CN103063768A - 一种乳制品中叶酸含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种乳制品中叶酸含量的检测方法，所述方法包括如下步骤：(1)样品前处理：取乳制品样品，配制成水溶液，超声波振荡萃取，加入高氯酸沉淀蛋白质，离心，过滤，滤液备用；(2)固相萃取净化：利用固相萃取柱对步骤(1)得到的滤液进行净化，以除去其中的干扰物质，收集过柱后的样品，氮气吹干，备用；(3)衍生：将步骤(2)得到的样品用水溶解，加入过氧化氢水溶液、氢氧化钠水溶液和水，混匀后加热处理，然后水洗冷却得到衍生样品；(4)色谱检测：使用C18色谱柱对步骤(3)得到的衍生样品进行检测。本发明所建立的方法具有很高的灵敏度、精密度和准确度，易于在乳品企业中推广使用。
Description
技术领域
本发明是关于一种乳制品中叶酸含量的检测方法。
背景技术
叶酸(folic acid，FA)为蝶呤衍生物，亦称喋酰谷氨酸，是机体细胞生长和繁殖的必须物质，其分子式为C19H19N7O6，分子量为441.40。叶酸主要用于各种原因引起的叶酸缺乏以及叶酸缺乏引起的巨幼红细胞性贫血的治疗，恶性贫血的辅助治疗，以及妊娠期、哺乳期妇女的预防给药；叶酸还对人体的神经健康有重要作用，它可提供大量游离碳原子，是制造神经末梢和构成传递神经冲动的重要化学物质的原料。
由于叶酸具有特殊的生理功能，特别是对妊娠期、哺乳期妇女和胎儿，叶酸经常作为营养强化剂用于保健食品及配方食品中，因此，如何测定这些食品中的叶酸含量，以监控这些食品的质量就变得尤为重要。
文献“高效液相色谱法测定叶酸片中叶酸的含量”(高桂花等人，《济宁医学院学报》，2010年04期)公布了一种测定叶酸的方法，但该方法主要应用于叶酸含量大于50％的叶酸片剂中，色谱峰中干扰物质很少，用普通的紫外色谱方法就可以直接进行测定，而对于干扰物质较多，叶酸含量较少的食品就很难通过这种方法进行定量。
CN102175878A公开了一种酶联免疫法测定食品、饲料和维生素产品的方法，但酶联免疫法长期使用成本较高，不利于生产企业节约成本。
文献“高效液相色谱-柱后衍生法测定乳粉中的叶酸含量”(关晓书等人，《民营科技》，2010年11期)和“固相萃取-反相高效液相色谱法检测婴幼儿配方乳粉中叶酸的含量”(包怡红等人，《营养学报》，2009年3期)分别公布了利用柱前和柱后衍生的方法测定乳粉中叶酸的含量，但两种方法中使用的衍生剂过二硫酸钾和高锰酸钾具有很强的氧化性，容易腐蚀高效液相色谱仪器的管路，长期测定容易造成设备的损坏。
文献“荧光粉光光度法测定食品中叶酸的含量”(黄宏南等人，《中国卫生检验杂志》，2002年01期)公布了一种采用反相高效液相色谱荧光法测定保健食品中的叶酸含量的方法，其中主要是利用高锰酸钾氧化衍生叶酸，并通过过氧化氢滴定过量的高锰酸钾，再用荧光光度计测定叶酸含量。该方法使用了两种氧化剂共同作用过程繁琐，此方法的回收了仅为75％，回收率不在规定的80％～120％之间，不能作为一种成熟的方法应用于实际检测。
针对现有技术中存在的问题，本发明利用含有C18填料的固相萃取技术进行除杂，再使用反相高效液相色谱经过过氧化氢衍生后检测乳粉中叶酸的含量，本发明衍生过程中稍过量的过氧化氢在加热时分解，不会带入检测设备中，因此可以防止设备长期使用过程中发生管路氧化。本方法具有操作简单、方法灵敏度高、选择性好、回收率高、重现性好等特点，并且该方法主要适用于基质复杂、叶酸添加量少的乳粉中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种乳制品中叶酸含量的检测方法。本发明方法具有很高的灵敏度、精密度和准确度。
为达上述目的，本发明提供了一种乳制品中叶酸含量的检测方法，所述方法包括如下步骤：
(1)样品前处理：取乳制品样品，配制成水溶液，超声波振荡萃取，加入高氯酸沉淀蛋白质，离心，过滤，滤液备用；
(2)固相萃取净化：利用固相萃取柱对步骤(1)得到的滤液进行净化，以除去其中的干扰物质，收集过柱后的样品，氮气吹干，备用；
(3)衍生：将步骤(2)得到的样品用水溶解，加入过氧化氢水溶液、氢氧化钠水溶液和水，混匀后加热处理，然后水洗冷却得到衍生样品；
(4)色谱检测：使用C18色谱柱对步骤(3)得到的衍生样品进行检测。
本发明利用固相萃取小柱除去食品中的大部分干扰物质，再使用过氧化氢溶液对叶酸进行衍生，最后使用高效液相色谱荧光检测法测定食品中的叶酸含量。本发明方法具有很高的灵敏度、精密度和准确度。
根据本发明的具体实施方案，本发明的检测方法中，所述乳制品可以为液态乳制品或是乳粉，步骤(1)中是取乳制品样品调配成固形物含量0.1～0.2g/ml的水溶液。
根据本发明的具体实施方案，本发明的检测方法中，步骤(1)中配制的乳制品样品溶液先在30～50℃下超声波萃取10～20min(本发明中超声波功率的不同对萃取结果基本无影响)，再加入50％～60％浓度的高氯酸沉淀蛋白质，沉淀完全后4000r/min离心15min，过滤，滤液备用。
其中优选步骤(1)中配制的乳制品样品溶液先在50℃下超声波萃取15min。
根据本发明的具体实施方案，本发明的检测方法中，所述固相萃取柱为C18固相萃取小柱。
本发明的固相萃取小柱为所属领域常用设备。本发明优选的固相萃取小柱规格为：C18小柱，500mg/6ml。进一步优选为Thermo Hypersep公司的C18固相萃取小柱。更具体地，所述固相萃取净化步骤中，先用甲醇活化萃取柱，取5mL～10mL样品清液加到柱床上，用固相萃取仪控制流速在40d/min，使样品流过填料；待样液全部通过固相萃取柱后，用5～10mL的去离子水将干扰物洗出；再用5～10mL 甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，保存备用。
根据本发明的具体实施方案，本发明的检测方法中，所述衍生步骤中，用1mL水复溶经氮气吹干的样品，向复溶后的样品中加1～3mL的5％～20％(v/v)的过氧化氢溶液衍生剂、1～3mL的0.05～2mol/L的氢氧化钠和1～3mL的去离子水，混匀，然后加热处理使样品中的叶酸在碱性条件下与过氧化氢发生衍生反应，冷却，用有机系针头式滤膜过滤到自动进样瓶中，上机备用。
本发明中，过氧化氢具体用量的控制是使样品衍生完全的同时，剩余量尽可能少。加入氢氧化钠的目的是使叶酸衍生过程在碱性条件下充分衍生(发明人在研究过程中发现如果在酸性条件下加热很长时间都不会衍生完全，而影响测量数据的准确性)。加入去离子水的目的主要是为了方便计算。
以通常乳粉中叶酸含量范围为例，利用本发明的方法进行检测时，具体可向复溶后的样品中加1ml 10％(v/v)的过氧化氢溶液、1ml 0.1mol/L的氢氧化钠溶液和2ml去离子水。
根据本发明的具体实施方案，为了进一步提高检测的准确性，本发明优选的加热处理为：在60℃下加热40～50min；或者为先在30～50℃下加热30～60min，再升温至50～70℃加热30～60min。加热处理的开始阶段主要是为了衍生反应，加热处理的后段是为了在高温下除去剩余的过氧化氢。
根据本发明的具体实施方案，本发明的检测方法中，所述色谱检测条件为：色谱柱BDS HYPERSIL C18，柱体积250×4.6mm i.d.5μm；柱温为30℃；检测器为荧光检测器，检测波长Ex为285nm，Em为437nm；流动相为含乙腈15％的0.05mol/L磷酸二氢钠溶液；流速1mL/min；进样量20μL。
本发明中未详细提及的操作步骤，可以采用本领域中的常规操作，或是按照仪器制造厂商的说明书进行。
在本发明的一具体实施方案中，本发明是以对乳粉中的叶酸含量进行检测为例进行详细说明，该检测方法具体包括：
(1)样品前处理：称取乳粉样品5g～10g于50mL锥形瓶中，加30mL去离子水(40～50℃)溶解，置于50℃超声波振荡器中进行超声萃取15min，再加入50％～60％的高氯酸1.0～3.0mL沉淀蛋白质，4000r/min离心15min，之后将溶液全部转移至50mL容量瓶中，加去离子水定容至刻度、摇匀，滤纸过滤至锥形瓶中后放入0～4℃冰箱备用。
(2)固相萃取净化：①先用5mL100％甲醇活化萃取柱(C18固相萃取小柱)，加入5mL水冲洗去甲醇，并使小柱平衡，上样前勿让填料流干；②取5mL～10mL样品清液加到柱床上，用固相萃取仪控制流速在40d/min，使样品流过填料；③待样液全部通过固相萃取柱后，用5～10mL去离子水将干扰物洗出；④最后用5mL 100％甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，保存备用。
(3)衍生方法：用1mL水复溶经氮气吹干的样品，涡旋振荡使其全部溶解；向其中加1～3mL的5％～20％(v/v)的过氧化氢溶液衍生剂、1～3mL的0.05～2mol/L的氢氧化钠和1～3mL的去离子水，涡旋振荡使其充分混匀。然后放入30～50℃水浴加热30～60min后，再升高温度至50℃～70℃，加热30～60min；或者直接在60℃下加热40～50min，取出用自来水冲洗冷却，经涡旋振荡后用有机系针头式滤膜过滤到自动进样瓶中，上机备用。
(4)色谱检测条件：色谱柱：BDS HYPERSIL C18(250×4.6mm i.d.5μm)；柱温为30℃；检测器为荧光检测器，检测波长：Ex为285nm，Em为437nm；流动相为含乙腈15％的0.05mol/L磷酸二氢钠溶液；流速1mL/min；进样量20μL。
本发明方案可靠性分析表明，本发明的方法在步骤(1)中配制的样品水溶液中叶酸浓度为0.003～2.7μg/mL的范围内线性良好，平均回收率为95.0％～102.0％，RSD％小于3％，检出限为3ng/mL，定量限为15ng/mL，叶酸提取液放置3d后仍有很好的稳定性。
综上所述，本发明提供了一种乳制品中叶酸含量的检测方法。本发明所建立的方法具有很高的灵敏度、精密度和准确度，且检测时间较短，易于在乳品企业中推广使用。
具体实施方式
以下通过具体实施例详细说明本发明的实施过程和产生的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质和特点，不作为对本案可实施范围的限定。
实施例1
称取乳粉样品5g于50mL锥形瓶中，加入50℃的30mL去离子水溶解，置于50℃超声波振荡器中超声萃取15min，再加入60％的高氯酸1.5mL沉淀蛋白质，4000r/min离心15min，沉淀完全后将溶液全部转移至50mL容量瓶中，加去离子水定容至刻度、摇匀，滤纸过滤至锥形瓶中后放入0～4℃冰箱备用。
用5mL100％甲醇活化萃取柱(Thermo Hypersep公司的C18固相萃取小柱，500mg/6ml)，加入5mL水冲洗去甲醇，并使小柱平衡，上样前勿让填料流干；取5mL样品清液加到柱床上，用Waters固相萃取仪控制流速在40d/min，使样品流过填料；待样液全部通过固相萃取柱后，用6mL 1％的去离子水将干扰物洗出；最后用5mL 100％甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，保存备用。
用1mL水复溶经氮气吹干的样品，涡旋振荡使其全部溶解；向其中加1mL 5％(v/v)的过氧化氢溶液(作为衍生剂)、1mL 0.05mol/L的氢氧化钠和2mL去离子水，涡旋振荡使其充分混匀。在60℃条件下直接加热50min，取出用自来水冲洗冷却，经涡旋振荡后用有机系针头式滤膜过滤到自动进样瓶中，上机准备进行色谱检测。
色谱条件：色谱柱：BDS HYPERSIL C18(250×4.6mm i.d.5μm)；柱温为30℃；检测器为荧光检测器，检测波长：Ex为285nm，Em为437nm；流动相为含乙腈15％的0.05mol/L磷酸二氢钠溶液；流动相流速：1mL/min；进样量：20μL。
实施例2
称取乳粉样品10g于50mL锥形瓶中，加入50℃的30mL去离子水溶解，置于30℃超声波振荡器中超声萃取20min，再加入50％的高氯酸1.5mL沉淀蛋白质，4000r/min离心15min，沉淀完全后将溶液全部转移至50mL容量瓶中，加去离子水定容至刻度、摇匀，滤纸过滤至锥形瓶中后放入0～4℃冰箱备用。
用5mL100％甲醇活化萃取柱，加入5mL水冲洗去甲醇，并使小柱平衡，上样前勿让填料流干；取5mL样品清液加到柱床上，用Waters固相萃取仪控制流速在40d/min，使样品流过填料；待样液全部通过固相萃取柱后，用5mL 1％的去离子水将干扰物洗出；最后用10mL 100％甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，保存备用。
用1mL水复溶经氮气吹干的样品，涡旋振荡使其全部溶解；向其中加3mL 5％(v/v)的过氧化氢溶液(作为衍生剂)、1mL 0.05mol/L的氢氧化钠和3mL去离子水，涡旋振荡使其充分混匀。在60℃条件下直接加热50min，取出用自来水冲洗冷却，经涡旋振荡后用有机系针头式滤膜过滤到自动进样瓶中，上机准备进行色谱检测。
色谱条件：色谱柱：BDS HYPERSIL C18(250×4.6mm i.d.5μm)；柱温为30℃；检测器为荧光检测器，检测波长：Ex为285nm，Em为437nm；流动相为含乙腈15％的0.05mol/L磷酸二氢钠溶液；流动相流速：1mL/min；进样量：20μL。
实施例3
称取乳粉样品10g于50mL锥形瓶中，加入50℃的30mL去离子水溶解，置于40℃超声波振荡器中超声萃取10min，再加入55％的高氯酸1.5mL沉淀蛋白质，4000r/min离心15min，沉淀完全后将溶液全部转移至50mL容量瓶中，加去离子水定容至刻度、摇匀，滤纸过滤至锥形瓶中后放入0～4℃冰箱备用。
用5mL100％甲醇活化萃取柱，加入5mL水冲洗去甲醇，并使小柱平衡，上样前勿让填料流干；取5mL样品清液加到柱床上，用Waters固相萃取仪控制流速在40d/min，使样品流过填料；待样液全部通过固相萃取柱后，用10mL 1％的去离子水将干扰物洗出；最后用5mL 100％甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，保存备用。
用1mL水复溶经氮气吹干的样品，涡旋振荡使其全部溶解；向其中加2mL 5％(v/v)的过氧化氢溶液(作为衍生剂)、3mL 0.05mol/L的氢氧化钠和1mL去离子水，涡旋振荡使其充分混匀。在60℃条件下直接加热40min；或者30～50℃加热30～60min后，再升高温度至50℃～70℃，加热30～60min取出用自来水冲洗冷却，经涡旋振荡后用有机系针头式滤膜过滤到自动进样瓶中，上机准备进行色谱检测。
色谱条件：色谱柱：BDS HYPERSIL C18(250×4.6mm i.d.5μm)；柱温为30℃；检测器为荧光检测器，检测波长：Ex为285nm，Em为437nm；流动相为含乙腈15％的0.05mol/L磷酸二氢钠溶液；流动相流速：1mL/min；进样量：20μL。
实施例4检测精密度实验
本实施例选用的四种市售婴儿配方乳粉进行精密度试验。分别称取4种配方乳粉，按实施例1方法进行处理，每个样品平行操作6次，测定精密度。结果见表1。
表1精密度试验结果
结果表明，在添加浓度范围内，本方法的批内相对标准偏差均小于3％，说明该方法的重现性较好，能够满足实验室测定叶酸含量的要求。
本实施例中，还分别采用实施例2、3的方法，对同样的四种市售婴儿配方乳粉中叶酸含量进行检测，每个样品平行操作3次，取平均值，测定结果见表2。
表2
实施例5
称取5g婴儿配方乳粉样品，称取4组，样品溶解后分别向其中添加40μg/100mg、60μg/100mg、80μg/100mg、100μg/100mg叶酸标准品，按实施例1方法处理样品，每组做6个平行进行回收率试验，结果见表3。
表3回收率试验结果
结果显示：四种浓度的方法回收率平均值均在95.0％～102.0％之间，RSD小于2％，说明测定方法准确度良好。
Claims (8)
1.一种乳制品中叶酸含量的检测方法，该方法包括如下步骤：
(1)样品前处理：取乳制品样品，配制成水溶液，超声波振荡萃取，加入高氯酸沉淀蛋白质，离心，过滤，滤液备用；
(2)固相萃取净化：利用固相萃取柱对步骤(1)得到的滤液进行净化，以除去其中的干扰物质，收集过柱后的样品，氮气吹干，备用；
(3)衍生：将步骤(2)得到的样品用水溶解，加入过氧化氢水溶液、氢氧化钠水溶液和水，混匀后加热处理，然后水洗冷却得到衍生样品；
(4)色谱检测：使用C18色谱柱对步骤(3)得到的衍生样品进行检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述乳制品为液态乳制品或乳粉，步骤(1)中是取乳制品样品调配成固形物含量0.1～0.2g/ml的水溶液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(1)中配制的乳制品样品溶液先在30～50℃下超声波萃取10～20min，再加入50％～60％浓度的高氯酸沉淀蛋白质，沉淀完全后4000r/min离心15min，过滤，滤液备用。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述固相萃取柱为C18固相萃取小柱。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述固相萃取净化步骤中，先用甲醇活化萃取柱，取5mL～10mL样品清液加到柱床上，用固相萃取仪控制流速在40d/min，使样品流过填料；待样液全部通过固相萃取柱后，用5～10mL去离子水将干扰物洗出；再用5～10mL 甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，保存备用。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其中，所述衍生步骤中，用1mL水复溶经氮气吹干的样品，向复溶后的样品中加1～3mL的体积百分比浓度为5％～20％的过氧化氢溶液衍生剂、1～3mL的0.05～2mol/L的氢氧化钠和1～3mL的去离子水，混匀，然后加热处理使样品中的叶酸在碱性条件下与过氧化氢发生衍生反应，冷却，用有机系针头式滤膜过滤到自动进样瓶中，上机备用。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述加热处理为在60℃下加热40～50min；或者为先在30～50℃下加热30～60min，再升温至50～70℃加热30～60min。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述色谱检测条件为：色谱柱BDS HYPERSILC18，柱体积250×4.6mmi.d.5μm；柱温为30℃；检测器为荧光检测器，检测波长Ex为285nm，Em为437nm；流动相为含乙腈15％的0.05mol/L磷酸二氢钠溶液；流速1mL/min；进样量20μL。
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