CN101782557A - 一种保健食品中低聚木糖(以木糖计)含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本技术涉及一种通过带视差折光检测器的高效液相色谱对保健食品中低聚木糖(以木糖计)含量的检测方法。即待测试样经提取，无水乙醇沉淀多糖，上清液浓缩赶尽乙醇，定容得水解前测定液M₁；取M₁再经硫酸溶液水解，中和(如果颜色深加入少量碳粉水浴脱色)，无水乙醇脱盐、除杂质，过滤后浓缩得水解后测定液M₂；通过HPLC对标准液和试样处理液进行检测，外标定量计算水解前后木糖含量差值得低聚木糖(以木糖计)含量；采用本技术方法检测保健食品中低聚木糖(以木糖计)的含量，准确有效，误差小于10％，由此可见，本技术方法为保健食品中低聚木糖含量测定，提供了一种可靠的便于实施的方法，能够满足工厂、检测机构和日常生活的需要。

Description

一种保健食品中低聚木糖(以木糖计)含量的测定方法

技术领域

本发明涉及一种保健食品中低聚木糖(以木糖计)含量的测定方法，特别是涉及一种通过带有视差折光检测器的高效液相色谱(HPLC)测定水解前后的木糖值计算出保健食品中低聚木糖(以木糖计)含量的方法。

背景技术

低聚木糖是由2-7个木糖以β-1，4糖苷键结合而成的功能性聚合糖，属国际新型低聚糖类产品，具有高选择性促进双歧杆菌增殖，在低聚糖类中增殖双歧杆菌功能最强，功效性是其它聚合糖类的20倍，且不被人体消化酶系统所分解，能量值几乎为零，糖尿病人、肥胖病人、低血糖病人和患有龋齿的儿童均可放心食用，此外还具有减少有毒发酵产物及有害细菌酶的产生、双向调节治疗便秘、抑制病原菌和腹泻、保护肝脏功能、增强机体免疫力、降低血清胆固醇、降低血压、促使机体生成多种营养物质等功能。因具有优越的生理学特性，使之不仅可广泛使用于保健食品、饮料、乳制品、糖果、饼和饮料等多种食品中，同时又可用作医药、饲料行业的原料，是国内外食品研究的热门领域。

发明内容

随着人们生活水平的提高，对食品尤其是保健食品的检测，提出了更高的要求，而目前现有的标准体系尚不健全、信息交流和应急反应体系建设缓慢，现有的检测方法于食品工艺要求和食品安全要求仍有较大的差距，并且因为低聚糖和单糖种类多，虽然本色谱体系能够良好的分离木糖、阿拉伯糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖等单糖和二糖，但是要测定本底组分复杂的样品中低聚木糖的含量是很困难的，并且较高纯度低聚木糖标准品较难买到，木四、木五、木六糖保留时间长，色谱峰形宽，在没有这些糖的标准品时，定量误差较大。

鉴于以上情况，为了更准确地测定保健食品和食品中低聚木糖的含量，《食品中低聚木糖的高效液相色谱法》为检测食品中低聚木糖的含量提供了准确、方便和经济的检测方法，有利于食品生产厂家监控低聚木糖的添加使用量，填补了国标空白。

为实现上述目的，本发明采取以下设计方案：

本发明的通过带有视差折光检测器的高效液相色谱(HPLC)测定水解前后的木糖值来计算出保健食品中低聚木糖(以木糖计)含量的方法，包括如下步骤：

待测试样为固体，称取10.0g左右样品置于烧杯中用水反复提取后，转移到容量瓶中定容，取样液处理；液体样品时直接取体积试样于容量瓶中，加一定量的水。再加入无水乙醇，滤纸慢速过滤除去多糖，取上清液，用低温浓缩(不大于50℃)赶尽乙醇，用水溶解定容，得水解前上机测定液M₁；然后取一定量样品水解前上机测定液于水解管中，加入4.0mol/L硫酸液摇匀，于沸水锅中水解1小时；冷却，再用40％氢氧化钠中和(PH值5-6)耗费体积V₀ml(如果颜色深加入少量碳粉水浴脱色，冷却)；滤纸过滤，取清液加入无水乙醇，脱盐、除杂质；用0.45um膜过滤，取滤液低温浓缩，加水溶解定容，得水解后上机测定液M₂。

称取木糖标准品，用水溶解并定容，作为木糖储备液，然后进一步用水稀释为具有浓度梯度的标准使用液，分别取0.5、1.0、2.0、3.0、5.0g/L的糖混合标准溶液，按色谱测定条件检测。以峰面积对各项糖浓度绘制标准曲线。

在同样的色谱条件下，将处理好的样品同样按色谱测定条件进行检测，用工作站记录系统记录各色谱峰的保留时间和峰面积，用木糖标样色谱峰的保留时间定性，用外标法(以峰面积计)定量，测定样品中木糖的含量，从而计算出低聚木糖的含量。

计算得出试样中低聚木糖含量为水解前后木糖含量差值(M₂-M₁)：

V₁＝50ml

V₂＝50/9×(9+V₀+2.0)/3×15/10×2ml

$X_i=\frac{A_i}{A_s}\×C_s\×V\×{10}^{-3}/W\×100\·\·\·\left(1\right)$

X＝X₂-X₁

式中：X_i-木糖的含量(以木糖计)g/100g(ml)；

X-样品中低聚木糖的含量(以木糖计，g/100g(ml))；

A_i-样品进样液木糖组分的峰面积；

A_s-木糖标准峰面积；

C_s-木糖标液浓度mg/ml；

V₁-样品水解前稀释体积(ml)；

V₂-样品水解后稀释体积(ml)；

W-样品称样量，g或(ml)；

优选地，无水乙醇沉降大分子多糖，滤纸慢速过滤除去大分子多糖物质，取上清液，用低温浓缩(不大于50℃)赶尽乙醇。

优选地，4.0mol/L硫酸液摇匀，于沸水锅中水解1小时。

优选地，40％氢氧化钠中和(PH值5-6)，如果颜色深加入少量碳粉水浴脱色。

优选地，所述利用高效液相色谱(HPLC)对试样处理液进行定性和定量检测的液相条件为：

色谱柱：ZORBAX NH₂ 4.6×250mm，5μm

检测器：示差折光检测器(温控35℃)

流动相：乙腈∶水＝75∶25

流速：1.0mL/min

进样量：20μL

柱温：30℃

根据峰保留时间定性，外标峰面积法定量。

本技术目的是，提供一种保健食品中低聚木糖(以木糖计)的测定方法，通过乙醇水溶液沉降并除去大分子多糖及高聚合度低聚木糖，而后进行硫酸水解，使低聚木糖组分水解变为木糖，键合氨基柱分离，示差折光检测高效液相色谱法测定木糖的含量，食品中低聚木糖的含量即为水解前后木糖含量的差值。此方法克服了现有技术存在的缺陷，能够更好的满足生产和人们日常生活的需要。

具体实施方式

实施例1，溶液状保健食品中低聚木糖的精密度和回收率检测：

准确移取液体试样10.0mL±0.01mL于容量瓶中，加一定量的水，再加入无水乙醇，滤纸慢速过滤除去多糖，取上清液，用低温浓缩(不大于50℃)赶尽乙醇，用水溶解定容，即为样品水解前上机测定液M1；然后取样品水解前上机测定液于水解管中，加入4.0mol/l硫酸液摇匀，于沸水锅中水解1小时；冷却，再用40％氢氧化钠中和(PH值5-6)耗费体积V₀ml(如果颜色深加入少量碳粉水浴脱色，冷却)；滤纸过滤，取清液加入无水乙醇，脱盐、除杂质；用0.45um膜过滤，取滤液低温浓缩，加水溶解定容，该溶液样品水解后上机测定M₂。

称取木糖标准品，用水溶解并定容，作为木糖储备液，然后进一步用水稀释为具有浓度梯度的标准使用液，分别取0.5、1.0、2.0、3.0、5.0g/L的糖混合标准溶液，按色谱测定条件检测。以峰面积对各项糖浓度绘制标准曲线。

在同样的色谱条件下，将处理好的样品同样按色谱测定条件进行检测，用工作站记录系统记录各色谱峰的保留时间和峰面积，用木糖标样色谱峰的保留时间定性，用外标法(以峰面积计)定量，测定样品中水解前后木糖的含量，从而计算出低聚木糖的含量。计算结果，样品中低聚木糖含量为水解前后木糖含量差值(M₂-M₁)计算得出：

V₁＝50ml    

V₂＝50/9×(9+V₀+2.0)/3×15/10×2ml

$X_i=\frac{A_i}{A_s}\×C_s\×V\×{10}^{-3}/W\×100\·\·\·\left(1\right)$

X＝X₂-X₁

式中：X_i-木糖的含量(以木糖计)g/100g(ml)；

X-样品中低聚木糖的含量(以木糖计，g/100g(ml))；

A_i-样品进样液木糖组分的峰面积；

A_s-木糖标准峰面积；

C_s-木糖标液浓度mg/ml；

V₁-样品水解前稀释体积(ml)；

V₂-样品水解后稀释体积(ml)；

W-样品称样量，g或(ml)；

试样中低聚木糖的含量按公式(1)进行计算，结果如下：

实施例2，固体和半固体保健食品中低聚木糖精密度和回收率的检测：

准确称取10.0g左右样品置于烧杯中用水反复提取后，转移到容量瓶中定容，取样液加入无水乙醇，滤纸慢速过滤除去多糖，取上清液，用低温浓缩(不大于50℃)赶尽乙醇，用水溶解定容，即为样品水解前上机测定液M1；然后取样品水解前上机测定液于水解管中，加入4.0mol/l硫酸液摇匀，于沸水锅中水解1小时；冷却，再用40％氢氧化钠中和(PH值5-6)耗费体积V₀ml(如果颜色深加入少量碳粉水浴脱色，冷却)；滤纸过滤，取清液加入无水乙醇，脱盐、除杂质；用0.45um膜过滤，取滤液低温浓缩，加水溶解定容，该溶液样品水解后上机测定M₂。

称取木糖标准品，用水溶解并定容，作为木糖储备液，然后进一步用水稀释为具有浓度梯度的标准使用液，分别取0.5、1.0、2.0、3.0、5.0g/L的糖混合标准溶液，按色谱测定条件检测。以峰面积对各项糖浓度绘制标准曲线。

在同样的色谱条件下，将处理好的样品同样按色谱测定条件进行检测，用工作站记录系统记录各色谱峰的保留时间和峰面积，用木糖标样色谱峰的保留时间定性，用外标法(以峰面积计)定量，测定样品中水解前后木糖的含量，从而计算出低聚木糖的含量。计算结果，样品中低聚木糖含量为水解前后木糖含量差值(M₂-M₁)计算得出：

V₁＝50ml

V₂＝50/9×(9+V₀+2.0)/3×15/10×2ml

$X_i=\frac{A_i}{A_s}\×C_s\×V\×{10}^{-3}/W\×100\·\·\·\left(1\right)$

X＝X₂-X₁

式中：X_i-木糖的含量(以木糖计)g/100g(ml)；

X-样品中低聚木糖的含量(以木糖计，g/100g(ml))；

A_i-样品进样液木糖组分的峰面积；

A_s-木糖标准峰面积；

C_s-木糖标液浓度mg/ml；

V₁-样品水解前稀释体积(ml)；

V₂-样品水解后稀释体积(ml)；

W-样品称样量，g或(ml)；

试样中低聚木糖的含量按公式(1)进行计算，结果如下：

显而易见，本领域的普通技术人员，可以用发明的这种通过带有视差折光检测器的高效液相色谱(HPLC)定性和定量检测保健食品中低聚木糖(以木糖计)方法。

上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明范围的情况下，还可以作出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也应属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由各权利要求限定。

Claims (6)

1.一种保健食品中低聚木糖(以木糖计)含量的测定方法，其特征在于，所述测定方法包括如下步骤：

待测试样为固体，称取10.0g左右样品置于烧杯中用水反复提取后，转移到容量瓶中定容，取样液处理；液体样品时直接取体积试样于容量瓶中，加一定量的水。再加入无水乙醇，滤纸慢速过滤除去多糖，取上清液，用低温浓缩(不大于50℃)赶尽乙醇，用水溶解定容，得水解前上机测定液M₁；然后取一定量样品水解前上机测定液于水解管中，加入4.0mol/L硫酸液摇匀，于沸水锅中水解1小时；冷却，再用40％氢氧化钠中和(PH值5-6)耗费体积V₀ml(如果颜色深加入少量碳粉水浴脱色，冷却)；滤纸过滤，取清液加入无水乙醇，脱盐、除杂质；用0.45um膜过滤，取滤液低温浓缩，加水溶解定容，得水解后上机测定液M₂。

称取木糖标准品，用水溶解并定容，作为木糖储备液，然后进一步用水稀释为具有浓度梯度的标准使用液，分别取0.5、1.0、2.0、3.0、5.0g/L的糖混合标准溶液，按色谱测定条件检测。以峰面积对各项糖浓度绘制标准曲线。

在同样的色谱条件下，将处理好的样品同样按色谱测定条件进行检测，用工作站记录系统记录各色谱峰的保留时间和峰面积，用木糖标样色谱峰的保留时间定性，用外标法(以峰面积计)定量，测定样品中木糖的含量，从而计算出低聚木糖的含量。

计算得出试样中低聚木糖含量为水解前后木糖含量差值(M₂-M₁)：

V₁＝50ml

V₂＝50/9×(9+V₀+2.0)/3×15/10×2ml

X＝X₂-X₁

式中：X_i-木糖的含量(以木糖计)g/100g(ml)；

X-样品中低聚木糖的含量(以木糖计，g/100g(ml))；

A_i-样品进样液木糖组分的峰面积；

A_s-木糖标准峰面积；

C_s-木糖标液浓度mg/ml；

V₁-样品水解前稀释体积(ml)；

V₂-样品水解后稀释体积(ml)；

W-样品称样量，g或(ml)。

2.根据权利要求1所述的一种保健食品中低聚木糖(以木糖计)含量的测定方法，其特征在于：无水乙醇沉降大分子多糖，滤纸慢速过滤除去大分子多糖物质，取上清液，用低温浓缩(不大于50℃)赶尽乙醇，能够有效的去除杂质干扰，避免低聚木糖在前处理过程中的损失，保证低聚木糖有效酸水解。

3.根据权利要求1所述的一种保健食品中低聚木糖(以木糖计)含量的测定方法，其特征在于：4.0mol/L硫酸液摇匀，于沸水锅中水解1小时，4.0mol/L硫酸液水解1小时的酸水解条件能够有效的对样品中的低聚木糖进行水解。

4.根据权利要求1所述的一种保健食品中低聚木糖(以木糖计)含量的测定方法，其特征在于：40％氢氧化钠中和(PH值5-6)，如果颜色深加入少量碳粉水浴脱色，适当的PH值以及碳粉的水浴脱色，保证了样品的回收率。

5.根据权利要求1所述的一种保健食品中低聚木糖(以木糖计)含量的测定方法，其特征在于：所述利用高效液相色谱(HPLC)对试样处理液进行定性和定量检测的液相条件为：

色谱柱：ZORBAX NH₂ 4.6×250mm，5μm

检测器：示差折光检测器(温控35℃)

流动相：乙腈∶水＝75∶25

流速：1.0mL/min

进样量：20μL

柱温：30℃

此条件下具有很好的分离效果。

6.根据权利要求1所述的一种保健食品中低聚木糖(以木糖计)含量的测定方法，其特征在于：通过带有视差折光检测器的高效液相色谱(HPLC)测定水解前后的木糖值来计算出保健食品中低聚木糖(以木糖计)含量的方法。