CN102980967B

CN102980967B - 一种检测水溶性维生素的方法

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Publication number: CN102980967B
Application number: CN201210584541.4A
Authority: CN
Inventors: 梁玉树; 王虎; 何芸芸
Original assignee: Sichuan New Hope Animal Husbandry Technology Co Ltd; NEW HOPE DAIRY HOLDINGS CO Ltd
Current assignee: New hope dairy Limited by Share Ltd; Sichuan New Hope Animal Husbandry Technology Co., Ltd.
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2032-12-28
Also published as: CN102980967A

Abstract

本发明公开了一种测定水溶性维生素的方法，步骤包括：（1）制备维生素标准溶液，利用高效液相色谱仪对其检测，得保留时间并生成标准曲线；（2）取样品预处理得到溶液样品，利用所述高效液相色谱仪在与步骤（1）相同的条件下对其进行检测，得到样品保留时间和峰面积；（3）将步骤（2）中获得的保留时间和峰面积与步骤（1）中得到的保留时间及所述标准曲线进行比对，通过计算确定维生素含量。步骤（2）中预处理步骤包括：超声提取，将提取液于沸水中煮沸20-30min，冷却至室温，定容，摇匀；静置，取上清液过滤。采用本发明方法避免重复制样的繁琐过程，一次性完成四种维生素的测试，检测速度提高，且检测结果准确。

Description

一种检测水溶性维生素的方法

技术领域

本发明涉及一种维生素的检测方法，尤其是关于动物饲料中水溶性维生素的检测方法，属于化学成份的检测技术领域。

背景技术

水溶性维生素是指能在水中溶解的维生素，主要包括维生素B₁、维生素B₂、维生素B₆、烟酰胺和维生素C等。其中，维生素B₁又称硫胺素，参与动物体内糖类代谢，维持神经、消化和循环系统的正常功能。维生素B₂又称核黄素，在生物氧化的呼吸链中起递氢作用，参与动物体内多种物质代谢和能量代谢。维生素B₆参与氨基酸、糖原代谢和激素的合成，能促进消化、吸收，增强免疫力。烟酰胺是辅酶I和辅酶II的组成部分，是动物体内合成多种脱氢酶的辅酶的重要原料。

上述水溶性维生素对生命活动具有重要作用。维生素通常是从食物中摄取的，人工饲养的动物食物源固定，维生素的摄取途径单一。控制好饲料中的维生素添加量就成了防止家畜缺乏维生素的主要手段。

现有饲料工业检测水溶性维生素B₁、B₂、B₆和烟酰胺的方法，是先将样品分别预处理后，再分别按照以下标准进行检测：标准GB/T14700-2002《饲料中维生素B₁的测定》、GB/T14701-2002《饲料中维生素B₂的测定》、GB/T14702-2002《饲料中维生素B₆的测定》和NY/T2130-2012《饲料中烟酰胺的测定》。上述水溶性维生素检测方法存在以下不足：

（1）检测分别进行，操作重复，检测周期冗长。

（2）前处理过程中，所用的提取液、流动相为多种不同试剂，需分别配置，操作重复，过程繁琐。

（3）为消除检测结果中拖尾现象，流动相配制时需用额外添加三乙胺。三乙胺是一种易燃、易爆、有毒、具强刺激性的药品，增加测试过程危险性。

（4）维生素B₁和B₂结构类似，分离较困难。先分别提取再检测，维生素B₁和B₂相互影响，检测结果不准确。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中检测过程繁杂，检测周期冗长、分离效果不佳等不足，提出一种检测水溶性维生素的方法。本发明的检测方法可以在较短的时间内实现对维生素B₁、B₂、B₆和烟酰胺的同时分离及精确检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种水溶性维生素的检测方法，包括以下步骤：

（1）制备维生素B₁、B₂、B₆和烟酰胺的标准溶液，利用高效液相色谱仪对其检测，得所述维生素的保留时间，并生成维生素浓度与峰面积之间对应的标准曲线；

（2）取饲料样品进行预处理，然后利用所述高效液相色谱仪在与步骤（1）相同的条件下对其进行检测，得到所述溶液样品的各组份的保留时间和检测峰面积；

（3）将步骤（2）中获得的所述溶液样品的各组分的保留时间和检测到的峰面积与步骤（1）中得到的保留时间及所述的标准曲线进行比对，计算确定饲料中的维生素B₁、B₂、B₆和烟酰胺的含量；

进一步的，所述步骤(2)中的预处理包括：

（201）将饲料样品用离子对溶液超声提取，得提取液；

（202）将步骤（201）所得提取液于沸水中煮沸20-30min；

（203）将步骤（202）得到的提取液冷却至室温，定容，摇匀；静置，取上清液过滤；

所述离子对溶液为含有4-8mmol/L己烷磺酸钠和15-25mmol/L磷酸的水溶液。

进一步，上述水溶性维生素的检测方法中，所述离子对溶液为含有5mmol/L己烷磺酸钠和20mmol/L磷酸的离子对溶液。

进一步，上述水溶性维生素的检测方法中，所述高效液相色谱的流动相为所述离子对溶液。

进一步，上述水溶性维生素的检测方法中，所述高效液相色谱的流动相分为流动相A和流动相B，其中流动相A为所述离子对溶液，流动相B为乙腈。高效液相色谱检测过程采用梯度洗脱方式，优选梯度洗脱程序如表1。

表1用于洗脱水溶性维生素的梯度洗脱程序

时间(min)	流动相A(体积百分比)	流动相B(体积百分比)
			0.0	91	9
2.0	91	9
			14.0	80	20
15.0	91	9
			25.0	91	9

进一步，上述水溶性维生素的检测方法中，步骤（201）中饲料样品比提取液是重量体积比g/L，2：1~5：1。

进一步，上述水溶性维生素的检测方法中，步骤（203）可将提取液上清液经过0.45μm滤膜过滤。

进一步，上述水溶性维生素的检测方法中，高效液相色谱检测条件：色谱柱，资生堂UG120(5μm，4.6mm i.d.×250mm)；温度，30℃；流速，1.0mL/min；检测波长为210nm。

现有的水溶性维生素的检测方法，是按照相应的国标分别进行检测，如按照现有国标方法采用酸性提取液提取样品中的水溶性维生素，并参照现有国标方法进行检测，由于维生素B₁、B₂结构相似，分离困难，峰形叠加甚至重叠，难以定量测试。本发明的水溶性维生素的检测方法中，用离子对溶液作为提取液，离子对溶液中，磷酸保证溶液环境呈适宜酸性，使维生素B₁、B₂、B₆和烟酰胺在提取液中更稳定，有利于检测结果准确；并且，在进行高效液相检测时，采用离子对溶液作为流动相，既能稳定维生素，又能够调节所述维生素在色谱柱内的保留时间和峰形，实现了维生素B₁、B₂、B₆和烟酰胺的有效分离与准确检测。离子对溶液中的己烷磺酸钠还有利于检测过程中不出现拖尾现象，从而不再使用三乙胺做调节峰形试剂，操作过程更加安全简单，且结果准确稳定。特别是，当选用含有20mmol/L磷酸，5mmol/L己烷磺酸钠的离子对溶液时，分离效果和检测准确度可以达到最优。

本发明中，高效液相色谱系统采用梯度洗脱程序，初始流动相A，B比例91:9（v/v），梯度变化至80:20(v/v)，使提取液中因结构相似而难以分离的维生素B1、B2在最短的时间内完全分离开，其峰形无重叠部分。梯度洗脱检测速度快，适用于各种需要快速得到检测结果的情况。

本发明检测前处理中采用0.45μm有机相滤膜过滤检测液，过滤效果好，有效保护柱子免受杂质影响，增长色谱柱的使用寿命。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明的检测方法能够一次前处理完成四种维生素提取，且处理过程简单；检测过程无需使用三乙胺，更加安全；所选流动相对四种维生素分离效果好，检测结果精确度高；实现了在短时间内对维生素B₁、B₂、B₆和烟酰胺的同时分离和检测。

附图说明：

图1维生素B₁标准曲线；

图2维生素B₂标准曲线；

图3维生素B₆标准曲线；

图4烟酰胺标准曲线；

图5维生素B₁、B₂、B₆及烟酰胺同时分离和检测，从下到上依次为烟酰胺、B₆、B₁、B₂标样，样品1，样品2检测曲线；

图6各个不同浓度维生素标准品色谱分析图，从下到上依次为样品1-5检测曲线；

图7按照国标方法同时测定维生素B₁、B₂的图谱

具体实施方式

下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

本发明列举的实施例中，所用仪器、设备、色谱条件如下：

1）仪器和设备

电子天平（精确至0.1mg）、实验室常用玻璃器皿、超声波提取器、带45μm滤膜的溶液过滤器、配带紫外检测器的高效液相色谱仪。

2）色谱条件

色谱柱：资生堂UG120(5μm，4.6mm i.d.×250mm)

温度：30℃

流速：1.0mL/min

流动相A：含5mmol/L己烷磺酸钠和20mmol/L磷酸的离子对溶液；

B：乙腈。

梯度洗脱程序见表1：

表1用于洗脱水溶性维生素的梯度洗脱程序

进样量：20μL；

检测波长：210nm

本发明列举的实施例中，所采用的检测方法如下：

（1）分别制备维生素B₁、B₂、B₆和烟酰胺的标准溶液，利用高效液相色谱仪对其检测，得所述维生素的保留时间，并生成维生素浓度与峰面积之间对应的标准曲线：

标准液制备

Ⅰ：维生素B₁标准溶液

维生素B₁标准贮备液：准确称取0.05g维生素B1于100mL棕色容量瓶中，加乙醇溶液超声15min，用乙醇溶液定容。

维生素B₁标准工作液：准确吸取2.00mL标准贮备液于50mL棕色容量瓶中，用流动相离子对溶液定容。

Ⅱ：维生素B₂标准溶液

维生素B₂标准贮备液：准确称取0.01g维生素B₂于100mL棕色容量瓶中，加1mL冰乙酸在沸水浴80℃~100℃煮沸30min，待冷却至室温后，用超纯水定容。

维生素B₂标准工作液：准确吸取2.00mL标准贮备液于50mL棕色容量瓶中，用流动相离子对溶液定容。

Ⅲ：维生素B₆标准溶液

维生素B₆标准贮备液：准确称取0.05g维生素B₆于100mL棕色容量瓶中，加70mL浓度0.1mol/L盐酸溶液，超声15min，用0.1mol/L盐酸溶液定容。

维生素B₆标准工作液：准确吸取2.00mL标准贮备液于50mL棕色容量瓶中，用流动相离子对溶液定容。

Ⅳ：烟酰胺标准溶液

烟酰胺标准贮备液：准确称取0.05g烟酰胺于100mL棕色容量瓶中，加70mL超纯水，超声15min，用超纯水定容。

烟酰胺标准工作液：准确吸取2.00mL标准贮备液于50mL棕色容量瓶中，用流动相离子对溶液定容。

绘制标准曲线：

将制备的维生素B₁、B₂、B₆和烟酰胺的标准溶液在上述要求的色谱条件下进行色谱测定，记录所述维生素的保留时间和色谱峰面积。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程。

上述维生素B₁、B₂、B₆和烟酰胺的标准溶液在所述的检测条件下测试结果分别见与表2、表3、表4、表5、表6，图1~图4。

表2维生素B₁、B₂、B₆和烟酰胺保留时间的相对标准偏差（RSD）分析

表3维生素B₁的标准溶液检测结果

序号	保留时间（min）	含量（μgmL）	峰面积	校正计算值	偏差（%）
						1	11.837	25.0	128127.339	24.315	-2.74
2	11.832	50.0	287176.851	49.720	-0.56
						3	11.801	75.0	413623.607	76.477	1.97
4	11.813	100.0	542677.619	100.056	0.06
						5	11.782	150.0	812927.144	149.432	-0.38

表4维生素B₂标准溶液的检测结果

序号	保留时间（min）	含量（μg/mL）	峰面积	校正计算值	偏差（%）
						1	12.530	25.0	107020.177	24.417	-2.33
2	12.538	50.0	215878.814	49.875	-0.25

3	12.523	75.0	326051.886	75.640	0.85
						4	12.521	100.0	433412.127	100.747	0.75
5	12.516	150.0	641120.323	149.321	-0.45

表5维生素B₆标准溶液检测结果

序号	保留时间（min）	含量（μg/mL）	峰面积	校正计算值	偏差（%）
						1	7.438	25.0	523452.373	24.503	-1.99
2	7.442	50.0	1052112.321	49.739	-0.52
						3	7.442	75.0	1605925.073	76.175	1.57
4	7.429	100.0	2105032.143	100.000	0.00
						5	7.429	150.0	3143708.737	149.582	-0.28

表6烟酰胺标准溶液的检测结果

序号	保留时间（min）	含量（μg/mL）	峰面积	校正计算值	偏差（%）
						1	4.664	25.0	872512.719	24.765	-0.94
2	4.656	50.0	1752798.856	49.283	-1.43
						3	4.645	75.0	2687606.682	75.321	0.43
4	4.635	100.0	3628967.582	101.541	1.54
						5	4.664	150.0	5336143.553	149.091	-0.61

上述维生素标准曲线方程为：

维生素B₁标准曲线方程：Y=5467X-2525R＝0.999835R²=0.999670

维生素B₂标准曲线方程：Y=4276X+2608R＝0.999904R²=0.999807

维生素B₆标准曲线方程：Y=20949X-10134R=0.999899R²=0.999798

烟酰胺标准曲线方程：Y=35902X-16603R=0.999791R²=0.999582

下文举出的实施过程均在同一天进行预处理，同一天进行上机检测，标准曲线均为上述检测得到的标准曲线，故不再赘述标准溶液检测过程及标准曲线。

（2）待测试样预处理及检测：

取0.25g待测样品，置于100mL棕色容量瓶中，加入70mL的离子对溶液，超声提取30min，超声提取过程中辅以旋摇。将所得超声提取液置于沸水中煮沸20min，待温度降至室温后用离子对溶液定容。静置，取上清液经0.45μm滤膜过滤后，在上述要求的色谱条件下进行色谱测定。

（3）结果计算：

将步骤（2）中获得的所述溶液样品的各组分的保留时间和检测到的峰面积与步骤（1）中得到的保留时间及所述的标准曲线进行比对，按式（Ⅰ）计算确定饲料中的维生素B₁、B₂、B₆和烟酰胺的含量。

Wi = \frac{Pi \times V \times Ci \times Vst}{Psti \times m \times Vi} \cdot \cdot \cdot \cdot \cdot \cdot (I)

式中：

W_i——试样中维生素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）;

m——试样质量，单位为克（g）；

V_i——试样溶液进样体积，单位为微升（μL）；

P_i——试样溶液峰面积值；

C_i——标准溶液浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）;

V_st标准溶液进样体积，单位为微升（μL）；

P_sti——标准溶液峰面积值。

V——标准品体积

下文举出的实施过程均按照上述检测步骤进行具体测试，上述计算方法计算结果，不再赘述测液体试样质量、峰面积和试样的进样浓度等数值，仅描述具体计算结果。

取xxx品牌饲料样品1-5，按前述待测样品预处理方法处理后在上述检测条件下测定样品中维生素B₁、B₂、B₆和烟酰胺的含量，检测结果如表7-11、图5、图6所示。

取相同样品1-5分别采用相应的国标检测其中的维生素B₁、B₂、B₆和烟酰胺的含量（所述国标为：GB/T14700-2002《饲料中维生素B₁的测定》、GB/T14701-2002《饲料中维生素B₂的测定》、GB/T14702-2002《饲料中维生素B₆的测定》、NY/T2130-2012《饲料中烟酰胺的测定》）。检测结果见表7-11。

表7样品1中维生素含量

	实测值(mg/kg)	加标量(mg/kg）	回收率(%)	国标方法(mg/kg)	相对偏差（%）
						维生素B_１	15650	5000	97	10800	1.39
维生素B₂	34530	5000	96.6	29700	0.57
						维生素B₆	16420	5000	100.4	11400	-0.18
烟酰胺	186690	5000	95.8	181900	0.12

表8样品2中维生素含量

	实测值(mg/kg)	加标量(mg/kg）	回收率(%)	国标方法(mg/kg)	相对偏差（%）
						维生素B１	25100	5000	102	20000	0.50
维生素B2	18675	5000	95.5	13900	-1.62
						维生素B6	19525	5000	98.5	14600	-0.51
烟酰胺	31980	5000	95.6	27200	-0.81

表9样品3中维生素含量

	实测值(mg/kg)	加标量(mg/kg）	回收率(%)	国标方法(mg/kg)	相对偏差（%）
						维生素B1	17900	5000	101.8	12810	-0.70
维生素B2	31100	5000	96	26300	0.76
						维生素B6	17650	5000	104	12400	-2.02
烟酰胺	197150	5000	103	192000	-0.08

表10样品4中维生素含量

	实测值(mg/kg)	加标量(mg/kg）	回收率(%)	国标方法(mg/kg)	相对偏差（%）
						维生素B1	31450	5000	99	26500	0.19
维生素B2	18880	5000	101.6	13800	-0.58
						维生素B6	19110	5000	98.2	14200	0.63
烟酰胺	30350	5000	103	25200	-0.60

表11样品5中维生素含量

	实测值(mg/kg)	加标量(mg/kg）	回收率(%)	国标方法(mg/kg)	相对偏差（%）
						维生素B1	29640	5000	99.4	24780	0.6
维生素B2	17580	5000	99.4	12650	0.6
						维生素B6	18910	5000	104.1	13320	-1.1
烟酰胺	30100	5000	97.6	25710	2.4

试验结果显示，本发明对维生素B₁、B₂、B₆和烟酰胺的分离良好，峰形无重叠部分，可准确测定饲料中维生素B₁、B₂、B₆和烟酰胺的含量。且多次试验结果重现性良好。

对比例：

取维生素B₁、B₂的标准品配置成含维生素B₁、B₂各50mg/L混合标准溶液，按照国标GB/T14700-2002进行检测。

测试结果如图7所示，峰形出现了严重的重叠，未能有效的分离，难以在一次检测分析中进行定量测定。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种水溶性维生素的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

所述步骤(2)中的预处理包括：

（201）将饲料样品用离子对溶液超声提取，得提取液；

（202）将步骤（201）所得提取液于沸水中煮沸20-30min；

所述离子对溶液为含有5mmol/L己烷磺酸钠和20mmol/L磷酸的水溶液；

高效液相色谱流动相分为A，B两种，A为所述的离子对溶液，B为乙腈，高效液相色谱检测过程采用梯度洗脱方式；

程梯度洗脱程序如下：流动相A、B初始比例为91:9，待基线平衡后进样，同时调整流动相A、B比例在12min内线性调整为80：20；

色谱柱，资生堂UG120 规格为5μm，4.6mm i.d.×250mm。

2.根据权利要求1所述的检测水溶性维生素的方法，其特征在于，步骤（203）中提取液过滤用的是0.45μm水相滤膜。

3.根据权利要求1所述的检测水溶性维生素的方法，其特征在于，步骤（201）预处理中，饲料样品与提取液比例是2：1~5：1，重量体积比g/L。

4.根据权利要求1所述的检测水溶性维生素的方法，其特征在于，高效液相色谱检测条件：温度，30℃；流速，1.0mL/min；检测波长210nm。