CN112986424A - 一种婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性的快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性的快速检测方法，属于婴幼儿辅食营养包产品创制的技术领域。本发明公开了一种基于液相色谱HPLC法检测婴幼儿辅食营养包叶酸含量的快速检测方法与其判断叶酸含量均衡稳定性模型Y＝0.876X+11.131，模型R2＝0.944，P值＝0.000<0.05，模型在校验水平0.05显著，且模型均方根误差RMSE＝2.245843，实测值与预测值间的标准偏差≤0.768024。本发明不仅可以广泛应用于富含叶酸的强化食品中叶酸含量快速检测领域，也可应用于检测不同批次的婴幼儿辅食营养包中叶酸强化均衡稳定性状态，还能够迅速指导生产以提高婴幼儿辅食营养包的优品率。

Description

一种婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性的快速检测 方法
技术领域
本发明属于婴幼儿辅食营养包创制的技术领域，涉及一种婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性的快速检测方法和用于判断富含叶酸婴幼儿营养包在生产或贮藏环境下产品中叶酸含量均衡稳定性的快速检测方法。
背景技术
叶酸又称为蝶酰谷氨酸，由2-氨基-4-羟基-6-甲基-蝶呤啶、谷氨酸和对氨基苯甲酸三部分组成，作为甲基供体参与了许多重要的生物化学反应过程，特别在维生素B12和维生素B6合成、修复，以及嘌呤嘧啶和甲基化DNA的合成等方面发挥着重要作用。叶酸不能在人体内合成，必须通过日常饮食伴随摄入，故世界卫生组织WHO建议正常成年人的每日叶酸(游离态)摄入量为200μg，孕妇和乳母为400μg。GB22570-2014《食品安全国家标准辅食营养补充品》明确了6～36月龄婴幼儿及37～60月龄儿童食用辅食营养素叶酸的每日份含量依次为18.8～150μg和35.3～150μg。倘若叶酸缺乏则会引起诸多疾病发生，如新生儿神经管畸形、癌症、心血管疾病、巨幼红细胞贫血、动脉硬化、急性心肌梗塞和脑中风等疾病。故婴幼儿、孕产妇、老年人等特殊群体营养需求中叶酸摄入问题备受关注。
基于叶酸性质不稳定，且光、热、pH值等因素均会致使叶酸被不同程度的降解。叶酸强化产品在其特定生产环境中会因光照和受热与其特定食品体系pH值等诸多影响因素严重制约着营养包产品的“优品率”。故以叶酸作为重要因子赋予各类营养包产品必须高度重视叶酸的均衡性和稳定性。
目前，常见的叶酸含量分析检测方法包括微生物法、荧光分析法、伏安法、酶联免疫ELISA方法等，其中微生物法是GB/T5009.211-2014《食品中叶酸的测定》和GB5413.16-2010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中叶酸(叶酸盐活性)的测定》通用方法，多采用鼠李糖乳杆菌，其优点为灵敏度高、结果准确，但其缺点也比较突出，如操作复杂、试验周期较长、菌种传代保存比较繁琐，所测定的结果为叶酸总含量，不能反映叶酸不同衍生物的细节。而荧光分析法具有测定快速、灵敏、选择性好、仪器简单等优点。纵观叶酸检测的方法研究文献中均未见相关富含叶酸产品中的均衡稳定性的方法研究，更没有将国标微生物方法与HPLC方法间构建一种快速检测判断生产产品中叶酸均衡稳定性的相关报道。
此外，判断模型优劣程度通常有三个评价指标为相关系数R2、χ2和均方根误差RMSE，其中相关系数R2是用来表示各变量之间的密切关系，越大且接近，表示回归关系越显著；而χ2和RMSE均方根误差反映的是实际值与期望值之间的变异程度，其值越小说明回归方程的预测精度越高。故本申请专利中有关婴幼儿营养包叶酸含量液相色谱HPLC法标准曲线以相关系数R2为判断指标；有关一种婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性判断模型的优劣以均方根误差RMSE和相关系数R2为判断指标。
综上所述，我们必须高度重视因光照、受热和食物体系pH值等因素致使叶酸不同程度被降解问题，亟待开发一种适用于富含叶酸产品均衡稳定性的快速检测方法，全面应用于富含叶酸的高品质婴幼儿营养包的质量监控领域。
本发明的技术优势：主要体现在以下三个方面：
第一，申请专利提供一种婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性的快速检测方法，可广泛应用于富含叶酸的强化食品中叶酸含量快速检测领域。
第二，申请专利核心技术聚焦于国标微生物法与液相色谱HPLC法综合构建富含叶酸婴幼儿营养包均衡稳定性判断模型，创新性突出。
第三，申请的专利技术主要用于快速判定不同批次的婴幼儿辅食营养包中叶酸强化均衡稳定性状态，迅速指导生产以提高婴幼儿辅食营养包的优品率。
发明内容
申请发明所需要解决的技术问题：公开一种婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性的快速检测方法，其特征在于，结合国标微生物法和液相色谱HPLC法的婴幼儿营养包叶酸含量的测定方法，构建出一种可以实现快速评价营养包产品中叶酸均衡稳定性判断模型，应用于不同批次的婴幼儿辅食营养包中叶酸强化均衡稳定性状态，进而迅速指导生产以提高婴幼儿辅食营养包的优品率。
申请发明的技术方案：
一种婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性的快速检测方法，其特征在于，包括HPLC法检测叶酸含量标准曲线的构建、婴幼儿辅食营养包内容物中叶酸含量HPLC法检测的样品制备、叶酸含量HPLC法检测、叶酸含量检测校正集样本和验证集样本的设计、叶酸含量均衡稳定性判断模型的构建、婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性判断模型的验证5个基本步骤，构建出一种婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性判断模型为Y＝0.876X+11.131，R2＝0.944，其中Y为国标微生物法测定12g样品中叶酸含量/μg；X为液相色谱HPLC法测定12g样品中叶酸含量/μg；模型F统计量值＝1137.735，P值＝0.000<0.05，模型在校验水平0.05显著，且模型均方根误差RMSE＝2.245843，实测值与预测值间的标准偏差≤0.768024；
1)所述的HPLC法检测叶酸含量标准曲线的构建，包括叶酸标准溶液的配制、液相色谱HPLC检测条件的设定、叶酸标准溶液的HPLC法检测、叶酸HPLC检测标准曲线的构建4个基本环节；
叶酸标准溶液的配制：称取0.0100～0.0115g叶酸标准品于50mL容量瓶中，加入适量0.5％氨水，利用超声频率20～40kHz进行超声处理10～30min使叶酸完全溶解，再用0.5％氨水定容至刻度，得到浓度为200～230μg/mL的叶酸标准品储备液/母液；再将叶酸标准品储备液/母液分别加水稀释4000倍、2000倍、400倍、200倍、100倍的浓度梯度的叶酸标准溶液备用；
液相色谱HPLC检测条件的设定：是选用250mm×4.6mm，5μm的C18色谱柱和荧光检测器；检测波长为λex＝344nm和λem＝428nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.05mol/L磷酸二氢钾水溶液；流速设定为1.0mL/min，进样量为25μL，柱温为40℃；样品检测时间为25.0min，其梯度洗脱程序如表1所示；
表1液相色谱HPLC检测梯度洗脱程序
Figure BDA0002940578510000031
叶酸标准溶液的HPLC法检测：将0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL浓度梯度的叶酸标准溶液依次进行液相色谱HPLC检测，准确记录每个叶酸标准溶液的液相色谱图谱备用；
叶酸HPLC检测标准曲线的构建：计算每个叶酸标准溶液液相色谱图谱中对应叶酸的峰面积；以叶酸标准溶液浓度下所对应的峰面积值为纵坐标，以叶酸标准溶液的浓度为横坐标，绘制叶酸浓度与峰面积间的标准曲线，并求得叶酸检测的标准曲线回归方程；
2)所述的婴幼儿辅食营养包内容物中叶酸含量HPLC法检测的样品制备，是准确称量1.0000～1.0015g婴幼儿辅食营养包内容物置于100mL离心管中，加入预先配制体积比为20～30:80～70的乙腈与乙酸-乙酸钠缓冲液的混合液25.0mL，涡旋混匀后，利用超声频率20～40kHz进行超声处理10～30min，再置于低温高速离心机中设定离心温度4℃、6000r/min条件下离心10～20min；取上清液5.0mL置于离心管中，再加入10.0mL正己烷，涡旋混合1～3min；再置于离心温度4℃，6000～10000r/min条件下离心5～10min，取下层液，经0.22μm滤膜处理，收集滤液置于棕色进样瓶中备用；
3)所述的叶酸含量HPLC法检测，是经步骤2)制备的待检样品，利用步骤1)设定条件进行液相色谱HPLC检测获得色谱图，计算谱图中叶酸对应峰面积代入所构建的叶酸检测标准曲线回归方程，求得所检婴幼儿辅食营养包内容物叶酸浓度，再利用如下公式1计算所检婴幼儿辅食营养包内容物叶酸的含量；
Figure BDA0002940578510000041
式中：S为叶酸含量，单位μg/g；Amt为叶酸浓度，单位μg/mL；V为待检样品稀释体积，单位mL；m为测试样品质量，单位为g；
4)所述的叶酸含量检测校正集样本和验证集样本的设计：将75个婴幼儿辅食营养包待测样本随机分为70个校正集样本和5个验证集样本，依次按照GB5009.211-2014叶酸测定方法与本申请发明所构建的液相色谱HPLC方法进行叶酸含量分析，获得75个样品两种检测方法对应的叶酸含量数据备用；
5)所述的叶酸含量均衡稳定性判断模型的构建，基于婴幼儿辅食营养包中叶酸强化含量是线性关系原因，以70个校正集婴幼儿辅食营养包叶酸含量为数据源，基于一元线性回归方法构建的婴幼儿辅食营养包中叶酸含量的均衡稳定性判断模型(如附图所示)：Y＝0.876X+11.131，R2＝0.944，其中Y为国标微生物法测定叶酸含量(μg/12g)，X为液相色谱HPLC法测定叶酸含量(μg/12g)，模型F统计量值＝1137.735，P值＝0.000<0.05，且模型在校验水平0.05显著；
6)所述的婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性判断模型的验证：以5个验证集样本叶酸含量结果为模型验证数据源，带入5)所构建的两个婴幼儿辅食营养包中叶酸含量的均衡稳定性判断模型，验证结果如表2所示：构建一种婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性判断模型为Y＝0.876X+11.131，R2＝0.944，其中Y为国标微生物法测定12g样品中叶酸含量/μg，X为液相色谱HPLC法测定12g样品中叶酸含量/μg，模型F统计量值＝1137.735，P值＝0.000<0.05，模型在校验水平0.05显著，且模型均方根误差RMSE＝2.245843，实测值与预测值间的标准偏差≤0.768024；
表2两叶酸两种检测方法构建模型结果
Figure BDA0002940578510000051
一种婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性判断模型，其特征在于，叶酸含量均衡稳定性判断模型为Y＝0.876X+11.131，R2＝0.944，其中Y为国标微生物法测定12g样品中叶酸含量/μg，X为液相色谱HPLC法测定12g样品中叶酸含量/μg，模型F统计量值＝1137.735，P值＝0.000<0.05，模型在校验水平0.05显著，且模型均方根误差RMSE＝2.245843，实测值与预测值间的标准偏差≤0.768024；
所述的一种婴幼儿辅食营养包，其特征在于，液相色谱HPLC法测定叶酸含量为75～110μg/12g；
所述的婴幼儿辅食营养包内容物中叶酸含量HPLC法检测的样品制备，其特征在于，全过程要求全程避光操作；
所述的婴幼儿辅食营养包内容物中叶酸含量HPLC法检测的样品制备，其特征在于，称取婴幼儿辅食营养包内容物样量为1g时，HPLC法的叶酸检测低限为2.0μg/g，测定结果绝对差值不超过算术平均值的10％；
所述的一种婴幼儿辅食营养包液相色谱HPLC法检测叶酸含量，其特征在于，叶酸标准品加样回收率≥95.86±4.46％；
所述的一种婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性的快速检测方法，其特征在于，叶酸取样量完全满足GB/T5009.211-2014《食品中叶酸的测定》和GB5413.16-2010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中叶酸--叶酸盐活性的测定》规定的“蛋白质和淀粉含量高的试样称样量为5g时，检出限为1.0μg/100g，定量限为2.0μg/100g；营养氧化剂和强化食品称样量为1g时，检出限为0.5μg/100g，定量限为1.0μg/100g”相关要求；
所述的一种婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性的快速检测方法，其特征在于，所述方法不仅可以用于快速判定不同批次的婴幼儿辅食营养包中叶酸含量的均衡稳定性状态，也可用于监控婴幼儿辅食营养包在贮藏与销售环节中叶酸含量衰减程度；
一种婴幼儿辅食营养包叶酸检测的标准品，其特征在于，叶酸标准品C19H19N7O6纯度≥97.0％。
附图说明
说明书附图图1为一种婴幼儿辅食营养包中叶酸含量的均衡稳定性判断模型Y＝0.876X+11.131，其中X轴为通过液相色谱HPLC法检测婴幼儿辅食营养包内容物中叶酸含量(μg/12g)，Y轴是与之对应的国标微生物法测定的叶酸含量(μg/12g)，数据点落入95％置信区间，拟合方程为Y＝0.876X+11.131，R2＝0.944，模型F统计量值＝1137.735，P值＝0.000<0.05，且模型在校验水平0.05显著；且模型均方根误差RMSE＝2.245843，实测值与预测值间的标准偏差≤0.768024。
具体实施方式
实施例1：
精密称取0.0117g叶酸标准品(C19H19N7O6纯度为97％)于50mL容量瓶中，加入适量0.5％氨水，利用超声频率40kHz进行超声处理10min使叶酸完全溶解，再用0.5％氨水定容至刻度，得到浓度为213.74μg/mL的叶酸标准品储备液(母液)；再将叶酸标准品储备液(母液)分别加水稀释4000倍、2000倍、400倍、200倍、100倍的浓度梯度的叶酸标准溶液，分别进行液相色谱HPLC检测，测试条件为选用250mm×4.6mm，5μm的C18色谱柱和荧光检测器，检测波长为λex＝344nm和λem＝428nm，流动相A为乙腈，流动相B为0.05mol/L磷酸二氢钾水溶液，流速设定为1.0mL/min，进样量为25μL，柱温为40℃，样品检测时间为25.0min，其梯度洗脱程序如表1所示；构建出婴幼儿辅食营养包中叶酸含量液相色谱HPLC检测标准曲线为Y＝11.5327X+0.1568，其中R2＝0.99978；准确称量1.0008g婴幼儿辅食营养包内容物置于100mL离心管中，加入预先配制体积比为20:80的乙腈与乙酸-乙酸钠缓冲液的混合液25.0mL，涡旋混匀后，利用超声频率40kHz进行超声处理10min，再置于低温高速离心机中设定离心温度为4℃、转速为6000r/min条件下离心20min；取上清液5.0mL置于离心管中，再加入10.0mL正己烷，涡旋混合1min；再置于低温4℃，10000r/min条件下离心5min，取下层液，收集0.22μm滤膜滤液置于棕色进样瓶进行液相色谱HPLC分析，婴幼儿辅食营养包内容物叶酸含量的HPLC法实测值X＝104.9μg/12g，带入婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性判断模型Y＝0.876X+11.131，求得国标微生物法叶酸含量预测值Y为103.0μg/12g，而与按照国标法检测实测值102.8μg/12g间的标准偏差值为-0.19，小于模型验证集的标准偏差均值0.768024。
实施例2：精密称取0.0114g叶酸标准品(C19H19N7O6纯度97％)于50mL容量瓶中，加入适量0.5％氨水，利用超声频率20kHz进行超声处理30min使叶酸完全溶解，再用0.5％氨水定容至刻度，得到浓度为228.33μg/mL的叶酸标准品储备液(母液)；再将叶酸标准品储备液(母液)分别加水稀释4000倍、2000倍、400倍、200倍、100倍的浓度梯度的叶酸标准溶液备用，分别进行液相色谱HPLC检测，测试条件为选用250mm×4.6mm，5μm的C18色谱柱和荧光检测器，检测波长为λex＝344nm和λem＝428nm，流动相A为乙腈，流动相B为0.05mol/L磷酸二氢钾水溶液，流速设定为1.0mL/min，进样量为25μL，柱温为40℃，样品检测时间为25.0min，其梯度洗脱程序如表1所示；构建出HPLC液相检测婴幼儿辅食营养包中叶酸含量的线性回归方程为Y＝10.8325X+0.07813其中R2＝0.99943；准确称量1.0010g婴幼儿辅食营养包内容物置于100mL离心管中，加入预先配制体积比为30:70的乙腈与乙酸-乙酸钠缓冲液的混合液25.0mL，涡旋混匀后，利用超声频率20kHz进行超声处理30min，再置于低温高速离心机中设定离心温度为4℃、转速为6000r/min条件下离心10min；取上清液5.0mL置于离心管中，再加入10.0mL正己烷，涡旋混合3min；再置于低温4℃，8000r/min条件下离心10min，取下层液，收集0.22μm滤膜滤液置于棕色进样瓶进行液相色谱HPLC分析，婴幼儿辅食营养包内容物叶酸含量的HPLC法实测值X＝104.0μg/12g，带入婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性判断模型Y＝0.876X+11.131，求得国标微生物法叶酸含量预测值Y为102.2μg/12g，而与按照国标法检测实测值102.6μg/12g间的标准偏差值为0.36，小于模型验证集的标准偏差均值0.768024。
实施例3：
精密称取0.0101g叶酸标准品(C19H19N7O6纯度97％)于50mL容量瓶中，加入适量0.5％氨水，利用超声频率30kHz进行超声处理20min使叶酸完全溶解，再用0.5％氨水定容至刻度，得到浓度为202.3μg/mL的叶酸标准品储备液(母液)；再将叶酸标准品储备液(母液)分别加水稀释4000倍、2000倍、400倍、200倍、100倍的浓度梯度的叶酸标准溶液备用，分别进行液相色谱HPLC检测，测试条件为选用250mm×4.6mm，5μm的C18色谱柱和荧光检测器，检测波长为λex＝344nm和λem＝428nm，流动相A为乙腈，流动相B为0.05mol/L磷酸二氢钾水溶液，流速设定为1.0mL/min，进样量为25μL，柱温为40℃，样品检测时间为25.0min，其梯度洗脱程序如表1所示；构建出HPLC液相检测婴幼儿辅食营养包中叶酸含量的线性回归方程为Y＝12.1179X+0.1615其中R2＝0.99958；准确称量1.0013g婴幼儿辅食营养包内容物置于100mL离心管中，加入预先配制体积比为25:75的乙腈与乙酸-乙酸钠缓冲液的混合液25.0mL，涡旋混匀后，利用超声频率30kHz进行超声处理20min，再置于低温高速离心机中设定离心温度为4℃、转速为6000r/min条件下离心15min；取上清液5.0mL置于离心管中，再加入10.0mL正己烷，涡旋混合2min；再置于低温4℃，6000r/min条件下离心10min，取下层液，收集0.22μm滤膜滤液置于棕色进样瓶进行液相色谱HPLC分析，婴幼儿辅食营养包内容物叶酸含量的HPLC法实测值X＝92.3μg/12g，带入婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性判断模型Y＝0.876X+11.131，求得国标微生物法叶酸含量预测值Y为92.0μg/12g，而与按照国标法检测实测值92.5μg/12g间的标准偏差值为0.53，小于模型验证集的标准偏差均值0.768024。

Claims (9)

1.一种婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性的快速检测方法，其特征在于，包括HPLC法检测叶酸含量标准曲线的构建、婴幼儿辅食营养包内容物中叶酸含量HPLC法检测的样品制备、叶酸含量HPLC法检测、叶酸含量检测校正集样本和验证集样本的设计、叶酸含量均衡稳定性判断模型的构建、婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性判断模型的验证5个基本步骤，构建出一种婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性判断模型为Y＝0.876X+11.131，R2＝0.944，其中Y为国标微生物法测定12g样品中叶酸含量/μg；X为液相色谱HPLC法测定12g样品中叶酸含量/μg；模型F统计量值＝1137.735，P值＝0.000<0.05，模型在校验水平0.05显著，且模型均方根误差RMSE＝2.245843，实测值与预测值间的标准偏差≤0.768024；
1)所述的HPLC法检测叶酸含量标准曲线的构建，包括叶酸标准溶液的配制、液相色谱HPLC检测条件的设定、叶酸标准溶液的HPLC法检测、叶酸HPLC检测标准曲线的构建4个基本环节；
叶酸标准溶液的配制：称取0.0100～0.0115g叶酸标准品于50mL容量瓶中，加入适量0.5％氨水，利用超声频率20～40kHz进行超声处理10～30min使叶酸完全溶解，再用0.5％氨水定容至刻度，得到浓度为200～230μg/mL的叶酸标准品储备液/母液；再将叶酸标准品储备液/母液分别加水稀释4000倍、2000倍、400倍、200倍、100倍的浓度梯度的叶酸标准溶液备用；
液相色谱HPLC检测条件的设定：是选用250mm×4.6mm，5μm的C18色谱柱和荧光检测器；检测波长为λex＝344nm和λem＝428nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.05mol/L磷酸二氢钾水溶液；流速设定为1.0mL/min，进样量为25μL，柱温为40℃；样品检测时间为25.0min，其梯度洗脱程序如表1所示；
表1 液相色谱HPLC检测梯度洗脱程序
Figure FDA0002940578500000011
叶酸标准溶液的HPLC法检测：将0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL浓度梯度的叶酸标准溶液依次进行液相色谱HPLC检测，准确记录每个叶酸标准溶液的液相色谱图谱备用；
叶酸HPLC检测标准曲线的构建：计算每个叶酸标准溶液液相色谱图谱中对应叶酸的峰面积；以叶酸标准溶液浓度下所对应的峰面积值为纵坐标，以叶酸标准溶液的浓度为横坐标，绘制叶酸浓度与峰面积间的标准曲线，并求得叶酸检测的标准曲线回归方程；
2)所述的婴幼儿辅食营养包内容物中叶酸含量HPLC法检测的样品制备，是准确称量1.0000～1.0015g婴幼儿辅食营养包内容物置于100mL离心管中，加入预先配制体积比为20～30:80～70的乙腈与乙酸-乙酸钠缓冲液的混合液25.0mL，涡旋混匀后，利用超声频率20～40kHz进行超声处理10～30min，再置于低温高速离心机中设定离心温度4℃、6000r/min条件下离心10～20min；取上清液5.0mL置于离心管中，再加入10.0mL正己烷，涡旋混合1～3min；再置于离心温度4℃，6000～10000r/min条件下离心5～10min，取下层液，经0.22μm滤膜处理，收集滤液置于棕色进样瓶中备用；
3)所述的叶酸含量HPLC法检测，是经步骤2)制备的待检样品，利用步骤1)设定条件进行液相色谱HPLC检测获得色谱图，计算谱图中叶酸对应峰面积代入所构建的叶酸检测标准曲线回归方程，求得所检婴幼儿辅食营养包内容物叶酸浓度，再利用如下公式1计算所检婴幼儿辅食营养包内容物叶酸的含量；
Figure FDA0002940578500000021
式中：S为叶酸含量，单位μg/g；Amt为叶酸浓度，单位μg/mL；V为待检样品稀释体积，单位mL；m为测试样品质量，单位为g；
4)所述的叶酸含量检测校正集样本和验证集样本的设计：将75个婴幼儿辅食营养包待测样本随机分为70个校正集样本和5个验证集样本，依次按照GB5009.211-2014叶酸测定方法与本申请发明所构建的液相色谱HPLC方法进行叶酸含量分析，获得75个样品两种检测方法对应的叶酸含量数据备用；
5)所述的叶酸含量均衡稳定性判断模型的构建，基于婴幼儿辅食营养包中叶酸强化含量是线性关系原因，以70个校正集婴幼儿辅食营养包叶酸含量为数据源，基于一元线性回归方法构建的婴幼儿辅食营养包中叶酸含量的均衡稳定性判断模型(如附图所示)：Y＝0.876X+11.131，R2＝0.944，其中Y为国标微生物法测定叶酸含量(μg/12g)，X为液相色谱HPLC法测定叶酸含量(μg/12g)，模型F统计量值＝1137.735，P值＝0.000<0.05，且模型在校验水平0.05显著；
6)所述的婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性判断模型的验证：以5个验证集样本叶酸含量结果为模型验证数据源，带入5)所构建的两个婴幼儿辅食营养包中叶酸含量的均衡稳定性判断模型，验证结果如表2所示：构建一种婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性判断模型为Y＝0.876X+11.131，R2＝0.944，其中Y为国标微生物法测定12g样品中叶酸含量/μg，X为液相色谱HPLC法测定12g样品中叶酸含量/μg，模型F统计量值＝1137.735，P值＝0.000<0.05，模型在校验水平0.05显著，且模型均方根误差RMSE＝2.245843，实测值与预测值间的标准偏差≤0.768024；
表2 两叶酸两种检测方法构建模型结果
Figure FDA0002940578500000031
2.一种婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性判断模型，其特征在于，叶酸含量均衡稳定性判断模型为Y＝0.876X+11.131，R2＝0.944，其中Y为国标微生物法测定12g样品中叶酸含量/μg，X为液相色谱HPLC法测定12g样品中叶酸含量/μg，模型F统计量值＝1137.735，P值＝0.000<0.05，模型在校验水平0.05显著，且模型均方根误差RMSE＝2.245843，实测值与预测值间的标准偏差≤0.768024。
3.一种婴幼儿辅食营养包，其特征在于，其使用如权利要求1或2任意一项的婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性的快速检测方法或判断模型，液相色谱HPLC法测定叶酸含量为75～110μg/12g。
4.根据权利要求1、2、3任意一项所述的婴幼儿辅食营养包内容物中叶酸含量HPLC法检测的样品制备，其特征在于，全过程要求全程避光操作。
5.根据权利要求1、2、3、4任意一项所述的婴幼儿辅食营养包内容物中叶酸含量HPLC法检测的样品制备，其特征在于，称取婴幼儿辅食营养包内容物样量为1g时，HPLC法的叶酸检测低限为2.0μg/g，测定结果绝对差值不超过算术平均值的10％。
6.根据权利要求1、2、3任意一项所述的一种婴幼儿辅食营养包液相色谱HPLC法检测叶酸含量，其特征在于，叶酸标准品加样回收率≥95.86±4.46％。
7.根据权利要求1、2任意一项所述的一种婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性的快速检测方法，其特征在于，叶酸取样量完全满足GB/T5009.211-2014《食品中叶酸的测定》和GB5413.16-2010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中叶酸--叶酸盐活性的测定》规定的“蛋白质和淀粉含量高的试样称样量为5g时，检出限为1.0μg/100g，定量限为2.0μg/100g；营养氧化剂和强化食品称样量为1g时，检出限为0.5μg/100g，定量限为1.0μg/100g”相关要求。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的一种婴幼儿辅食营养包中叶酸含量均衡稳定性的快速检测方法，其特征在于，所述方法不仅可以用于快速判定不同批次的婴幼儿辅食营养包中叶酸含量的均衡稳定性状态，也可用于监控婴幼儿辅食营养包在贮藏与销售环节中叶酸含量衰减程度。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的一种婴幼儿辅食营养包叶酸检测的标准品，其特征在于，叶酸标准品C19H19N7O6纯度≥97.0％。
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