CN105987961A - 一种母乳中左乙拉西坦的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种母乳中左乙拉西坦的检测方法，包括以下步骤：(1)供试品制备：取供试母乳，加入供试母乳5倍体积的乙酸乙酯混匀，离心，取乙酸乙酯层，吹干，复溶，作为供试品；(2)检测：取步骤(1)的供试品用高效液相色谱进行检测，检测条件为：固定相：C18色谱柱；流动相：甲醇-无机盐溶液，二者的体积比为17:83，所述无机盐溶液的pH为4.5；检测波长：210nm。本发明方法可以准确检测母乳中左乙拉西坦，并且检测方法快速简便，专属性强，灵敏度高，稳定性好，可用于临床检测母乳中左乙拉西坦的浓度，为服用左乙拉西坦的哺乳期妇女喂母乳提供指导。
Description
技术领域
本发明属于生物药物分析领域，具体涉及一种母乳中左乙拉西坦的检测方法。
背景技术
左乙拉西坦(levetiracetam，LEV，商品名KePPra)是新一代抗癫痫药物，属吡咯烷酮衍生物。吡咯烷酮类促智药属于五元杂环内酞胺类促智药，可视为γ-氨基丁酸(GABA)的衍生物，对参与神经保护和记忆过程的受体具有特殊作用，是目前最引人注目的一类促智药，具有广谱、起效迅速的抗癫痫活性，药物代谢动力学特性较理想、耐受性和安全性好，特别适用于成人和儿童的难治性部分性发作的辅助治疗。左乙拉西坦的结构与作用机制均与其他抗癫痫药物不同，它的药代动力学与给药剂量呈线性关系，生物利用度能达到100％，不具备肝药酶诱导效应，大约91％的剂量能通过肾脏排泄；而且可以通过监控血浆中LEV的浓度来优化治疗效果，特别对于有肾损伤的病人或者小孩具有良好的效果，且不良反应小，LEV于2000年经FDA获准在美国上市，2007年3月10日在中国上市(商品名开浦兰)。
由于上述优点，该药物成了全世界妊娠期女性常用的抗癫痫药物。然而，因哺乳期妇女服用左乙拉西坦以后，母乳中是否含有左乙拉西坦以及含有的左乙拉西坦浓度均不清楚，导致很多服用左乙拉西坦的癫痫女性不敢给孩子喂母乳，最后只能直接选择奶粉喂养，增加了癫痫患者家庭的经济负担，最重要的是奶粉不含母乳所含的所有免疫成分，而且奶粉喂养也不能替代母乳喂养在培养亲子感情方面的重要作用。因此，有效检测母乳中的左乙拉西坦具有重要意义。
但是，目前尚没有关于检测母乳中左乙拉西坦方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种母乳中左乙拉西坦的检测方法。
本发明提供了一种母乳中左乙拉西坦的检测方法：它是采用高效液相色谱法进行检测，包括以下步骤：(1)供试品制备：取供试母乳，加入供试母乳5倍体积的乙酸乙酯混匀，离心，取乙酸乙酯层，吹干，复溶，作为供试品；(2)检测：取步骤(1)的供试品用高效液相色谱进行检测，检测条件为：固定相：C18色谱柱；流动相：甲醇-无机盐溶液，二者的体积比为17:83，所述无机盐溶液的pH为4.5；检测波长：210nm。
进一步优选地，所述检测方法是定量检测方法，步骤如下：a、供试品制备：取供试母乳，加入1/9倍体积的对乙酰氨基酚标准品溶液，混匀，得内标供试母乳，再加入内标供试母乳5倍体积的乙酸乙酯混匀，离心，取乙酸乙酯层，吹干，复溶，作为供试品；b、标准品制备：取空白母乳，加入1/8倍体积的左乙拉西坦标准品溶液和1/8倍体积的对乙酰氨基酚标准品溶液，混匀，得标样母乳，再加入标样母乳5倍体积的乙酸乙酯，混匀，离心，取乙酸乙酯层，吹干，复溶，作为标准品；c、检测：取步骤a的供试品和步骤b的标准品，用高效液相色谱进行检测，检测条件为：固定相：C18色谱柱；流动相：甲醇-无机盐溶液，二者的体积比为17:83，所述无机盐的溶液的pH为4.5；检测波长：210nm；d、绘制标准曲线，计算供试品中左乙拉西坦的含量。
进一步优选地，步骤a或步骤b中，对乙酰氨基酚标准品溶液的浓度为10μg/mL。
母乳：是产后女性乳房产生的用作哺育婴儿的汁液。
空白母乳：是指来自于未服用左乙拉西坦妇女的母乳。
进一步优选地，步骤(1)、步骤a或步骤b中，离心的转速是4000r/min，离心的时间为10min。
进一步优选地，步骤(1)、步骤a或步骤b中，吹干是在50℃条件下用氮气吹干。
进一步优选地，步骤(1)、步骤a或步骤b中，复溶是采用步骤(2)中的流动相复溶。
进一步优选地，步骤(2)或步骤c中，所述C18色谱柱的规格为150mm×4.6mm，填料粒径为5μm。
进一步优选地，步骤(2)或步骤c中，所述流动相中，无机盐溶液是浓度为0.01mol/L的磷酸二氢钾溶液。
进一步优选地，步骤(2)或步骤c中，流动相的流速1.0mL/min。
进一步优选地，步骤(2)或步骤c中，检测的柱温为30℃。
高效液相色谱是检测领域常用的检测方法，但是由于母乳本身的成分复杂，干扰杂质多，会干扰左乙拉西坦的测定，而且左乙拉西坦在母乳中的代谢产物也会干扰左乙拉西坦的测定，另外，由于母乳中左乙拉西坦的浓度低，不易富集，检测难度大。
本发明通过特定的前处理方法与特定高效液相色谱检测条件的结合，达到了准确检测母乳中左乙拉西坦的目的，并且，本发明方法快速简便，专属性强，灵敏度高，稳定性好，可用于临床检测母乳中左乙拉西坦的浓度，为服用左乙拉西坦的哺乳期妇女喂母乳提供指导。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明试验例1空白母乳的高效液相色谱图。
图2为本发明试验例1标样母乳的高效液相色谱图。
图3为本发明试验例1供试母乳的高效液相色谱图。
图4为按本发明试验例2方法所得的标准曲线图。
图5为本发明试验例5拉莫三嗪的高效液相色谱图。
图6为本发明试验例5奥卡西平的高效液相色谱图。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。具体如下：实验材料：左乙拉西坦标准品：12-YM-175-1,TorontoResearch Chemicals Inc；甲醇：分析纯(20120921)，成都市科龙化工试剂厂；磷酸二氢钾：分析纯(20091010)，成都市科龙化工试剂厂；乙酸乙酯：分析纯(20120414)，成都市科龙化工试剂厂。主要实验仪器：高效液相色谱仪：LC-20AB，日本岛津公司；紫外扫描仪：UV-VIS282PC，Unico仪器有限公司。供试母乳来自服用了左乙拉西坦妇女的母乳。
实施例1本发明定量检测方法
(1)供试品的制备：取供试母乳180μL，置于1.5mL离心管中，加入浓度为10μg/mL的对乙酰氨基酚标准液20μL，旋涡混合20s，作为内标供试母乳。向上述内标供试母乳中加入1mL乙酸乙酯，旋涡混合20s，4000r/min离心10min，吸取上层乙酸乙酯层于1.5mL离心管中，在50℃水浴下用氮气吹干，加入100μL流动相后旋涡混合20s，作为供试品。
(2)标准品的制备：取空白母乳160μL，置于1.5mL离心管中，加入浓度为10μg/mL的对乙酰氨基酚标准液20μL，再分别加入浓度为10，20，40，100，200和400μg/mL左乙拉西坦标准品溶液20μL，旋涡混合20s，使左乙拉西坦浓度分别为1，2，4，10，20，40μg/mL，作为标样母乳。向该标样母乳中加入1mL乙酸乙酯，旋涡混合20s，4000r/min离心10min，吸取上层乙酸乙酯层于1.5mL离心管中，在50℃水浴下用氮气吹干，加入100μL流动相后旋涡混合20s，作为标准品。
(3)分别取供试品和标准品进行检测，进样量为20μL，色谱条件如下：色谱柱为Diamonsil C18(5μm 150mm×4.6mm)，流动相为甲醇-磷酸二氢钾(0.01mol/L，pH4.5)(17:83)，等度洗脱；柱温为30℃；流速为1mL/min；检测波长为210nm。
(4)制作标准曲线：X轴为左乙拉西坦和对乙酰氨基酚的峰面积比，Y轴为左乙拉西坦和对乙酰氨基酚的浓度比；根据标准曲线，计算供试母乳中左乙拉西坦的含量。
实施例2本发明定性检测方法
(1)供试品的制备：取供试母乳200μL，置于1.5mL离心管中，加入1mL乙酸乙酯，旋涡混合20s，4000r/min离心10min，吸取上层乙酸乙酯层于1.5mL离心管中，在50℃水浴下用氮气吹干，加入100μL流动相后旋涡混合20s，作为供试品。
(2)取供试品进行检测，进样量为20μL，色谱条件如下：色谱柱为Diamonsil C18(5μm 150mm×4.6mm)，流动相为甲醇-磷酸二氢钾(0.01mol/L，pH4.5)(17:83)，等度洗脱；柱温为30℃；流速为1mL/min；检测波长为210nm。
为进一步说明本发明方法的有益效果，本发明提供以下试验例。
试验例1系统适用性和专属性实验
取空白母乳、加入了内标物对乙酰氨基酚和左乙拉西坦(浓度10μg/mL)标准品的标样母乳和加入内标物对乙酰氨基酚的内标供试母乳，按实施例1的方法测定，所得色谱图分别如图1、图2、图3所示。可以看出，内标物对乙酰氨基酚和左乙拉西坦的出峰时间分别为8.612min、11.844min，对乙酰氨基酚和左乙拉西坦完全分离，且无内源性杂质干扰，证明本发明的方法分离度好，无内源性杂质干扰，且出峰时间短，检测效率高。
试验例2标准曲线的绘制
对实施例1标样母乳的高效液相色谱测定结果如表1所示，以左乙拉西坦和对乙酰氨基酚的浓度比Y对左乙拉西坦和对乙酰氨基酚的峰面积比X线性回归，得左乙拉西坦的标准曲线方程Y＝6.856832X+0.4314762(R＝0.9995，n＝2)，标准曲线图见图4。证明按照本发明的方法，母乳中左乙拉西坦的检出限可达1.0μg/mL，灵敏度高，且在1.0～40.0μg/mL浓度范围内线性关系良好，准确度好。表中LEV表示左乙拉西坦，ALEV和AISTD分别表示左乙拉西坦和对乙酰氨基酚的峰面积，ALEV/AISTD表示同一色谱图中左乙拉西坦和对乙酰氨基酚的峰面积比。
表1
试验例3精密度实验
按照实施例1中步骤(2)的方法制备左乙拉西坦浓度分别为1.0，10.0，40.0μg/mL的标样母乳各5份，分别作为低、中、高三种浓度的标样母乳。按照实施例1中的方法，在同一天内和同一周内分别对上述5份低、中、高三种浓度的标样母乳进行测定并计算其日内精密度值和日间精密度值。上述低、中、高三种浓度的标样母乳日内RSD(n＝5)分别为3.51％、3.13％、5.15％；日间RSD(n＝5)分别为4.40％、6.99％、6.33％，说明本发明的方法精密度好。
试验例4回收率实验
按照实施例1中步骤(2)的方法制备左乙拉西坦浓度分别为1.0，10.0，40.0μg/mL的标样母乳各5份，分别作为低、中、高三种浓度的标样母乳。按照实施例1中的方法，测定浓度与实际配置浓度之比计算回收率。上述低、中、高三种浓度的标样母乳平均回收率分别为103.20％、80.61％、92.58％，其RSD(n＝5)分别为5.36％、2.73％、3.74％，平均回收率均大于80％，说明本发明的方法准确度好。
试验例5抗干扰性实验
左乙拉西坦临床常与抗癫痫药物拉莫三嗪、奥卡西平联合使用，因此有必要进行左乙拉西坦的抗干扰性实验。分别取空白母乳180μL，置于1.5mL离心管中，分别加入10μg/mL的拉莫三嗪20μL和10μg/mL的奥卡西平20μL作为供试母乳样品。向上述母乳中加入1mL乙酸乙酯，旋涡混合20s，4000r/min离心10min，吸取上层乙酸乙酯层850μL于1.5mL离心管中，在50℃水浴下用氮气吹干，加入100μL流动相后旋涡混合20s，按照实施例1中步骤(3)的方法测定。可以看出，拉莫三嗪和奥卡西平在本发明方法的检测条件下无吸收，说明本发明方法在临床上的抗干扰性强。
综上所述，本发明检测方法快速简便，专属性强，灵敏度高，精密度好，准确性高，稳定性好，抗干扰性强，适用于临床应用。
Claims (10)
1.一种母乳中左乙拉西坦的检测方法，其特征在于：它是采用高效液相色谱法进行检测，包括以下步骤：
(1)供试品制备：取供试母乳，加入供试母乳5倍体积的乙酸乙酯混匀，离心，取乙酸乙酯层，吹干，复溶，作为供试品；
(2)检测：取步骤(1)的供试品用高效液相色谱进行检测，检测条件为：固定相：C18色谱柱；流动相：甲醇-无机盐溶液，二者的体积比为17:83，所述无机盐溶液的pH为4.5；检测波长：210nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测方法是定量检测方法，步骤如下：
a、供试品制备：取供试母乳，加入1/9倍体积的对乙酰氨基酚标准品溶液，混匀，得内标供试母乳，再加入内标供试母乳5倍体积的乙酸乙酯混匀，离心，取乙酸乙酯层，吹干，复溶，作为供试品；
b、标准品制备：取空白母乳，加入1/8倍体积的左乙拉西坦标准品溶液和1/8倍体积的对乙酰氨基酚标准品溶液，混匀，得标样母乳，再加入标样母乳5倍体积的乙酸乙酯，混匀，离心，取乙酸乙酯层，吹干，复溶，作为标准品；
c、检测：取步骤a的供试品和步骤b的标准品，用高效液相色谱进行检测，检测条件为：固定相：C18色谱柱；流动相：甲醇-无机盐溶液，二者的体积比为17:83，所述无机盐的溶液的pH为4.5；检测波长：210nm；
d、绘制标准曲线，计算供试母乳中左乙拉西坦的含量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤a或步骤b中，对乙酰氨基酚标准品溶液的浓度为10μg/mL。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(1)、步骤a或步骤b中，离心的转速是4000r/min，离心的时间为10min。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(1)、步骤a或步骤b中，吹干是在50℃条件下用氮气吹干。
6.根据1或2所述的方法，其特征在于：步骤(1)、步骤a或步骤b中，复溶是采用步骤(2)中的流动相复溶。
7.根据1或2所述的方法，其特征在于：步骤(2)或步骤c中，所述C18色谱柱的规格为150mm×4.6mm，填料粒径为5μm。
8.根据1或2所述的方法，其特征在于：步骤(2)或步骤c中，所述流动相中，无机盐溶液是浓度为0.01mol/L的磷酸二氢钾溶液。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(2)或步骤c中，流动相的流速1.0mL/min。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(2)或步骤c中，检测的柱温为30℃。
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