CN102608046A - 简易的低聚木糖平均聚合度的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种简易的低聚木糖平均聚合度的测定方法，通过低聚木糖溶液中总糖浓度和还原糖浓度测定低聚木糖在水溶液中的整体聚合度N，从而能对低聚木糖品质有个宏观的判定；当N=1则溶液中全为木糖，当N数值偏小则可以判定溶液中低聚木糖组分中聚合较小的组分含量较高；该测定方法对仪器要求不高，简单易于操作，在分离纯化过程中N的变换能反映出各个组分在溶液中的变化情况，通过测定平均聚合度这一宏观指标来直观的反应低聚木糖品质。
Description
技术领域
本发明涉及测定方法，具体涉及一种简易的低聚木糖平均聚合度的测定方法。
背景技术
低聚木糖亦称木寡糖(xylooligosaccharides) ，由2~7 个D-木糖以β-1 ，4-木糖苷键结合而成，是功能性低聚糖家族中的一个重要成员。 它的甜度比蔗糖和葡萄糖均低，与麦芽糖差不多，约为蔗糖的40%。低聚木糖对pH 值及热的稳定性较好，即使是在酸性条件(pH=2.5 ~7)加热也基本不分解，适合用于酸奶、乳酸菌饮料和碳酸饮料等酸性饮料中。低聚木糖极难被消化吸收，肠道内残存率高，具有极好的双歧杆菌增殖性，其选择利用性高于其它功能性低聚糖。
由于低聚木糖是几种寡聚木聚糖的总称，其水溶液为混合物，因此在检测过程中对木聚糖的测定是通过测定各组分的浓度的方法来检测低聚木糖的，现在普遍采用高效液相色谱（HPLC）检测的方法（详见国标QB/T2984-2008），预先测定各组分的标样然后依次测定各组分浓度。此方法能详细的以具体数字的方式显示出低聚木糖各个组分的含量，但是由于市面上低聚木糖的标样不全，只能买到部分组分的标样，因此在定量计算时多采用其中一种组分的方程计算其他组分，造成了定量的不准确。此外使用HPLC方法检测，由于仪器昂贵、检测耗时较长，并且无法从宏观上对低聚木糖品质进行评价，造成表观上不直接，无法直观的对低聚木糖含量有直接的认识。国标GB/T23747-2009通过液相测定低聚木糖水解前后的木糖含量，计算出由低聚木糖水解所得的木糖含量并除以平均转化系数进而得到低聚木糖的浓度，通过此方法测定的低聚木糖浓度能直观的反应溶液中平均低聚木糖浓度。由于低聚木糖的聚合度越小，特别是木二的浓度越高该低聚木糖的品质越好，但由此国标测得的浓度对应的平均聚合度无法判断，因而无法宏观的判断低聚木糖的品质给宏观判定低聚木糖品质带来了不便。此外该方法同样需要HPLC，使得没有该设备的实验室、工厂判定困难。
由于每一个低聚木糖分子含有一个还原端糖，假设每一个低聚木糖总共含有n个木糖单元， 此时n为该低聚木糖的聚合度。n等同于通过完全水解低聚木糖所得到的还原性木糖的个数。 由于样品中含有聚合度和浓度不等的低聚木糖和木糖分子，因此为了方便说明低聚木糖中的聚合度和浓度等情况，采用平均聚合度N作为表征样品中聚合度的平均值。
其定义为：
N =样品中总糖浓度（所有低聚糖水解成单糖+起始单糖浓度）
还原糖浓度
通过低聚木糖溶液中总糖浓度和还原糖浓度可以测定低聚木糖在水溶液中的整体聚合度N，从而能对低聚木糖品质有个宏观的判定。当N=1则溶液中全为木糖，当N数值偏小则可以判定溶液中低聚木糖组分中聚合较小的组分含量较高。在分离纯化过程中N的变换能反映出各个组分在溶液中的变化情况。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种简易的低聚木糖平均聚合度的测定方法，该测定方法对仪器要求不高，简单易于操作，通过测定平均聚合度这一宏观指标来直观的反应低聚木糖品质。
本发明的技术解决方案是该测定方法包括以下步骤：
（1） 标准样品测定低聚木糖液的总糖浓度：采用苯酚-浓硫酸法，苯酚-浓硫酸法测定步骤及标准曲线制备如下：⑴ 标准木糖溶液的配制：先制备1mol/L的标准木糖液，再分别稀释到200、180、150、100、60、50、30、20、10 uM/L的木糖液；⑵ 制备标准曲线：9支试管分别移取1ml的200、180、150、100、60、50、30、20、10 uM/L的木糖液，加入25ul的质量浓度80%的苯酚，迅速加入2.5ml的浓硫酸摇匀，静置10min，再置于25-30℃的恒温水池10-20min，取出冷却，在480nm测其吸光值；
（2） 标准样品还原糖浓度的测定：采用DNS法或BCA法，其中DNS法适用于糖浓度相对较高的溶液，测量范围在200-5000mg/L；而BCA法适合测量糖浓度低的糖溶液，测量范围在0.4-9mg/L；DNS法测定步骤及标准曲线制备如下：⑴ 配制DNS试剂：将10.6g 的3，5-二硝基水杨酸和19.8g氢氧化钠溶于1416ml的蒸馏水中，完全溶解后加入360g的酒石酸钾钠、7.6ml的苯酚和8.3g的亚硫酸钠，50℃溶解混匀，同时确保该溶液为碱性；⑵ 配制标准木糖溶液：先配置1mol/L的木糖溶液，再稀释到25、20、18、15、12、10、5、2mM/L的木糖液；⑶ 制备标准曲线：取8支试管分别移取1ml的25、20、18、15、12、10、5、2 mM/L的木糖溶液和1ml的蒸馏水，加入3mLDNS试剂于沸水浴显色5min，冰水浴冷却，取出至常温，吸取200ul的糖液放入2.5ml的蒸馏水于比色皿中，测定540nm的吸光值并绘制标准曲线；BCA法测定步骤及标准曲线制备如下：⑴ 配制A液：分别称取0.971g 2’2-联喹啉-4’4-二羧酸钠、27.14g碳酸钠和12.1g碳酸氢钠溶于500ml蒸馏水中，加热溶解；⑵ 配制B液：分别称取0.624g的硫酸铜、0.631g的L-serine于500ml蒸馏水中；⑶ 配制标准木糖溶液：先配制1mol/L的木糖溶液，再最终稀释到 60、50、40、30、15、10、5 uM各5ml；⑷ 制备标准曲线：7支试管内分别取1ml A液和1ml B液混合均匀，再加入2ml标准木糖溶液摇匀，在75℃保存20-30min，室温冷却之后在560nm下测吸光值并绘制标准曲线；
（3）样品的测定：把样品溶液稀释到标准曲线线性范围之中，采用同标准样品测定相同的步骤进行样品的测定，得到总糖浓度和还原端糖浓度；
（4）平均聚合度的计算：将步骤（3）得到的总糖浓度和还原端糖浓度采用公式计算得平均聚合度，公式为：平均聚合度=总糖浓度/还原端糖浓度；
（5 ）利用平均聚合度对低聚木糖水溶液判定：低聚木糖是指2~7 个D-木糖以β-1 ,4-木糖苷键结合而成的寡聚木聚糖，1mol低聚木糖分解成木糖的范围为2~7mol，平均聚合度的数值范围应该为1~7；当平均聚合度数值为1时，则说明溶液中的糖溶液为木糖溶液；1＜N＜2时，说明低聚木糖中有木糖混在其中；2＜N＜7时，数值越大则说明低聚木糖的聚合度越高；数值超过7时，则说明溶液中非低聚木糖含量较大。
本发明提供了一个简易的评估低聚木糖溶液组分聚合度的方法，此方法能简单快捷的评测出低聚木糖各组分在溶液中的变化，特别适用于低聚木糖工业化生产、分离纯化过程中宏观的判定。
附图说明
图1为总糖测定标准曲线。
图2 DNS测定还原糖标准曲线。
图3 BCA测定还原糖标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，这些实施例不能理解为是对技术解决方案的限制。
实例中所使用的高效液相色谱条件为：shodex sugar sp0810色谱柱，流动相：水，流速0.5ml/min，柱温85℃，检测器采用shodexR1-201H示差折光检测器。
实施例1：取低聚木糖液离心稀释至50-200 uM/L；移取1ml的低聚木糖液稀释液，加入25ul的质量浓度80%的苯酚，迅速加入2.5ml的浓硫酸摇匀，静置10min，再置于25-30℃的恒温水池10-20min，取出冷却，在480nm测其总糖吸光值。取低聚木糖液离心稀释至5-25 mM/L，试管中移取1ml稀释后的低聚木糖溶液和1ml的蒸馏水，加入3mLDNS试剂于沸水浴显色5min，冰水浴冷却，取出至常温，吸取200ul的糖液放入2.5ml的蒸馏水于比色皿中，测定540nm的还原糖吸光值；通过标准曲线计算所得的总糖和还原糖分别为 7.04g/L、还原糖4.68g/L，平均聚合度N为 1.5；HPLC检测结果表明该低聚木糖液组分以木二、木三、木四为主，混有大量的木糖。
实施例2：称取99%的木糖标样配置1mol/L，再稀释到50-200 uM/L；试管中移取1ml木糖稀释液，加入25ul的质量浓度80%的苯酚，迅速加入2.5ml的浓硫酸摇匀，静置10min，再置于25-30℃的恒温水池10-20min，取出冷却，在480nm测其总糖吸光值。取木糖液离心稀释至5-25mM/L，试管中移取1ml的木糖稀释溶液和1ml的蒸馏水，加入3mLDNS试剂于沸水浴显色5min，冰水浴冷却，取出至常温，吸取200ul的糖液放入2.5ml的蒸馏水于比色皿中，测定540nm的还原糖吸光值；通过标准曲线计算所得的总糖和还原糖分别为 11.43g/L、还原糖11.26g/L，平均聚合度N为 1；HPLC图谱显示只有单一的木糖峰。
实施例3：取寡聚木聚糖配置浓度为50-200 uM/L溶液；试管中移取1ml的稀释液，加入25ul的质量浓度80%的苯酚，迅速加入2.5ml的浓硫酸摇匀，静置10min，再置于25-30℃的恒温水池10-20min，取出冷却，在480nm测其总糖吸光值；取寡聚木聚糖配置浓度为5-25mM/L；试管中移取1ml的稀释溶液和1ml的蒸馏水，加入3mLDNS试剂于沸水浴显色5min，冰水浴冷却，取出至常温，吸取200ul的糖液放入2.5ml的蒸馏水于比色皿中，测定540nm的还原糖吸光值；通过标准曲线计算所得的总糖和还原糖分别为 8.03g/L、还原糖0.74g/L，平均聚合度N为 10.8；HPLC检测结果表明该溶液在低聚木糖保留时间内几乎没有检测到出峰。
实施例4：取低聚木糖液离心稀释至50-200 uM/L；移取1ml的低聚木糖液稀释液，加入25ul的质量浓度80%的苯酚，迅速加入2.5ml的浓硫酸摇匀，静置10min，再置于25-30℃的恒温水池10-20min，取出冷却，在480nm测其总糖吸光值。取低聚木糖液离心稀释至20-60 mM/L，试管内分别取1ml A液和1ml B液混合均匀，再加入2ml低聚木糖稀释溶液摇匀，在75℃保存30min，室温冷却之后在560nm下测其还原糖吸光值；通过标准曲线计算所得的总糖和还原糖分别为总糖 16.13g/L、还原糖4.68g/L，平均聚合度N为 3.44；HPLC检测结果表明该低聚木糖液组分以木三含量占整个溶液组分含量61.3%、木二为11.2%、木四为9.3%，并混有少量的木五及木六。
实施例5：取低聚木糖液离心稀释至50-200 uM/L；移取1ml的低聚木糖液稀释液，加入25ul的质量浓度80%的苯酚，迅速加入2.5ml的浓硫酸摇匀，静置10min，再置于25-30℃的恒温水池10-20min，取出冷却，在480nm测其总糖吸光值。取低聚木糖液离心稀释至5-25 mM/L，试管中移取1ml稀释后的低聚木糖溶液和1ml的蒸馏水，加入3mLDNS试剂于沸水浴显色5min，冰水浴冷却，取出至常温，吸取200ul的糖液放入2.5ml的蒸馏水于比色皿中，测定540nm的还原糖吸光值；通过标准曲线计算所得的总糖和还原糖分16.34g/L、还原糖3.62g/L，平均聚合度N为 4.5；HPLC检测结果表明该低聚木糖液组分中木三含量占30%、木四占36.1%为主，木五12.2%，木六8%，并混有少量的木二及木糖。
Claims (1)
1.简易的低聚木糖平均聚合度的测定方法，其特征在于该测定方法包括以下步骤：
（1） 标准样品测定低聚木糖液的总糖浓度：采用苯酚-浓硫酸法，苯酚-浓硫酸法测定步骤及标准曲线制备如下：⑴ 标准木糖溶液的配制：先制备1mol/L的标准木糖液，再分别稀释到200、180、150、100、60、50、30、20、10 uM/L的木糖液；⑵ 制备标准曲线：9支试管分别移取1ml的200、180、150、100、60、50、30、20、10 uM/L的木糖液，加入25ul的质量浓度80%的苯酚，迅速加入2.5ml的浓硫酸摇匀，静置10min，再置于25-30℃的恒温水池10-20min，取出冷却，在480nm测其吸光值；
（2） 标准样品还原糖浓度的测定：采用DNS法或BCA法，其中DNS法适用于糖浓度相对较高的溶液，测量范围在200-5000mg/L；而BCA法适合测量糖浓度低的糖溶液，测量范围在0.4-9mg/L；DNS法测定步骤及标准曲线制备如下：⑴ 配制DNS试剂：将10.6g 的3，5-二硝基水杨酸和19.8g氢氧化钠溶于1416ml的蒸馏水中，完全溶解后加入360g的酒石酸钾钠、7.6ml的苯酚和8.3g的亚硫酸钠，50℃溶解混匀，同时确保该溶液为碱性；⑵ 配制标准木糖溶液：先配置1mol/L的木糖溶液，再稀释到25、20、18、15、12、10、5、2mM/L的木糖液；⑶ 制备标准曲线：取8支试管分别移取1ml的25、20、18、15、12、10、5、2 mM/L的木糖溶液和1ml的蒸馏水，加入3mLDNS试剂于沸水浴显色5min，冰水浴冷却，取出至常温，吸取200ul的糖液放入2.5ml的蒸馏水于比色皿中，测定540nm的吸光值并绘制标准曲线；BCA法测定步骤及标准曲线制备如下：⑴ 配制A液：分别称取0.971g 2’2-联喹啉-4’4-二羧酸钠、27.14g碳酸钠和12.1g碳酸氢钠溶于500ml蒸馏水中，加热溶解；⑵ 配制B液：分别称取0.624g的硫酸铜、0.631g的L-serine于500ml蒸馏水中；⑶ 配制标准木糖溶液：先配制1mol/L的木糖溶液，再最终稀释到 60、50、40、30、15、10、5 uM各5ml；⑷ 制备标准曲线：7支试管内分别取1ml A液和1ml B液混合均匀，再加入2ml标准木糖溶液摇匀，在75℃保存30min，室温冷却之后在560nm下测吸光值并绘制标准曲线；
（3）样品的测定：把样品溶液稀释到标准曲线线性范围之中，采用同标准样品测定相同的步骤进行样品的测定，得到总糖浓度和还原端糖浓度；
（4）平均聚合度的计算：将步骤（3）得到的总糖浓度和还原端糖浓度采用公式计算得平均聚合度，公式为：平均聚合度=总糖浓度/还原端糖浓度；
（5 ）利用平均聚合度对低聚木糖水溶液判定：低聚木糖是指2~7 个D-木糖以β-1 ,4-木糖苷键结合而成的寡聚木聚糖，1mol低聚木糖分解成木糖的范围为2~7mol，平均聚合度的数值范围应该为1~7；当平均聚合度数值为1时，则说明溶液中的糖溶液为木糖溶液；1＜N＜2时，说明低聚木糖中有木糖混在其中；2＜N＜7时，数值越大则说明低聚木糖的聚合度越高；数值超过7时，则说明溶液中非低聚木糖含量较大。
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