
Michael Schutz
Holger Grallert
Renate Grassl
Stefan Miller
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hyglos Invest GmbH
Original Assignee
Hyglos Invest GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hyglos Invest GmbH filed Critical Hyglos Invest GmbH
Application granted granted Critical
Publication of ES2334236T3 publication Critical patent/ES2334236T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • G01N2400/50—Lipopolysaccharides; LPS
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • External Artificial Organs (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)

Abstract

Procedimiento para la detección de endotoxinas que comprende las etapas de: a) la puesta en contacto de una muestra que contiene endotoxinas con una superficie recubierta con una sustancia de unión a endotoxina, a continuación b) la incubación de proteínas de cola de bacteriófago o proteínas de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o de proteínas de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola en endotoxinas inmovilizadas sobre la superficie, y c) la detección de proteínas de cola de bacteriófago o proteínas de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o de proteínas de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola mediante procedimientos espectroscópicos, ELISA, reacciones de detección química o enzimática de endotoxinas o componentes escindidos de endotoxinas o mediante medida de la capacidad.

Description

Procedimiento para la detección de endotoxinas.
La presente invención se refiere a procedimientos para la detección de endotoxinas en una muestra.
Endotoxina (ET) designa una familia de lipopolisacáridos que, junto con proteínas y fosfolípidos, forman la pared celular externa de bacterias gramnegativas. Las endotoxinas aparecen exclusivamente en este grupo de bacterias y desempeñan un papel importante en la organización, estabilidad y función de barrera de la membrana externa. Numerosos bacteriófagos aprovechan las endotoxinas o lipopolisacáridos generales para el reconocimiento específico de sus bacterias hospedadoras.
Todas las variantes de endotoxina están compuestas por un heteropolisacárido que está unido covalentemente a lípido A. El lípido A ancla la endotoxina en la membrana bacteriana externa. El heteropolisacárido, que está compuesto por un oligosacárido central y el antígeno O, se muestra en la disolución circundante y determina la identidad serológica de la bacteria. El antígeno O está compuesto por unidades oligosacáridas repetidas cuya composición es específica de cepa. Los constituyentes característicos del oligosacárido central son ácido 2-ceto-3-desoxioctulosónico (KDO) y L-glicero-D-manoheptosa (Hep).
La parte más conservada de la endotoxina de distintos géneros es el lípido A. Está igualmente conservada que el lípido A la región central interna, la región central externa presenta ya una mayor variación. La región central interna, el KDO y el lípido A portan por sí mismos varios grupos fosfato como sustituyentes y son por tanto responsables de la carga negativa de la endotoxina. Además, los grupos fosfato en el lípido A y la región central pueden estar sustituidos variablemente con arabinosa, etanolamina y fosfato. Los constituyentes sacáridos individuales del antígeno O están acetilados, sializados o glucosilados. El antígeno O varía además respecto al número de unidades repetidas, por lo que la población de endotoxinas de cada bacteria presenta cierta heterogeneidad.
Las endotoxinas son biomoléculas que, sin las correspondientes medidas de precaución, se encuentran prácticamente en todas las disoluciones acuosas. Las endotoxinas pueden conducir en hombres y animales a sepsis, una fuerte reacción adversa del sistema inmunitario. Por tanto, por ejemplo en la preparación de proteínas farmacológicas, han de detectarse exactamente las impurezas con endotoxina y a continuación eliminarse completamente. Las endotoxinas representan un problema en medicamentos preparados por ingeniería genética, productos terapéuticos genéticos o sustancias que se inyectan en hombres o animales (por ejemplo, tratamiento veterinario o en ensayos animales). Sin embargo, no sólo en aplicaciones médicas, sino también en investigación como en experimentos de transfección de células de mamífero, puede observarse una inhibición o una reducción de la eficacia de transfección por
endotoxinas.
Para poder utilizar proteínas en el marco de estudios clínicos, las farmacopeas europea y estadounidense requieren que las proteínas no superen determinados valores límite de carga de endotoxina (por ejemplo, inmunoglobulina sérica \leq 0,91 UE/ml, esto corresponde a \leq 5 UE/kg de peso corporal y hora (dosis = UE/kg\cdoth); UE = unidad de endotoxina; "FDA (Food and Drug Administration): Guideline on Validation of LAL as End Product)". En caso de que un medicamento o las proteínas en él contenidas presenten una carga alta de endotoxinas, ésta puede conducir a la muerte del sujeto de ensayo. La defensa inmunitaria mal dirigida daña al paciente por una sobrerreacción. Esto puede conducir a inflamaciones de tejido, caída de la presión sanguínea, taquicardia, trombosis, choque, etc. Ya una exposición de larga duración a endotoxinas en cantidades de picogramos puede conducir a efectos secundarios crónicos como, por ejemplo, inmunodeficiencias, síntomas sépticos, etc. Por tanto, en el marco de la preparación de sustancias, particularmente generadas en procesos en condiciones de "Good Manufacturing Practice (Buenas Prácticas de Fabricación) (GMP)", las endotoxinas se empobrecen lo más posible. Sin embargo, la eliminación de endotoxinas en proteínas, polisacáridos y ADN es problemática. Precisamente en proteínas, hay grandes problemas por sus propiedades intrínsecas como estado de carga o hidrofobicidad, que pueden impedir casi la eliminación de endotoxinas o conducir a grandes pérdidas de producto en el procedimiento de eliminación.
Actualmente, se han descrito cuatro procedimientos para la detección de endotoxina en disoluciones biológicos, en los que sólo los dos primeros están admitidos por la FDA. 1. "Ensayo de pirógenos en conejos": Un procedimiento en el que se inyecta a un conejo vivo una disolución de endotoxina y se desencadena por tanto una reacción inmunitaria. Esta respuesta inmunitaria causada por endotoxina se detecta mediante el desarrollo de fiebre. 2. Es claramente mejor estandarizable el ensayo de "Lisado de amebocitos de Limulus (LAL)", que actualmente es el ensayo más frecuentemente usado (BioWhittaker, Inc., Charles River, Inc., Associates of Cape Cod, Inc., todos los EE.UU.). En este procedimiento, se mide la aglutinación de la sangre de cangrejo de herradura (Limulus polyphemus) después de contacto con endotoxina. 3. El ensayo de pirógenos in vitro basado en la detección de interleucina 1\beta en sangre humana, que participa en la inducción de fiebre. El ensayo está compuesto por una etapa de incubación de sangre humana con la disolución a analizar y la posterior detección de la interleucina mediante anticuerpos. 4. Es una posibilidad adicional el empleo de un sistema de cultivo celular especial (Sterogene Inc., EE.UU.) con el que sigue la activación de monocitos mediante la generación de determinadas citocinas.
Los dos procedimientos citados en primer lugar son sin embargo muy caros y cuestionables no por último por razones de protección de animales por la gran necesidad de animales de ensayo o de sangre de los muy escasos cangrejos de herradura. El ensayo LAL puede ciertamente miniaturizarse y automatizarse también, pero debido a la baja estabilidad de los componentes tiene enormes desventajas en su aplicación. Una disolución de LAL una vez abierta debe procesarse directamente y aplicarse, ya que los componentes agregan al cabo de pocas horas. El ensayo de pirógenos in vitro requiere sangre humana lo más fresca posible y es relativamente largo, ya que la producción de la interleucina requiere de aproximadamente 10 a 24 horas. Además de endotoxinas, pueden reconocerse con el ensayo de pirógenos también otros pirógenos. Este ensayo se usa sin embargo en primera línea como sustitución del "ensayo de pirógenos en conejos". Para todos los procedimientos de ensayo es necesario personal entrenado y los procedimientos son muy sensibles a interferencias porque, por ejemplo, el sistema inmunitario de los conejos puede reaccionar de forma completamente distinta a la misma dosis de endotoxina. El procedimiento de cultivo celular de la compañía Sterogene es igualmente muy costoso, como todos los procedimientos de cultivo celular, y presenta problemas de estandarización.
En conjunto, puede comprobarse que no hay un procedimiento sencillo, manejable y económico para la detección de endotoxina y que los procedimientos utilizados actualmente presentan una serie de desventajas. Existe por tanto la necesidad de un procedimiento que evite estas desventajas.
Por tanto, la invención se basa en el objetivo de procurar un procedimiento que pueda detectar endotoxinas más rápidamente, más sencillamente y de forma más estandarizada en disoluciones y muestras.
Los objetivos se consiguen mediante el objeto definido en las reivindicaciones.
Las siguientes figuras ilustran la invención.
La Fig. 1 muestra una vista esquemática de la estructura química de la endotoxina de E. coli 0111:B4.
Hep = L-glicero-D-manoheptosa; Gal = galactosa; Glc = glucosa; KDO = ácido 2-ceto-3-desoxioctulosónico;
NGa = N-acetilgalactosamina; NGc = N-acetilglucosamina.
La Figura 2 muestra los resultados de medidas de resonancia de plasmón de superficie. (A) Curvas de resonancia que se han medido como respuesta a la inyección de distintas concentraciones de p12 (cada una en \mug/ml: 100; 25; 6,25; 4; 1,56; 0,4) (_). La unión se realiza en la endotoxina de E. coli D21f1, que se ha inmovilizado sobre un chip de HPA hidrófobo. Se marca la inyección de p12 y EDTA (5 mM) mediante una barra sobre las curvas. Tampón: Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0. (B) Se midieron los valores de resonancia de equilibrio para la unión de p12 a endotoxina inmovilizada aproximadamente 600 s después del inicio de la inyección de p12 y se aplicaron frente a la correspondiente concentración de p12. La línea continua muestra el ajuste de isoterma de adsorción de Langmuir (UR = URmáx\cdot[p12]/([p12]+K_{d})) en los datos. (C) Unión de E. coli a p12 biotinilada que se ha inmovilizado sobre chips de estreptavidina. E. coli D21eS (_), cuya región central interna está completa, se une a p12. Por el contrario, E. coli D21f2 (- - - -), que posee una región central altamente acortada, no se une a p12. Las medidas se llevaron a cabo en PBS.
La Figura 3 muestra esquemáticamente la estructura de la región central de endotoxina de distintos mutantes de E. coli.
La Figura 4 muestra en un diagrama de barras el comportamiento de unión de la proteína de cola de bacteriófago p12 a endotoxina que se había unido mediante polimixina B a columnas de cromatografía (0,5 ml). Se aclararon respectivamente dos columnas de polimixina B con endotoxina de E. coli 055:B5 (10^{6} UE/ml) (+LPS, barra negra) y se lavaron dos columnas con agua (- LPS, barra rayada). Se aplicó la cantidad de proteína de cola de bacteriófago p12 frente a las fracciones de elución cromatográfica. Cada barra muestra el valor medio que se estableció a partir de dos eluciones cromatográficas paralelas. El primer par de barras (A) muestra la cantidad de p12 aplicada y el segundo la fracción 1 (F1), una fracción de control antes de la aplicación de p12 sobre la columna. La flecha marca la aplicación de p12 sobre la columna. Se combinaron las fracciones 2-5 después de la aplicación. Se estableció la concentración de p12 mediante medida de absorción a 280 nm. El volumen de fracción para las fracciones 1-4 ascendía a 1 ml y a 2 ml para la fracción 5. La regeneración de la columna en la fracción 5 se realizó mediante la adición de EDTA 2 mM al tampón de elución (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 0,1 mM pH 7,5). Se retuvo la proteína de cola de bacteriófago p12 en las columnas que se habían cargado antes con endotoxina, mientras que por las columnas que no contenían endotoxina eluyó sin retardo.
Las Figuras 5A y B muestran en una gráfica la reducción de fluorescencia del mutante de T4p12 W359_283Y tras la adición de endotoxina-polisacárido (de Salmonella thyphimurium). A) Se midió la fluorescencia del mutante de p12 W359_283Y (40 \mug/ml) en el intervalo de 305-450 nm después de excitación a 295 nm. Después de la adición de 3 \mul de polisacárido (10 mg/ml) (curva gris) a 120 \mul de disolución con el mutante de p12 W359_283Y, pudo observarse en comparación con la muestra no tratada (curva negra) una reducción de la fluorescencia. Las curvas se corrigieron frente a las medidas de control sin el mutante de p12. La Figura B) muestra la reducción porcentual de la fluorescencia del mutante de p12 W359_283Y dependiendo de la concentración de endotoxina-polisacárido aplicada. La longitud de onda de excitación era de 295 nm y la longitud de onda de emisión de 350 nm. Se dispuso el mutante de p12 W359_283Y (200 \mug/ml o 3,6 \muM) y se tituló con endotoxina-polisacárido. Se aplican al eje X las concentraciones finales de endotoxina-polisacárido. Se corrigieron los valores de medida frente a las medidas de control sin el mutante de p12 W359_283Y. A partir de una concentración de polisacárido de 500 nM, pudo medirse una clara reducción de la fluorescencia.
\newpage
La Figura 6 muestra la unión de un anticuerpo anti-lípido A a lipopolisacárido que se ha unido mediante T4p12 a una superficie. La unión se observó mediante la medida de la señal de resonancia de plasmón de superficie con un Biacore J. En primer lugar, se inmovilizó covalentemente T4p12 sobre una célula de flujo continuo (chip CM-5 de Biacore) mediante los grupos amino primarios correspondientemente a las instrucciones del fabricante. A continuación, se inyectó lipopolisacárido de E. coli O55:B5 (LPS, 0,1 mg/ml). Se marcan las fases de inyección mediante barras sobre la curva de medida. El aumento de la señal de resonancia muestra la unión de lipopolisacárido a T4p12. También después de terminada la inyección, la señal de resonancia permanece elevada y por tanto el lipopolisacárido unido a la superficie. A continuación, se inyectaron tres veces un anticuerpo (AK) contra lipopolisacárido (2 \mug/ml, anticuerpo policlonal contra lípido A de Accurate Chemical & Scientific Corporation). El aumento de la señal de resonancia en cada inyección muestra la unión del anticuerpo. Mediante la adición de EDTA (EDTA), pudo disociarse la unión de lipopolisacárido a T4p12. La señal de resonancia vuelve al nivel de partida. Una segunda célula de flujo continuo permaneció sin tratar y sirvió como referencia. La curva representada muestra la diferencia de señal de la célula de medida y la célula de referencia.
La Figura 7 muestra una comparación de distintas proteínas de cola de bacteriófago p12 a nivel de aminoácidos. Las proteínas proceden de fagos de la familia Myrovidiae y poseen una homología de al menos un 60% con T4p12. Las proteínas p12 usadas para la comparación proceden de los fagos T2 (nº de acceso al banco de datos NCBI CAA39905; SEC ID NO: 9), T4 (AAD42417; SEC ID NO: 10), PP01 (BAD20635; SEC ID NO: 11), RB69 (AAP76072; SEC ID NO: 12) y AR1 (AAN03609; SEC ID NO: 13). Las proteínas de los fagos K3 (Btuda M.R. y col., Biol. Chem. (2000) 381, 225-258), RB32-33 y Ox2 presentan una homología similar con los fagos anteriormente citados.
El término "material de muestra" o "muestra" como se usa aquí comprende disoluciones enteras en las que deben detectarse endotoxinas. Son ejemplos de disoluciones la siguiente enumeración: disoluciones acuosas y mezclas de agua y disolventes orgánicos, sangre, productos sanguíneos, plasma, suero, orina y medios. Son además ejemplos de disoluciones aquellas en que se han disuelto sustancias sólidas para analizar o sustancias de bajo peso molecular y/o alto peso molecular para purificar, por ejemplo, azúcares, sales, antibióticos, proteínas, ADN, ARN, alimentos, medicamentos, vacunas o productos químicos orgánicos e inorgánicos como, por ejemplo, NaCl, MgCl_{2}, purinas o pirimidinas.
El término "endotoxina" como se usa aquí designa el lipopolisacárido bacteriano que es componente de la membrana externa de bacterias gramnegativas. Endotoxina designa no sólo el lipopolisacárido completo, sino también los componentes individuales, por ejemplo el lípido A, la región central interna o externa.
El término "proteína de cola de bacteriófago" como se usa aquí designa aquellas proteínas que aparecen en bacteriófagos y pueden unirse a endotoxinas. Habitualmente, estas proteínas se localizan en la cola de bacteriófagos, pero pueden localizarse también en la cabeza de bacteriófagos o en bacteriófagos sin cola sobre la cubierta de bacteriófago normal. El término proteína de cola de bacteriófago comprende tanto proteínas de cola de bacteriófago cortas como largas. Así, los bacteriófagos con una placa base (por ejemplo Myoviridae como fagos similares a T4) pueden presentar diferentes proteínas de cola de bacteriófago, las denominadas proteínas de cola de bacteriófago largas o cortas, que poseen también distinta especificidad por estructuras de las membranas bacterianas.
El término "homología" aquí usado designa una similitud significativa de una secuencia de aminoácidos con una secuencia comparativa o partes de la misma. La homología de una secuencia se determina con la ayuda del algoritmo de similitud BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul y col., Journal of Molecular Biology 215, 403-410 (1990). Se designan como significativamente similares, como se usa aquí, secuencias que presentan una homología de al menos un 60% o que, por ejemplo, usando parámetros estándar en el servicio BLAST del NCBI, presentan un nivel de significancia (valor de E o probabilidad) de P < 10^{-5} cuando se comparan con las secuencias comparativas.
El término "inmovilización inespecífica" o "inmovilización no dirigida" como se usa aquí significa que el acoplamiento de una proteína con una superficie se realiza por restos de proteína (por ejemplo aminas primarias) que pueden estar distribuidos por toda la superficie proteica. La selección del grupo usado para el acoplamiento de la molécula de proteína particular es al azar.
El término "superficie" o "portador" como se usa aquí comprende todos los materiales en los que es posible un acoplamiento o adhesión de una molécula de proteína como, por ejemplo, superficies de vidrio, materiales de cromatografía, por ejemplo, agarosa o Sepharose, superficies de plástico, por ejemplo, poliestireno o polipropileno y materiales de filtro, por ejemplo, celulosa.
El término "inmovilización dirigida" como se usa aquí significa que el acoplamiento se realiza mediante restos de aminoácidos u otros restos (por ejemplo, glucosilaciones de proteína) cuya posición en la proteína (por ejemplo, N- o C-terminal) es conocida. La selección de estos grupos para el acoplamiento se realiza mediante la selección de las parejas/ligadores de reacción adecuados que reaccionan preferiblemente con estos restos (por ejemplo, acoplamiento de restos sulfhidrilo con restos yodoacetato; el yodoacetato reacciona mil veces más rápido con restos sulfhidrilo que con restos amino).
Un aspecto se refiere a un procedimiento para la detección de endotoxina que comprende las etapas de:
a) incubación de una muestra con proteínas de cola de bacteriófago y a continuación
b) detección de endotoxina unida a proteínas de cola de bacteriófago mediante procedimientos espectroscópicos, ELISA, reacción de detección química o enzimática de endotoxinas o componentes escindidos de endotoxinas, o mediante medida de la capacidad.
Dado el caso, se introduce después de la etapa a) y antes de la etapa b) una etapa adicional a') de separación del complejo de proteína de cola de bacteriófago-endotoxina de la muestra.
La detección mediante procedimientos espectroscópicos puede llevarse a cabo, por ejemplo, con emisión de fluorescencia, polarización de fluorescencia, absorción o dicroísmo circular, la detección mediante medida de la capacidad puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante señales eléctricas. Las detecciones citadas pueden combinarse además con una detección competitiva.
Preferiblemente, se describe un procedimiento en el que después de la separación del complejo de proteína de cola de bacteriófago-endotoxina formado en la etapa a) de la muestra, se realiza la detección de las endotoxinas mediante reacciones inmunológicas, químicas o enzimáticas. Para ello, pueden unirse las proteínas de cola de bacteriófago con ayuda de ligandos especiales como, por ejemplo, biotina, marcador Strep o marcador His, a los correspondientes portadores, por ejemplo, Sepharose o perlas magnéticas que están recubiertas con estreptavidina o Streptactine. A continuación, puede realizarse, si se desea, una separación del portador de grano grueso mediante filtración, centrifugación o separación magnética de la muestra. Se desea la separación, particularmente, cuando el complejo de proteína de cola de bacteriófago-endotoxina está fijado a una superficie que no puede utilizarse en las detecciones usadas.
La detección inmunológica se realiza, por ejemplo, mediante la unión de anticuerpos específicos de endotoxina a las endotoxinas, la unión de un anticuerpo secundario al anticuerpo primario y la posterior detección mediante una reacción enzimática que se cataliza mediante una enzima fusionada con un anticuerpo secundario (ELISA).
La detección de endotoxina puede realizarse también después de la escisión química de la endotoxina mediante ácido o base y posterior detección de los componentes de endotoxina individuales, como ácido 2-cetodesoxioctulosónico, heptosas (Lee C.-H., Tsai C.-M., Analytical Biochemistry, 1999; 267: 161-168) o ácidos hidroxigrasos (Lyngby J., Olsen L.H., Eidem T., Lundanes E., Jantzen E., Biologics, 2002; 30: 7-13).
La presente invención se refiere a un procedimiento para la detección de endotoxina que comprende las etapas de:
a) la puesta en contacto de una muestra que contiene endotoxinas con un portador, a continuación
b) la incubación de proteínas de cola de bacteriófago en endotoxina inmovilizada sobre el portador, y
c) la detección de proteínas de cola de bacteriófago mediante procedimientos espectroscópicos, ELISA, reacciones de detección química o enzimática de endotoxinas o componentes escindidos de endotoxinas o mediante medida de la capacidad.
Dado el caso, se lleva a cabo después de la etapa b) una etapa b') adicional de separación de las proteínas de cola de bacteriófago unidas de la endotoxina.
Se prefieren particularmente las proteínas p12 de los fagos K3, T2, T4, Ox2, RB32-33, AR1, PP01 o RB69.
Se prefiere un procedimiento en el que, después de la unión de endotoxina a una superficie que porta ligandos de unión a endotoxina como polimixina B, poli-L-lisina, quitosano y similares, se unen las proteínas de cola de bacteriófago a las endotoxinas inmovilizadas y se detectan estas proteínas de cola de bacteriófago mediante una reacción enzimática a continuación. Las proteínas de cola de bacteriófago pueden detectarse mediante ELISA que es específica de proteína de cola de bacteriófago, o mediante enzimas que se fusionan con la proteína de cola de bacteriófago por ingeniería genética o se unen mediante reacciones químicas. En las enzimas, se trata, por ejemplo, de fosfatasa alcalina, peroxidasa u otras.
Preferiblemente, antes de la etapa de incubación del procedimiento según la invención, se ajusta la composición iónica de los iones difuncionales, por ejemplo, Ca^{2+}, Mg^{2+} y/o el valor de pH para obtener una unión de endotoxina-proteína de cola de bacteriófago óptima. Además, se prefiere en o después de la incubación un "desenmascaramiento" de la endotoxina unida mediante la adición de detergentes y/o sales, por ejemplo, Tween, Triton, NaCl o sulfato de amonio u otras sustancias, por ejemplo, quitosano, azúcares o lípidos, que aceleran la disociación de las endotoxinas de, por ejemplo, proteínas o ácidos nucleicos.
La proteína de cola de bacteriófago usada para la detección de endotoxina puede ser de origen natural o modificada por biología molecular o bioquímica. Se prefieren particularmente proteínas de bacteriófago que se unen a zonas muy conservadas de endotoxina, a saber, a la región central de LPS o a lípido A. se prefieren particularmente las proteínas de cola de bacteriófago cortas, preferiblemente de fagos de Myoviridae. Sin embargo, pueden usarse también las proteínas de unión a endotoxina de una cabeza de bacteriófago o las cubiertas de bacteriófago normales de bacteriófagos sin cola. Se prefieren muy especialmente proteínas de cola de bacteriófago con una homología de al menos un 60% a nivel de aminoácidos con la proteína p12 de T4. La proteína de cola de bacteriófago puede estar modificada por distintas razones por ingeniería genética y/o bioquímica. Para los procedimientos según la invención, pueden usarse sin embargo no sólo las proteínas de cola de bacteriófago de origen natural, sino también sus variantes. Variantes significa en el sentido de la presente invención que las proteínas de cola de bacteriófago presentan una secuencia de aminoácidos modificada. Estas pueden obtenerse mediante cribado de las variantes de origen natural o mediante mutagénesis aleatoria o mutagénesis dirigida, pero también mediante modificación química. Las proteínas de cola de bacteriófago usadas para los procedimientos según la invención pueden adaptarse en su especificidad o propiedades de unión a las estructuras portadoras mediante una mutagénesis dirigida o aleatoria. Esta unión al portador puede realizarse fuertemente, por ejemplo covalente o mediante una biotinilización inespecífica o no específica, o también reversiblemente, por ejemplo mediante un puente disulfuro reducible. Además, la estabilidad puede elevarse mediante una modificación. Mediante mutagénesis de biología molecular o química, se introducen mutaciones que pueden ser adiciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o modificaciones químicas. Estas mutaciones pueden causar una alteración de la secuencia de aminoácidos en la región de unión de las proteínas de cola de bacteriófago, con el fin de adaptar la especificidad y afinidad de unión a las necesidades del ensayo, por ejemplo, para elevar o hacer irreversible la unión de endotoxinas a las proteínas de cola de bacteriófago para mejorar la detección. Además, puede llevarse a cabo una modificación por ingeniería genética o bioquímica de las proteínas de fago con el fin de desconectar la actividad enzimática presente dado el caso para mejorar así la unión o hacerla irreversible. Además, puede llevarse a cabo una modificación por ingeniería genética o química de las proteínas de fago para adaptar las propiedades físicas presentes de la proteína como solubilidad, termoestabilidad y demás en el sentido del procedimiento según la invención.
Además, puede realizarse una conexión de las proteínas de cola de bacteriófago con proteínas activas enzimáticas para poder detectar las proteínas de cola de bacteriófago más sensiblemente. Las proteínas activas enzimáticas como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante, para las que hay sustratos comerciales, pueden conectarse mediante procedimientos de acoplamiento químico o mediante fusión por ingeniería genética con las proteínas de cola de bacteriófago. La reacción enzimática que se introduce mediante estas proteínas eleva claramente la sensibilidad de la detección.
Los trabajos para elucidar la estructura tridimensional de p12 de T4 han mostrado que a temperatura elevada pueden producirse fragmentos de 33 kDa y 45 kDa que están acortados de forma N- y C-terminal (33 kDa) o sólo N-terminal (45 kDa). En contraposición con el fragmento de 33 kDa, el fragmento de 45 kDa es todavía capaz de unirse a bacterias (Thomassen, E., y col., Mol. Biol.; 331: 361-373, 2003). Por lo tanto, el extremo C participa en la unión celular. Por tanto, mediante una modificación N-terminal puede llevarse a cabo una unión dirigida a la superficie y así por último optimizar indirectamente la unión de endotoxina. Además, es posible una optimización directa de la unión de endotoxina.
La modificación puede tener además particularmente el fin de posibilitar una detección directa, por ejemplo mediante la medida de la fluorescencia de triptófano. Por ejemplo, la p12 de T4 posee cinco restos de triptófano. El espectro de fluorescencia de la proteína nativa sugiere que estos restos están lo más posible inaccesibles al disolvente. A partir de una pluralidad de trabajos científicos, es conocido que casi siempre los aminoácidos aromáticos participan en la unión de restos de azúcar, como se presentan también en endotoxinas. La unión de restos de azúcar a la proteína puede seguirse mediante la inactivación de la fluorescencia de triptófano o dado el caso también adicionalmente mediante una alteración del máximo de fluorescencia. Los trabajos propios permiten suponer que la distribución desventajosa de los fluoróforos de p12 natural impide el aprovechamiento de las propiedades de fluorescencia de p12 para la medida de la unión. Las propiedades de fluorescencia de p12 están regidas por los cinco restos de triptófano, cuya fluorescencia no cambia mensurablemente por la adición de endotoxina. Estos datos permiten esperar que los restos de tirosina, más que los restos de triptófano, participen en la unión, cuya alteración de señal no puede hacerse visible ante el alto fondo del triptófano. Basándose en los resultados de la proteólisis, se tienen en cuenta seis tirosinas en el extremo C de p12 para el kit de detección de endotoxina, que pueden hacerse "visibles" correspondientemente. Mediante un intercambio de biología molecular selectivo de los cinco restos de triptófano por tirosinas, se alteran selectivamente en una primera etapa las propiedades espectroscópicas de modo que la unión a endotoxina sea mensurable mediante una alteración de la señal de fluorescencia de un resto de triptófano individual. A continuación, se eleva significativamente la intensidad de la señal mensurable mediante un intercambio selectivo respectivamente de una de las seis tirosinas en la zona C-terminal por un resto de triptófano, para obtener el desarrollo de diferencias de señal atractivas para un kit de detección de endotoxina. Como se muestra para la proteína p12 de T4, pueden modificarse también correspondientemente otras proteínas de cola de bacteriófago cortas como, por ejemplo, aquellas de fagos Myoviridae como T4, T2, K3, Ox2, RB32-33 o RB69. También aquí pueden usarse sin embargo igualmente las proteínas de unión a endotoxina de una cabeza de bacteriófago o la cubierta de bacteriófago normal de bacteriófagos sin cola, particularmente de PhiX 174.
Cuáles proteínas de cola de bacteriófago usar depende de cuáles endotoxinas deban detectarse. Ya ahora está a disposición un gran número de bacteriófagos conocidos para la mayoría de las bacterias descritas hasta ahora y pueden usarse para el procedimiento según la invención. Los fagos y las correspondientes bacterias hospedadoras son obtenibles, entre otras, a partir de las siguientes colecciones de cepas: ATCC (EE.UU.), DSMZ (Alemania), UKNCC (Reino Unido), NCCB (Holanda) y MAFF (Japón); o pueden aislarse mediante procedimientos microbiológicos estándar a partir de muestras ambientales. Las proteínas de bacteriófago pueden proceder de la familia de Myoviridae, o sea, ser proteínas de cola cortas, particularmente del grupo de fagos Pseudo-T-Even, Schizo-T-Even o T-Even. Preferiblemente, se usan para la detección según la invención las proteínas de cola de bacteriófago cortas de los fagos K3, T2, T4, Ox2, RB32-33, AR1, PP01 y RB69 o las proteínas de unión a endotoxina de bacteriófagos sin cola, por ejemplo, de PhiX 174.
Preferiblemente, las proteínas de cola de bacteriófago para el procedimiento según la invención provienen de bacteriófagos cuyas bacterias hospedadoras tienen importancia médica o biotecnológica relevante como, por ejemplo E. coli, que se usa en la producción de proteínas recombinantes o de ácidos nucleicos para terapia génica. Se prefieren especialmente proteínas de cola de bacteriófago que se unen a zonas fuertemente conservadas de la endotoxina como, por ejemplo, la región central o el lípido A. Se prefieren particularmente T4p12 y proteínas de cola de bacteriófago similares a T4p12, por ejemplo, T2-p12, K3-p12 (Burda M.R., Hindennach I., Miller S., Biol. Chem. 2000; 381: 255-258). En una combinación de impurezas de endotoxina de distintas bacterias hospedadoras, puede utilizarse para las detecciones o empobrecimientos según la invención una combinación de las correspondientes proteínas de cola de bacteriófago reconocidas por endotoxina.
La detección de la endotoxina en o de una muestra se realiza mediante la unión de endotoxina a proteínas de cola de bacteriófago. Esta unión puede detectarse, por ejemplo, mediante medida directa mediante procedimientos espectroscópicos, por ejemplo, mediante emisión de fluorescencia, polarización de fluorescencia, absorción o dicroísmo circular. Además, la unión puede hacerse visible mediante señales eléctricas, por ejemplo, una medida de capacidad. Además, la unión de endotoxina a proteínas de cola de bacteriófago puede detectarse también indirectamente mediante experimentos de desplazamiento.
Además, la unión de proteínas de cola de bacteriófago a endotoxina puede detectarse inmovilizando en primer lugar sobre una superficie la endotoxina sobre otras sustancias de unión a endotoxina o también mediante una segunda proteína de cola de bacteriófago, y uniendo a continuación otra proteína de cola de bacteriófago a la endotoxina. Después de la eliminación por lavado de la proteína de cola de bacteriófago en exceso, se cuantifica a continuación la cantidad de la otra proteína de cola de bacteriófago unida. Esto se realiza mediante anticuerpos contra la otra proteína de cola de bacteriófago (el denominado ELISA) o mediante una reacción enzimática que se cataliza mediante una proteína que está fusionada con la otra proteína de cola de bacteriófago. La superficie puede recubrirse por tanto previamente con sustancias de unión a endotoxina como, por ejemplo, polimixina B, histidina, histamina, poli-L-lisina, DEAE, polietilenimina, ácido desoxicólico, poli-\gamma-aminometil-L-glutamina, poli(alcohol vinílico), poli-N,N-dimetilaminopropilacrilamida, dextrano, quitosano y similares. Además, puede usarse también una proteína de cola de bacteriófago para la inmovilización de endotoxina. La detección de la endotoxina se realiza entonces con una segunda proteína de cola de bacteriófago que posee otras propiedades de unión a endotoxina que la proteína de cola de bacteriófago empleada para la inmovilización. La inmovilización de sustancias de unión a endotoxina se realiza a este respecto mediante adhesión, acoplamiento covalente o unión mediante grupos de inmovilización especiales como biotina, estreptavidina, marcador Strep, marcador His y grupos comparables. La detección de la proteína de cola de bacteriófago puede realizarse también mediante la disociación de la proteína de la superficie.
Para las detecciones según la invención, pueden acoplarse las proteínas de cola de bacteriófago, en caso de necesitar una separación del complejo de proteína de cola de bacteriófago-endotoxina de la muestra, con superficies adecuadas, por ejemplo, partículas imantadas, partículas de Sepharose, partículas de agarosa, placas de microvaloración, materiales de filtro o cámaras celulares de flujo continuo (detección indirecta). Las estructuras portadoras pueden estar compuestas, por ejemplo, por poliestireno, polipropileno, policarbonato, PMMA, acetato de celulosa, nitrocelulosa, vidrio, silicio o agarosa. El acoplamiento puede conseguirse, por ejemplo, mediante adsorción o unión covalente.
Es importante a este respecto un acoplamiento funcional, es decir, que las proteínas de cola de bacteriófago dispongan de estructuras o puntos de unión accesibles para la endotoxina a pesar de la unión al material portador. El acoplamiento de las proteínas de cola de bacteriófago puede realizarse inespecíficamente o también preferiblemente de forma dirigida, por ejemplo, mediante una biotinilización selectiva, o acoplado mediante un espaciador o ligador.
Para ello, pueden conectarse las proteínas de cola de bacteriófago con sustancias de bajo peso molecular, por ejemplo biotina, para unirse mediante estas sustancias de bajo peso molecular a polipéptidos, por ejemplo, estreptavidina, que a su vez se han inmovilizado sobre el portador. En lugar de biotina, puede usarse además el denominado marcador Strep (Skerra, A. y Schmidt, T. G. M. Biomolecular Engineering 16 (1999), 79-86), que es una secuencia de aminoácidos corta que se une a estreptavidina. Además, puede usarse el marcador His, que puede unirse mediante iones bifuncionales (cinc o níquel) o un anticuerpo específico del mismo (Qiagen GmbH, Hilden) a un material portador. El marcador Strep así como el marcador His se unen preferiblemente mediante tecnología de ADN recombinante a proteínas de bacteriófago preparadas recombinantemente. Este acoplamiento puede realizarse dirigido, por ejemplo al extremo N o C o a otras posiciones en la proteína de cola de bacteriófago. El acoplamiento dirigido se realiza mediante un aminoácido adecuado reactivo de forma natural en proteínas de fago no expuesto a superficie frecuentemente como la cisteína, que se ha introducido selectivamente en los sitios adecuados. Ya que las proteínas de cola de fago se sintetizan en el citoplasma, no hay que contar con puentes disulfuro. Preferiblemente, sin embargo, pueden acoplarse directamente mediante otros aminoácidos, o también indirectamente como en cisteína mediante un "espaciador" o "reticulante" (monofuncional o bifuncional).
En el acoplamiento de cisteína, son posibles todos los reticulantes bifuncionales con grupos reactivos NH y SH con y sin espaciador intermedio, por ejemplo, sulfo-NHS del ácido 11-maleimidoundecanoico o 4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxi-[6-amido]caproato de succinimidilo. En caso de no estar presente ningún espaciador, pueden insertarse espaciadores de 8-12 átomos de C con grupos NH terminales. Preferiblemente, se realiza el acoplamiento mediante una biotinilización específica de la cisteína, por ejemplo, mediante biotina activada con EZ-Link-PEO-maleimida Biotin (Pierce).
Los iones divalentes, por ejemplo Ca^{2+} o Mg^{2+}, son importantes para la unión de endotoxinas a proteínas de cola de bacteriófago como p12 de T4 o las proteínas de fibra de cola cortas de los fagos K3, T2, Ox2, RB32-33, AR1, PP01 o RB69. Mediante la adición de quelantes adecuados como, por ejemplo, EDTA o EGTA, puede disociarse sin embargo esta unión. Se prefieren para la unión concentraciones de Ca^{2+} en el intervalo de aproximadamente 0,1 \mum a aproximadamente 100 mM, con especial preferencia en el intervalo de aproximadamente 0,1 \muM a aproximadamente 10 mM, con particular preferencia en el intervalo de aproximadamente 0,1 \muM a aproximadamente 1 mM y además con particular preferencia en el intervalo de aproximadamente 10 \muM a 1 mM. Se prefieren además para la unión concentraciones de Mg^{2+} en el intervalo de aproximadamente 0,1 \muM a aproximadamente 10 mM, con especial preferencia en el intervalo de aproximadamente 0,1 \muM a aproximadamente 1 mM, con particular preferencia en el intervalo de aproximadamente 10 \muM a 1 mM. Si se reduce la concentración de iones bifuncionales mediante la adición de EDTA 1 mM por debajo de 100 nM, se disocia la unión de endotoxina a p12. Concentraciones de Mg^{2+} superiores a 10 mM empeoran la unión de endotoxina a p12, lo que se observa por una elevación de la constante de disociación. Sin la adición de Mg^{2+}, resulta un valor de K_{d} de 50 nM, y en un tampón con Mg^{2+} 10 mM, se midió un valor de K_{d} de 1 \muM. El cinc mostró un efecto inhibidor aún más fuerte. El Zn 1 mM eleva el valor de K_{d} a 10 \muM. Puede realizarse un ajuste de la concentración de iones bifuncionales u otros (por ejemplo: Cu^{2+}, Al^{3+}, Zn^{2+}, Fe^{2+}, Ca^{2+}, Ba^{2+}, Mg^{2+}, Cd^{2+}) a un intervalo óptimo para la unión mediante sustancias como HEDTA, NTA o quelantes/tampones generales (ADA: ácido N-[2-acetamido]-2-iminodiacético; 5-AMP: 5'-monofosfato de adenosina; ADP: 5'-difosfato de adenosina; ATP: 5'-trifosfato de adenosina; Bapta: ácido 1,2-bis-(2-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético; citrato: ácido cítrico; EDTA: ácido etilendiaminotetraacético; EGTA: ácido etilenglicolbis-(\beta-aminoetileter)-N,N,N',N'-tetraacético; HEDTA: ácido N-hidroxietiletilendiaminotriacético; NTA: ácido nitrilotriacético; SO_{4}: sulfato), que pueden emplearse como tampón para iones bifuncionales.
Los procedimientos según la invención pueden comprender por tanto además etapas de lavado. Dependiendo de si la detección directa o indirecta necesita una separación de muestra y proteínas de cola de bacteriófago, pueden incorporarse etapas de lavado. Ya que el Ca^{2+} u otros iones metálicos (por ejemplo Mg^{2+}) son esenciales para la unión, puede disociarse la unión de endotoxina, por ejemplo a p12 (por ejemplo, las proteínas de fibra de cola cortas de los fagos K3, T2, T4, Ox2, RB32-33, AR1, PP01 y RB69) mediante etapas de lavado adecuadas. Dependiendo del fin, si la endotoxina debe quedar unida a la proteína de cola de bacteriófago, por ejemplo, p12 (por ejemplo las proteínas de fibra de cola cortas de los fagos K3, T2, T4, Ox2, RB32-33, AR1, PP01 y RB69), se lava con tampón exento de EDTA; si la unión debe disociarse, con tampón que contiene EDTA, encontrándose las concentraciones de EDTA en el intervalo de al menos 0,05 mM a más de 10 mM, preferiblemente en el intervalo de 2 mM a 5 mM.
Ya que las interacciones iónicas son en principio siempre influenciables mediante alteraciones de la fuerza iónica, pueden influir también elevaciones o reducciones de otras sales en disolución como, por ejemplo, NaCl o KCl, en la unión de endotoxina a las proteínas de cola de bacteriófago.
Para hacer visible directa o indirectamente la unión en procedimientos de detección, puede alterarse también la proteína por biología molecular o bioquímica, para posibilitar la medida o para mejorarla. Para hacer directamente visible la unión de endotoxina, por ejemplo, p12 de T4 o las proteínas de fibra de cola cortas de los fagos K3, T2, T4, Ox2, RB32-33, AR1, PP01 o RB69 o las proteínas de unión a endotoxina de bacteriófagos sin cola, puede llevarse a cabo un intercambio por biología molecular de restos de tirosina por triptófano. Para una reducción del señal de fondo, puede ser necesario a este respecto intercambiar los triptófanos contenidos originalmente por tirosinas. Para poder medir también en disoluciones que contienen proteína, puede modificarse químicamente además p12 de T4 o las proteínas de fibra de cola cortas de los fagos K3, T2, T4, Ox2, RB32-33, AR1, PP01 o RB69 después de la introducción de triptófano. A este respecto, se alteran restos de triptófano mediante el reactivo de Koshland (bromuro de 2-hidroxi-5-nitrobencilo) respecto a sus propiedades espectroscópicas. En experimentos de desplazamiento, puede desplazarse, por ejemplo, por endotoxina marcada con fluorescencia (por ejemplo de Sigma) la endotoxina que se encuentra en la muestra, por ejemplo, de p12 de T4 o las proteínas de fibra de cola cortas de los fagos K3, T2, T4, Ox2, RB32-33, AR1, PP01 o RB69 o, por ejemplo, PhiX 174 y determinarse la concentración de endotoxina fluorescente libre.
Con el procedimiento según la invención, puede detectarse endotoxina de y en todas las disoluciones acuosas. Estas disoluciones pueden contener proteínas, ADN de plásmido, ADN genómico, ARN, peptidoglicanos, polisacáridos, complejos de proteína-ácido nucleico como, por ejemplo, fagos o virus, sacáridos, vacunas, medicamentos, tampones de reacción, disoluciones tampón generales, medios, tampón de diálisis (medicina), sales, sangre, componentes sanguíneos u otras sustancias de contaminadas por unión a endotoxina.
Son otro aspecto de la invención proteínas de bacteriófago a las que se acoplan los denominados marcadores, por ejemplo, el marcador Strep o el marcador His, preferiblemente en el extremo N o C de la proteína, con especial preferencia el extremo C. Se prefiere el acoplamiento o conexión del marcador con las proteínas de bacteriófago mediante tecnología de ADN recombinante. La preparación de ácidos nucleicos que comprenden la secuencia de la proteína de bacteriófago y el marcador y la preparación del producto de expresión son estado de la técnica y no tienen que ilustrarse aquí separadamente. Es otro aspecto de la invención la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de bacteriófago junto con el marcador Strep o His. Es una proteína de bacteriófago modificada con el marcador Strep o His la proteína p12 del fago T4, pero se prefieren igualmente todas las demás proteínas de bacteriófago que participan en el reconocimiento y unión de bacterias o que son responsables de los mismos.
Para los procedimientos según la invención, se usan preferiblemente proteínas de bacteriófago con un marcador que presenta una cisteína expuesta en superficie para biotinilación específica dirigida, por ejemplo, el marcador según las SEC ID NO: 5, 6 y 7. Es un ejemplo de p12 con marcador la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID NO: 8. Se prefiere una p12 con un marcador, particularmente con un marcador con una cisteína expuesta en superficie, particularmente una p12 con el marcador según las SEC ID NO: 6 y 7. Esta biotinilación dirigida puede mediarse adicionalmente mediante un espaciador o ligador adecuado.
Los procedimientos según la invención ofrecen ventajas frente a los procedimientos de detección de endotoxina actuales en el rendimiento de las correspondientes aplicaciones. Además, la preparación de anticuerpos contra LPS-oligosacáridos centrales es muy difícil, lo que puede hacer muy caros los correspondientes procedimientos basados en anticuerpos.
La presente invención se refiere además a un kit de detección de endotoxina que comprende los componentes necesarios para el procedimiento según la invención. El kit comprende particularmente un portador recubierto con las proteínas de cola de bacteriófago aquí descritas, un envase que contiene una endotoxina de referencia para la creación y medida de una curva patrón, otro envase con al menos otra proteína de cola de bacteriófago aquí descrita que puede estar modificada dado el caso para la detección o acoplada con una proteína activa como se describe aquí o un envase con anticuerpos anti-lípido A para la detección de endotoxina.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no han de considerarse limitantes. A menos que se indique otra cosa, se han usado los procedimientos de biología molecular estándar como se describen, por ejemplo, en Sambrook y col., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. Los experimentos descritos a continuación se llevaron a cabo con proteínas p12 de T4, T2 y K3. A menos que se declare explícitamente de otro modo, se han indicado sólo los resultados para p12 de T4, ya que los resultados de las tres proteínas son intercambiables debido a la alta homología (Burda M.R., Hindenach I., Miller S., Biol. Chem. (2000) 381, 225-258) (Riede I., Mol. Gen Genet. Ene 1987; 206 (1): 110-115). Esto se aplica igualmente a las otras proteínas indicadas en la Figura 7.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1 Recipientes de vidrio, recipientes de plástico y tampón
Para la eliminación de endotoxinas, se despirogenizaron todos los recipientes de vidrio mediante cocción a 200ºC (4 h) y se usaron exclusivamente materiales de plástico exentos de pirógenos (por ejemplo, puntas de pipeta, placas de microvaloración). Los demás dispositivos o recipientes no termorresistentes se trataron con peróxido de hidrógeno al 3% o se lavaron con desoxicolato de sodio al 1%. A continuación, se aclaró con agua exenta de endotoxinas. Se prepararon los tampones a partir de sustancias tampón ampliamente exentas de endotoxinas (Sigma) y se cargaron en agua exenta de endotoxinas. Se cocieron (200ºC, 4 h) las sales como, por ejemplo NaCl, que pueden calentarse a 200ºC. Se desgasificó y filtró el tampón usado para purificaciones cromatográficas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 Detección de endotoxina mediante el ensayo LAL
Se llevaron a cabo detecciones de control de endotoxina con un ensayo LAL cromogénico (ensayo de lisado de amebocitos de Limulus, Charles-River Endosafe, Charleston, EE.UU.) correspondientemente a las indicaciones del fabricante. Para la determinación de la concentración, se utilizó endotoxina patrón (Charles-River Endosafe, Charleston, EE.UU.) en el intervalo de 0,005-50 ó 0,02-50 UE/ml. La medida de absorción a 405 nm se realizó en un lector de placas de microvaloración termorregulable (Genios, Tecan GmbH).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3 Transferencia Western para la detección de p12
Se realizó la detección de p12 en el sobrenadante de muestras tratadas con perlas o en las fracciones de cromatografía de afinidad mediante transferencias Western. Se concentraron en parte las proteínas previamente mediante precipitación con NaDOC/TCA (desoxicolato/tetracloroacetato de sodio). Se separaron electroforéticamente así las muestras sobre geles de SDS al 12% y se transfirieron a membranas de PVDF (Immobilon, Millipore). Se lavaron las membranas con PBS durante 30 min, se bloquearon con leche en polvo al 5% (1 h) y a continuación se incubaron con anticuerpos policlonales anti-p12 (1 h, dilución 1:1000). Después de incubar con un anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina (IgG de cabra anti-conejo), se realizó el revelado de la muestra con BCIP/NBT (fosfato de 5-bromo-4-cloroindolilo/sal de nitroazul de tetrazolio).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4 Purificación de endotoxina
Se llevó a cabo la purificación de endotoxina según las instrucciones de Galanos, C., Lüderitz, O. y Westphal, O. 1969, Europ. J. Biochem. 9, 245-249.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5 Acoplamiento específico de p12 con restos de yodoacetilo inmovilizados
Para conseguir una unión dirigida de p12 a la superficie, se sustituyó el aminoácido serina en posición 3 del marcador Strep según la SEC ID NO: 5 por cisteína como en el ejemplo 12, y se inmovilizó la proteína mediante restos yodoacetilo que se unen preferiblemente a restos sulfhidrilo libres. La p12 resultante se denominó p12S3C.
Se vertió con 1 ml de gel de acoplamiento Sulfolink (Pierce), se lavó con 6 ml de desoxicolato de sodio al 1% y se equilibró con 6 ml de tampón de acoplamiento (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, pH 8,5). A continuación, se inyectó 1 ml de p12S3C (=N-StrepS3Cp12) (1-1,5 mg/ml en tampón de acoplamiento), se agitó ligeramente la columna durante 15 min, se incubó otros 30 min sin agitación a temperatura ambiente, se inyectó de nuevo 1 ml de p12S3C y se repitieron las etapas de incubación. Se repitió este acoplamiento de p12S3C en total 4 veces y a continuación se lavó la columna con 6 ml de tampón de acoplamiento. Se combinaron los eluidos y se determinó la concentración respectiva de p12S3C mediante medida de la absorción a 280 nm. Se unieron 2,2-2,8 mg de p12S3C por ml de gel. A continuación, se bloquearon los restos de yodoacetilo en exceso mediante incubación (45 min) con 1 ml de cisteína (50 mM en Tris 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8,5). Después de lavar la columna con 16 ml de NaCl 1 mM y 16 ml de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5, la columna estaba lista para el uso.
Se ensayó la capacidad de este gel de separar endotoxina de las disoluciones de proteína con BSA (2-4 mg/ml), anhidrasa carbónica (1-2 mg/ml) y lisozima (3-4 mg/ml). Se sembraron las disoluciones de BSA y lisozima con endotoxina de E. coli O55:B5 (Charles-River Endosafe, Charleston, EE.UU.) o E. coli HMS 174 (100-1000 UE/ml), mientras que la anhidrasa carbónica no se mezcló con endotoxina adicional. Se añadieron respectivamente 0,5 ml de disolución de proteína a la columna, se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente y a continuación se lavó la columna con tampón. Se combinaron por fracciones las proteínas y se determinó el contenido de endotoxina antes y después de la columna mediante un ensayo LAL cromogénico (Charles-River Endosafe, Charleston, EE.UU.). Además, se estableció la recuperación de proteína mediante medidas de absorción a 280 nm. Las endotoxinas podían separarse de las tres disoluciones de proteína casi completamente (93-99%), como se muestra en la Fig. 2A. Además, las proteínas podían eluirse ampliamente de la columna (80-99%, Fig. 2B). Se regeneró finalmente la columna con EDTA 5 mM, Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5. Para excluir de las impurezas de las fracciones de proteína la p12 disociada después de la elución por la columna, se analizó la p12 de las fracciones mediante la técnica de transferencia Western. No pudo detectarse p12 en las fracciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6 Acoplamiento inespecífico de p12 con material portador activado con NHS
Se desplazaron con N-hidroxisuccinimida (NHS) los restos amino primario de los compuestos y se empleó por tanto para el acoplamiento de proteínas a superficies. Se lavaron en primer lugar columnas de Sepharose activadas con NHS (HP activada con NHS de HiTrap, 1 ml, Amersham-Pharmacia-Biotech) con 6 ml de ácido clorhídrico 1 mM enfriado con hielo. A continuación, se bombearon circularmente por la columna a temperatura ambiente 10-15 ml de p12S3C (1,0-3,5 mg/ml) en NaHCO_{3} 0,2 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3 (caudal 0,8 ml/min). Después de 60 min, se combinó el eluido por fracciones y se lavó la columna con 6 ml de tampón. Se separó de estas fracciones la NHS mediante desalado de la disolución mediante columnas pequeñas de desalado HiTrap (5 ml, Amersham-Pharmacia-Biotech) y se determinó a continuación la cantidad de p12 mediante medida de la absorción a 280 nm. Se unieron 20-25 mg de p12S3C a la columna. Se aclararon repetidamente las columnas después del acoplamiento correspondientemente a las indicaciones del fabricante con 6 ml respectivamente de tampón de bloqueo (etanolamina 0,5 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3) y tampón de lavado (acetato 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 4,0). A continuación, se equilibró la columna con 6 ml de tampón de uso (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 o Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,5).
Se ensayó la separación de endotoxina por estas columnas con disoluciones de lisozima (3-4 mg/ml en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 o Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,5). Se sembraron las disoluciones de lisozima con endotoxina de E. coli HMS 174 (\sim500 UE/ml). Se añadieron 0,5 ml de disolución de proteína a la columna, se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente y a continuación se lavó la columna con tampón. Se combinó la lisozima por fracciones y se determinó la cantidad de endotoxina antes y después de la columna mediante un ensayo LAL cromogénico (Charles-River Endosafe, Charleston, EE.UU.). Además, se estableció la recuperación de proteína mediante medidas de absorción a 280 nm. Se eliminaron las endotoxinas de la disolución al 85-90%, como se muestra en la Fig. 3A, y pudieron volver a eluirse de la columna el 85-90% de la lisozima mediante lavado con tampón de uso (Fig. 3B). Se lavó a continuación la columna con 6 ml de EDTA 5 mM, Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 y 6 ml de NaCl 1 M. Para excluir de las impurezas de las fracciones de proteína la p12 disociada después de la elución por la columna, se analizó la p12 de las fracciones mediante la técnica de transferencia Western. No pudo detectarse p12 en las fracciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7 Acoplamiento dirigido de p12 con columnas de material portador activado con NHS con diaminoetano y yodoacetato de N-succinimidilo (SIA) como espaciador
Para conseguir una unión dirigida al material portador de cromatografía, se unió un ligador bifuncional a superficies activadas por NHS, lo que posibilitaba un acoplamiento de p12S3C mediante su cisteína libre y los restos yodoacetilo del ligador bifuncional.
Se lavaron en primer lugar las columnas de Sepharose activadas con NHS (HP activada con NHS de HiTrap, 1 ml, Amersham-Pharmacia-Biotech) con 6 ml de ácido clorhídrico 1 mM enfriado con hielo, se inyectó después 1 ml de etilendiamina (10 mg/ml en NaHCO_{3} 0,2 M, NaCl 0,5, pH 8,3) y se incubó la columna durante 30 min a temperatura ambiente. Después de bloquear los grupos NHS en exceso con etanolamina (etanolamina 0,5 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3) y lavar (acetato 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 4,0) la columna, se equilibró la columna con 6 ml de tampón borato (borato de sodio 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, pH 8,3). A continuación, se aclaró circularmente la columna durante 30 min con 10 ml de yodoacetato de N-succinimidilo (SIA, Pierce, 200 \mul de disolución madre de SIA en 10 ml de tampón borato; disolución madre de SIA: 1,4 mg de SIA en 1 ml de DMSO). Se lavó la columna después con 6 ml de tampón borato y se aclaró la columna durante 1 h con p12S3C (1 mg/ml, 50 ml en tampón borato). Se saturaron los restos yodoacetilo en exceso con 1 ml de disolución de cisteína (cisteína 5 mM en tampón borato, incubar 15 min a temperatura ambiente) antes de equilibrar la columna con el tampón de uso (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 ó Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 8,5). Se llevaron a cabo las reacciones de acoplamiento con SIA en la oscuridad.
Se ensayó la eliminación de endotoxinas mediante esta columna con disoluciones de lisozima (3-4 mg/ml en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 ó Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,5). Se sembraron las disoluciones de lisozima con endotoxina de E. coli HMS 174 (\sim500 UE/ml). Se añadieron 0,5 ml de disolución de proteína a la columna, se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavó a continuación la columna con tampón. Se combinó la lisozima por fracciones y se determinó el contenido de endotoxina antes y después de la columna mediante un ensayo LAL cromogénico (Charles-River Endosafe, Charleston, EE.UU.). Además, se estableció la recuperación de proteína mediante medidas de absorción a 280 nm. Se eliminaron las endotoxinas al 90% de la disolución y pudo volver a eluirse de la columna el 75-85% de la lisozima mediante lavado con tampón de uso. Se lavó a continuación la columna con 6 ml de EDTA 5 mM, Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 y 6 ml de NaCl 1 M. Para excluir de las impurezas de las fracciones de proteína la p12 disociada después de la elución por la columna, se analizó la p12 de las fracciones mediante la técnica de transferencia Western. No pudo detectarse p12 en las fracciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 8 Eliminación de endotoxina de una disolución de BSA en un procedimiento de flujo continuo
Se acopló inespecíficamente Sepharose activada con NHS Hi-Trap (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) con p12 según las instrucciones del fabricante mediante grupos amino primario. A este respecto, se inmovilizaron covalentemente 8 mg de p12 por ml de material de gel. La columna de cromatografía de 1 ml así obtenida se equilibró a un caudal de 1 ml/min con 10 ml de tampón A (Hepes 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 0,1 mM). A continuación, se aplicaron 4 ml de una disolución de BSA (11,5 mg de BSA (Carl Roth GmbH, Alemania)/ml de tampón A) (inyección: I) y se combinó el eluido (E) en fracciones de 2,5 ml. Se lavó a continuación la columna con 15 ml de tampón A y se eluyó la endotoxina unida a la columna con 7 ml de tampón B (Hepes 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM). En el lavado y elución, se combinaron respectivamente fracciones de 2 ml. Después de cada experimento, se regeneró la columna con 20 ml de tampón C (Hepes 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, 0,1% de desoxicolato de sodio). Se determinó la concentración de endotoxina mediante un ensayo de lisado de amebocitos de Limulus cromogénico (LAL) (Charles-River Endosafe, Charleston, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Se realizó la determinación de la concentración de proteína mediante medida de la absorción UV. La eficacia de eliminación de endotoxina ascendía a entre 95-99% y la pérdida de proteína ascendía a aproximadamente 6-10%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 9 Eliminación de bajas cantidades de endotoxina del tampón mediante p12 acoplada inespecíficamente
Se lavaron en primer lugar 20 ml de Sepharose activada con NHS 4 FastFlow (Amersham Biosciences) con ácido clorhídrico enfriado con hielo y a continuación se incubaron con 292 mg de p12 (7 mg/ml en citrato 25 mM, pH 7,0) durante 4 horas con agitación a temperatura ambiente. A continuación, se lavó la Sepharose con 7 x 80 ml de citrato 5 mM a pH 2,0 y se dializó respectivamente 1 ml de las fracciones de lavado frente a citrato 5 mM a pH 2,0. Se emplearon estos dializados para cuantificar la p12 en exceso en las fracciones de lavado mediante medida de la absorción a 280 nm. Se determinó una densidad de carga de 8,7 mg de p12 por 1 ml de Sepharose. Se saturaron los restos de NHS no reaccionados mediante incubación de 12 h de Sepharose con Tris 1 M a pH 8,0. Se rellenaron columnas de 2 ml de volumen con este material de columna y se almacenaron éstas a 4ºC en etanol al 20% hasta su empleo. Se aplicaron en tres ensayos paralelos sobre una columna respectivamente 4 ml de disolución de endotoxina (S). La disolución de endotoxina estaba compuesta por E. coli O55:B5 (Charles-River Endosafe, Charleston, EE.UU.) en tampón de equilibrado (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 0,1 mM, pH 7,5). La concentración de endotoxina de esta disolución se encontraba a 4,6 UE/ml. Se aclararon las columnas en primer lugar con 12 ml de tampón de regeneración (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, pH 7,5) y a continuación con 12 ml de tampón de equilibrado. A continuación, se añadió de nuevo tampón de equilibrado a la columna y se fraccionó en 1 ml. Se aplicó la disolución de endotoxina a la columna (I) y se combinaron fracciones de 5 ml y 2 ml. A continuación, se regeneró la columna con 4 ml de tampón de regeneración (B). En las fracciones de elución no pudo detectarse endotoxina, es decir, las impurezas de endotoxina pudieron eliminarse totalmente en los tres experimentos. Este ejemplo muestra claramente que también a bajas cantidades de endotoxina se realiza una unión que corresponde a una detección de bajas cantidades de endotoxina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 10 Acoplamiento inespecífico de p12 biotinilada a perlas de estreptavidina magnéticas
Se incubó p12 (3 mg/ml en PBS, 0,05% de Tween 20) con sulfo-NHS-LC-LC-biotina (Pierce) a una relación de 1:10 a 1:20 durante 1 hora a TA y a continuación se dializó frente a tampón (por ejemplo, PBS o Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, pH 7,5). La biotina activada con NHS se une a este respecto a restos amino primario de p12. A continuación, se añadieron a 1 ml de perlas de estreptavidina (MagPrep Streptavidin Beads, Merck) 50 \mul de p12 biotinilada (1 mg/ml), se agitó durante 2 h a temperatura ambiente y a continuación se eliminó la p12 en exceso mediante cuatro lavados con 1,5 ml de Tris 20 mM, EDTA 10 mM, pH 7,5.
Se ensayó la eliminación de endotoxinas con tampón (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) y disoluciones de proteína (BSA 0,1 mg/ml, lisozima 0,1 mg/ml, anhidrasa carbónica 0,1 mg/ml en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5). Se sembró el tampón así como la disolución de BSA y lisozima con 5 UE/ml (endotoxina de E. coli O55:B5, Charles-River Endosafe, Charleston, EE.UU.). La disolución de anhidrasa carbónica recibió aproximadamente 1 UE/ml. Se añadieron a 200 \mul de tampón o disolución de proteína 25 \mul de perlas magnéticas con p12 inmovilizada, se mezclaron pipeteando y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Se eliminaron las perlas de la disolución con ayuda de un imán y se eliminó por pipeteo el sobrenadante. Se determinó a continuación el contenido de endotoxina de muestras no tratadas y muestras incubadas con perlas con el ensayo LAL y se determinó la recuperación de proteína mediante la medida de absorción a 280 nm. Puede eliminarse prácticamente del todo la endotoxina del tampón (99,9% de eliminación de endotoxina) y también en la disolución de proteína se empobreció la endotoxina al 70-92%. La recuperación de proteína se encontraba entre 57% y 99% (BSA: 87%, anhidrasa carbónica: 99%, lisozima: 57%;
Fig. 4B).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 11 Acoplamiento inespecífico de p12 biotinilada con estreptavidina inmovilizada
Se incubó p12 (3 mg/ml en PBS, 0,05% de Tween 20) con sulfo-NHS-LC-LC-biotina (Pierce) a una relación de 1:10 a 1:20 durante una hora a TA y a continuación se dializó frente a tampón (por ejemplo, PBS o Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, pH 7,5). La biotina activada con NHS se une a este respecto a restos amino primario de p12. La p12 biotinilada se incuba a continuación durante 1 h a temperatura ambiente con material de cromatografía cargado con estreptavidina (estreptavidina inmovilizada ImmunoPure: perlas de agarosa reticuladas al 6%) y se elimina la p12 en exceso mediante lavado con PBS.
Se ensayó la eliminación de endotoxinas con tampón (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0) y BSA (0,5 mg/ml en Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0). Se sembraron por cada 1 ml de tampón o disolución de BSA 10 UE/ml, se añadieron 50 \mul de p12-agarosa y se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. Se centrifugó a continuación la p12-agarosa y se midió la concentración de endotoxina y proteína en el sobrenadante. Pudieron eliminarse del tampón el 99% y de la disolución de BSA el 86% de endotoxina. La BSA pudo recuperarse hasta el 90%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 12 Análisis de la unión de p12-endotoxina mediante medidas de resonancia de plasmón de superficie
Se analizó la unión de p12 a endotoxina o a bacterias por lipopolisacáridos en la membrana celular externa mediante medidas de resonancia de plasmón de superficie (Biacore J). Para establecer la constante de disociación (K_{d}), se inmovilizó endotoxina de E. coli O55:B5 (Sigma) sobre un chip HPA hidrófobo correspondientemente a las instrucciones del fabricante y se inyectó p12 a distintas concentraciones (Fig. 2A). Se mide la unión en "unidades de respuesta" (UR) relativas, los valores de equilibrio se aplican frente a las concentraciones de p12 apropiadas (Fig. 2B). Mediante la adaptación de la isoterma de adsorción de Langmuir (UR = (URmáx\cdot[p12])/([p12]+K_{d})) a estos datos, se establece del valor de K_{d} (Tabla 1). Para las medidas, se usó un tampón exento de endotoxina. Para los valores de pH entre 6 y 10, se establecieron valores de K_{d} en el intervalo de 10^{-7} a 10^{-9} M (Tabla 1). La unión se volvió a anular mediante la inyección de EDTA 1 mM o 5 mM y se regeneró el chip.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1 Constantes de disociación de endotoxina a p12 dependiendo del valor de pH de la disolución
1 
\vskip1.000000\baselineskip
Para analizar la unión de bacterias a p12, se inmovilizó p12 biotinilada sobre chips de estreptavidina y se inyectaron distintas cepas de E. coli. Se suspendieron las bacterias en PBS para las medidas. Se usaron cepas de E. coli que poseen lipopolisacáridos con distintas proporciones de polisacárido. La parte de polisacárido está compuesta por una región "central" que está conectada con el lípido A y el denominado antígeno O. El antígeno O varía mucho entre las distintas especies bacterianas y también entre las cepas bacterianas, mientras que la región "central" está fuertemente conservada. Las cepas que poseen la región "central" y el antígeno (por ejemplo E. coli), así como las cepas que poseen una región "central" completa (E. coli D21) se unieron a p12, mientras que las cepas con una región "central" muy acortada (por ejemplo E. coli D21f2) no se reconocieron ya por p12 (Fig. 2C). La unión pudo redisociarse mediante EDTA (5 mM) y regenerarse el chip.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 13 Constructos de p12 recombinantes
1. Construcción de p12 con marcador Strep N-terminal (N-Strep-p12): Se introdujo mediante PCR en el extremo 5' del gen T4p12 la secuencia nucleotídica del marcador Strep (patente de EE.UU. 5.506.121). Se construyó para ello para el extremo 5' del gen p12 un cebador (5'-GAA GGA ACT AGT CAT ATG GCT AGC TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC GCC AGT AAT AAT ACA TAT CAA CAC GTT-3' (SEC ID NO: 1)), que contiene la secuencia nucleotídica del marcador Strep en su extremo 5' (en cursiva en la secuencia) y posee un sitio de corte de restricción (NdeI, subrayado en la secuencia) de modo que pueda utilizarse el gen en un marco de lectura correcto en el plásmido de expresión. Para el extremo 3' del gen p12, se construyó un cebador que introduce detrás del gen p12 un sitio de corte de restricción BamHI (en cursiva en la secuencia) (5'-ACG CGC AAA GCT TGT CGA CGG ATC CTA TCA TTC TTT TAC CTT AAT TAT GTA GTT-3', (SEC ID NO: 2)). Se llevó a cabo la PCR con 40 ciclos (1 min a 95ºC, 1 min a 45ºC y 1 min a 72ºC). Se escindió la preparación de PCR con las endonucleasas de restricción NdeI y BamHI y se utilizó el fragmento deseado después de fraccionamiento por tamaño en un gel de agarosa y elución del gel en el sitio NdeI y BamHI del plásmido de expresión pET21a. Se comprobó la corrección de la secuencia del gen N-Strep-p12 mediante secuenciación de ADN. Se llevaron a cabo las etapas adicionales hasta el plásmido pNS-T4p12p57 como se describe en Burda, M.R. y Miller, S. (Eur. J. Biochem. 1999 265 (2), 771-778) para T4p12p57. Se transformó entonces el plásmido pNS-T4p12p57 en la cepa de expresión BL21 (DE3).
2. Inserción de un resto de cisteína N-terminal en N-Strep-p12 (N-Strep-S3C-p12 y N-Strep-S14C-p12): Se llevó a cabo la inserción de un resto de cisteína N-terminal como se describe en 1, construyendo para ello dos nuevos cebadores para el extremo 5'. Para N-Strep-S3C-p12, se usó el cebador 5'-GAA GGA ACT AGT CAT ATG GCT TGT TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC GCC AGT AAT AAT ACA TAT CAA CAC GTT-3' (SEC ID NO: 3), para N-Strep-S14C-p12, se usó el cebador 5'-GAA GGA ACT AGT CAT ATG GCT AGC TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC GCC TGT AAT AAT ACA TAT CAA CAC GTT-3' (SEC ID NO: 4).
3. Purificación de la proteína N-Strep-p12: Se cultivó la cepa BL21(DE3) de E. coli con el plásmido pNS-T4p12p57 en cultivos agitados de 2 l (medio LB con ampicilina 100 \mug/ml) hasta una DO_{600} de 0,5-0,7 a 37ºC y se indujo la expresión de la proteína N-Strep-p12 mediante la adición de IPTG 1 mM (\beta-tiogalactopiranósido de isopropilo). Después de incubar a 37ºC durante 4 h, se recolectaron las células. Se suspendieron las células recolectadas de un cultivo de 10 l en 50 ml de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, MgSO_{4} 2 mM, NaCl 0,1 M, se trituraron mediante tres tratamientos en prensa French (137,9 MPa) y a continuación se centrifugaron durante 30 min a 15.000 rpm (SS34). Después de dos lavados con el mismo tampón, se extrajo la proteína N-Strep-p12 del sedimento 3 veces con agitación durante 30 min en Tris-HCl 40 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM, se centrifugó la preparación durante 30 min a 15.000 rpm (SS34) y se almacenó la NS-p12 disociada en el sobrenadante a 4ºC. Se repitió dos veces la extracción y se aplicaron los sobrenadantes reunidos sobre una columna de afinidad de Streptactine (15 ml), equilibrada con tampón "W" (Tris-HCl 100 mM, pH 8, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM) (IBA GmbH, Göttingen). Después de lavar con 5 volúmenes de columna de tampón "W", se eluyó con 3 volúmenes de columna de tampón "W" con destiobiotina 2,5 mM en tampón "W". Después de múltiples diálisis frente a tampón "W" y concentración, se establecieron mediante PAGE-SDS y espectroscopia UV (Burda y col. 1999) la concentración y pureza de N-Strep-T4p12. Se purificaron así de 10 l de cultivo aprox. 100 mg de N-Strep-T4p12.
2 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 14 Detección de LPS mediante la unión de p12 a LPS inmovilizada
Se rellenaron 4 columnas con 0,5 ml de volumen cada una de Sepharose con polimixina B (Detoxi-Gel, Pierce). Se lavaron las columnas con 3 ml cada una de tampón fosfato de sodio (fosfato de sodio 20 mM, pH 12,0) y con 3 ml cada una de tampón de regeneración (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, pH 7,5). A continuación, se aplicaron sobre dos de estas columnas 1 ml de LPS de E. coli O55:B5 (0,1 mg/ml en tampón Hepes, 10^{6} UE/ml). Se aclararon las otras dos columnas con 1 ml cada una de tampón de regeneración. Se lavaron después todas las columnas con 3 ml de tampón de equilibrado cada una (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 0,1 mM, pH 7,5) y a continuación se aplicó de nuevo 1 ml de este tampón y se recogió como fracción 1. A continuación, se aplicaron 0,5 ml de una disolución con la proteína de cola de bacteriófago p12 (0,844 mg/ml en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 0,1 mM) sobre las columnas y se lavó con 2,5 ml de tampón de equilibrado y 2 ml de tampón de regeneración. Se recogió el eluido en fracciones tres veces de 1 ml y una vez de 2 ml y se determinó la concentración de la proteína de cola de bacteriófago p12 en estas fracciones mediante medida de la absorción a 280 nm (Figura 4). La proteína de cola de bacteriófago p12 se unía en gran medida a las columnas que se habían tratado previamente con LPS, y podía disociarse de estas columnas mediante la adición de tampón de regeneración. En contraposición a esto, pasaba sin retardo por las columnas que no se habían tratado con LPS.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 15 Detección de la unión de endotoxina-polisacárido al mutante de T4p12 W359 Y W283Y
En el mutante de T4p12 usado, se sustituye en las posiciones 359 y 283 el aminoácido triptófano por tirosina. Para los análisis de fluorescencia, se usó un polisacárido (PM = 2 kDa) que procedía de endotoxina de Salmonella typhimurium. Se disolvieron tanto el mutante de p12 (40 ó 200 \mug/ml) como endotoxina-polisacárido en citrato 5 mM a pH 2. Se determinó la fluorescencia en el intervalo de 305-450 nm mediante excitación a 295 nm. Se dispusieron 120 \mul de una disolución con el mutante de p12 W359 Y W283Y en una cubeta de fluorescencia, se midió la fluorescencia y se añadió a continuación por etapas polisacárido (concentración final: 0,5-120.000 nM) y se midió de nuevo la fluorescencia después de mezclar la muestra. Se llevó a cabo en ensayos de control el mismo ensayo sin el mutante p12 y se corrigieron las curvas de medida frente a estos datos. La unión de endotoxina o endotoxina-polisacárido reduce la fluorescencia de este mutante (Figura 5). Esto puede utilizarse para la detección de endotoxina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 16 Inmovilización de lipopolisacárido sobre T4p12 y detección de la unión por un anticuerpo anti-lípido A
Para la detección, deben unirse en primer lugar lipopolisacáridos de una disolución de muestra a una superficie y a continuación detectarse estos lipopolisacáridos inmovilizados con la ayuda de una segunda proteína que se une a lipopolisacáridos. Para representar la factibilidad de este procedimiento de detección, se construyó dicho "sándwich" sobre la superficie de un chip Biacore y se siguió la unión de lipopolisacárido y un anticuerpo de lípido A mediante medida de resonancia de plasmón de superficie. Para ello, se acopló covalentemente en primer lugar T4p12 con la superficie de un chip CM-5 (Biacore). Se activaron los restos carboxilo de la superficie con una mezcla de EDC (clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, 75 mg/ml) y NHS (N-hidroxisuccinimida, 11,5 mg/ml) y a continuación se inyectó T4p12, cuyos restos amino primario reaccionan con la superficie activada. Se dejó sin tratar la superficie de una segunda célula de referencia. Pudo seguirse la unión de 100 \mul de lipopolisacárido (E. coli O55:B5, 0,1 mg/ml) a T4p12 mediante el aumento de la señal de resonancia (véase la Fig. 6). También después del final de la inyección, la señal de resonancia permaneció a su nivel y mostró por tanto una unión estable. Las inyecciones posteriores de un anticuerpo anti-lípido A (2 \mug/ml, anticuerpo policlonal contra lípido A de cabra de Accurate Chemical & Scientific Corporation, nº de producto YVS6921) mostraron igualmente un aumento de la señal de resonancia y por tanto una unión del anticuerpo. La señal de resonancia pudo volver a reducirse al nivel de partida mediante la inyección de EDTA (2 mM), que suprime la unión de lipopolisacárido a T4p12. Esto significa que el aumento de señal, que se ha inducido por la inyección del anticuerpo, se realizaba mediante la unión a lipopolisacárido. Los experimentos se llevaron a cabo en el siguiente tampón: Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 0,1 mM, pH 7,5.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 17 Inmovilización de lipopolisacárido mediante T2p12 y detección de la unión por un anticuerpo anti-lípido A
Se clonó, expresó y purificó T2p12 análogamente a T4p12. Para la detección, se unen en primer lugar lipopolisacáridos de una disolución de muestra a una superficie y a continuación se detectan estos lipopolisacáridos inmovilizados con la ayuda de una segunda proteína que se une a lipopolisacárido. Para representar la factibilidad de este procedimiento de detección, se construyó dicho "sándwich" sobre la superficie de un chip Biacore y se siguió la unión de lipopolisacárido y un anticuerpo de lípido A mediante medida de la resonancia de plasmón de superficie. Se acopló covalentemente para ello en primer lugar T2p12 con la superficie de un chip CM-5 (Biacore). Se activaron los restos carboxilo de la superficie con una mezcla de EDC (clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, 75 mg/ml) y NHS (N-hidroxisuccinimida, 11,5 mg/ml) y a continuación se inyectó T2p12, cuyos restos amino primario reaccionaban con la superficie activada. Se dejó sin tratar la superficie de una segunda célula de referencia. La unión de 100 \mul de lipopolisacárido (E. coli O55:B5, 0,1 mg/ml) a T2p12 pudo seguirse mediante el aumento de la señal de resonancia. También después del final de la inyección, permanecía la señal de resonancia al mismo nivel, y demuestra por tanto una unión estable. Las inyecciones posteriores de un anticuerpo anti-lípido A (2,1 \mug/ml, anticuerpo policlonal contra lípido A de cabra de Accurate Chemical & Scientific Corporation, nº de producto YVS6921) mostraron igualmente un aumento de la señal de resonancia y por tanto una unión del anticuerpo. La señal de resonancia pudo volver a reducirse al nivel de partida mediante la inyección de EDTA (2 mM), que suprime la unión de lipopolisacárido a T4p12. Esto significa que el aumento de señal, que se ha inducido por la inyección del anticuerpo, se realizaba mediante la unión a lipopolisacárido. Los experimentos se llevaron a cabo en el siguiente tampón: Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 0,1 mM, pH 7,5.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 18 Inmovilización de lipopolisacárido mediante RB69p12 y detección de la unión mediante un anticuerpo anti-lípido A
Se clonó, expresó y purificó RB69p12 análogamente a T4p12. Para la detección, se unen en primer lugar lipopolisacáridos de una disolución de muestra a una superficie y a continuación se detectan estos lipopolisacáridos inmovilizados con la ayuda de una segunda proteína que se une a lipopolisacárido. Para representar la factibilidad de este procedimiento de detección, se construyó dicho "sándwich" sobre la superficie de un chip Biacore y se siguió la unión de lipopolisacárido y un anticuerpo de lípido A mediante medida de la resonancia de plasmón de superficie. Se acopló covalentemente para ello en primer lugar RB69p12 con la superficie de un chip CM-5 (Biacore). Se activaron los restos carboxilo de la superficie con una mezcla de EDC (clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, 75 mg/ml) y NHS (N-hidroxisuccinimida, 11,5 mg/ml) y a continuación se inyectó RB69p12, cuyos restos amino primario reaccionaban con la superficie activada. Se dejó sin tratar la superficie de una segunda célula de referencia. La unión de 100 \mul de lipopolisacárido (E. coli O55:B5, 0,1 mg/ml) a RB69p12 pudo seguirse mediante el aumento de la señal de resonancia. También después del final de la inyección, permanecía la señal de resonancia al mismo nivel, y demuestra por tanto una unión estable. Las inyecciones posteriores de un anticuerpo anti-lípido A (2,1 \mug/ml, anticuerpo policlonal contra lípido A de cabra de Accurate Chemical & Scientific Corporation, nº de producto YVS6921) mostraron igualmente un aumento de la señal de resonancia y por tanto una unión del anticuerpo. La señal de resonancia pudo volver a reducirse al nivel de partida mediante la inyección de EDTA (2 mM), que suprime la unión de lipopolisacárido a RB69p12. Esto significa que el aumento de señal, que se ha inducido por la inyección del anticuerpo, se realizaba mediante la unión a lipopolisacárido. Los experimentos se llevaron a cabo en el siguiente tampón: Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 0,1 mM, pH 7,5.
<110> PROFOS AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la detección de endotoxina
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PRO-013 PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<140> desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 20-12-2004
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DE 10360844.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 20-12-2003
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
3 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acgcgcaaag cttgtcgacg gatcctatca ttcttttacc ttaattatgt agtt 
\hfill
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
4 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
5 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> marcador strep
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
6 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> marcador strep
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
7 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> marcador strep
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
8 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 539
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> T4p12 con marcador strep
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
9
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 527
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína p12 del fago T2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
11
12
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 527
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína p12 del fago T4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
14
15 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 518
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína p12 del fago PP01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
16
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 516
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína p12 del fago RB69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
18
19
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 516
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína p12 del fago AR1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
21
22 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 527
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína p12 del fago K3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
23
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 516
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína p12 del fago RB32-33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
25
26
27

Claims (14)

1. Procedimiento para la detección de endotoxinas que comprende las etapas de:
a) la puesta en contacto de una muestra que contiene endotoxinas con una superficie recubierta con una sustancia de unión a endotoxina, a continuación
b) la incubación de proteínas de cola de bacteriófago o proteínas de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o de proteínas de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola en endotoxinas inmovilizadas sobre la superficie, y
c) la detección de proteínas de cola de bacteriófago o proteínas de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o de proteínas de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola mediante procedimientos espectroscópicos, ELISA, reacciones de detección química o enzimática de endotoxinas o componentes escindidos de endotoxinas o mediante medida de la capacidad.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además después de la etapa b) y antes de la etapa c) la etapa adicional de
b') separación de proteínas de cola de bacteriófago o proteínas de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o de proteínas de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola de la endotoxina.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la sustancia de unión a endotoxina es una proteína de cola de bacteriófago o proteína de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o una proteína de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína de cola de bacteriófago es una proteína de fibra de cola de bacteriófago corta.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que la proteína de fibra de cola de bacteriófago corta se selecciona de K3, T2, T4, Ox2, RB32-33, AR1, PP01 y RB69.
6. Procedimiento según la reivindicación 4 ó 5, en el que la proteína de cola de bacteriófago presenta una homología a nivel de aminoácidos de al menos un 60% con la proteína T4p12.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que las proteínas de cola de bacteriófago o proteínas de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o las proteínas de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola están modificadas.
8. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que las proteínas de cola de bacteriófago o las proteínas de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o las proteínas de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola están unidas covalentemente con proteínas activas enzimáticas.
9. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína de cola de bacteriófago o proteína de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o la proteína de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola presentan un marcador Strep o un marcador His.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que el marcador presenta una secuencia de aminoácidos según las SEC ID NO. 5, 6 ó 7.
11. Procedimiento según la reivindicación 9 ó 10, en el que se usa como proteína de cola de bacteriófago la proteína p12 de los fagos T4, K3, T2, Ox2, RB32-33, AR1, PP01 o RB69.
12. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que la concentración de Ca^{2+} en la incubación asciende a 0,1 \muM a 10 mM y/o la concentración de Mg^{2+} a 0,1 \muM a 10 mM.
13. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que la endotoxina marcada se desplaza por la unión con una proteína de cola de bacteriófago o proteína de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o una proteína de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola y a continuación se detecta la endotoxina marcada.
14. Un kit de detección de endotoxina que comprende un portador recubierto con sustancia de unión a endotoxina, un recipiente que contiene una endotoxina de referencia para la medida de una curva patrón y un recipiente con al menos una proteína de cola de bacteriófago o proteína de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o una proteína de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola, o un anticuerpo anti-lípido A.
ES04802964T 2003-12-20 2004-12-20 Procedimiento para la deteccion de endotoxinas. Active ES2334236T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10360844 2003-12-20
DE10360844A DE10360844B4 (de) 2003-12-20 2003-12-20 Verfahren zum Nachweis und zur Entfernung von Endotoxin

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2334236T3 true ES2334236T3 (es) 2010-03-08

Family

ID=34706511

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES04802964T Active ES2334236T3 (es) 2003-12-20 2004-12-20 Procedimiento para la deteccion de endotoxinas.

Country Status (9)

Country Link
US (2) US8394597B2 (es)
EP (1) EP1695085B1 (es)
AT (1) ATE441113T1 (es)
AU (1) AU2004303928B2 (es)
CA (1) CA2549530C (es)
DE (2) DE10360844B4 (es)
DK (1) DK1695085T3 (es)
ES (1) ES2334236T3 (es)
WO (1) WO2005062051A1 (es)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10360844B4 (de) * 2003-12-20 2007-05-16 Profos Ag Verfahren zum Nachweis und zur Entfernung von Endotoxin
AU2015273431C1 (en) 2014-06-12 2019-01-03 Hyglos Invest Gmbh Unmasking endotoxins in solution
ES2736024T5 (es) 2014-06-12 2022-07-01 Biomerieux Deutschland Gmbh Desenmascarar endotoxinas en solución
CN105116142B (zh) * 2015-08-05 2017-09-22 上海拜攸生物科技有限公司 一种新型细菌内毒素检测试纸及检测方法
CN112462015B (zh) * 2020-11-18 2022-07-12 海南倍特药业有限公司 一种氢溴酸瑞马唑仑细菌内毒素的检测方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4906567A (en) 1987-01-21 1990-03-06 E. I. Dupont De Nemours And Company Non-immunochemical binding of lipopolysaccharides and sandwich assays therefor
US6436653B1 (en) * 1998-12-15 2002-08-20 Exiqon A/S Method for introduction of reporter groups into bacterial lipopolysaccharide-derived carbohydrates and the subsequent coupling of such derivatives onto solid surfaces
DE10129815A1 (de) 2001-06-24 2003-01-09 Profos Ag Verfahren zur Aufreinigung von Bakterienzellen und Zellbestandteilen
DE10228133A1 (de) * 2002-06-24 2004-01-22 Profos Ag Verfahren zum Nachweis und zur Entfernung von Endotoxin
AU2003250270B2 (en) * 2002-06-24 2009-05-07 Hyglos Invest Gmbh Method for identifying and extracting endotoxin
DE10307793A1 (de) * 2003-02-24 2004-09-02 Profos Ag Verfahren zum Nachweis und zur Entfernung von Endotoxin
DE10360844B4 (de) * 2003-12-20 2007-05-16 Profos Ag Verfahren zum Nachweis und zur Entfernung von Endotoxin

Also Published As

Publication number Publication date
CA2549530C (en) 2013-07-30
DE10360844A1 (de) 2005-07-28
CA2549530A1 (en) 2005-07-07
AU2004303928B2 (en) 2010-06-17
ATE441113T1 (de) 2009-09-15
DE10360844B4 (de) 2007-05-16
US20130244224A1 (en) 2013-09-19
DK1695085T3 (da) 2009-12-07
US20110053188A1 (en) 2011-03-03
EP1695085B1 (de) 2009-08-26
US8551719B1 (en) 2013-10-08
WO2005062051A1 (de) 2005-07-07
US8394597B2 (en) 2013-03-12
EP1695085A1 (de) 2006-08-30
DE502004009980D1 (de) 2009-10-08
AU2004303928A1 (en) 2005-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7858299B2 (en) Method for detecting and for removing endotoxin
US8822641B2 (en) Method for detecting and removing endotoxin
ES2263598T3 (es) Deteccion e identificacion de grupos de bacterias.
ES2405848T3 (es) Composiciones y métodos para detección de infección patógena
ES2371292T3 (es) Nuevas proteínas de adhesión de bacteriófagos.
US8551719B1 (en) Endotoxin detection method
WO2012028697A1 (en) Affinity purification system based on donor strand complementation
Mourez et al. Use of phage display and polyvalency to design inhibitors of protein-protein interactions
CN110996986A (zh) Hcv抗原的多表位融合蛋白及其用途
Lang et al. Using biotinylated SUMO-traps to analyze SUMOylated proteins
TW202208401A (zh) 與寡聚脂多醣結合蛋白質相關之用途、方法及產物
US20150175998A1 (en) Methods and Kits to Create Protein Substrate˜HECT-Ubiquitin Ligase Pairs
ES2361121T3 (es) Ensayos de fosfato inorgánico mejorados.
JPWO2018135651A1 (ja) 抗体−多糖結合体及びそれを用いた高感度免疫測定方法
Jones The binding of an afimbrial bacterial surface adhesin to glycophorin using aqueous polymer two-phase partitioning