CN109061008A - 一种蜂蜜中低聚木糖含量的测定方法 - Google Patents
一种蜂蜜中低聚木糖含量的测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种蜂蜜中低聚木糖含量的测定方法,该测定方法的具体步骤包括:S1、样品前处理;S2、标准溶液配制;S3、仪器分析;S4、结果计算。本发明与现有技术相比具有的特点和优势如下:试验材料易得,操作容易,采用固相萃取小柱(HLB)净化可除去蜂蜜中强水溶性和脂溶性的杂质,优选的酰胺基色谱柱能将干扰木糖测定的果糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖等糖完全分离。该方法能有效排除干扰,检测准确度提高,科学有效,完全满足蜂蜜样品中低聚木糖含量的测定要求。
Description
技术领域
本发明涉及蜂蜜中低聚木糖含量的检测技术领域,具体为一种蜂蜜中低聚木糖含量的测定方法。
背景技术
称取蜂蜜低聚木糖(Xylo-oligosaccharide,XOS)是近几年发展起来的一种功能性低聚糖,其由2-9个木糖单元,以β1-4糖苷键聚合而成,并以木二糖、木三糖、木四糖等为主要成分的混合物。具有良好的物化性质及生理功效,能促进双歧杆菌增殖、抑制肠道病原菌、增强脂代谢、促进机体免疫力、增进钙等矿物质的吸收等。因而被广泛应用于糕点、蜂蜜、饮料、乳制品、保健品等食品、医药和饲料领域。
目前,低聚木糖的含量测定方法主要有:核磁共振法、毛细管电泳法、气相色谱法和高效液相色谱法。有的采用衍生化法配合气相色谱法对木二糖进行测定的;也有的采用毛细管电泳法测定酶解纸浆中的低聚木糖含量的;但大多数实验人员多采用高效液相色谱-蒸发光散射(HPLC-ELSD)检测法或高效液相色谱-示差折光(HPLC-RID)检测法或对木二糖至木八糖进行定性分析。近几年来,对低聚木糖水解成木糖进行单一含量的测定受到推崇。如:肖林等用硫酸水解测定果胶中低聚木糖的含量,王冲、李泰然、毕晓黎等分别采用硫酸水解测定口服液、保健品中低聚木糖的含量等。
本发明在前人研究的基础上,考虑到低聚木糖各组分间分子量相差较小,高纯标准品不易获取,价格尤其昂贵,兼顾蜂蜜样品本身含有的葡萄糖、果糖、蔗糖等特点,从产品的理化特性和基本结构单元着手,本着方法科学性、可操作性和可普及性,采用分离效果更好的酰胺基柱,利用低聚木糖在一定条件下水解生成木糖的特性,对木糖单一标准品进行含量测定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蜂蜜中低聚木糖含量的测定方法,蜂蜜中的低聚木糖用乙醇溶液提取,提取液经硫酸溶液水解成木糖,使用高效液相色谱仪分别测定样品水解前后木糖的含量,水解后与水解前木糖含量的差值乘低聚木糖和木糖的平均转化系数,即得样品中低聚木糖的含量,外标法定量,该方法易于操作,准确度高,精密度良好,能够满足检测工作的需要,以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种蜂蜜中低聚木糖含量的测定方法,是将蜂蜜中的低聚木糖在一定条件下水解成木糖,由测定木糖的含量折算出样品中低聚木糖的含量,该测定方法的具体步骤如下:
S1、样品前处理:
水解前试样溶液的制备:称取蜂蜜试样4.00g于50.00mL容量瓶,加入提取溶剂至满刻度,混匀,转移至50mL离心管中,离心,取上清液10.00mL,于70℃下,氮吹至1/2体积即可,最后用水定容至 10.00mL,涡旋混匀,作为水解前试样溶液,待净化;
水解后试样溶液的制备:准确量取5.00mL的水解前试样溶液,加入4.0mol/L的硫酸溶液,水解后,冷却至室温,用NaOH溶液调 pH值,使得pH=5~7,加水定容至25mL,混匀,离心,取上清液作为水解后试样溶液,待净化;
净化:分别准确量取1.00mL水解前试样溶液和水解后试样溶液,通过固相萃取小柱,用4mL的洗脱剂进行重力洗脱,收集洗脱液,于 70℃下,氮吹至干,再用1.00mL的乙腈-水溶液定容,涡旋混匀,经过0.45μm的有机微孔滤膜,供高效液相色谱仪分析;
优选地,所述步骤S1中提取溶剂采用体积比为1:1的水和乙醇的混合液。
优选地,所述步骤S1中4.0mol/L的硫酸溶液用量为1.4mL,水解温度为100℃,水解时间为100min。
优选地,所述步骤S1中的固相萃取小柱采用HLB固相萃取柱,规格为:6mL、500mg,使用前,依次用3mL甲醇和3mL水进行活化处理。
优选地,所述步骤S1中净化时的洗脱剂为甲醇。
S2、标准溶液配制:
准确称取木糖标准品,制成木糖标准储备液,再精密量取木糖标准储备液适量,配制成系列标准曲线工作溶液;
优选地,所述步骤S2中标准溶液配制的具体过程如下:
准确称取0.25g木糖标准品于25mL容量瓶中,用去离子水溶解并稀释至满刻度;配制成10mg/mL的木糖标准储备液,于4℃下保存;精密量取10.0mg/mL的木糖标准储备液适量,用0.005mol/L硫酸溶液稀释,配制成浓度为0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00mg/mL 的系列标准曲线工作液。
S3、仪器分析:
采用高效液相色谱仪分析,示差折光检测器测定,外标法定量;
优选地,所述步骤S3中仪器分析的条件如下:色谱柱:Waters BEH Amide,4.6×250mm,5μm;流动相:乙腈-水溶液;流速:1.0mL/min;柱温:45℃;进样量:20μL;示差检测器温度:45℃。
优选地,所述的乙腈-水溶液由体积比为77:23的乙腈和水混合而成。
S4、结果计算:
将配制的标准曲线工作溶液,按浓度由低到高的顺序进行检测,以木糖标准曲线工作溶液的浓度为横坐标,色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线;工作曲线的线性相关系数r2大于0.999,在所采用的的分析条件下,将净化过滤后的试样溶液注入高效液相色谱仪中,得到相应的峰高或峰面积,依据标准曲线得到待测液中木糖的浓度,最终测定的是蜂蜜中的低聚木糖经水解后的木糖的含量;水解后与水解前木糖含量的差值乘低聚木糖和木糖的平均转化系数,即得样品中低聚木糖的含量。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
1)本发明在样品处理过程中所采用的固相萃取方式,相较于现有技术的不净化过程,可有效去除样品中的强水溶性和脂溶性的杂质,操作简单,有机溶剂用量小,样品净化程度高,易实现高通量操作;
2)本发明选用酰胺基色谱柱能有效避开果糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖等糖对低聚木糖测定的干扰,该方法能有效排除干扰,使检测准确度提高;
3)本发明方法易于操作,准确度高,精密度良好,能够满足检测工作的需要。
附图说明
图1为木糖标准溶液色谱图示意图;
图2为木糖标准曲线示意图;
图3为木糖、果糖、半乳糖、甘露糖的分离效果图。
附表说明
表1为木糖的线性范围、线性方程、相关系数和精密度;
表2为木糖在水解前和水解后的加标回收率和相对标准偏差;
表3为样品A、B、C、D中低聚木糖的检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
一种蜂蜜中低聚木糖含量的测定方法,该测定方法具体步骤如下:
1.试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯级,水为符合GB/T 6682规定的一级水;甲醇、乙腈,色谱纯;无水乙醇、硫酸(98%,优级纯)、氢氧化钠、盐酸;木糖,纯度≥99%;
Oasis HLB固相萃取柱(6mL,500mg,使用前依次用3mL甲醇和 3mL水活化);0.45μm的有机微孔滤膜。
2.仪器和设备
LC-20AD高效液相色谱仪,配示差折光检测器;涡旋混合器; Milli-Q去离子水发生器;氮吹仪;固相萃取装置;pH测试仪;高速微型离心机;数显恒温水浴锅;电子天平(感量0.1mg、0.01g);移液器。
3.溶液的配制
试剂的配制:
乙腈-水溶液:量取770mL乙腈,加入230mL水,混匀;
提取溶剂:甲醇-水溶液(1:1,V/V),量取250mL甲醇,加入 250mL水,混匀;
0.005mol/L硫酸溶液:称取0.50g的98%硫酸,用水定容至1L;
4.0mol/L硫酸溶液:量取55mL的98%硫酸,缓缓加到约150mL 水中,边加边搅拌,再用水稀释至250mL,配制成4.0mol/L硫酸溶液,取适量的4.0mol/L硫酸溶液稀释10倍,配制成0.4mol/L硫酸溶液;
氢氧化钠溶液:称取100.00g氢氧化钠,加入100g水,混匀,即制成50%NaOH溶液,再取适量体积,依次稀释成10%NaOH溶液、 2%NaOH溶液;
1mol/L盐酸溶液:量取83mL盐酸,用水稀释并定容至1L。
标准溶液配制:
准确称取0.25g木糖标准品于25mL容量瓶中,用去离子水溶解并稀释至满刻度,配制成10mg/mL的木糖标准储备液,于4℃下保存。
精密量取10.0mg/mL木糖标准储备液适量,用0.005mol/L硫酸溶液稀释,配制成浓度为0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00mg/mL 的系列标准曲线工作液,现用现配。
4.样品前处理
水解前试样溶液的制备:
称取蜂蜜试样4.00g(精确至0.01g)于50.00mL容量瓶中,加水约25mL,溶解,预混匀,再用无水乙醇定容至刻度,混匀,转移至50mL离心管中,离心(6000r/min,5min),取上清液10.00mL,于70℃下氮吹至1/2体积即可,最后用水定容至10.00mL,涡旋混匀,作为水解前试样溶液,待净化。
水解后试样溶液的制备:
准确量取5.00mL水解前试样溶液,加入1.4mL的4.0mol/L硫酸溶液,于100℃水浴下,水解100min后,冷却至室温,用50%NaOH 溶液调pH值约3.0时,再用10%NaOH、2%NaOH溶液和0.4mol/L 硫酸溶液微调,使得pH=5~7,加水定容至25mL,混匀,离心,取上清液作为水解后试样溶液,待净化。
净化:
准确量取1.00mL水解前试样溶液和水解后试样溶液,分别通过预活化的HLB固相萃取柱,用4mL甲醇洗脱,收集洗脱液,于70℃氮吹至干,再用1.00mL的乙腈-水溶液定容,溶解,涡旋混匀,过 0.45μm的有机微孔滤膜,供高效液相色谱仪分析。
若样品中低聚木糖的含量超出线性范围,应将水解前试样溶液稀释适当倍数后再水解。
空白试验:除不加试样外,采用完全相同的测定步骤进行平行操作。
5.仪器分析
采用高效液相色谱仪分析,示差折光检测器测定,外标法定量;其中,仪器分析的条件如下:色谱柱:Waters BEH Amide,4.6×250 mm,5μm;流动相:乙腈-水溶液;流速:1.0mL/min;柱温:45℃;进样量:20μL;示差检测器温度:45℃。
6.结果分析
将配制的标准曲线工作溶液,按浓度由低到高的顺序进行检测,以木糖标准曲线工作液的浓度为横坐标,色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,求回归方程和线性相关系数,见表1;由表1可知,所采用的的分析条件下,最终测定的是蜂蜜中的低聚木糖经水解后的产物木糖的含量,木糖与果糖、半乳糖、甘露糖等干扰物质的分离效果较好,且具有良好的线性相关性,标准溶液的色谱图如图1,校准曲线如图2;定量下限以不含有目标物的处理液样品为背景,低浓度的加标溶液进行,当信噪比S/N≥10,且称样量为4.0g时,得到方法的定量下限为0.34g/100g,如图3;线性范围为0.34g/100g~34 g/100g;木糖在0.05~5.00mg/mL范围内具有良好的线性关系,线性相关系数r2>0.999;每个浓度水平重复进样6次,其相对标准偏差见表1。
试样中低聚木糖的含量(MXOS)按下式计算:
MXOS=(X2-X1)×1.1…………………(3)
式中:
X1—样品水解前木糖含量,单位为克每百克(g/100g);
X2—样品水解后木糖含量,单位为克每百克(g/100g);
MXOS—样品中低聚木糖的含量,单位为克每百克(g/100g);
C1—水解前样品溶液中木糖的浓度,单位为毫克每毫升 (mg/mL);
C2—水解后样品溶液中木糖的浓度,单位为毫克每毫升 (mg/mL);
V1—水解前样品溶液的总稀释体积,单位为毫升(mL);
V2—水解后样品溶液的定容体积,单位为毫升(mL);
f—水解后样品溶液的稀释倍数,f=50/5;
m—样品的质量,单位为克(g)。
1.1—低聚木糖和木糖的平均转换系数。
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,保留三位有效数字;在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。
对空白蜂蜜样品进行高、中、低不同浓度水平的标准溶液加标回收实验,每一浓度水平重复测定6次,可以获得木糖在水解前和水解后的回收率,见表2;实验结果表明,方法的平均回收率在81.9%~ 100.6%之间,平均相对标准偏差(RSD)小于5%;说明本方法的准确度高,重复性较好。
实施例1
用上述检测方法,选择洋槐蜂蜜样品A,测得样品中低聚木糖的含量见表3。
实施例2
用上述检测方法,选择油菜花蜂蜜样品B,测得样品中低聚木糖的含量见表3。
实施例3
用上述检测方法,选择批把蜂蜜样品C,测得样品中低聚木糖的含量见表3。
实施例4
用上述检测方法,选择蜂蜜膏样品D,测得样品中低聚木糖的含量见表3。
表1:木糖的线性范围、线性方程、相关系数和精密度(n=6)
化合物 | 线性范围/(mg/mL) | 线性方程 | r2 | RSD/% |
木糖 | 0.05~5.00 | Y=515956X-3960.14 | 0.9999 | 0.1~3.2 |
表2:添加回收率及相对标准偏差(n=6)
表3:蜂蜜样品A、B、C、D的检测结果
样品名称 | 水解前/(g/100g) | 水解后/(g/100g) | XOS/(g/100g) |
样品A洋槐蜂蜜 | 12.6 | 14.8 | 2.2 |
样品B油菜花蜂蜜 | 37.8 | 39.5 | 1.7 |
样品C批把蜂蜜 | 40.7 | 48.8 | 8.1 |
样品D蜂蜜膏 | 45.9 | 45.4 | — |
注:“-”表示未检出。
Claims (8)
1.一种蜂蜜中低聚木糖含量的测定方法,是将蜂蜜中的低聚木糖在一定条件下水解成木糖,由测定木糖的含量折算出样品中低聚木糖的含量,其特征在于,该测定方法的具体步骤如下:
S1、样品前处理:
水解前试样溶液的制备:称取蜂蜜试样4.00g于50.00mL容量瓶,加入提取溶剂至满刻度,混匀,转移至50mL离心管中,离心,取上清液10.00mL,于70℃下,氮吹至1/2体积即可,最后用水定容至10.00mL,涡旋混匀,作为水解前试样溶液,待净化;
水解后试样溶液的制备:准确量取5.00mL的水解前试样溶液,加入4.0mol/L的硫酸溶液,水解后,冷却至室温,用NaOH溶液调pH值,使得pH=5~7,加水定容至25mL,混匀,离心,取上清液作为水解后试样溶液,待净化;
净化:分别准确量取1.00mL水解前试样溶液和水解后试样溶液,通过固相萃取小柱,用4mL的洗脱剂进行重力洗脱,收集洗脱液,于70℃下,氮吹至干,再用1.00mL的乙腈-水溶液定容,涡旋混匀,经过0.45μm的有机微孔滤膜,供高效液相色谱仪分析;
S2、标准溶液配制:
准确称取木糖标准品,制成木糖标准储备液,再精密量取木糖标准储备液适量,配制成系列标准曲线工作溶液;
S3、仪器分析:
采用高效液相色谱仪分析,示差折光检测器测定,外标法定量;
S4、结果计算:
将配制的标准曲线工作溶液,按浓度由低到高的顺序进行检测,以木糖标准曲线工作溶液的浓度为横坐标,色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线;工作曲线的线性相关系数r2大于0.999,在所采用的的分析条件下,将净化过滤后的试样溶液注入高效液相色谱仪中,得到相应的峰高或峰面积,依据标准曲线得到待测液中木糖的浓度,最终测定的是蜂蜜中的低聚木糖经水解后的木糖的含量;水解后与水解前木糖含量的差值乘低聚木糖和木糖的平均转化系数,即得样品中低聚木糖的含量。
2.根据权利要求1所述的一种蜂蜜中低聚木糖含量的测定方法,其特征在于,所述步骤S1中提取溶剂采用体积比为1:1的水和乙醇的混合液。
3.根据权利要求1所述的一种蜂蜜中低聚木糖含量的测定方法,其特征在于,所述步骤S1中4.0mol/L的硫酸溶液用量为1.4mL,水解温度为100℃,水解时间为100min。
4.根据权利要求1所述的一种蜂蜜中低聚木糖含量的测定方法,其特征在于,所述步骤S1中的固相萃取小柱采用HLB固相萃取柱,规格为:6mL、500mg,使用前,依次用3mL甲醇和3mL水进行活化处理。
5.根据权利要求1所述的一种蜂蜜中低聚木糖含量的测定方法,其特征在于,所述步骤S1中净化时的洗脱剂为甲醇。
6.根据权利要求1所述的一种蜂蜜中低聚木糖含量的测定方法,其特征在于,所述步骤S2中标准溶液配制的具体过程如下:
准确称取0.25g木糖标准品于25mL容量瓶中,用去离子水溶解并稀释至满刻度;配制成10mg/mL的木糖标准储备液,于4℃下保存;精密量取10.0mg/mL的木糖标准储备液适量,用0.005mol/L硫酸溶液稀释,配制成浓度为0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00mg/mL的系列标准曲线工作液。
7.根据权利要求1所述的一种蜂蜜中低聚木糖含量的测定方法,其特征在于,所述步骤S3中仪器分析的条件如下:色谱柱:Waters BEH Amide,4.6×250mm,5μm;流动相:乙腈-水溶液;流速:1.0mL/min;柱温:45℃;进样量:20μL;示差检测器温度:45℃。
8.根据权利要求7所述的一种蜂蜜中低聚木糖含量的测定方法,其特征在于,所述的乙腈-水溶液由体积比为77:23的乙腈和水混合而成。
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