CN112763629A - 用于同时检测复合酸化剂中6种酸化剂的方法 - Google Patents

用于同时检测复合酸化剂中6种酸化剂的方法 Download PDF

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CN112763629A CN202110061465.8A CN202110061465A CN112763629A CN 112763629 A CN112763629 A CN 112763629A CN 202110061465 A CN202110061465 A CN 202110061465A CN 112763629 A CN112763629 A CN 112763629A
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徐文娟
刘惠芳
洪伟
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Abstract

本发明涉及一种用于同时检测复合酸化剂中6种酸化剂的方法，所述的复合酸化剂中的6种酸化剂分别为甲酸钙、苹果酸、乳酸、乙酸、富马酸和丙酸钙，所述的方法包括步骤：(1)、制备系列混合标准液、待检测样品溶液；(2)、在预设色谱条件下，将步骤(1)中的系列混合标准液注入高效液相色谱仪中，进行色谱分析，以保留时间定性，绘制相应酸化剂的标准曲线；(3)、在预设色谱条件下，将待检测样品溶液注入高效液相色谱仪中进样分析，定量计算所述的样品溶液中6种酸化剂的浓度和含量；在所述的预设色谱条件中，色谱柱为反相C18，流动相为pH＝2.4～2.6的0.01mol/L磷酸二氢铵水溶液。

Description

用于同时检测复合酸化剂中6种酸化剂的方法
技术领域
本发明涉及一种分析检测技术领域，尤其涉及高效液相色谱分析检测，具体是指一种用于同时检测复合酸化剂中6种酸化剂的方法。
背景技术
复合酸化剂是将两种或两种以上的单一酸化剂按照一定的比例复合而成，可以是几种酸配合在一起使用，也可以是酸和盐类复配而成。在饲料中添加酸化剂后能够调节消化道内环境，提高消化酶的活性；降低饲料系酸力；调节消化道微生物平衡；参与机体代谢；增强机体免疫力。复合酸化剂产品并不是由单一的酸化剂组成，为更好的酸化性能，几种酸化剂按照合适的比率组成复合酸化剂。因此，如何有效的监控复合酸化剂的主成分和含量，已成为饲料公司、养殖户以及饲料添加剂公司的关注热点。
目前，关于酸化剂的检测方法很多，最常见的有比色法、荧光法、分光光度法、高效液相色谱法、离子交换色谱法、毛细管电泳法、气相色谱法等，但这些检测方法大多是针对单一有机酸，或用气相检测多种有机酸时需要用到特定的FFAP柱子(价格昂贵、适用性不广泛)。因此，当需要检测复合酸化剂中的酸化剂成分时，需要采用各自的前处理技术和分析方法，检测费时、费力，并且消耗资金大。也有采用串联质谱法检测多种有机酸的报道，但这种分析仪器造价高昂，不便于在我国饲料行业普遍推广。相比较高效液相色谱法更适用于实践生产中检测有机酸的含量，简单、快速。
发明内容
本发明的目的是克服了上述现有技术的缺点，提供了一种用于同时检测复合酸化剂中6种酸化剂的方法，该方法使用的是高效液相色谱仪，处理样品方式简单，分析速度快，检测灵敏度高，结果准确可靠，所用设备常见易得，适用于饲料复合酸化剂中甲酸钙、苹果酸、乳酸、乙酸、富马酸、丙酸钙含量的检测。
为了实现上述目的，本发明提供了一种用于同时检测复合乳化剂中3种乳化剂的方法，具体如下：
所述的复合酸化剂中的6种酸化剂分别为甲酸钙、苹果酸、乳酸、乙酸、富马酸和丙酸钙，所述的方法包括步骤：
(1)、制备系列混合标准液、待检测样品溶液；
(2)、在预设色谱条件下，将步骤(1)中的系列混合标准液注入高效液相色谱仪中，进行色谱分析，以保留时间定性，根据各酸化剂所测峰面积的大小与相应浓度的对应关系绘制相应酸化剂的标准曲线；
(3)、在步骤(2)中的预设色谱条件下，将步骤(1)中的待检测样品溶液注入高效液相色谱仪中进样分析，以保留时间定性，根据步骤(2)中所得的各酸化剂的标准曲线，定量计算所述的样品溶液中6种酸化剂的浓度和含量；
在所述的预设色谱条件中，色谱柱为反相C18，流动相为pH＝2.4～2.6的0.01mol/L磷酸二氢铵水溶液。
较佳地，所述的步骤(1)中制备系列混合标准液具体包括步骤：
(1-1)制备混合标准品工作液：分别准确吸取10.00mL5mg/mL的甲酸钙标准储备液、10.00mL20mg/mL的乳酸钙标准储备液、1.00mL1mg/mL的富马酸标准储备液、10.00mL5mg/mL的乙酸标准储备液、10.00mL5mg/mL的苹果酸标准储备液、10.00mL5mg/mL的丙酸钙标准储备液于250mL烧杯中，使用1mol/L磷酸溶液调节pH至2.10～2.30，将溶液转移至100mL容量瓶中，用水定容到刻度，混匀；
(1-2)制备系列混合标准液：分别准确量取1.00ml、2.00ml、3.00ml、5.00ml、10.00ml所述的混合标准品工作液至10ml容量瓶中，用水定容到刻度，混匀，现配现用。
较佳地，所述的步骤(1)中制备待检测样品溶液具体包括：
为响应甲酸钙、苹果酸、乳酸、乙酸、丙酸钙的待检测样品溶液的配制为：称取样品0.5g于250mL的锥形瓶中，加入30～40mL的水，再加入1mL 10mol/L NaOH，将锥形瓶放在95℃的恒温水浴锅中加热30min左右，取出冷却到常温后，测定溶液的pH值；若pH＜12，则再加入1mL 10mol/L NaOH，继续在在95℃的恒温水浴锅中加热，直到测定的pH＞12为止，加热30min后，取出后趁热加入5滴20％硫酸溶液，冷却到常温后，用20％硫酸溶液与10mol/LNaOH溶液调节pH至2.10～2.30；将溶液转移至100mL容量瓶中，定容后摇匀；取部分溶液过0.45μm滤膜后作为样品液，供HPLC测定甲酸钙、苹果酸、乳酸、乙酸、丙酸钙使用；
为响应富马酸的待检测样品溶液的配制为：取响应甲酸钙、苹果酸、乳酸、乙酸、丙酸钙的待检测样品溶液1mL于100mL容量瓶中，用水定容到刻度，摇匀，溶液过0.45μm滤膜后作为样品液，供HPLC测定富马酸使用。
较佳地，所述的方法中的预设色谱条件具体为：
色谱柱：反相C18，规格250mm×4.6mm，5μm；
色谱柱温度：25±1℃；
流速：1ml/min；
进样体积：10μL。
较佳地，所述的方法中使用的检测器为二极管阵列检测器或紫外检测器，紫外检测波长为210nm。
较佳地，所述的步骤(2)中甲酸钙的标准曲线的线性回归方程为：Y＝403.906717X-0.5474427，甲酸钙的保留时间为3.32min；苹果酸的标准曲线的线性回归方程为：Y＝505.203743X-0.2506189，苹果酸的保留时间为11.7min；乳酸的标准曲线的线性回归方程为：Y＝452.066217X+0.1492011，乳酸的保留时间为5.09min；乙酸的标准曲线的线性回归方程为：Y＝335.405006X-0.3251972，乙酸的保留时间为5.47min；富马酸的标准曲线的线性回归方程为：Y＝80768.1959X+0.08965578，富马酸的保留时间为9.12min；丙酸钙的标准曲线的线性回归方程为：Y＝262.623744X+0.0163372，丙酸钙的保留时间为15.04min。
较佳地，所述的步骤(2)中所得到的各酸化剂的标准曲线的线性回归方程相关系数大于0.9999。
本发明的用于同时检测复合酸化剂中6种酸化剂的方法的有益效果在于：
(1)建立了一种用于同时检测复合酸化剂中6种酸化剂的方法，能够对复合酸化剂进行定性和定量，为复合酸化剂成分和含量的准确判定和快速检测提供科学依据。
(2)使用的分析仪器为高效液相色谱仪-紫外检测器，相对于高效液相色谱串联质谱仪、气相色谱串联质谱仪等造价高昂的仪器，更加普及，更利于检测方法的应用。
(3使用反相C18色谱柱与0.01mol/L磷酸二氢铵水溶液(用H3PO4调pH＝2.4～2.6)为流动相，对饲用酸化剂中的6种酸化剂的分离达到了优异的分离效果，同时也减少了检测过程中检测试剂对环境造成的污染，检测人员安全性高。
(4)操作简单，检测结果准确可靠、重复性好，18分钟内即可完成6种酸化剂含量的检测，检测效率高。
附图说明
图1为本发明的检测方法中混合标准液的高效液相色谱图。
图2为本发明的检测方法中待检测样品1的高效液相色谱图。
图3为本发明的检测方法中待检测样品2的高效液相色谱图。
图4为本发明的检测方法中待检测样品3的高效液相色谱图。
图5为本发明的检测方法中待检测溶液1的富马酸稀释后的高效液相色谱图。
具体实施方式
为了能够更清楚地描述本发明的技术内容，下面结合具体实施例来进行进一步的描述。
1、试剂和材料
磷酸二氢铵：分析纯；乙腈：色谱纯；85％磷酸：色谱纯；氢氧化钠：分析纯；98％硫酸：分析纯；甲酸钙标准品：99％；乳酸钙标准品：98％(有效乳酸含量：61.18％)；富马酸标准品：99％；乙酸标准品：99.5％；苹果酸标准品：99％；丙酸钙标准品：98％。
待检测样品1、待检测样品2、待检测样品3分别取自上海某公司的3种饲用复合酸化剂产品。
2、仪器和设备
分析天平：感量0.0001g；pH计；水性微孔滤膜：孔径0.45μm；高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器或紫外检测器；恒温水浴锅。
3、溶液的配制
1mol/L磷酸溶液：在50mL水中加入53.5mL85％磷酸，混匀后，加水定容至1000mL。
10mol/L NaOH：称取40gNaOH于放入烧杯中，加适量的水溶解，冷却后转移到100mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀。
20％硫酸溶液(V/V)：小心的将20ml硫酸加入100ml水内，备用。
甲酸钙标准储备液：称取甲酸钙标准品0.5g(精确至0.0001g)于100mL容量瓶中，用水溶解，定容至刻度，溶液浓度为5mg/mL，4℃条件下藏，保存期3个月。
乳酸钙标准储备液：称取乳酸钙标准品1.0g(精确至0.0001g)于50mL容量瓶中，用水溶解，定容至刻度，溶液浓度为20mg/mL，4℃条件下储藏，保存期3个月。
富马酸标准储备液：称取富马酸标准品0.1g(精确至0.0001g)于100mL容量瓶中，加入30～40mL水，超声30min进行溶解，取出冷却后，用水定容至刻度，溶液浓度为1mg/mL，4℃条件下储藏，保存期3个月。
乙酸标准储备液：称取乙酸标准品0.5g(精确至0.0001g)于100mL容量瓶中，用水溶解，定容至刻度，溶液浓度为5mg/mL，4℃条件下储藏，保存期3个月。
苹果酸标准储备液：称取苹果酸标准品0.5g(精确至0.0001g)于100mL容量瓶中，用水溶解，定容至刻度，溶液浓度为5mg/mL，4℃条件下储藏，保存期3个月。
丙酸钙标准储备液：称取丙酸钙标准品0.5g(精确至0.0001g)于100mL容量瓶中，用水溶解，定容至刻度，溶液浓度为5mg/mL，4℃条件下储藏，保存期3个月。
混合标准品工作液的配制：分别准确吸取10.00mL甲酸钙标准储备液、10.00mL乳酸钙标准储备液、1.00mL富马酸标准储备液、10.00mL乙酸标准储备液、10.00mL苹果酸标准储备液、10.00mL丙酸钙标准储备液于250mL烧杯中，使用1mol/L磷酸溶液调节pH至2.10～2.30，将溶液转移至100mL容量瓶中，用水定容到刻度，混匀，现配现用。
混合标准液的配制：分别准确吸取1.00mL、2.00mL、3.00mL、5.00mL、和10.00mL混合标准品工作液于10mL容量瓶中，用水定容到刻度，混匀，现配现用。
NH4H2PO4溶液：称取磷酸二氢铵1.5g，用500mL水溶解，用1mol/L磷酸溶液调节pH至2.4～2.6，转移至1000mL容量瓶中，定容，摇匀，用0.45μm滤膜过滤后作为流动相使用。
待检测样品溶液的配制：
为响应甲酸钙、苹果酸、乳酸、乙酸、丙酸钙的待检测样品溶液的配制为：称取样品0.5g(精确到0.0001g)于250mL的锥形瓶中，加入30～40mL的水，再加入1mL 10mol/L NaOH，将锥形瓶放在95℃的恒温水浴锅中加热30min左右，取出冷却到常温后，测定溶液的pH值；若pH＜12，则再加入1mL 10mol/L NaOH，继续在在95℃的恒温水浴锅中加热，直到测定的pH＞12为止，加热30min后，取出后趁热加入5滴20％硫酸溶液，冷却到常温后，用20％硫酸溶液与10mol/L NaOH溶液调节pH至2.10～2.30；将溶液转移至100mL容量瓶中，定容后摇匀；取部分溶液过0.45μm滤膜后作为样品液，供HPLC测定甲酸钙、苹果酸、乳酸、乙酸、丙酸钙使用；
为响应富马酸的待检测样品溶液的配制为：取响应甲酸钙、苹果酸、乳酸、乙酸、丙酸钙的待检测样品溶液1mL于100mL容量瓶中，用水定容到刻度，摇匀，溶液过0.45μm滤膜后作为样品液，供HPLC测定富马酸使用。
其中，加入碱液后溶液pH应为强碱性，pH值≥12，水浴时间不得少于0.5h，温度不得低于95℃。
4、预设色谱条件
色谱柱：C18柱，长250mm，内径4.6mm，粒度5μm(极性色谱柱)；
色谱柱温度：25±1℃；
流动相：pH 2.4～2.6的0.01mol/L(NH4H2PO4)
流速：1mL/min；
检测波长：210nm；
色谱柱温度：25±1℃；
进样体积：10μL；
等度洗脱程；
检测方法：外标法。
5、绘制标准曲线
分别取混合标准液，按照预设色谱条件进行色谱分析测定。以各有机酸的峰面积对其所相应的质量浓度进行线性回归，各线性回归方程所对应的曲线即为相应有机酸的标准曲线。
所述的混合标准液的高效液相色谱图如图1所示，在图1所示的色谱图中从左至右分别为甲酸钙、苹果酸、乳酸、乙酸、富马酸、丙酸钙，保留时间依次为3.32min、4.14min、5.09min、5.47min、9.12min、15.04min；所述的6种酸化剂对应的线性回归方程及相关系数r2见表1，方程中Y即为相应酸化剂所对应的峰面积，X即为酸化剂的质量浓度。
表1
Figure BDA0002902523270000061
6、测定待检测样品
在相同的色谱条件下，分别精密量取混合标准液和各待检测样品液，进行色谱分析测定，以混合标准液作多点校准，用色谱峰面积分值定量。
其中的定量计算公式为：
Figure BDA0002902523270000062
式中，X为：待检测样品溶液中甲酸钙、苹果酸、乳酸、乙酸、富马酸、丙酸钙的含量，以质量分数(％)表示；
C为：由标准曲线得出的待检测样品溶液中甲酸钙、苹果酸、乳酸、乙酸、富马酸、丙酸钙的浓度，mg/ml；
V为：待检测样品溶液定容体积，ml；
m为：待检测样品的质量，mg。
样品1、样品2、样品3对应的高效液相色谱图分别见图2、图3、图4，且其中的6种酸化剂检测结果见表2。
表2
Figure BDA0002902523270000071
7、本发明检测方法的验证
(1)重复性
精密量取待检测样品溶液注入液相色谱仪检测，连续检测4次，计算各酸化剂测得含量的相对标准偏差(RSD)，结果见表3。
表3
Figure BDA0002902523270000072
(2)准确度
在空白液中，通过加入不同量的各有机酸原料，配成5个已知样，在相同的色谱操作条件下，定量分析、计算，测得各个酸化剂原料的回收率如表4所示。
表4
Figure BDA0002902523270000073
本发明的用于同时检测复合酸化剂中6种酸化剂的方法的有益效果在于：
(1)建立了一种用于同时检测复合酸化剂中6种酸化剂的方法，能够对复合酸化剂进行定性和定量，为复合酸化剂成分和含量的准确判定和快速检测提供科学依据。
(2)使用的分析仪器为高效液相色谱仪-紫外检测器，相对于高效液相色谱串联质谱仪、气相色谱串联质谱仪等造价高昂的仪器，更加普及，更利于检测方法的应用。
(3)使用反相C18色谱柱与0.01mol/L磷酸二氢铵水溶液(用H3PO4调pH＝2.4～2.6)为流动相，对饲用酸化剂中的6种酸化剂的分离达到了优异的分离效果，同时也减少了检测过程中检测试剂对环境造成的污染，检测人员安全性高。
(4)操作简单，检测结果准确可靠、重复性好，18分钟内即可完成6种酸化剂含量的检测，检测效率高。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (7)

1.一种用于同时检测复合酸化剂中6种酸化剂的方法，所述的复合酸化剂中的6种酸化剂分别为甲酸钙、苹果酸、乳酸、乙酸、富马酸和丙酸钙，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(1)、制备系列混合标准液、待检测样品溶液；
(2)、在预设色谱条件下，将步骤(1)中的系列混合标准液注入高效液相色谱仪中，进行色谱分析，以保留时间定性，根据各酸化剂所测峰面积的大小与相应浓度的对应关系绘制相应酸化剂的标准曲线；
(3)、在步骤(2)中的预设色谱条件下，将步骤(1)中的待检测样品溶液注入高效液相色谱仪中进样分析，以保留时间定性，根据步骤(2)中所得的各酸化剂的标准曲线，定量计算所述的样品溶液中6种酸化剂的浓度和含量；
在所述的预设色谱条件中，色谱柱为反相C18，流动相为pH＝2.4～2.6的0.01mol/L磷酸二氢铵水溶液。
2.根据权利要求1所述的用于同时检测复合酸化剂中6种酸化剂的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中制备系列混合标准液具体包括步骤：
(1-1)制备混合标准品工作液：分别准确吸取10.00mL5mg/mL的甲酸钙标准储备液、10.00mL20mg/mL的乳酸钙标准储备液、1.00mL1mg/mL的富马酸标准储备液、10.00mL5mg/mL的乙酸标准储备液、10.00mL5mg/mL的苹果酸标准储备液、10.00mL5mg/mL的丙酸钙标准储备液于250mL烧杯中，使用1mol/L磷酸溶液调节pH至2.10～2.30，将溶液转移至100mL容量瓶中，用水定容到刻度，混匀；
(1-2)制备系列混合标准液：分别准确量取1.00ml、2.00ml、3.00ml、5.00ml、10.00ml所述的混合标准品工作液至10ml容量瓶中，用水定容到刻度，混匀，现配现用。
3.根据权利要求1所述的用于同时检测复合酸化剂中6种酸化剂的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中制备待检测样品溶液具体包括：
为响应甲酸钙、苹果酸、乳酸、乙酸、丙酸钙的待检测样品溶液的配制为：称取样品0.5g于250mL的锥形瓶中，加入30～40mL的水，再加入1mL 10mol/L NaOH，将锥形瓶放在95℃的恒温水浴锅中加热30min左右，取出冷却到常温后，测定溶液的pH值；若pH＜12，则再加入1mL 10mol/L NaOH，继续在在95℃的恒温水浴锅中加热，直到测定的pH＞12为止，加热30min后，取出后趁热加入5滴20％硫酸溶液，冷却到常温后，用20％硫酸溶液与10mol/LNaOH溶液调节pH至2.10～2.30；将溶液转移至100mL容量瓶中，定容后摇匀；取部分溶液过0.45μm滤膜后作为样品液，供HPLC测定甲酸钙、苹果酸、乳酸、乙酸、丙酸钙使用；
为响应富马酸的待检测样品溶液的配制为：取响应甲酸钙、苹果酸、乳酸、乙酸、丙酸钙的待检测样品溶液1mL于100mL容量瓶中，用水定容到刻度，摇匀，溶液过0.45μm滤膜后作为样品液，供HPLC测定富马酸使用。
4.根据权利要求1所述的用于同时检测复合酸化剂中6种酸化剂的方法，其特征在于，所述的方法中的预设色谱条件具体为：
色谱柱：反相C18，规格250mm×4.6mm，5μm；
色谱柱温度：25±1℃；
流速：1ml/min；
进样体积：10μL。
5.根据权利要求1所述的用于同时检测复合酸化剂中6种酸化剂的方法，其特征在于，所述的方法中使用的检测器为二极管阵列检测器或紫外检测器，紫外检测波长为210nm。
6.根据权利要求1所述的用于同时检测复合酸化剂中6种酸化剂的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中甲酸钙的标准曲线的线性回归方程为：Y＝403.906717X-0.5474427，甲酸钙的保留时间为3.32min；苹果酸的标准曲线的线性回归方程为：Y＝505.203743X-0.2506189，苹果酸的保留时间为11.7min；乳酸的标准曲线的线性回归方程为：Y＝452.066217X+0.1492011，乳酸的保留时间为5.09min；乙酸的标准曲线的线性回归方程为：Y＝335.405006X-0.3251972，乙酸的保留时间为5.47min；富马酸的标准曲线的线性回归方程为：Y＝80768.1959X+0.08965578，富马酸的保留时间为9.12min；丙酸钙的标准曲线的线性回归方程为：Y＝262.623744X+0.0163372，丙酸钙的保留时间为15.04min。
7.根据权利要求1或8所述的用于同时检测复合酸化剂中6种酸化剂的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中所得到的各酸化剂的标准曲线的线性回归方程相关系数大于0.9999。
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