CN110609100A - 气相色谱法同时检测复合酸化剂中6种有机酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种气相色谱法同时检测复合酸化剂中6种有机酸的方法，其特征在于，所述的方法用于同时测定乳酸、富马酸、苹果酸、苯甲酸、山梨酸和柠檬酸，所述的方法包括：将待测复合酸化剂样品进行甲酯化处理以获得测试样品溶液，将所述的测试样品溶液注入气相色谱仪中，进行色谱检测，以保留时间定性，测得各有机酸组分的峰面积，根据标准曲线，计算各有机酸组分的含量。该方法使用的是气相色谱仪，并且使用的柱子是最常见和普通的HP‑5色谱柱，在前处理过程中对于样品进行甲酯化处理后直接检测，检测灵敏度高，结果准确可靠，所用设备常见易得。适用于饲料添加剂中乳酸、富马酸、苹果酸、苯甲酸、山梨酸和柠檬酸含量的检测。

Description

气相色谱法同时检测复合酸化剂中6种有机酸的方法

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，更具体地，涉及一种气相色谱法同时检测复合酸化剂中6种有机酸的方法。

背景技术

复合酸化剂是将两种或两种以上的单一酸化剂按照一定的比例复合而成，可以是几种酸配合在一起使用，也可以是酸和盐类复配而成。在饲料中添加酸化剂后能够调节消化道内环境，提高消化酶的活性；降低饲料系酸力；调节消化道微生物平衡；参与机体代谢；增强机体免疫力。复合酸化剂产品并不是由单一的酸化剂组成，为更好的酸化性能，几种酸化剂按照合适的比率组成复合酸化剂。因此，如何有效的监控复合酸化剂的主成分和含量，已成为饲料公司、养殖户以及饲料添加剂公司的关注热点。

目前，关于酸化剂的检测方法很多，最常见的有比色法、荧光法、分光光度法、高效液相色谱法、离子交换色谱法、毛细管电泳法、气相色谱法等，但这些检测方法大多是针对单一有机酸，或使用液相法检测多种有机酸但是检测灵敏度也有待提高，或用气相检测多种有机酸时需要用到特定的FFAP柱子(价格昂贵、适用性不广泛)。因此，当需要检测复合酸化剂中的酸化剂成分时，需要采用各自的前处理技术和分析方法，检测费时、费力，并且消耗资金大。也有采用串联质谱法检测多种有机酸的报道，但这种分析仪器造价高昂，不便于在我国饲料行业普遍推广。

针对当下检测多种有机酸大部分采用高效液相色谱法，但是流动相的变化可能引起某些有机酸紫外吸收波长的变化，导致检测灵敏度和准确度下降；另外随着市场的变化，现有的复合酸化剂产品中不单单是只有有机酸的原料，有时候产品中还需要添加一些植物精油类的原料，如果用液相检测的话严重影响检测结果和降低色谱柱的使用寿命；用气相也有检测多种有机酸的方法，但是大都是用到了价格昂贵针对性强的色谱柱或用串联质谱法进行检测。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种同时检测饲料添加剂中6种酸化剂中有机酸的检测方法，该方法使用的是气相色谱仪，并且使用的柱子是最常见和普通的HP-5色谱柱，在前处理过程中对于样品进行甲酯化处理后直接检测，检测灵敏度高，结果准确可靠，所用设备常见易得。适用于饲料添加剂中乳酸、富马酸、苹果酸、苯甲酸、山梨酸和柠檬酸含量的检测。

为了实现上述目的，本发明采用的气相色谱法同时检测复合酸化剂中6种有机酸的方法技术方案如下：

所述的方法用于同时测定乳酸、富马酸、苹果酸、苯甲酸、山梨酸和柠檬酸，所述的方法包括：将待测复合酸化剂样品进行甲酯化处理以获得测试样品溶液，将所述的测试样品溶液注入气相色谱仪中，进行色谱检测，以保留时间定性，测得各有机酸组分的峰面积，根据标准曲线，计算各有机酸组分的含量。

较佳地，所述的甲酯化处理具体为：

在待测复合酸化剂样品的溶液中，加入硫酸甲醇溶液，置于水浴锅中反应后，加入三氯甲烷萃取，取下层清液经无水硫酸钠脱水后，用过滤器进行过滤处理，获得所述的测试样品溶液。

较佳地，所述的甲酯化处理具体为：

在待测复合酸化剂样品的溶液中，加入20％硫酸甲醇溶液，置于80℃水浴锅中反应1h，待反应结束冷却至室温后加入三氯甲烷萃取，取下层清液经无水硫酸钠脱水后，用0.45μm有机相针式过滤器进行过滤处理，获得所述的测试样品溶液。

较佳地，所述的色谱检测条件为：

a)升温程序：起始温度30℃保持2min，以4℃/min升至70℃，再以20℃/min升至250℃；

b)载气流速：0.8mL/min；

c)进样体积：1.0μL；

d)进样口温度：250℃；

e)进样模式：分流进样；

f)分流比：10:1；

g)检测器温度：300℃；

h)氢气流量：30mL/min；

i)空气流量：400mL/min；

j)氮气补充气流量：25mL/min。

较佳地，所述的气相色谱仪配置的检测器为FID；

色谱柱规格为石英毛细管色谱柱：HP-5，30m×320μm×0.25μm。

较佳地，所述的标准曲线通过以下方法获得：

制备混合有6种有机酸的混合酸标准储备液，并进行甲酯化处理；

制备混合酸标准工作液浓度梯度：分别准确移取1.00mL、2.00mL、3.00mL、5.00mL、10.00mL混合酸标准储备液于10.00mL容量瓶中，以三氯甲烷定容；

绘制标准曲线：将混合酸标准工作液浓度梯度注入气相色谱仪中，进行色谱检测，以保留时间定性，根据浓度梯度中每个浓度所测峰面积的大小与浓度的对应关系绘制标准曲线。

附图说明

图1为混合酸标准溶液的高效液相色谱图，在该色谱图中从左至右分别为乳酸、山梨酸、富马酸、苯甲酸、苹果酸、柠檬酸，保留时间依次为8.1min、15.5min、15.6min、16.6min、16.9min、19.5min。

图2为复合样品溶液1的高效液相色谱图。

图3为复合样品溶液2的高效液相色谱图。

图4为复合样品溶液3的高效液相色谱图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。

通过本发明的方法对现有的3种复合酸化剂进行有机酸组分含量检测，其中样品1、2、3取自上海某公司的3种饲用复合酸化剂产品。

1、试剂和材料

三氯甲烷：分析纯；硫酸：分析纯；甲醇：分析纯；碳酸氢钠：纯度≥98％；乳酸标准品：纯度≥98％；富马酸标准品：纯度99.5％；苹果酸标准品：纯度99.5％；苯甲酸标准品：纯度99.5％；山梨酸标准品：纯度99.5％；柠檬酸标准品：纯度99.5％。

5％碳酸氢钠溶液：准确称取碳酸氢钠5.0000g于100.00mL容量瓶中，超纯水定容溶解。

20％硫酸甲醇溶液：准确移取100.00mL硫酸溶解于400.00mL甲醇中。

山梨酸、苯甲酸的标液储备液：准确称取0.2000g山梨酸、0.2000g苯甲酸于10.00mL容量瓶中，用5％碳酸氢钠溶液定容，于数显恒温水浴锅中70℃加热溶解10min。

乳酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸的标准储备液：准确称取0.5000g乳酸、0.4000g富马酸、1.0000g苹果酸、0.2500g柠檬酸于25.00mL容量瓶中，超纯水定容，超声溶解10min。

混合酸标准储备液：将山梨酸、苯甲酸的标液储备液，乳酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸标准储备液转移至100.00mL容量瓶加超纯水定容；取定容后的混合溶液5.00mL于50.00mL容量瓶中，加入10.00mL20％硫酸甲醇溶液，置于80℃水浴锅中反应1h。反应结束，待冷却至室温后，加入25.00mL三氯甲烷进行萃取，收集下层溶液即为混合标准储备液。

混合酸标准工作液：分别准确移取1.00mL、2.00mL、3.00mL、5.00mL、10.00mL混合酸标准储备液于10.00mL容量瓶中，以三氯甲烷定容，现配现用。

2、仪器和设备

分析天平：感量0.0001g

有机相微孔滤膜：孔径0.45μm

气相色谱仪：7890B型，安捷伦公司，配置氢焰离子化检测器

石英毛细管色谱柱：HP-5，30m×320μm×0.25μm，安捷伦公司

进样器：1μL玻璃进样器

数显恒温水浴锅

烘箱

恒温超声波清洗器

3、方法

3.1色谱条件

a)升温程序：起始温度30℃保持2min，以4℃/min升至70℃，再以20℃/min升至250℃。

b)载气流速：0.8mL/min。

c)进样体积：1.0μL。

d)进样口温度：250℃。

e)进样模式：分流进样。

f)分流比：10:1。

g)检测器温度：300℃。

h)氢气流量：30mL/min。

i)空气流量：400mL/min。

j)氮气补充气流量：25mL/min。

3.2绘制标准曲线

分别取混合酸标准品工作液，按照3.1的色谱条件进行色谱分析测定。

以各有机酸的峰面积对其所相应的质量浓度进行线性回归，各线性回归方程所对应的曲线即为相应有机酸的标准曲线(要求相关系数大于0.999)。

所述的6种有机酸对应的线性回归方程及相关系数r²见表1，方程中Y即为相应有机酸所对应的峰面积，X即为有机酸的质量浓度。

表1.6种有机酸的线性回归方程、相关系数

3.3样品测定及结果计算

3.3.1待测样品的配制

吸附型酸化剂试样制备：准确称取1.0000g样品于100.00mL容量瓶中，加入超纯水，并在70℃水浴锅中加热10min，超声40min后定容，移取5.00mL溶液于50.00mL容量瓶中，加入10.00mL20％硫酸甲醇溶液后置于80℃水浴锅中反应1h，待反应结束冷却至室温后加入25.00mL三氯甲烷萃取，取下层清液经无水硫酸钠3-5g脱水后用0.45μm有机相针式过滤器进行过滤处理，置于样品瓶中，待测定。

微囊型酸化剂试样制备：准确称取1.0000g样品于100.00mL容量瓶中，加入10mL甲醇置于70℃水浴锅中加热溶解10min后，加入适量超纯水超声40min后定容，移取5.00mL溶液于50.00mL容量瓶中，加入10.00mL20％硫酸甲醇溶液后置于80℃水浴锅中反应1h，待反应结束冷却至室温后加入25.00mL三氯甲烷萃取，取下层清液经无水硫酸钠3-5g脱水后用0.45μm有机相针式过滤器进行过滤处理，置于样品瓶中，待测定。

3.3.2待测样品的测定

在相同的色谱条件下，分别精密量取样品溶液1.0μL注入气相色谱仪，进行检测，以表1中的混合标准工作液作多点校准，以保留时间定性，测得滤液中各组分的峰面积，根据绘制的标准曲线定量，计算滤液中各有机酸的浓度，由此计算出待检测样品中有机酸的含量。

3.3.3结果计算与表述

试样中乳酸、富马酸、苹果酸、苯甲酸、山梨酸、柠檬酸的含量以质量分数X计，数值以克每千克(g/kg)表示，按下式计算：

式中：

c—试样溶液中对应的乳酸、富马酸、苹果酸、苯甲酸、山梨酸、柠檬酸浓度，单位为克每升(g/L)；

V—定容体积，单位为升(L)；

m—试样质量，单位为克(g)。

样品溶液1、2、3的色谱图分别见图2、图3、图4。

不同复合酸化剂样品的检测结果见表2。

表2.样品中有机酸的含量(％)

4.方法重复性

精密量取样品溶液注入气相色谱仪检测，连续检测4次，计算各有机酸测得含量的相对标准偏差(RSD)。结果见表3。

表3.样品1中有机酸含量的相对标准偏差

5.准确度试验

在空白液中，加入不同量的有机酸原料，配成5个已知样，在相同的色谱操作条件下，定量分析、计算，测得各个有机酸原料的回收率。

表4.空白液中有机酸的加标回收实验

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)本发明建立了一种气相色谱法同时检测复合酸化剂中6种有机酸的方法，能够对复合酸化剂进行定性和定量，为复合酸化剂成分和含量的准确判定和快速检测提供科学依据。

(2)本发明中使用的分析仪器为气相色谱-FID检测器，相对于高效液相色谱串联质谱仪、气相色谱串联质谱仪等造价高昂的仪器，更加普及，更利于检测方法的应用。

(3)本发明中使用的色谱柱为常用的HP-5石英毛细管色谱柱，相对于FFAP毛细管色谱柱等不常用且价格昂贵的色谱柱，更加普及和利于检测。

(4)本发明采用将样品甲酯化前处理，检测结果准确可靠、重复性好，一次进样即可完成6种有机酸含量的检测，检测效率高。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (6)

1.一种气相色谱法同时检测复合酸化剂中6种有机酸的方法，其特征在于，所述的方法用于同时测定乳酸、富马酸、苹果酸、苯甲酸、山梨酸和柠檬酸，所述的方法包括：将待测复合酸化剂样品进行甲酯化处理以获得测试样品溶液，将所述的测试样品溶液注入气相色谱仪中，进行色谱检测，以保留时间定性，测得各有机酸组分的峰面积，根据标准曲线，计算各有机酸组分的含量。

2.根据权利要求1所述的气相色谱法同时检测复合酸化剂中6种有机酸的方法，其特征在于，所述的甲酯化处理具体为：

在待测复合酸化剂样品的溶液中，加入硫酸甲醇溶液，置于水浴锅中反应后，加入三氯甲烷萃取，取下层清液经无水硫酸钠脱水后，用过滤器进行过滤处理，获得所述的测试样品溶液。

3.根据权利要求2所述的气相色谱法同时检测复合酸化剂中6种有机酸的方法，其特征在于，所述的甲酯化处理具体为：

在待测复合酸化剂样品的溶液中，加入20％硫酸甲醇溶液，置于80℃水浴锅中反应1h，待反应结束冷却至室温后加入三氯甲烷萃取，取下层清液经无水硫酸钠脱水后，用0.45μm有机相针式过滤器进行过滤处理，获得所述的测试样品溶液。

4.根据权利要求1所述的气相色谱法同时检测复合酸化剂中6种有机酸的方法，其特征在于，所述的色谱检测条件为：

a)升温程序：起始温度30℃保持2min，以4℃/min升至70℃，再以20℃/min升至250℃；

b)载气流速：0.8mL/min；

c)进样体积：1.0μL；

d)进样口温度：250℃；

e)进样模式：分流进样；

f)分流比：10:1；

g)检测器温度：300℃；

h)氢气流量：30mL/min；

i)空气流量：400mL/min；

j)氮气补充气流量：25mL/min。

5.根据权利要求1所述的气相色谱法同时检测复合酸化剂中6种有机酸的方法，其特征在于，所述的气相色谱仪配置的检测器为FID；

色谱柱规格为石英毛细管色谱柱：HP-5，30m×320μm×0.25μm。

6.根据权利要求1所述的气相色谱法同时检测复合酸化剂中6种有机酸的方法，其特征在于，所述的标准曲线通过以下方法获得：

制备混合有6种有机酸的混合酸标准储备液，并进行甲酯化处理；

制备混合酸标准工作液浓度梯度：分别准确移取1.00mL、2.00mL、3.00mL、5.00mL、10.00mL混合酸标准储备液于10.00mL容量瓶中，以三氯甲烷定容；

绘制标准曲线：将混合酸标准工作液浓度梯度注入气相色谱仪中，进行色谱检测，以保留时间定性，根据浓度梯度中每个浓度所测峰面积的大小与浓度的对应关系绘制标准曲线。