CN115902009A

CN115902009A - 细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法

Info

Publication number: CN115902009A
Application number: CN202211428671.9A
Authority: CN
Inventors: 请求不公布姓名
Original assignee: Shenzhen Vitavitro Biotech Co ltd
Current assignee: Shenzhen Vitavitro Biotech Co ltd
Priority date: 2022-11-15
Filing date: 2022-11-15
Publication date: 2023-04-04

Abstract

本申请涉及细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，包括如下的步骤：配制硫酸溶液作为流动相；取葡萄糖对照品用超纯水定容至适宜的浓度后以作为对照品储备液，取适宜体积的对照品储备液进行梯度浓度稀释，得到多个不同浓度的线性测试液；取细胞培养液适量且经微孔滤膜过滤作为供试品溶液；将各个线性测试液、及供试品溶液分别在相同色谱条件下引入高效液相色谱仪，得到各个线性测试液的色谱图及供试品溶液的色谱图；采用外标法将各个线性测试液的浓度与各个线性测试液的色谱图的峰面积绘制成标准工作曲线，得到线性公式，将得到的供试品溶液的色谱图的峰面积代入公式，即可计算出供试品溶液中葡萄糖的浓度。

Description

细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法

技术领域

本申请属于葡萄糖含量检测技术领域，涉及一种细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，该方法还适用于无机化合物、有机化合物及有机高分子化合物、于药物化合物技术领域的葡萄糖含量测定。

背景技术

葡萄糖是细胞的能量来源，是新陈代谢的中间产物，是生物体的主要能量来源。特定细胞如胚胎细胞发育营养早期，葡萄糖是进入细胞的作用，是可以提供最基本的能量来源。

现有技术提供的细胞培养液多作为商品化试剂，按相应法规的要求在其出厂前需要对该细胞培养液的主要组分包括葡萄糖进行含量测定，以保证其实际使用过程的安全性和有效性。

生殖用细胞培养液中成份多而复杂，且各种组分多以微量存在。而食品、生物、医药等行业中，针对葡萄糖的含量测定方法也多种多样，其中就有标准GB5009.8-2016《食品安全国家标准食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》，该标准提供了液相色谱法对葡萄糖进行定量的分析，该方法与行业的其他类型葡萄糖检测方法大同小异，均以乙腈-水为流动相，采用氨基色谱柱进行分离，通过示差检测器(RID)采集信号进行分析。但其缺点是基线噪音大，平衡久，检出限过高(大多高于2mg/ml)，不适合微量成份＜2mg/ml的检验。因此，急需开发一个易于平衡且适合于微量成份检验的液相色谱法以测定细胞培养液中的葡萄糖含量。

发明内容

本申请的目的是提供一种细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，采用高效液相色谱法进行测定，流动相为水系状态，系统易于平衡，基线稳定噪声小，定量浓度低，具有良好的稳定性、可靠性及准确度，且操作简便。

为实现上述目的，本申请采用的技术方案是：

本申请的技术方案是一种细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，包括如下的步骤：

配制硫酸溶液作为高效液相色谱仪的流动相；

取适宜数量的葡萄糖对照品，用超纯水定容至适宜的浓度后以作为对照品储备液，取适宜体积的对照品储备液进行梯度浓度稀释，得到多个不同浓度的线性测试液；

取细胞培养液适量且经微孔滤膜过滤作为供试品溶液；

将各个线性测试液、及供试品溶液分别在相同色谱条件下引入高效液相色谱仪，得到各个线性测试液的色谱图及供试品溶液的色谱图；

采用外标法将各个线性测试液的浓度与各个线性测试液的色谱图的峰面积绘制成标准工作曲线，得到线性公式(1)：

Y_标＝a X_标+b (1)

其中，Y_标为线性测试液的色谱图的峰面积，X_标为线性测试液的浓度，a为斜率，b为截距；

将得到的供试品溶液的色谱图的峰面积代入上述公式(1)的Y_标，即可计算出供试品溶液中葡萄糖的浓度。

本技术方案的有益效果是，硫酸溶液可有效分离到葡萄糖，配制方法简单可行，易于操作；采用数量级浓度关系来标定、分析检测结果，具有高精确度和高可行度；葡萄糖为单糖，是一种多羟基醛，在硫酸溶液中，具有很好的洗脱和保留能力，通过有机酸分析专用柱可获得很好分离效果；方法的抗干扰能力强，分别往流动相中加入5％乙腈和1％异丙醇进行试验，葡萄糖的色谱峰依旧具有良好的对称性和分离度。

在该技术方案的实施方式中，所述色谱条件为使用流动相在20℃-40℃下洗脱40min-60min，设置流动相的流速为0.1-0.6mL/min，梯度洗脱，在示差检测器30-35℃条件下测定，记录色谱图。

经试验确认后提供较佳的色谱条件，能够最大限度分离到葡萄糖，具有高回收率、高纯度的优势。

在该技术方案的实施方式中，优选的色谱条件为通过自动进样器引入10μL到高效液相色谱仪，通过色谱柱分离后，使用流动相在35℃下洗脱60min，设置流动相的流速为0.6mL/min，梯度洗脱，在示差检测器35℃条件下测定，记录色谱图。

在该技术方案的实施方式中，所述色谱柱采用型号为Aminex HPX-87H的有机酸和和醇分析柱，其固定相为磺化聚苯乙烯二乙烯苯树脂，树脂离子型为氢型，有机酸和醇分析专用柱可获得很好分离效果。

在该技术方案的实施方式中，“将各个线性测试液、及供试品溶液分别在相同色谱条件下引入高效液相色谱仪”具体是包括：

将各个线性测试液按照浓度从低至高依次在相同色谱条件下引入高效液相色谱仪一次；

将供试品溶液在相同色谱条件下重复引入高效液相色谱仪至少一次。可以是多次，可取多次的平均值，优选为两次，

在该技术方案的实施方式中，所述葡萄糖对照品的纯度级别为色谱级。

在该技术方案的实施方式中，所述照品储备液的浓度为5.0mg/mL，线性测试液的数量为五个，各个线性测试液的梯度浓度依次为0.025mg/mL，0.05mg/mL，0.1mg/mL，0.5mg/mL和1mg/mL。

在该技术方案的实施方式中，所述照品储备液的浓度为5.0mg/mL，线性测试液的数量为五个，各个线性测试液的梯度浓度依次为0.25mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL，2.5mg/mL和5mg/mL。

在该技术方案的实施方式中，流动相的配制为：精密量取硫酸至烧杯中，加入超纯水，玻璃棒搅拌均匀，再用0.45μm的水系滤膜过滤，超声波振动15min，配制浓度为0.002-0.005mol/L的硫酸溶液。硫酸溶液配制量可根据实际实际情况按比例配制。

在该技术方案的实施方式中，所述细胞培养液经0.22μm微孔滤膜过滤后即得供试品溶液。

本技术方案的测定方法以0.002-0.005mol/L硫酸溶液为流动相，采用AminexHPX-87H色谱柱分离，通过示差检测器(RID)采集信号进行分析，流动相为水系状态，系统易于平衡，基线稳定、噪声小，方法最低定量浓度为0.025mg/ml，方法具有良好的稳定性、可靠性及准确度，且操作简便。

附图说明

通过结合附图对本申请示例性实施方式进行更详细的描述，本申请的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显，其中，在本申请示例性实施方式中，相同的参考标号通常代表相同部件。

图1是本申请实施例1中的葡萄糖含量的标准工作曲线。

具体实施方式

下面将结合本申请一些实施例中的附图，对本申请一些实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

实施例1

本实施例是提供一种细胞培养液中葡萄糖的测定方法，方法包括：

1、流动相的配制

配制具体过程是：：精密量取(移取)0.27mL的硫酸至1000mL烧杯中，加入1000mL的超纯水，玻璃棒搅拌均匀，再用0.45μm的水系滤膜过滤，超声15min即得0.0035mol/L硫酸溶液(即，5mM硫酸溶液)，硫酸溶液的配制量可根据实际实际情况按比例或需求配制。

2、对照品储备液与线性测试液的配制

配制的具体过程为：取适宜数量的葡萄糖对照品，葡萄糖对照品的纯度级别为色谱级，加于10mL的容量瓶中，用超纯水定容至浓度为5.0mg/mL后，作为对照品储备液。

再取适宜体积的对照品储备液，按照表1所示的各个线性测试液的葡萄糖的梯度浓度采用超纯水进行稀释，所得实际的各个的线性测试液的葡萄糖的实际浓度如表1所示，备用。

本实施例中采用的葡萄糖对照品来源于中国食品药品检定研究院，

表1线性测试液的梯度浓度与实际的浓度

溶液名称	梯度浓度(mg/ml)	实际浓度(mg/mL)
			线性测试液1	0.025	0.0254
线性测试液2	0.05	0.0508
			线性测试液3	0.1	0.1016
线性测试液4	0.5	0.5080
			线性测试液5	1.0	1.0160

3、供试品溶液的配制

取1mL细胞培养液，经0.22μm微孔滤膜过滤后即得供试品溶液，备用。

4、高效液相色谱法进行测定

测定过程以前述配制的0.0035mol/L的硫酸溶液为流动相，采用Aminex HPX-87H色谱柱分离，通过示差检测器(RID)采集信号进行分析。具体为：

(1)将表1所示的线性测试液分别上机进样两次，具体为：

取线性测试液1，通过自动进样器引入10μL到高效液相色谱仪，通过色谱柱分离后，使用流动相在35℃下洗脱60min，洗脱时设置流动相流速为0.6mL/min，梯度洗脱，在示差检测器35℃条件下测定，记录线性测试液1的色谱图；

结束后同样分别取线性测试液2至线性测试液5，进行上机测定，分别记录线性测试液2至记录线性测试液5的色谱图。

(2)将供试品溶液重复上机进样两次。

取供试品溶液通过自动进样器引入10μL到高效液相色谱仪，通过色谱柱分离后，使用流动相在35℃下洗脱60min，洗脱时设置流动相流速为0.6mL/min，梯度洗脱，在示差检测器35℃条件下测定，同样记录两次供试品溶液的色谱图。

5、分析方法与计算

(1)绘制标准工作曲线

记录一次上机测试的线性测试液的葡萄糖的实际浓度与对应色谱图的峰面积，结果如表2所示。将相关数据用统计工具进行处理，绘制标准工作曲线并得到标准工作曲线的线性公式，标准工作曲线参考附图1中所示。

表2一次测试的线性测试液浓度与对应峰面积

溶液名称	实际浓度(mg/mL)	色谱图的峰面积
			线性测试液1	0.0254	6356.8
线性测试液2	0.0508	10137.7
			线性测试液3	0.1016	22617.6
线性测试液4	0.5080	122505.6
			线性测试液5	1.0160	246052.1

(2)线性评价：

本实施例得到的葡萄糖峰面积与浓度的线性公式为：

y＝243488x-1339.4 (2)

其中，y为色谱图的峰面积；x为浓度；斜率a为243488；截距b为1339.4。

依据GB/T 27417-2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》、《中华人民共和国药典》2020版第四部“9101分析方法验证指导原则”的要求，要求线性方程的相关系数R2应≥0.99。

相关系数R²＝0.9999，表明本实施例的线性测试液的配制浓度与线性测试液所得色谱图的峰面积呈现良好的线性关系，符合相关标准的要求。

(3)计算本次实施例供试品溶液的葡萄糖浓度

本实施例得到的供试品葡萄糖色谱图峰面积为133885.5、，代入线性公式(2)中可得葡萄糖浓度为，葡萄糖浓度为0.5554mg/mL、，葡萄糖平均值为0.5554mg/mL，即为细胞培养液中的葡萄糖浓度

实施例2

本实施例与实施例1的不同之处在于对测定后的葡萄糖浓度开展了精密度和准确度(回收率)研究试验，从而证实本申请技术方案的测定方法可对葡萄糖含量进行精准测量，测定过程不造成浪费。

1、专属性试验

(1)试验步骤

取空白溶液(即，超纯水)，经0.22μm微孔滤膜过滤即得。

取0.5080mg/ml葡萄糖溶液(即，线性测试液4)，作为定位溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤即得。

称取适量原液的细胞培养液作为供试品溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤即得。

取上述各溶液，分别采用与实施例1中相同的色谱条件进行进样，记录葡萄糖色谱图中峰的保留时间、峰面积、分离度。

(2)结果统计

上述各溶液的葡萄糖色谱图中峰的保留时间、峰面积、分离度如表3中所示。

表3葡萄糖的专属性

名称	空白溶液	葡萄糖定位溶液	供试品
				保留时间	/	25.865	25.824
峰面积	/	123424.6	114527.4
				分离度	/	＞1.5	10.1

(3)结果分析

根据GB/T 27417-2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》、《中华人民共和国药典》2020版第四部“9101分析方法验证指导原则”，要求葡萄糖色谱峰的分离度应≥1.5。

本实施例中，细胞培养液供试品中葡萄糖的保留时间与定位溶液、对照品溶液相一致，说明供试品中葡萄糖能被有效的鉴别；且葡萄糖色谱峰的分离度为10.1，符合相关标准要求，表明本专利提供的测定方法有较好的专属性，并能有效的鉴别和分离葡萄糖。

2、精密度试验

(1)试验步骤：

称取适量原液的细胞培养液作为供试品溶液，平均分成1mL共6份，经0.22μm微孔滤膜过滤即得。

根据实施例1提供的含量测定方法测定6份供试品溶液的葡萄糖的含量，计算其相对标准偏差(RSD，％)。

(2)结果统计：

本实施例2一次精密度试验RSD统计结果见表4中所示。

表4一次精密度试验RSD统计结果

(3)结果分析

根据GB/T 27417-2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》、《中华人民共和国药典》2020版第四部“9101分析方法验证指导原则”，要求相关系数RSD≤2.0％。

本实施例中细胞培养液中葡萄糖的精密度重复性RSD为0.91％，符合相关标准要求，表明本申请技术方案提供的葡萄糖含量的测定方法有较好的精密度，测定结果误差小。

3、准确度试验(回收率)

(1)试验步骤

测试液的配制：取经含量测定的细胞培养液作为供试品溶液，平均分成1mL共6份，进行编号分组；各组依次加入实施例1中不同体积的线性测试液4(葡萄糖浓度为0.5080mg/mL)；其中第一组加入0.8mL，第二组加入1mL，第三组加入1.2mL。

根据实施例1提供的含量测定方法测定上述测试液中葡萄糖的含量(葡萄糖浓度0.5554mg/mL)，计算其回收率。详细分组情况见表4中所示。

(2)结果统计：

本实施例一次回收率试验统计结果见表5中所示。

表5一次回收率试验统计结果

上表的葡萄糖回收率计算公式为：

其中，量的单位为mg；

示例性地，如分组编号1-1，(0.5369*1.8-0.5554*1)/(0.8*0.5080)*100％＝101.14％

(3)结果分析

根据GB/T 27417-2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》、《中华人民共和国药典》2020版第四部“9101分析方法验证指导原则，葡萄糖要求回收率为90％～108％。

本实施例中葡萄糖的平均回收率为101.07％，符合相关标准要求，表明本申请技术方案提供的测定方法具有良好的准确度，测定过程中不造成葡萄糖损失。

Claims

1.细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，其特征在于，包括如下的步骤：

配制硫酸溶液作为高效液相色谱仪的流动相；

取葡萄糖对照品用超纯水定容至适宜的浓度后以作为对照品储备液，取适宜体积的对照品储备液进行梯度浓度稀释，得到多个不同浓度的线性测试液；

取细胞培养液适量且经微孔滤膜过滤作为供试品溶液；

采用外标法将各个线性测试液的浓度与各个线性测试液的色谱图的峰面积绘制成标准工作曲线，得到葡萄糖的峰面积与浓度线性公式；

将得到的供试品溶液的色谱图的峰面积代入线性公式中，即可计算出供试品溶液中葡萄糖的浓度。

2.根据权利要求1所述的细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，其特征在于，所述色谱条件为使用流动相在20℃-40℃下洗脱40min-60min，设置流动相的流速为0.1-0.6mL/min，梯度洗脱，在示差检测器30-35℃条件下测定，记录色谱图。

3.根据权利要求2所述的细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，其特征在于，优选的色谱条件为通过自动进样器引入10μL到高效液相色谱仪，通过色谱柱分离后，使用流动相在35℃下洗脱60min，设置流动相的流速为0.6mL/min，梯度洗脱，在示差检测器35℃条件下测定，记录色谱图。

4.根据权利要求3所述的细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，其特征在于，所述色谱柱采用型号为Aminex HPX-87H的有机酸和和醇分析柱。

5.根据权利要求1所述的细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，其特征在于，“将各个线性测试液、及供试品溶液分别在相同色谱条件下引入高效液相色谱仪”具体是包括：

将供试品溶液在相同色谱条件下重复引入高效液相色谱仪至少一次。

6.根据权利要求1所述的细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，其特征在于，所述葡萄糖对照品的纯度级别为色谱级。

7.根据权利要求1所述的细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，其特征在于，所述照品储备液的浓度为5.0mg/mL，线性测试液的数量为五个，各个线性测试液的梯度浓度依次为0.025mg/mL，0.05mg/mL，0.1mg/mL，0.5mg/mL和1mg/mL。

8.根据权利要求1所述的细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，其特征在于，所述照品储备液的浓度为5.0mg/mL，线性测试液的数量为五个，各个线性测试液的梯度浓度依次为0.25mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL，2.5mg/mL和5mg/mL。

9.根据权利要求1所述的细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，其特征在于，流动相的配制为：精密量取硫酸至烧杯中，加入超纯水，玻璃棒搅拌均匀，再用0.45μm的水系滤膜过滤，超声波振动15min，配制浓度为0.002-0.005mol/L的硫酸溶液。

10.根据权利要求1所述的细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，其特征在于：所述细胞培养液经0.22μm微孔滤膜过滤后即得供试品溶液。