CN101039962A - 检测含有唾液酸的荚膜糖的聚合化程度 - Google Patents

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Abstract

聚合度(DP)是分析糖抗原，特别是偶联糖的重要参数。本发明提供可用于检测荚膜糖，具体说是脑膜炎球菌糖，例如血清群W135和Y荚膜糖DP的方法。优选方法根据糖末端唾液酸残基的还原，然后比较总唾液酸与还原唾液酸的摩尔比来计算DP。

Description

检测含有唾液酸的荚膜糖的聚合化程度
本文引用的所有文件全文纳入作为参考。
技术领域
本发明涉及含有细菌荚膜糖，特别是载体偶联糖的疫苗的分析和质量控制领域。
背景技术
含有与载体蛋白相偶联的荚膜糖的免疫原为本领域所熟知。偶联将T细胞不依赖性抗原转变为T细胞依赖性抗原，从而提高了记忆应答并产生保护性免疫力，原型偶联疫苗是b型流感嗜血杆菌(Hib)[例如，参见参考文献1的第14章]。自Hib疫苗以来，开发了保护性抗脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)(脑膜炎球菌)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(肺炎球菌)的偶联糖疫苗。其它(微)生物的感兴趣偶联疫苗有无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(B族链球菌)[2]、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[3]和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[4]。
除了利用全长荚膜糖，也可选择水解步骤后产生的所需大小的寡核苷酸[例如参考文献5]，有报导说用中等链长寡糖制成的偶联物提高了免疫原性[例如参考文献6和7]。三种已批准的人用脑膜炎奈瑟球菌血清群C偶联疫苗中，MenjugateTM[8]和MeningitecTM以寡糖为基础，而NeisVac-CTM利用全长多糖。因此检测寡糖长度(例如，检测聚合度，或“DP”，即链中重复单元的数目)可用于间接评估免疫原性。
当疫苗中含有寡糖片段时，生产和投放市场(release)的质量控制需要寡糖具有明确的长度，并且各批之间此长度应一致。因此，DP也可用于质量控制，欧洲药品质量理事会(European Directorate for Quality of Medicines)(EDQM)为偶联Hib疫苗制定了官方授权管制放行(Official Control Authority BatchRelease)(OCABR)，其专门要求递交关于生产期间所用糖的DP与分子大小分布数据。
DP也可用于监测疫苗稳定性。糖抗原在室温易于解聚[9、10]，导致免疫原性降低和疫苗异质性增加。可通过跟踪储存期间DP随时间的(变化情况)来监测这种改变。
可采用许多方法检测寡糖合并物(pool)中的平均DP，在一些情况中，方法的选择取决于所分析的糖。已报道采用例如比色法和/或酶法分析Hib与脑膜炎球菌血清群A和C的寡糖[5、11、12]，但本发明人发现在脑膜炎球菌血清群W135和Y(“MenW135”和“MenY”)糖中存在糖苷键意味着不能用这些技术。
虽然以前已描述了检测偶联物疫苗中MenA和MenC糖DP的方法[例如，参考文献5和13]，但仍需要可应用于血清群W135和Y的糖的方法。因此，本发明的目的是改进评估糖DP的方法，特别是提供可用于脑膜炎球菌血清群W135和Y糖DP的检测方法。
发明内容
本发明人发现了一种可用于检测脑膜炎球菌血清群W135和Y荚膜糖DP的方法。因此，本发明提供一种检测荚膜糖聚合度的方法，其特征在于该糖来自脑膜炎球菌血清群W135或血清群Y。该方法由于包括了色谱分离步骤而易于执行。在含有大小不同的荚膜糖群的组合物中，本发明提供一种检测平均DP的方法。
该方法通常包括水解糖以释放组成单糖，并根据单糖进行分析。因此，本发明提供一种检测脑膜炎球菌血清群W135或血清群Y荚膜糖聚合度的方法，该方法包括以下步骤：(i)水解该糖得到含有单糖亚基的糖水解物；(ii)定量测定水解物中的单糖亚基，其中步骤(ii)的定量结果用于计算出聚合度。
该方法在水解之前一般包括对该糖的末端残基(可在还原端或非还原端)进行化学修饰，从而在水解为单糖后可鉴别该末端残基与非末端残基。因此，本发明提供一种检测脑膜炎球菌血清群W135或血清群Y荚膜糖聚合度的方法，该方法包括以下步骤：(i)修饰该糖的末端单糖亚基产生修饰的末端单糖；(ii)水解该糖产生含单糖亚基，包括修饰的末端单糖的糖水解产物；(iii)定量测定水解产物中的单糖亚基；(iv)定量测定水解产物中修饰的末端单糖；和(v)利用步骤(ii)和(iv)的定量测定结果来计算出聚合度。
一般地说，该方法适用于含有一种以上不同类型单糖亚基和包含末端唾液酸残基的任何糖。该方法的优点是只根据对糖中唾液酸残基的定量测定而无需分析任何其它类型单糖来提供DP信息。因此，本发明提供了一种检测荚膜糖聚合度的方法，其中：(a)所述糖含有唾液酸单糖亚基和非唾液酸单糖亚基；(b)所述糖含有末端唾液酸单糖亚基；和(c)该方法包括以下步骤：(i)修饰该糖的末端唾液酸亚基产生修饰的末端唾液酸亚基；(ii)水解该糖产生含有唾液酸亚基，包括修饰的末端唾液酸亚基的糖水解差别物；(iii)定量测定水解产物中的唾液酸亚基，包括修饰的末端唾液酸亚基；和(iv)利用步骤(iii)的定量测定结果来计算出聚合度。
本发明的优选方法是根据对糖中末端唾液酸残基的还原，然后比较总唾液酸与还原唾液酸的摩尔比计算DP。因此，本发明提供一种检测荚膜糖聚合度的方法，其中：(a)所述糖含有唾液酸单糖亚基和非唾液酸单糖亚基；(b)所述糖含有末端唾液酸单糖亚基；和(c)该方法包括以下步骤：(i)还原该末端唾液酸单糖亚基产生还原的唾液酸单糖亚基；(ii)水解该糖产生含有单糖亚基的水解产物；(iii)测定水解产物中总(即，还原的与非还原的)唾液酸与还原唾液酸之比率。
就含有大小不同的荚膜糖群的组合物而言，本发明提供检测这些糖平均聚合度的方法，其中：(a)所述糖含有唾液酸单糖亚基和非唾液酸单糖亚基；(b)所述糖含有末端唾液酸单糖亚基；和(c)该方法包括以下步骤：(i)还原该末端唾液酸单糖亚基产生还原的唾液酸单糖亚基；(ii)水解该糖产生含有单糖亚基的糖水解产物；(iii)测定水解产物中总(即，还原的与非还原的)唾液酸与还原唾液酸之比率。该组合物可包含不含有末端唾液酸单糖亚基的糖。
已报道了分析聚唾液酸糖长度与组成的方法[14]，该方法中氧化和/或还原末端残基，然后用神经氨酸酶消化该糖释放其唾液酸单糖亚基。然而，所述的此现有技术只用于单由唾液酸(包括N-乙酰基-神经氨酸、N-乙醇酰基-神经氨酸和脱氨基唾液酸)构成的糖，在技术上限于可酶切为单糖的糖。相反，本发明方法可处理包含非唾液酸单糖的糖，并且无需(但不排除)采用酶水解。
本发明人也发现可用于检测脑膜炎球菌血清群C荚膜糖DP的方法。该方法同样是基于对末端唾液酸残基的还原，并以相同方式计算DP。一般来说，该方法适用于含有α2→9相连唾液酸残基的任何糖。该方法优点是不涉及酶解聚。因此，本发明提供检测荚膜糖聚合度的方法，其中：(a)所述糖含有α2→9相连的唾液酸单糖亚基；(b)所述糖含有末端唾液酸单糖亚基；和(c)该方法包括以下步骤：(i)还原该末端唾液酸单糖亚基产生还原的唾液酸单糖亚基；(ii)水解该糖产生含有单糖亚基的水解产物；(iii)测定水解产物中总(即，还原的与非还原的)唾液酸与还原唾液酸之比率。
就含有大小不同的荚膜糖群的组合物而言，本发明提供检测这些糖平均聚合度的方法，其中：(a)所述糖含有α2→9相连的唾液酸单糖亚基；(b)这些糖含有末端唾液酸单糖亚基；和(c)该方法包括以下步骤：(i)还原该末端唾液酸单糖亚基产生还原的唾液酸单糖亚基；(ii)水解这些糖产生含有单糖亚基的水解产物；(iii)测定水解产物中总(即，还原的与非还原的)唾液酸与还原唾液酸之比率。
已报道了分析聚唾液酸糖的长度与组成的方法[14]，该方法中氧化和/或还原末端残基，然后用神经氨酸酶消化该糖释放其唾液酸单糖亚基。然而，所述的此现有技术只能用于由α2→8相连唾液酸构成的糖，在技术上限于可酶切为单糖的糖。相反，本发明方法涉及α2→9相连的唾液酸，优点是不采用酶水解，一般用化学(例如，酸)水解。
测定血清群C糖长度的方法已知[5]，此方法通过比较总唾液酸和高碘酸盐处理MenC糖所产生的甲醛之比来测定DP。此现有技术和方法涉及修饰聚合物的非还原末端，而不涉及产生唾液醇(sialitol)。
含有唾液酸残基和非唾液酸残基的荚膜糖
在一些实施方案中，本发明提供含有唾液酸单糖亚基和非唾液酸单糖亚基的糖的分析方法。更具体地说，所述糖优选由重复单元构成，这些重复单元由唾液酸单糖亚基和非唾液酸单糖亚基构成。
感兴趣的两种具体的糖是脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)血清群W135和Y的荚膜糖。这些糖天然在其还原末端含有唾液酸残基，在其非还原末端含有葡萄糖或半乳糖。这些血清群天然糖中的唾液酸是N-乙酰基神经氨酸或“NeuNAc”。
血清群W135糖是由唾液酸-半乳糖二糖单元组成的聚合物。其7和9位唾液酸的O-乙酰化(水平)不同[15]。该结构如图1所示，书写为：→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→。
除了二糖重复单元含有葡萄糖而非半乳糖外，血清群Y糖与血清群W135糖类似(参见图3)。其7和9位唾液酸的O-乙酰化(水平)不同[15]。该结构如图2所示，书写为：→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→。
在其它实施方案中，本发明提供含有(α2→9)相连唾液酸的糖的分析方法。血清群C荚膜糖是(α2→9)相连的在7和/或8位唾液酸O-乙酰化水平(不同)的均聚物。
血清群C、W135和Y的荚膜不同于具有(α1→6)相连的N-乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸均聚物的血清群A(荚膜)和具有(α2→8)相连的唾液酸均聚物的血清群B(荚膜)。
聚合度
糖的聚合度定义为该糖中重复单元的数目。因此，均聚物的聚合度与单糖单元的数目相同。而杂聚物的聚合度是整个链长中单糖单元的数目除以最小重复单元中单糖单元的数目，例如(Glc-Gal)10的DP是10而非20，而(Glc-Gal-Neu)10的DP是10而非30。
在具有相同基本重复结构但长度不同的糖混合物中(例如，在长的多糖的部分水解产物中)，通常是检测群体的平均DP而非检测各分子的DP。如果糖的大小范围太大使测定平均值没有意义，则可在分离后(例如，按糖的大小分离后)检测混合物各组分的DP。总体上，本发明可用于检测含有混合长度的糖组合物的平均DP。
还原末端唾液酸单糖亚基
本发明用于分析含有末端唾液酸残基的糖。具体地说，本发明用于分析在还原末端含有唾液酸残基的糖。
可采用任何合适的化学(方法)来还原末端唾液酸残基，一般包括使糖与还原剂一起温育。可采用常规分析确定任何给定还原剂和任何给定糖的合适条件。
优选的还原剂是可在碱性条件下还原末端唾液酸残基的硼氢化钠(NaBH4)。此还原(反应)的产物有时称为唾液醇[16]。一般在37℃与NaBH4温育2小时足够。在碱性条件下还原后，优选(例如)加入温和的酸性乙酸铵中和组合物。
水解糖产生糖水解产物
末端唾液酸残基还原后，糖分解成其组成单糖单元。笼统地说，可通过化学(方法)或酶(方法)解聚糖产生单糖。然而，如果没有可进行给定切割的酶，则必需采用化学途径。
糖的化学水解一般包括在该领域的标准条件下用酸或碱处理。将荚膜糖解聚为其组成单糖的条件是本领域已知的。血清群W135和Y糖优选酸水解。利用TFA(三氟乙酸)的酸水解可用于水解所有的血清群C、W135和Y，血清群C的温育温度宜略低以免其唾液酸降解(90℃而非100℃)。典型的TFA处理包括加入终浓度为2M的TFA，然后加热至90-100℃，90分钟。为分析总糖含量，可在80℃用100mM HCl处理2小时来水解血清群C糖[17]。其它典型的水解条件包括升温(例如，70-80℃)用毫摩尔浓度的弱酸(例如乙酸)处理。
本发明采用可用于切割血清群C中α2→9连接键的酶。然而，这些酶通常需要这些糖在水解前脱-O-乙酰化，因此如果要维持O-乙酰化[15]，优选用化学(方法)水解糖。酶水解作用缓慢时也优选化学水解。但一般买不到可用于切割血清群W135和Y糖的酶。
虽然在上文中本发明就制备和分析含单糖亚基的水解产物作了定义，本发明也可应用于含有二糖、三糖、四糖等荚膜糖片段的水解产物，但制备单糖水解产物更容易。提供二糖、三糖、四糖等糖的均质群，即控制只有一种待定量测定化合物的水解条件的难度远大于简单地完全解聚，即得到单糖。
解聚后，可利用，例如真空干燥器干燥糖水解产物。
测定总唾液酸与还原唾液酸的比例
水解得到含有原始糖的单糖亚基的糖水解产物。在所述糖同时含有唾液酸亚基和非唾液酸亚基的实施方案中，水解产物含有唾液酸和非唾液酸单糖；在所述糖是唾液酸均聚物的实施方案中，水解产物只含有唾液酸；在两种情况中，唾液酸单糖组分可以是修饰形式(例如，还原形式)。可利用该组分测定原始糖的DP。例如，如果混合物中十分之一的唾液酸残基是修饰的残基并且糖的最小重复单位只含有唾液酸残基，则该原始糖的DP是10。
可根据分子的数目(例如，摩尔数)、分子量、比例或浓度来测定各单糖的含量。为简化比例的计算，特别是当组成的单糖分子量不同，通常采用摩尔数，但可利用任何这些测量值互换以确定混合物的单糖含量。为定量检测，可将分析结果与含量已知的某具体糖的标准品相比较。
优选将解聚的混合物完全水解为单糖。本发明人发现有时会发生不完全水解得到存在二糖片段(即，MenW135的Gal-NeuNAc和MenY的Glc-NeuNAc)的混合物。例如，发现90℃用TFA处理MenW135或MenY糖产生单糖和二糖的混合物，而将水解温度升至100℃基本上只产生单糖。即使90℃也不希望不完全水解，但现在发现如果需要技术人员可修改具体的水解方法以确保完全水解，例如通过升高温度等。
定量测定唾液酸单糖的方法是本领域熟知的。这些方法可以是直接或间接的(例如，它们可包括衍生单糖，然后分析与原始单糖含量的相关性)。优选的方法能在其它单糖存在时分析唾液酸，从而无需在分析前将唾液酸与其它单糖分开。此外，这些方法可用于偶联糖，从而无需在去偶联后分开载体和糖。一种这样的方法是一般采用脉冲电流分析检测(PAD)的阴离子色谱，特别是高效阴离子交换色谱(HPAEC)[18，19]。HPAEC-PAD系统由DionexTM Corporation(Sunnyvale，CA)提供，例如BioLCTM系统，该系统利用诸如PA1[直径10μm的聚苯乙烯基质，与二乙烯基苯交联度为2％，用500nm MicroBead季铵功能化的乳胶凝聚(交联度5％)]或PA10[直径10μm的乙基乙烯基苯基质，与二乙烯基苯交联度为55％，用460nm MicroBead双功能季铵离子凝聚(交联度5％)]柱。这些系统能定量分析混合物中的每种糖而无需衍生或在分析前分离。就糖类分析而言，在加入该柱前需要滤去其它化合物，DionexTM生产了用于此目的的预填装捕获柱和保护柱(guard)，例如用于除去氨基酸的氨基酸捕获柱和硼酸盐捕获柱等。
定量测定解聚混合物中唾液酸单糖的另一方法是核磁共振法(NMR)。然而，为便于使用和高灵敏度，优选本发明的色谱法。然而，在本发明的一些实施方案中，无论选择何种方法，重要的是要能鉴别还原唾液酸和非还原唾液酸。这可包括它们各自的独特信号，或者可包括一种独特的信号和一种组合信号，这两种给定信号之间的差异提供了所需信息。
定量测定唾液酸单糖的另一种方法是比色法[80]。此方法特别可用于TFA酸水解后定量测定非还原性唾液酸。
一旦测定了修饰和非修饰的(例如，还原和非还原的)唾液酸的相对含量后，则不难得到原始糖的DP。
除了定量测定水解产物中的唾液酸外，本发明方法也涉及定量测定可衍生自与唾液酸相同的糖或衍生自其它糖的其它单糖(例如，葡萄糖或半乳糖)。这些检测方法可用于检测DP以外的参数或者可用作DP测定的一部分，例如作为验证或代替检测总唾液酸，特别是当唾液酸和其它单糖的摩尔含量如在W135和Y糖中那样相同时。
本发明的方法一般是破坏性的。因此，不能对全部组合物实施该方法，更常见是采取感兴趣组合物的样品，然后分析该样品。
偶联物
本发明可用于分析疫苗，特别是含有偶联糖的疫苗中糖的含量。共价偶联可通过将糖从T-细胞不依赖性抗原转变为T-细胞依赖性抗原而引发免疫记忆来提高糖的免疫原性。偶联对儿科疫苗特别有用，它是熟知的技术[例如，参考文献20-29所总结的]。可将糖直接与载体相连[30，31]，但通常利用接头或间隔臂，例如己二酸、β-丙酰胺[32]、硝基苯基-乙胺[33]、卤代酰卤(haloacylhalide)[34]、糖苷键[35]、6-氨基己酸[36]、ADH[37]、C4-C12组分[38]等。
偶联物中的载体蛋白通常是细菌毒素或类毒素，例如白喉类毒素或破伤风类毒素。CRM197白喉毒素衍生物[39-41]是MenjugateTM和MeningitecTM中的载体蛋白，而破伤风类毒素用于NeisVacTM中。白喉类毒素用作MenactraTM中的载体。其它已知的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[42]、合成的肽[43，44]、热激蛋白[45，46]、百日咳蛋白[47，48]、细胞因子[49]、淋巴因子[49]、激素[49]、生长因子[49]、含各种病原体衍生抗原的多种人CD4+T细胞表位的人工蛋白[50]、流感嗜血杆菌的D蛋白[51，52]、肺炎球菌表面蛋白PsPA[53]、铁摄取蛋白[54]、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[55]等。组合物可利用一种以上载体蛋白以(例如)降低载体抑制的风险，一种载体蛋白可携带多种糖抗原[56]。偶联物的糖∶蛋白之比(w/w)一般在1∶5(即，蛋白过量)和5∶1(即糖过量)之间。除偶联物之外，组合物还可含有游离载体蛋白[57]。
本发明特别可用于在偶联前为产生该偶联物需要确保选择大小正确糖链的阶段。
本发明使得可核查或监测偶联前全长多糖片段化的进展(情况)。当需要特定长度(长度范围)的寡糖时，重要的是多糖片段化不应太过分从而使解聚超过所需程度(例如，结束时产生了单糖)。本发明通过随时间检测平均链长从而可监测此部分解聚的进展(情况)。因此，本发明提供了检测组合物中糖聚合度的方法，包括以下步骤：(a)开始解聚组合物中的糖；和在随后的一个或多个时间点，(b)如上所述检测糖的DP。在最初一轮实验中，通常在几个时间点检测DP以确定随时间的进展(情况)，但在建立标准条件后，一般在验证目的所设定的时间点检测DP。一旦DP达到所需水平，则该方法可包括额外步骤：(c)例如通过洗涤、分离、冷却等终止解聚。该方法也可包括在任选用化学方法活化后将解聚的糖与载体蛋白相偶联的下一步骤。
本发明也能在片段化后选择所需长度的寡糖链。因此，本发明提供用于制备糖偶联物而选择糖的方法，包括以下步骤：(a)获得含不同聚合度各种多糖片段的混合物的组合物；(b)将该混合物分离为次级混合物(sub-mixture)；(c)采用上述方法测定一种或多种次级混合物的DP；和(d)利用步骤(d)的结果选择一种或多种次级混合物用于偶联。该方法包括在步骤(a)之前使多糖片段化，或者可以从已制备的混合物开始。这些片段可以是相同多糖的片段，例如相同血清群多糖的片段。在步骤(d)之后，该方法可包括用任选的化学方法活化后与载体蛋白相偶联的步骤。
为引入能与载体反应的官能团，一般在偶联之前用化学方法活化糖。但糖活化的条件可导致水解，因此活化后须检查DP。在恰当的地方术语“糖”应包括活化的糖。此外，本发明提供制备活化糖用于制备糖偶联物的方法，包括以下步骤：(a)获得某种糖；(b)化学方法活化该糖以引入能与载体蛋白反应的官能团；和(c)如上所述检测步骤(b)产物的DP。该方法可包括其它步骤：(d)使活化的糖与载体蛋白(其本身可以是已活化的)反应产生糖偶联物。该方法可包括在步骤(a)之前使多糖片段化，或者可以从已制备的混合物开始。
本发明也可在偶联后使用。偶联后，可以三种方式利用本发明来分析组合物：第一，可在例如不同偶联物混合之前，或者疫苗投放(市场)之前检测组合物中总糖的DP(为管理或质控目的)；第二，可检测组合物中游离的未偶联糖的DP，例如检查不完全偶联，或监测游离糖随时间变化的增加来追踪偶联物水解(情况)；第三，可为同样的原因检测组合物中偶联糖的DP。第一和第三种方式需要在分析前将糖从偶联物中释放。然而，在糖偶联涉及还原末端唾液酸残基的反应或修饰从而使该残基不再能还原的情况中，本发明只可用于末端唾液酸可以再生(或还原的末端唾液酸可以直接再生)的糖。
为分别评估偶联的与未偶联的糖，必须使它们分离。可用各种方法使水性组合物中的游离(即，未偶联的)糖与偶联糖相分离。偶联反应可改变糖的各种化学和物理参数，可利用这些差异来分离。例如，可采用大小分离使游离和偶联糖相分离，因为偶联的物质因载体蛋白而具有较大的分子量。超滤是优选的大小分离方法。作为替代方案，如果偶联物吸附到佐剂上，则离心可使吸附的偶联物(沉淀物)与水解后解吸的游离糖(上清液)相分离。
本发明提供分析糖偶联物的方法，包括以下步骤：(a)处理糖偶联物以从载体上释放糖；和(b)如上所述检测所释放糖的DP。本发明提供分析糖偶联物组合物的方法，包括以下步骤：(a)使组合物中未偶联糖与偶联糖相分离；和(b)如上所述检测未偶联糖和/或偶联糖的DP。
本发明也提供投放疫苗为医生所用的方法，包括以下步骤：(a)制备含有荚膜糖偶联物的疫苗，此疫苗中该糖含有唾液酸单糖亚基和非唾液酸单糖亚基；(b)如上所述分析该疫苗中糖的DP；和如果步骤(b)的结果表明DP可为临床应用所接受，则(c)投放该疫苗为医生所用。可对包装好的疫苗，或者包装前的散装疫苗实施步骤(b)。
混合糖
本发明可分析含唾液酸的脑膜炎球菌荚膜糖组合物的DP。这些组合物也可含其它荚膜糖(例如，脑膜炎奈瑟球菌血清群A的荚膜糖，流感嗜血杆菌b的荚膜糖)，只要这些糖不含有可干扰总体分析的唾液酸。当组合物中多种糖含有唾液酸残基时，可采用参考文献58所述的原理来区分不同糖。
脑膜炎球菌血清群A的荚膜糖是(α1→6)-连接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸的均聚物，其C3和C4位部分O-乙酰化。用封闭基团取代此乙酰基可防水解[10]，这种修饰的糖仍是本发明意义内的血清群A糖。
Hib荚膜糖是核糖、核糖醇和磷酸的聚合物。该糖称为“PRP”(聚-3-β-D-核糖-(1，1)-D-核糖醇-5-磷酸)。
除荚膜糖以外的糖组分
本发明所分析的组合物优选不含有游离形式的唾液酸(不是荚膜糖水解所产生的任何背景单糖)。然而，如果存在唾液酸，则有两种通用方法来尽量降低或避免干扰问题。第一，可检测游离唾液酸的初始水平，然后从解聚混合物检测的水平中扣除。第二，可在分析前将游离唾液酸从组合物中除去，例如采用过滤或透析。可用超滤膜来除去低分子量组分。
非糖组分
除了分析组合物中的糖，该方法可包括分析其它组分或性质，例如每种糖或偶联物的重量克分子渗透浓度、pH、聚合度、蛋白质含量(特别是载体蛋白)、铝含量、洗涤剂含量、防腐剂含量等。
本发明提供制备疫苗组合物的方法，包括根据本发明分析糖的DP步骤，和测定组合物pH的步骤，然后任选将组合物的pH调节至所需值，例如6-8之间，或约7的步骤。
本发明也提供制备疫苗组合物的方法，包括以下步骤：(a)提供如上所述经DP-分析的荚膜糖；(b)将经DP-分析的荚膜糖与一种或多种载体蛋白相偶联；(c)任选分析该散装疫苗的pH和/或其它性质；和如果步骤(c)的结果表明该散装疫苗可为临床应用所接受，则(d)将该散装疫苗制备并包装为人用疫苗。步骤(c)可包括评估最低糖浓度，评估未偶联：偶联糖之比等。步骤(d)可包括包装成单位剂型或多剂型，例如装入小瓶或注射器中。用于注射的典型人用剂量体积是0.5ml。
本发明也提供制备疫苗组合物的方法，包括以下步骤：(a)提供如上所述经DP-分析的血清群W135和/或Y的荚膜糖；(b)将经DP-分析的荚膜糖与一种或多种载体蛋白相偶联产生偶联糖；和(c)混合该偶联糖与一种或多种其它抗原，例如以下抗原
-脑膜炎奈瑟球菌血清群C荚膜糖抗原。
-脑膜炎奈瑟球菌血清群A荚膜糖抗原。
-脑膜炎奈瑟球菌血清群B蛋白质抗原。
-脑膜炎奈瑟球菌血清群B微泡囊[59]、“天然OMV”[60]、细胞泡或外膜泡囊[例如，参考文献61到66等]的制剂。
-b型流感嗜血杆菌糖抗原。
-肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的抗原，例如多价偶联糖抗原[例如，见参考文献67到69]。
-甲肝病毒抗原，例如灭活的病毒[例如，70，71]。
-乙肝病毒抗原，例如表面和/或核心抗原[例如，71，72]。
-百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)抗原，例如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(“FHA”)，任选与百日咳杆菌粘附素(pertactin)和/或凝集原2和3联用[例如，参考文献73和74]。可以利用百日咳细胞抗原。
-白喉抗原，例如白喉类毒素[参考文献75的第3章]，例如CRM197突变体[例如，76]。
-破伤风抗原，例如破伤风类毒素[参考文献75的第4章]。
-脊髓灰质炎抗原[例如，77，78]，例如IPV。
这类抗原可吸附到铝盐佐剂上(例如，氢氧化铝或磷酸铝)。优选含有任何其它糖抗原作为偶联物。
批次间的一致性
就人用疫苗制备而言，偶联的糖应在偶联前(例如，糖和载体蛋白)、偶联后、配制后与混合后进行质量控制。DP检测的现有技术不涉及血清群W135和Y糖。然而，现在采用本发明可对此两种血清群进行DP检测，并且可联用血清群A和CDP检测的方法。此外，本发明方法可靠而一致，从而可正确比较不同批次的混合A/C/W135/Y偶联物，而这利用现有技术方法不可能。因此，可制备、检验不同批次的混合偶联疫苗，然后选择一致的批次投放市场应用，而弃去异常批次。
本发明提供两批疫苗，其中：(a)这两批疫苗均含有：(i)脑膜炎奈瑟球菌血清群A荚膜糖偶联物，(ii)脑膜炎奈瑟球菌血清群C荚膜糖偶联物，(iii)脑膜炎奈瑟球菌血清群W135荚膜糖偶联物，(iv)脑膜炎奈瑟球菌血清群Y荚膜糖偶联物；(b)第一批中血清群A糖的DP是A1和第二批中血清群A糖的DP是A2；(c)第一批中血清群C糖的DP是C1和第二批中血清群C糖的DP是C2；(d)第一批中血清群W135糖的DP是W1和第二批中血清群W135糖的DP是W2；(e)第一批中血清群Y糖的DP是Y1和第二批中血清群Y糖的DP是Y2；(f)A1/A2、C1/C2、W1/W2和Y1/Y2各自的比例在0.90和1.10之间，优选各自比例在0.95和1.05之间。
(f)所述比例可以根据所比较各批的一份样品，但通常是根据各批的多份样品的平均值(例如平均值)而定。因此，对两批可取多个样品，可多次检测每份样品的A1、A2、C1、C2、W1、W2、Y1和Y2，然后计算出每批的平均值，用该平均值计算出所需比例。
可分别制备每批(或每组)疫苗。例如，可分别混合同一种散装偶联物或混合分别制备的一种散装偶联物来制备不同的两批。同一散装混合物的不同样品不是不同的批次，因为这些样品不会发生制备不同偶联物的混合物时所产生差异而导致的批次间差异。
除了上述(a)到(f)所述的特征外，该两批(疫苗)的特征还在于：(g)第一批中未偶联的血清群A糖浓度是A3；(h)第二批中血清群A未偶联糖浓度是A4；(i)第一批中未偶联的血清群C糖浓度是C3；(j)第二批中未偶联的血清群C糖浓度是C4；(k)第一批中未偶联的血清群W135糖浓度是W3；如果适用，(1)第二批中未偶联的血清群W135糖浓度是W4；(m)第一批中未偶联的血清群Y糖浓度是Y3；(n)第二批中未偶联的血清群Y糖浓度是Y4；(o)A3/A4、C3/C4、W3/W4和Y3/Y4的各自比例在0.90和1.10之间，优选各自比例在0.95和1.05之间。
通用术语
术语“含有”包括“包括”以及“包含”，例如“含有”X的组合物可排他性地由X组成或者可以包括其它的物质，例如X+Y。
词“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可以是完全不含Y。如果需要，词“基本上”可从本发明的定义中省去。
与数值x相关的术语“约”表示，例如x±10％。
应该理解糖环可存在开环和闭环形式，虽然本文的结构式显示了闭环形式，但本发明也包括开环形式。
附图简述
图1和2显示了脑膜炎球菌血清群W135(11)和Y(2)荚膜糖的结构式。图3显示了血清群W135和Y(荚膜糖)之间的差异。
图4和5显示了MenY糖在大小分离之前(4)和之后(5)的色谱图。
图6和7显示了MenW135(6)和MenY(7)糖的ESI图谱。
图8显示了MenW135 DP3糖基于其1H NMR图谱的结构。图9显示了MenY DP4糖的结构。
图10到12显示了唾液酸标准溶液的等度洗脱分布。
图13显示了MenY寡糖的梯度洗脱分布。
图14显示了唾液醇的标准曲线。
图15显示了用HPAEC-PAD检测MenW135(□)和MenY(◇)的DP在解聚期间降低。图16和17显示在同一过程中，在时间0点(A)MenW135(16)和MenY(17)与最终混合物(B)相比短寡聚物增加。
图18显示了MenC DP5的ESI图谱，图19显示了MenC DP5的HPAEC分析。
图20是MenW135寡糖的梯度洗脱分布图。左轴显示以nC(表示)的电流检测值；右轴显示洗脱剂(100mM乙酸钠+20mM NaOH)％。
图21显示了MenW135寡糖的又一梯度洗脱分布。图21A显示标准样品，图21B显示MenW135糖。
本发明的实施方式
制备标准寡糖溶液
采用参考文献79所述的方法制备纯化的血清群W135和Y荚膜多糖(CPS)。它们以0.01M乙酸配制的10mg/ml溶液提供。为水解CPS，将它们加热至70-80℃，持续一段时间。水解期间，采集溶液样品供分析，提取后使样品冷却并中和。此水解所得片段具有末端唾液酸残基而非末端葡萄糖或半乳糖残基。然后根据大小和电荷量在Q-琼脂糖柱上进行离子交换色谱纯化这些寡糖。为(进行)初始标准化，采用改进的Svennerholm方法[80]检测唾液酸含量，读取564nm吸光值。分离特定的诸组分，用NMR、电喷雾质谱和HPAEC分析
寡糖的HPAEC分析利用装在Dionex DX-500色谱系统上的CarpoPacPA100或IonPac AS11柱(均是4×250mm)，所述系统装配了GP40泵、ED40检测器和AS3500自动进样器。分离采用1.0ml/分钟的流速，在室温下进行。
PA100柱利用以下洗脱剂：A)500mM乙酸钠+100mM氢氧化钠和B)100mM氢氧化钠。先用10％A(15分钟)进行初步等度洗脱，然后用10％到100％A液进行线性梯度洗脱，50分钟。AS11柱利用以下洗脱剂：A)100mM氢氧化钠和B)水，用5％到100％A液进行线性梯度洗脱，50分钟。
用脉冲电化学检测器(ED40)以脉冲电流模式用金工作电极和Ag/AgCl参比电极监测洗脱液。采用以下设置施加三相-电位波形：E1＝0.05V；t1＝400ms；E2＝0.75v；t2＝200ms；E3＝-0.15V；t3＝400ms。在施加E1期间对200ms到400ms进行积分。用PeakNet数据还原软件(Dionex)积分和处理得到的色谱数据。
CarboPac PA100 HPAEC得到了MenW135和MenY寡糖的分布图。通过比较纯化的与合并的寡糖色谱图对二图谱进行校正，同时用ESI-MS特征鉴定纯化的寡糖使色谱图中的峰数目与洗脱寡糖的DP相关连。
用装配有电喷雾离子源的Micromass ZQ-4000质谱分析仪进行ESI质谱测定。用以异丙醇/水50/50(v/v)稀释的碘化钠(2g/l)和碘化铯(50mg/l)校正该仪器。毛细管电压是3kV，锥电压是60V。将样品溶解于50％(v/v)乙腈水溶液+0.1％甲酸中，以10μl/分钟流速注射。以200到2000m/z扫描范围以正离子模式记录图谱。
图4和5显示MenY寡糖混合物在Q-琼脂糖(柱)分离之前(图4)和之后(图5)的HPAEC色谱图(PA100柱)。对约38分钟峰的ESI分析证实其是DP为4的MenY寡糖(图7)。对MenW135进行了类似的实验，图6显示了DP3寡糖的ESI图谱。
在ESI分析中，一种分子在该图谱中可显示多个分子离子(峰)，各峰对应于具有不同O-乙酰基取代的母体分子和加钠离子。在样品分析期间因存在一定量的钠可出现加钠离子(峰)，这常见于寡糖的质谱中观。此外，母体分子可携带数量不同的正电荷，因此取决于O-乙酰基取代、加入的钠和正电荷的数目，寡糖可产生许多不同的正离子。因此，图6和7中有大量正离子。
在图6中，700-800与1400-1526m/z之间的各峰分别对应于加入的钠阳离子和O-乙酰基所产生的双电荷与单电荷离子。它们分配为与三聚寡糖(MenW135 DP3)质量相对应的以下单一同位素质量：
  观察到的离子   预计的离子a   O-乙酰基b   Nac   电荷
  1400.61442.81484.81526.5712.0723.0733.1744.2754.0765.1775.6   1401.41443.41485.41527.4712.7733.7754.7775.7   01230112233   11112222   1111222222
aMW计算器(MassLynx software)从单一同位素质量计算的理论离子；
bO-乙酰基取代基的数目；
c作为反离子的钠的数目。
在图7中，900-1100和1800-2000m/z之间各峰分别对应于加入钠阳离子和O-乙酰基所产生的双电荷与单电荷离子。它们分配为与三聚寡糖(MenY DP4)质量相对应的以下单一同位素质量：
  观察到的离子   预计的离子   O-乙酰基   Na   电荷
  1896.0927.7938.7949.6959.7971.4980.8   1896.6916.8927.8937.8949.3958.8970.3979.8   10011223   10101010   12222222
  991.71003.3   991.31002.8   33   12   22
将冻干的寡糖溶解于750μL 99.9％D2O(AldrichTM)中得到10-15mM浓度的溶液来制备NMR样品。每次实验用5mm WilmadTM NMR试管。NMR图谱以298K记录在装有5mm TBI三共振杂核探针和BGU单元的BrukerTMNMR Spectrometer Avance DRX 600MHz上。用Bruker XWINNMR 3.0软件获取和处理数据。获取1H标准图谱的条件是收集6000Hz的整个波谱窗口经4次扫描和10秒延后松弛的32k数据点。应用0.1Hz线性拓宽功能和参比4.79ppm处单-氘化水后，将1H NMR图谱经傅立叶转换。进行13C和2D NMR实验(双量子过滤的COSY和HSQC)来指定寡糖的1H图谱。
通过与公开数据[81]作比较和两维质子-质子COSY和质子-碳HSQC相关谱指定脑膜炎球菌W135和Y寡糖的质子NMR图谱。除了质子化学位移之外，同核与杂核偶联常数提供了丰富的结构信息。W135(图8)和MenY(图9)寡糖的高分辨率NMR图谱显示相对尖锐的信号，从而可具体确定Gal/Glc部分的端基异构质子和NeuNAc部分的H3eq/axNeuNAc的峰分配。这些峰位于图谱中不与其它信号叠加从而可能使线性分辨率复杂化的区域。通过该扩展图谱可确定信号的质子化学位移：
  W135   ppm
  H1 Gal UR1   5.112
  H1 Gal UR2   5.095
  H1 Gal UR3   5.087
H3eq NeuNAc UR3 2.963
  H3eq NeuNAc UR2   2.905
  H3eq NeuNAc UR1   2.434
  H3ax NeuNAc UR1   1.762
  H3ax NeuNAc UR2   1.707
  H3ax NeuNAc UR3   1.687
  Y   ppm
  H1 Glc UR1   5.090
  H1 Glc UR2   5.049
  H1 Glc UR3   5.049
  H1 Glc UR4   5.025
  H3eq NeuNAc UR4   2.918
  H3eq NeuNAc UR3   2.907
  H3eq NeuNAc UR2   2.897
  H3eq NeuNAc UR1   2.400
  H3ax NeuNAc UR1   1.782
  H3ax NeuNAc UR2   1.726
  H3ax NeuNAc UR3   1.705
  H3ax NeuNAc UR4   1.705
1H NMR图谱证实了糖链的分子结构，相同性和完整性，显示样品的DP值是：DPMenW135＝3；DPMenY＝4。
因此，Q-琼脂糖柱能通过DP分辨寡糖，ESI和NMR分析证实这些寡糖标准品是：MenW135 DP3；和MenY DP4。可采用本发明方法分析这些标准品。
DP的色谱分析
调整寡糖样品使之在100μl中含有0.5mg/ml唾液酸。用10mM NaOH配制的100μl，40mM NaBH4溶液处理这些样品。样品于37℃在封闭的螺帽盖试管中加热2小时。为终止反应，用10μl，5M pH 6.0乙酸铵处理样品，并在室温下维持30分钟。加入200μl甲醇，然后在真空下用装有冷凝捕获器(Savant SC110)的Speed Vac浓缩器干燥1小时。
用100μl Milli-Q水和100μl 4M TFA(终浓度：2M)重建样品，100℃加热90分钟。然后用装有两个冷凝捕获器(Savant SC110)的Speed Vac浓缩器干燥水解产物1小时。
为进行HPAEC-PAD分析，将样品溶解于1.0ml Milli-Q脱气水中，然后过滤(0.22μm)。用同样的Dionex系统分析水解产物，但使用配有BorateTrap保护柱的Carbopac PA1柱(4×250mm)。此柱和保护柱比PA100和AS11柱更适合分析单糖。一些实验利用50mM乙酸钠+20mM氢氧化钠作等度洗脱，其它实验利用以下洗脱剂作梯度洗脱：A)100mM乙酸钠+20mM氢氧化钠和B)20mM氢氧化钠，从10％到70％A液梯度洗脱(曲线7)。如上所述分析洗脱液。
此装置可鉴别唾液酸和唾液醇，获得各自的定量测定结果。利用总(即，还原的和非还原的)唾液酸与还原唾液酸之比计算出起始寡糖的DP。
对于初步测试，制备2.0μg/ml纯唾液酸(Sigma，Steinheim，德国)的标准溶液并如上所述经NaBH4还原。通过HPAEC用等度洗脱分析各时间点的样品。在37℃用0.04M NaBH4处理2小时使标准品中的唾液酸完全还原。图10显示了0点时间的样品，图11显示了2小时的样品，保留时间从8.5降低至4.7-5.0。
唾液醇的不可分辨的非对映异构体导致产生了图11中的双峰[14]。在100℃用2M TFA处理唾液酸标准品90分钟能除去该双峰(图12)，从而得到可用于唾液醇定量的单峰。就去除的效率和简易程度而言[82-84]，已知TFA水解适合于糖切割，已用于分析几种糖疫苗[82]。因此，利用TFA进行糖酸水解有三个目的-唾液酸的有效水解、有效去除和去除唾液醇的分解峰。
如上所述处理预计DP范围在3-5之间MenY寡糖样品，但色谱洗脱的等度条件没能良好分离唾液醇的峰。因此用梯度洗脱代替，得到的色谱图如图13所示。唾液醇和唾液酸的保留时间分别为19.3和29.8分钟。采用同一方法分析了预计DP范围在3-5之间的MenW135寡糖样品(图20)。在19.33分钟观察到唾液醇，在29.77分钟观察到唾液酸。
为有助于定量分析图13和图20的色谱图，根据浓度已知的唾液酸和唾液醇制作了标准曲线。该标准曲线采用了0.5、1.0、2.0、4.0和6.0μg/ml的唾液酸或唾液醇。检测器的线性反应图见图14。
通过与这些标准曲线相比较，可定量MenW135和MenY样品中唾液醇和唾液酸的含量。例如，MenW135洗脱液中19.33分钟峰下面的面积(图20)计算为44914068。参比该标准曲线，唾液醇的浓度计算为7.96μg/ml。在一式两份的实验中，观察到的浓度为8.05μg/ml。两次分析得到的平均值为8.005μg/ml。由于样品在分析前稀释了10倍，原始平均唾液醇浓度为80.05μg/ml。比色法检测总唾液酸得到的浓度为241.09μg/ml。鉴于唾液酸和唾液醇之间微小的质量差异，将这些浓度转换为摩尔浓度(事实上，此质量差异极小以致于不转换为摩尔浓度也得到了优秀的近似值)，摩尔比计算为3(即，DP＝3)。从两个不同的一式两份分析结果计算出的比例如下：
  样品   唾液醇(μg/ml)   唾液酸(μg/ml)   DP
  Oligo-MenWOligo-MenWOligo-MenYOligo-MenY   80.579.662.768.9   241.09241.09303.64303.64   3.03.04.84.4
利用三种不同的硼酸盐前置捕获柱分析一式四份的一种MenW135样品评估了唾液醇检测方法的可重复性。结果如下：
  硼酸盐捕获柱   唾液醇(μg/ml)   唾液酸(μg/ml)*   DP   平均值   标准偏差   CV％
1   342.5   6484.2   18.9 18.7 0.2 0.9
  345.7   6484.2   18.8
  346.3   6484.2   18.7
  350.2   6484.2   18.5
2   335.7   6484.2   19.3 19.2 0.1 0.5
  339.5   6484.2   19.1
  338.3   6484.2   19.2
  336.0   6484.2   19.3
3   328.0   6484.2   19.8 19.7 0.4 1.9
  335.5   6484,2   19.3
  334.3   6484,2   19.4
  321.8   6484,2   20.2
*分别检测，一式两份分析
因此，这些结果显示了良好的可重复性(CV％＜2％)。
将0.01M乙酸配制的全长MenY或MenW135CPS的10mg/ml溶液加热至70-80℃。在水解期间，取样测定平均DP来追踪反应进程，多达6小时。快速冷冻样品，维持于-20℃，然后用IonPac AS11柱进行一式两份的分析。结果如下：
  时间(小时)   MenW135   MenY
  唾液醇(μg/ml)   唾液酸(μg/ml)   平均DP   唾液醇(μg/ml)   唾液酸(μg/ml)   平均DP
  0.5   45.40   5338.4   117.6   61.56   5903.0   95.9
  1.0   74.12   5351.5   72.2   94.84   5803.6   61.2
  1.5   125.63   5519.9   43.9   125.87   5764.0   45.8
  2.0   139.49   5620.2   40.3   170.92   5790.0   33.9
  2.5   195.40   5611.8   28.7   218.13   5808.4   26.6
  3.0   235.55   5555.7   23.6   237.17   6294.1   26.5
  3.5   256.90   5762.3   22.4   267.25   6196.6   23.2
  4.0   270.83   5491.2   20.3   286.79   6188.8   21.6
  4.5   296.09   5586.8   18.9   376.95   6715.1   17.8
  5.0   336.06   5678.7   16.9   440.85   6314.1   14.3
  5.5   384.09   5560.5   14.5   506.29   6400.3   12.6
  6.0   423.32   5629.8   13.3   —   —   —
因此，DP检测显示DP随时间推移逐步降低(图15)。如图16(MenW315)和17(MenY)所示，其中16A/17A在时间0点，16B/17B在6小时后，用IonPac AS11色谱分析显示了在酸水解期间低分子量寡糖含量如何随时间增加，从而证实已得到解聚。
血清群W135样品
制备血清群W135的荚膜糖。在制备期间，用本文所述方法检测其DP。图21B显示了此糖100倍稀释液的色谱图，图21A显示了6μg/ml的标准品。两种情况中均用100mM乙酸钠加20mM NaOH洗脱，在30分钟期间10％洗脱缓冲液线性上升至30％洗脱缓冲液，最后跳跃至100％洗脱缓冲液，10分钟。
唾液醇标准品显示在16.383分钟洗脱；样品中，在16.350分钟有峰。
下文显示同一样品两次不同分析与五种标准品的分析特性以及计算出的唾液醇浓度：
  样品名   保留时间(分钟)   面积(nC*分钟)   高度(nC)   含量(μg/ml)
  std1   16.700   0.8446   1.80   0.5023
  std2   16.584   1.6986   3.50   1.0103
  std3   16.134   3.4018   6.33   2.0234
  std4   16.567   6.8201   14.27   4.0566
  std5   16.384   10.0077   19.34   5.9526
  W135(a)   16.350   5.4644   11.35   3.2502
  W135(b)   16.600   5.7620   12.46   3.4272
根据分析(a)和(b)的平均值，该样品中有3.339μg/ml唾液醇。按初始稀释度校正，初始唾液醇浓度为333.9μg/ml。总唾液酸检测为5732.6μg/ml，DP值为17.2。
血清群C分析
如前文[5]所述获得纯化的MenC DP5寡糖。以正离子模式进行ESI MS分析。质谱见图18，明显有三组主要的离子。对最高强度(856-941m/z)的峰仔细检查表明这些峰对应于带双电荷的五糖，而1733-1826m/z的峰对应于带单电荷的五糖，二者的O-乙酰基取代基和作为反离子的钠的数目不同。
用本发明的色谱方法测定了MenC DP5寡糖的DP，色谱图的分析见图19。分别分析了这些寡糖的四种分离物，结果如下：
  唾液醇(μg/ml)   唾液酸(μg/ml)   DP   平均值   标准偏差   CV％
  160.7   845.4   5.3 5.0 0.2 3.1
  170.3   845.4   5.0
  169.1   845.4   5.0
  172.2   845.4   4.9
结论
糖分子的大小在设计前述偶联疫苗中重要[6，7]，中等链长的寡糖显示较好的免疫原性。(本发明)显示了用酸水解启动荚膜多糖的初步解聚[79]后中等大小MenW135和MenY寡糖的制备、分离和特征鉴定。本发明提供了测定这些寡糖聚合度的新型色谱方法，经NMR和ESI-MS分析证实这些方法显示了良好的精密度和精确性。此外，该方法也可用于测定血清群C寡糖的DP。
其它实验性细节见参考文献85。
应理解只通过实施例对本发明进行了描述，可作出一些改进而仍属于本发明的范围和构思内。
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Claims (16)

1.一种检测荚膜糖聚合度的方法，其中：(a)所述糖含有α2→9相连的唾液酸单糖亚基；(b)所述糖含有末端唾液酸单糖亚基；和(c)该方法包括以下步骤：(i)还原该末端唾液酸单糖亚基产生还原的唾液酸单糖亚基；(ii)水解该糖产生含单糖亚基的水解产物；(iii)测定水解产物中总唾液酸与还原唾液酸之比。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使所述糖与还原剂一起温育来还原所述末端唾液酸残基。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述还原剂是硼氢化钠。
4.如权利要求1到3中任一项所述的方法，其特征在于，通过化学方法或酶方法进行所述水解步骤。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，采用酸水解。
6.如以上任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述荚膜多糖是大小不同的荚膜糖群体，本发明提供这些糖的平均聚合度。
7.一种检测荚膜糖聚合度的方法，其中：(a)所述糖含有唾液酸单糖亚基和非唾液酸单糖亚基；(b)所述糖含有末端唾液酸单糖亚基；和(c)该方法包括以下步骤：(i)修饰该糖的末端唾液酸亚基产生修饰的末端唾液酸亚基；(ii)水解该糖产生含有唾液酸亚基，包括修饰的末端唾液酸亚基的糖水解产物；(iii)定量测定水解产物中的唾液酸亚基，包括修饰的末端唾液酸亚基；和(iv)利用步骤(iii)的定量测定结果计算出聚合度。
8.一种检测组合物中糖聚合度的方法，包括以下步骤：(a)开始解聚该组合物中的糖；和在随后的一个或多个时间点，(b)用以上任一项权利要求所述方法检测糖的DP。
9.如权利要求8所述的方法，还包括在经任选的化学方法活化后使解聚的糖与载体蛋白相偶联的步骤。
10.一种检测荚膜糖聚合度(DP)的方法，其特征在于，所述糖来自脑膜炎球菌血清群W135或血清群Y。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：(i)水解该糖产生含有单糖亚基的糖水解产物；(ii)定量测定水解产物中的单糖亚基，其中利用步骤(ii)的定量结果计算出聚合度。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(i)修饰该糖的末端单糖亚基产生修饰的末端单糖；(ii)水解该糖产生含有单糖亚基，包括修饰的末端单糖的糖水解产物；(iii)定量测定水解产物中的单糖亚基；(iv)定量测定水解产物中修饰的末端单糖；和(v)利用步骤(ii)和(iv)的定量测定结果计算出聚合度。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤(i)中所述的修饰是还原末端唾液酸残基，步骤(iii)中定量测定的单糖是总唾液酸，和通过比较总唾液酸和还原唾液酸之比来计算DP。
14.一种分析包含糖与载体的糖偶联物的方法，包括以下步骤；(a)处理该糖偶联物从载体释放出糖；和(b)采用以上权利要求中任一项所述的方法检测所释放糖的DP。
15.一种制备疫苗组合物的方法，包括以下步骤：(a)提供采用以上权利要求1到13中任一项所述方法计算出DP的荚膜糖；(b)将经DP-分析的糖与一种或多种载体蛋白相偶联；(c)任选分析该散装疫苗的pH和/或其它性质；和如果步骤(c)的结果表明该散装疫苗可为临床应用所接受，则(d)将该散装疫苗制备并包装为人用疫苗。
16.两批疫苗，其中：(a)两批疫苗均含有：(i)脑膜炎奈瑟球菌血清群A荚膜糖偶联物，(ii)脑膜炎奈瑟球菌血清群C荚膜糖偶联物，(iii)脑膜炎奈瑟球菌血清群W135荚膜糖偶联物，(iv)脑膜炎奈瑟球菌血清群Y荚膜糖偶联物；(b)第一批中血清群A糖的DP是A1，第二批中血清群A糖的DP是A2；(c)第一批中血清群C糖的DP是C1，第二批中血清群C糖的DP是C2；(d)第一批中血清群W135糖的DP是W1，第二批中血清群W135糖的DP是W2；(e)第一批中血清群Y糖的DP是Y1，第二批中血清群Y糖的DP是Y2；(f)A1/A2、C1/C2、W1/W2和Y1/Y2各自的比例在0.90和1.10之间。
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