CN101612173A - 肿节风提取物及其制剂的质量控制方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中药肿节风提取物及其相关制剂的质量控制方法，包括采用反相高效液相色谱法建立指纹图谱、确认标准指纹图谱，所述标准指纹图谱中包括十二个色谱峰，其中十个色谱峰的化学结构已经被确认；提取物及相关制剂的供试品指纹图谱与标准指纹图谱的相似度不小于0.65；此外，还利用工作曲线法建立了多种抗炎活性成分的含量测定方法。该方法可以有效的控制中药肿节风提取物及其相关制剂的产品质量，重现性好，稳定性高，精密度优异，且操作方法简便。

Description

肿节风提取物及其制剂的质量控制方法及其应用

技术领域

本发明涉及中药提取物及其相关药品的化学分析方法，具体的说是中药肿节风提取物及其制剂的质量控制方法及其应用。

背景技术

中药肿节风是金粟兰科植物草珊瑚Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai的全草，又称草珊瑚、九节风、接骨茶等；味苦、辛、性平；具清热凉血，活血消斑，祛风通络等功效；是我国常用的中草药，用于治疗血热紫斑、紫癜、风湿痹痛、跌打损伤等症。肿节风的水或不同浓度的乙醇提取物制成的单方制剂，如：肿节风片、肿节风注射液、清热消炎宁片、清热消炎宁胶囊，或与其他中药提取物制成复方制剂，如：复方草珊瑚含片、新癀片、万通炎康片，用于流行性感冒、咽喉炎、肺炎、急性胃肠炎、菌痢等。

但是，到目前为止，对于肿节风提取物及其相关制剂的鉴别方法仅包括试管定性反应及正相薄层色谱中与标准品异嗪皮啶对照实验；而含量测定方法也仅有关于异嗪皮啶含量的相关规定。浙江大学程翼宇教授和国家中央药检所林瑞超教授等虽先后对肿节风提取物的指纹图谱进行了考察，但均仅指认了其中一个色谱峰的化学结构，即异嗪皮啶。(吴永江等“中国中药杂志”，2005，30：67-69；王钢力等“中草药”，2005，36：1801-1803。)由于异嗪皮啶尚没有抗炎活性相关文献报道，因此仅以其作为指标成分，无法全面评价中药材肿节风提取物的质量。根据2010年药典编制大纲提出中成药及中药材应“逐步由单一指标性成分定性定量测定，向活性、有效成分及生物测定的综合检测过渡，向多成分和指纹或特征图谱整体质量控制模式转化”，有必要建立一种方法简便、稳定、精密度高的多成分和特征指纹图谱，并制定其中活性成分的定量方法，用以科学、有效地控制中药肿节风提取物及其制剂的质量。

发明内容

为解决现有技术存在的问题与不足，本发明的主要目的在于建立一种简便、稳定、精密度高的肿节风提取物及其制剂的质量控制方法。本发明的进一步目的还在于提供该质量控制方法的用途，即控制含有肿节风提取物的单方或复方中药产品的质量。。

本发明的主要目的通过下列技术方案实现：本发明的肿节风提取物及其制剂的质量控制方法，采用反相高效液相色谱法建立的肿节风提取物标准指纹图谱，包含十二个色谱峰，其中十个色谱峰的化学结构已经被准确指认，以迷迭香酸的色谱保留时间为1计算得到的各色谱峰的相对保留时间，分别为新绿原酸0.24±0.01、绿原酸0.39±0.01、0.41±0.01、隐绿原酸0.44±0.01、咖啡酸0.49±0.01、嗪皮素0.56±0.02、异嗪皮啶0.70±0.02、迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷0.90±0.02、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷0.97±0.02、迷迭香酸1.00、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷1.09±0.02、1.15±0.02；提取物及其制剂的供试品指纹图谱与标准指纹图谱的相似度不小于0.65。

以上的肿节风提取物及其制剂的质量控制方法，具体包括以下的步骤：

a、肿节风提取物标准指纹图谱的建立：

取中药肿节风干燥地上部分500g，用10倍量水回流两次，每次两小时，合并提取液，减压回收溶剂，浓缩后冷冻干燥，即得肿节风标准提取物51.2g；

取上述肿节风标准提取物以适量水溶解，制成每1mL水中含有肿节风提取物5.0mg的溶液，过0.45μm滤膜后，即得肿节风提取物的供试品溶液；

取迷迭香酸对照品，以适量甲醇溶解，制成每1mL甲醇中含有迷迭香酸1mg的溶液，即得迷迭香酸对照品溶液；

分别精密取上述供试品及对照品溶液10μL，参照国家药典附录中规定的高效液相分析方法，注入高效液相色谱仪进行色谱分析，记录色谱图；以迷迭香酸的色谱保留时间为1计算的各色谱峰的相对保留时间，得到标准指纹图谱；

b、肿节风提取物及其制剂的指纹图谱的建立：

取肿节风提取物或其制剂，以适量水溶解，过0.45μm滤膜，取滤液作为供试液；迷迭香酸对照品按步骤a所述制备；按步骤b所述条件对供试品和对照品溶液进行色谱分析，记录色谱图；以迷迭香酸的色谱保留时间为1计算得到的各色谱峰的相对保留时间，得到指纹图谱；

c、提取物及其制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度不小于0.65。

上述步骤a和b中，发明人经过反复实验，确立了较佳的色谱条件：采用十八烷基硅氧键合硅胶为固定相；以含有0.2％醋酸的甲醇-水溶液作为流动相，梯度洗脱；流速为0.8mL/min；检测波长为330nm；色谱柱温度为35℃；以迷迭香酸计算，理论塔板数不低于20000。

此条件下得到的标准指纹图谱包含十二个色谱峰(图1)，发明者还利用公知的现代色谱分离手段，富集并分离得到了该标准指纹图谱中的十个主要色谱峰，并利用核磁共振波谱、多级质谱等手段，结合文献，鉴定了上述十个化合物的结构。以迷迭香酸的色谱保留时间为1计算得到的各色谱峰的相对保留时间及色谱峰对应的化学物质依次是：

1号峰：0.24±0.01(新绿原酸)；

2号峰：0.39±0.01(绿原酸)；

3号峰：0.41±0.01；

4号峰：0.44±0.01(隐绿原酸)；

5号峰：0.49±0.01(咖啡酸)；

6号峰：0.56±0.02(嗪皮素)；

7号峰：0.70±0.02(异嗪皮啶)；

8号峰：0.90±0.02(迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷)；

9号峰：0.97±0.02(槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷)；

10号峰：1.00(迷迭香酸)；

11号峰：1.09±0.02(山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷)；

12号峰：1.15±0.02。

上述化学结构已经被准确指认的色谱峰的峰面积总和占总峰面积的89％。

发明者进而利用体外抗炎活性模型，确定绿原酸类成分、咖啡酸以及迷迭香酸类成分，能够不同程度的抑制15-LO的活性，是中药肿节风中的抗炎活性成分。

发明者还建立了与活性相关的肿节风提取物及其相关制剂中抗炎成分的含量测定方法，用以控制中药肿节风提取物及其相关制剂的质量；所述活性物质包括绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷、迷迭香酸或由它们中两种以上组成的混合物。

本发明的肿节风提取物及其制剂的质量控制方法的用途包括：

1、对中药肿节风提取物以及该提取物与药学上所允许的药用辅料或载体按照常规方法制成的制剂进行质量控制；

2、利用肿节风提取物及其制剂的高效液相指纹图谱和其中一种或几种已被指认的色谱峰，采用工作曲线法测定肿节风提取物及其制剂中相应活性物质的含量。

上述制剂包括散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、栓剂、滴丸剂、肠溶剂、注射剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、酊剂、膏剂或喷雾剂。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

提供了一种采用反相高效液相色谱法建立的HPLC标准指纹图谱控制产品质量，标准指纹图谱中包括十个已经被准确指认了化学结构的特征色谱峰，其中六个为抗炎活性成分；此外，还利用工作曲线法建立了多种抗炎活性成分的含量测定方法。利用该方法可以有效地控制中药肿节风提取物及其相关制剂的产品质量，重现性好、稳定性高、精密度优异且操作方法简便。

附图说明

图1是中药肿节风提取物的HPLC标准指纹图谱；

图2是中药肿节风提取物的标准指纹图谱中十个主要色谱峰的化学结构；

其中：I是新绿原酸、II是绿原酸、，III是隐绿原酸、IV是咖啡酸、V是嗪皮素、VI是异嗪皮啶、VII是迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷、VIII是槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、IX是迷迭香酸、X是山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；

图3是肿节风标准提取物的HPLC指纹图谱稳定性；

图4是肿节风标准提取物的HPLC指纹图谱相似度；

图5是相同条件下，各色谱峰单体化合物的HPLC图谱；

图6是咖啡酸的标准曲线；

图7是迷迭香酸的标准曲线；

图8是市售含有肿节风提取物中药制剂的HPLC指纹图谱相似度。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明，但本发明的实现方式并不局限于此。

实施例1肿节风提取物标准指纹图谱的建立：

取中药肿节风干燥地上部分500g，用10倍量水回流两次，每次两小时，合并提取液，减压回收溶剂，浓缩后冷冻干燥，即得肿节风提取物51.2g。

取上述肿节风标准提取物以适量水溶解，制成每1mL水中含有肿节风提取物5.0mg的溶液，过0.45μm滤膜后，即得肿节风提取物的供试品溶液。

取迷迭香酸对照品，以适量甲醇溶解，制成每1mL甲醇中含有迷迭香酸1mg的溶液，即得迷迭香酸的对照品溶液。

分别精密取上述供试品及对照品溶液10μL，参照国家药典附录中规定的高效液相分析方法，注入高效液相色谱仪进行色谱分析，记录色谱图(见图1)。液相色谱条件为：采用十八烷基硅氧键合硅胶为固定相；以含有0.2％醋酸的甲醇-水溶液作为流动相，梯度洗脱；流速为0.8mL/min；检测波长为330nm；色谱柱温度为35℃。获得的肿节风提取物的高效液相标准指纹图谱有十二个色谱峰，以迷迭香酸的色谱保留时间为1计算得到的各色谱峰的相对保留时间，分别为0.24±0.01、0.39±0.01、0.41±0.01、0.44±0.01、0.49±0.01、0.56±0.02、0.70±0.02、0.90±0.02、0.97±0.02、1.00(迷迭香酸)、1.09±0.02、1.15±0.02。以迷迭香酸计算，理论塔板数不低于20000。

实施例2标准指纹图谱重现性考察：

精密称取肿节风标准提取物25mg共6份，分别以水溶解定容于5mL容量瓶中，过0.45μm滤膜后，取滤液作为肿节风提取物的供试液，采用实施例1中所述液相条件进行色谱分析，记录色谱图(见图3)。获得的HPLC指纹图谱中，十二个色谱峰的相对保留时间均符合实施例1中的相关要求，各色谱峰的相对保留时间的相对偏差均小于1.0％(见表1)，表明实施例1获得的HPLC指纹图谱具有较好的重现性。利用药典委员会提供的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》软件计算，6份肿节风标准提取物供试液的HPLC指纹图谱的相似度大于0.991(见图4)。

表1肿节风标准提取物HPLC指纹图谱相对保留时间稳定性

实施例3色谱峰的富集及结构鉴定：

取中药肿节风干燥地上部分4kg，用10倍量水回流两次，每次两小时，合并提取液，减压回收溶剂，浓缩后冷冻干燥，即得肿节风提取物(ZJF)460g。将其混悬于适量水中，采用大孔树脂Diaion Hp-20开放柱色谱，分别以水、30％乙醇-水、50％乙醇-水和95％乙醇-水洗脱。分别减压回收溶剂，得水洗脱物(ZJF-I)340g、30％乙醇-水洗脱物(ZJF-II)70g、50％色谱，以甲醇-水(10，30，50，100％)梯度洗脱。其ODS柱下10％甲醇洗脱部分(ZJF-IA)经反相高效液相分离(15-20％甲醇-水，含0.2％醋酸)得到化合物I、II、III。对ZJF-II采用ODS柱色谱，以甲醇-水(10，30，50，100％)梯度洗脱。其ODS柱下30％甲醇洗脱部分(ZJF-IIB)经反相高效液相分离(30-40％甲醇-水，含0.2％醋酸)得到化合物IV、VII、IX。对ZJF-III采用ODS柱色谱，以甲醇-水(10，30，50，100％)梯度洗脱。其ODS柱下30％甲醇洗脱部分(ZJF-IIB)经反相高效液相分离(25-30％甲醇-水，含0.2％醋酸)得到化合物V、VI。其ODS柱下50％甲醇洗脱部分(ZJF-IIC)经反相高效液相分离(40-50％甲醇-水，含0.2％醋酸)得到化合物VIII、X。通过理化常数和现代波谱学手段(MS、NMR)，结合文献相关数据，鉴定了它们的结构(见图2)。

化合物II为白色粉末，ESI-MS(positive)给出m/z 399[M+2Na-H]⁺，775[2M+2Na-H]⁺，ESI-MS(negative)给出m/z 353[M-H]^-，提示该化合物的分子量为354。结合¹³C-NMR给出16个碳信号，推测化合物II的分子式为C₁₆H₁₈O₉，计算不饱和度为8，提示可能存在苯环。在化合物II的¹H-NMR(DMSO-d₆，400MHz)谱中，低场区一组ABX偶合的芳香质子信号δ_H7.03(1H，brs，H-2′)，6.96(1H，brd，J＝7.7Hz，H-6′)和6.76(1H，d，J＝7.7Hz，H-5′)提示结构中存在一个1，2，4-三取代苯环，相互偶合的烯氢质子信号δ_H7.42(1H，d，J＝16.0Hz，H-7′)和6.15(1H，d，J＝16.0Hz，H-8′)，提示结构中与吸电基团相连的反式双键的存在，进一步结合HSQC及HMBC相关信息，提示结构中存在一个咖啡酰基。其余质子信号δ_H1.78(1H，m，H-2a)，2.02(1H，m，H-2b)，5.08(1H，brs，H-3)，3.54(1H，brd，J＝4.7Hz，H-4)，3.93(1H，brs，H-5)和1.94(2H，m，H-6)在¹H-¹H COSY谱中顺次相关，结合HSQC及HMBC相关信息提示，结构中存在一个奎宁酸结构片断。由于奎宁酸中H-3显著向低场位移，表明咖啡酰基连接在奎宁酸的3位上。化合物II的¹H和¹³C-NMR数据与文献(Chemistry of Natural Compounds，2006，42(5)，567-570)报道一致(见表2)，从而鉴定化合物II为奎宁酸-3-咖啡酸酯，即绿原酸(chlorogenic acid)，其结构式如下：

表2化合物II的NMR数据(DMSO-d₆，400MHz for ¹H)

化合物I、III均为白色粉末，ESI-MS(positive)给出m/z 399[M+2Na-H]⁺，775[2M+2Na-H]⁺，ESI-MS(negative)给出m/z 353[M-H]^-，提示它们与化合物II一样，分子量也为354。进一步在负离子模式下，以m/z 353[M-H]^-为母离子，进行多级解离实验，发现化合物I、II的多级碎片离子解离方式一致：均在二级质谱中丢失162u的中性碎片，产生碎片离子191(咖啡酸上的酯氧键断裂)，并进而在三级质谱中丢失18u的中性碎片，产生碎片离子173；而化合物III的碎裂方式与化合物II略有不同，在二级质谱中除产生碎片离子191外，还可以丢失174u的中性碎片，产生碎片离子179(奎宁酸上的烷氧键断裂)。采用文献报道的色谱条件，对化合物I、II、III进行HPLC分析，发现以化合物II(绿原酸)的保留时间为1，则化合物I和III的相对保留时间分别为0.64，1.06，分别与文献(J.Agric.Food Chem.，2008，56(3)，1084-1090)报道的0.65(新绿原酸)，1.06(隐绿原酸)一致，故将化合物I和III分别鉴定为新绿原酸(neochlorogenic acid)和隐绿原酸(cryptochlorogenic acid)，它们的结构式如下：

化合物IV为淡黄色粉末，ESI-MS(negative)给出准分子离子峰m/z 179[M-H]^-，推测其分子量为180，结合碳谱中的9个信号，推测分子式C₉H₈O₄，计算不饱和度为6，提示可能存在苯环。化合物IV的¹H-NMR(MeOH-d₄，400MHz)谱中，低场区一组ABX偶合系统的质子信号δ_H7.02(1H，J＝2.0Hz，H-2)，6.92(1H，dd，J＝8.0，2.0Hz，H-6)和6.77(1H，d，J＝8.0Hz，H-5)，提示结构中存在一个1，2，4-三取代苯环，相互偶合的烯氢质子信号δ_H7.52(1H，d，J＝16.0Hz，H-7)和6.21(1H，d，J＝16.0Hz，H-8)提示结构中与吸电基团相连的反式双键的存在。结合分子式信息，推测化合物IV为咖啡酸。与咖啡酸标准品共薄层，两者的Rf.值完全相同，核磁共振数据与文献(云南植物研究，2004，26(5)，536-538)报道的咖啡酸一致(见表3)，由此推断化合物IV为咖啡酸，其结构式如下：

表3化合物IV的NMR数据(MeOH-d₄，400MHz for¹H)

化合物V为黄色粉末，在紫外灯(365nm)下呈蓝色荧光，遇5％NaOH溶液变黄绿色，提示其可能为香豆素类成分。ESI-MS(positive)给出m/z 231[M+Na]⁺，ESI-MS(negative)给出m/z 207[M-H]^-，推测其分子量为208，结合碳谱中的10个信号，推测其分子式为C₁₀H₈O₅，计算不饱和度为7，提示结构中可能存在苯环。化合物V的¹H-NMR(DMSO-d₆，400MHz)谱中，低场区相互偶合的烯氢质子δ_H 6.01(1H，d，J＝9.1Hz，H-3)和7.78(1H，d，J＝9.1Hz，H-4)，提示结构中存在一个与吸电基团相连的顺式烯键，δ_H6.64(1H，s，H-5)提示结构中五取代苯环的存在，δ_H3.75(3H，s，6-OCH₃)表明结构中存在一个甲氧基。¹³C-NMR(DMSO-d₆，100MHz)数据与文献(中国药学杂志，2007，42(4)，252-255)报道的秦皮素一致(见表4)，故鉴定此化合物V为6-甲氧基-7，8-二羟基香豆素，即：秦皮素(fraxetin)，其结构式如下：

表4化合物V的NMR数据(DMSO-d₆，400MHz for¹H)

化合物VI为黄色粉末，在紫外灯(365nm)下呈蓝色荧光，遇5％NaOH溶液变黄绿色，提示其可能为香豆素类成分。ESI-MS(positive)给出准分子离子峰m/z 245[M+Na]⁺，223[M+H]⁺，推测其分子量为222，结合碳谱中的11个信号，推测其分子式为C₁₁H₁₀O₅，计算不饱和度为7，提示结构中有苯环存在。化合物VI的¹H-NMR(MeOH-d₄，400MHz)谱中，低场区相互偶合的烯氢质子δ_H6.22(1H，d，J＝9.6Hz，H-3)和7.84(1H，d，J＝9.6Hz，H-4)，提示结构中存在一个与吸电基团相连的顺式烯键，δ_H6.91(1H，s，H-5)提示结构中五取代苯环的存在，δ_H3.89(3H，s，6-OCH₃)和3.89(3H，s，8-OCH₃)表明结构中存在两个甲氧基。上述核磁共振数据与文献(李媛，中国协和医科大学中国医学科学院博士研究生学位论文，2006，p149)报道的异嗪皮啶一致(见表5)，故鉴定化合物VI为6，8-二氧基-7-羟基香豆素，即：异嗪皮啶(isofraxidin)，其结构式如下：

表5化合物VI的NMR数据(MeOH-d₄，400MHz for¹H)

化合物VII为白色无定形粉末，ESI-MS(positive)给出m/z 567[M+2Na-H]⁺，ESI-MS(negative)给出m/z 521[M-H]^-，推测其分子量为522，结合碳谱中的24个信号，推测与分子式C₂₄H₂₆O₁₃，计算不饱和度为12，提示结构中存在多个苯环。化合物VII的¹H-NMR(DMSO-d₆，400MHz)谱中，低场区两组ABX偶合的芳香质子信号δ_H7.04(1H，brs，H-2)，7.01(1H，brd，J＝8.0Hz，H-6)，6.98(1H，d，J＝8.0Hz，H-5)，及6.76(1H，brd，J＝8.0Hz，H-5′)，6.74(1H，brs，H-2′)，6.63(1H，d，J＝8.0Hz，H-6′)提示结构中两个1，2，4-三取代苯环的存在。相互偶合的烯氢的质子信号δ_H7.42(1H，d，J＝16.0Hz，H-7)和6.23(1H，d，J＝16.0Hz，H-8)提示结构中存在一个与吸电基团相连的反式双键。其余氢信号中，δ_H4.61(1H，d，J＝7.0Hz，H-1″)为糖端基质子，表明结构中还存在一个六碳糖基。化合物VII的¹³C-NMR(DMSO-d₆，100MHz)谱图中给出24个碳信号，其中δC 102.4(C-1″)、73.3(C-2″)、75.8(C-3″)、69.8(C-4″)、77.1(C-5″)、60.7(C-6″)提示结构中葡萄糖的存在。其余碳信号，显示出一个咖啡酸和一个3，4-二羟基苯基乳酸的特征，结合分子式信息，推测化合物VII为迷迭香酸葡萄糖苷。上述核磁共振数据与文献(云南植物研究，1987，9(4)，407-411)报道一致(见表6)，故鉴定化合物VII为迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷，其结构式如下：

表6化合物VII的NMR数据(DMSO-d₆，400MHz for¹H)

化合物VIII为黄色无定形粉末，在甲醇溶液中，与Mg-HCl反应显淡红色，薄层斑点显亮黄色(氨熏)，放置在空气中颜色很快褪去，提示该化合物可能为黄酮类化合物。ESI-MS(positive)给出m/z 523[M+2Na-H]⁺，ESI-MS(negative)给出m/z 477[M-H]^-，推测其分子量为478，结合碳谱中的21个信号，推测其分子式C₂₁H₁₈O₁₃，计算不饱和度为13，提示结构中存在多个苯环。化合物VIII的¹H-NMR(DMSO-d₆，400MHz)谱中，低场区芳香质子δ_H7.89(1H，brs，H-2′)，6.82(1H，d，J＝8.4Hz，H-5′)和7.46(1H，brd，J＝8.4Hz，H-6′)提示结构中含有1，2，4-三取代的苯环。δ_H 6.40(1H，brs，H-8)，6.20(1H，brs，H-6)提示存在1，2，3，5-四取代苯环。δ_H5.36(1H，d，J＝5.7Hz，H-1″)的糖端基质子提示结构中六碳糖的存在。由碳谱中给出的碳信号δ_C103.8(C-1″)，73.9(C-2″)，76.2(C-3″)，71.5(C-4″)，75.6(C-5″)及170.0(C-6″)，推测结构中存在一个葡萄糖醛酸。化合物VIII的¹H和¹³C-NMR数据与文献(Chem.Pharm.Bull.，55(2)，334-336)报道一致(见表7)，从而推断化合物VIII为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，其结构式如下：

表7化合物VIII的NMR数据(DMSO-d₆，400MHz for ¹H)

化合物IX为白色无定形粉末，ESI-MS(positive)给出m/z 405[M+2Na-H]⁺，ESI-MS(negative)给出m/z 359[M-H]^-，推测其分子量为360，结合碳谱中的18个信号，推测与分子式C₁₈H₁₆O₈，计算不饱和度为11，提示结构中存在多个苯环。化合物IX的¹H-NMR(DMSO-d₆，400MHz)谱中，低场区两组ABX偶合的芳香质子信号δ_H7.05(1H，brs，H-2)，6.99(1H，brd，J＝7.5Hz，H-6)，6.77(1H，d，J＝7.5Hz，H-5)，及6.67(1H，brs，H-2′)，6.62(1H，brd，J＝7.5Hz，H-5′)，6.51(1H，d，J＝7.5Hz，H-6′)提示结构中两个1，2，4-三取代苯环的存在。相互偶合的烯氢的质子信号δ_H7.43(1H，d，J＝16.0Hz，H-7)和6.22(1H，d，J＝16.0Hz，H-8)提示结构中存在一个与吸电基团相连的反式双键。化合物IX的¹³C-NMR(DMSO-d₆，100MHz)谱图中给出18个碳信号，显示出一个咖啡酸和一个3，4-二羟基苯基乳酸的特征，结合分子式信息，推测化合物IX为迷迭香酸。上述核磁共振数据与文献(云南植物研究，1987，9(4)，407-411)报道一致(见表8)，故鉴定化合物IX为迷迭香酸，其结构式如下：

表8化合物IX的NMR数据(DMSO-d₆，400MHz for¹H)

化合物X为黄色无定形粉末，在甲醇溶液中，与Mg-HCl反应显淡红色，薄层斑点显亮黄色(氨熏)，放置在空气中颜色很快褪去，提示该化合物可能为黄酮类化合物。ESI-MS(positive)给出m/z 507[M+2Na-H]⁺，ESI-MS(negative)给出m/z461[M-H]^-，推测其分子量为462，结合碳谱中的21个信号，推测其分子式C₂₁H₁₈O₁₂，计算不饱和度为13，提示结构中存在多个苯环。化合物X的¹H-NMR(DMSO-d₆，400MHz)谱中，低场区芳香质子δ_H8.02(2H，d，J＝8.7Hz，H-2′，H-6′)，6.85(2H，d，J＝8.7Hz，H-3′，H-5′)提示结构中含有1，4-二取代的苯环。δ_H6.38(1H，brs，H-8)，6.16(1H，brs，H-6)提示存在1，2，3，5-四取代苯环。δ_H5.47(1H，d，J＝7.1Hz，H-1″)的糖端基质子提示结构中六碳糖的存在。由碳谱中给出的碳信号δ_C101.1(C-1″)，73.9(C-2″)，76.0(C-3″)，71.6(C-4″)，75.1(C-5″)及170.0(C-6″)，推测结构中存在一个葡萄糖醛酸。化合物X的¹H和¹³C-NMR数据与文献(李媛，中国协和医科大学中国医学科学院博士研究生学位论文，2006，p149)报道一致(见表9)，从而推断化合物X为山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，其结构式如下：

表9化合物X的NMR数据(DMSO-d₆，400MHz for¹H)

上述分离得到的各单体化合物，采用实施例1中建立的色谱条件，参照国家药典附录中规定的高效液相分析方法，注入高效液相色谱仪进行色谱分析，记录色谱图(见图5)。

实施例4绿原酸、咖啡酸、迷迭香酸等成分的对15-LO的抑制活性

1、药品及仪器：

脂加氧酶抑制剂筛选试剂盒(Lipoxygenase Inhibitor Screening Assay Kit，760700)购自Cayman公司；其他常用生化试剂均为国产分析纯；全自动酶标仪(美国，Biotek)。各测试样品以DMSO溶解并稀释至合适浓度，-20℃保存备用。

2、溶液配制：

Assay Buffer：0.1M Tris-HCl，pH 7.4

显色剂Chromogen：使用前等体积混合Developing Regent 1(Cayman，760711)和Developing Regent 2(Cayman，760712)既得。

15-脂加氧酶：使用前取10μl 15-脂加氧酶(15-LO，Cayman，760714)加入990μl AssayBuffer，混匀置于冰上备用。

底物：取底物亚油酸溶液(Linoleic acid，Cayman，760716)25μl，加入0.1M KOH溶液(Cayman，760713)25μl，涡旋混合后，加入950μl去离子水稀释，备用。

3、脂加氧酶活性的测定原理：

15-脂加氧酶(15-LO)是最主要的脂加氧酶，其通常作用底物为亚油酸盐和花生四烯酸盐。本实验利用纯化的15-脂加氧酶作用于亚油酸，测定反应过程中的产物过氧化物的含量，反映相应的脂加氧酶的活性。

4、脂加氧酶活性的测定方法：

实验在96孔酶标板中进行，设定空白对照组，100％酶活性组及测试样品组，每组设两个平行孔。

空白对照组：每孔加入100μl Assay Buffer。

100％酶活性组：每孔加入90μl相应的脂加氧酶，10μl溶解样品用的DMSO。

测试组：每孔加入90μl相应的脂加氧酶，10μl测试样品。

以上所有孔中各加入10μl配制好的亚油酸底物溶液，开始反应，将96孔酶标板置于水平摇床上振摇5min。每孔加入100μl显色剂Chromogen终止酶反应，用封板膜封板，置于水平摇床上振摇5min。取掉封板膜，测定500nm下的吸光值。

根据A₅₀₀计算测试样品对15-LO的抑制率：

$A_{500}/\min =\frac{A_{500}\left(\mathrm{sample}\right)-A_{500}\left(\mathrm{blank}\right)}{5\min \mathrm{utes}}$

4、实验结果：

实验结果(见表10)表明，迷迭香酸及咖啡酸对15-脂加氧酶(15-LO)具有较强的抑制作用，绿原酸及迷迭香酸糖苷则具有一定的抑制作用。上述化合物均能够抑制15-脂加氧酶的活性，从而发挥抗炎作用。

表10活性组分对15-脂加氧酶(15-LO)的抑制活性

实施例5咖啡酸、迷迭香酸标准工作曲线的绘制

配制咖啡酸和迷迭香酸对照品的系列标准溶液，每样品进样2次，每次10μL，峰面积取其平均值。以色谱峰面积为纵坐标(Y)，对照品浓度(X)为横坐标绘制工作曲线，得到CA的回归方程为Y＝44.055X-3.436，r＝0.9999(n＝10)。数据见表11；曲线见图6。得到RA的回归方程为Y＝22.892X-21.122，r＝0.9999(n＝10)。数据见表12；曲线见图7。结果表明，CA在0.555～22.2μg/mL范围内呈现良好的线性关系；RA在2.595～103.8μg/mL范围内呈现良好的线性关系。

表11咖啡酸标准曲线的数据

表12迷迭香酸标准曲线的数据

实施例6市售含有肿节风提取物的中药制剂的质量分析

取市售含有肿节风提取物的中药制剂：《肿节风片》(厂家：A，生产批号：08011101)、《清热消炎宁胶囊》(厂家：B，生产批号：z05069)、《血康胶囊》(厂家：C，生产批号：07070202)和《复方草珊瑚含片》(厂家：D，生产批号：0712032)药物内容物各1g，分别用水定容于10mL容量瓶中，超声提取两小时，过0.45μm滤膜，取续滤液作为各制剂的供试液。

分别精密取上述供试液10μL，采用实施例1中建立的色谱条件，参照国家药典附录中规定的高效液相分析方法，注入高效液相色谱仪进行色谱分析，记录色谱图。获得的各含有肿节风提取物的中药制剂的色谱图与肿节风提取物的高效液相标准指纹图谱比较，四种中药制剂至少检出12个指标色谱峰中的10个(见表13)，相对保留时间相对标准偏差小于1％；使用药典委员会提供的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》软件计算，四种中药制剂供试液HPLC色谱图的相似度分别为0.921，0.858，0.662和0.700(见图8)。

表13市售含有肿节风提取物的中药制剂HPLC指纹图谱相似度

根据实施例5获得的工作曲线，计算四种中药制剂中，咖啡酸和迷迭香酸的含量，如表14所示。

表14肿节风提取物及相关中药制剂中咖啡酸、迷迭香酸含量

由表13和表14不难看出，多家生产的含有肿节风提取物的中药制剂，无论从所含成分、含量均有所不同。尤其是抗炎活性成分，绿原酸、咖啡酸、迷迭香酸及其衍生物的含量波动较大。采用本发明提供的反相HPLC方法，能够有效的确定肿节风提取物及其相关中药制剂中抗炎活性成分情况及其含量，从而可以有效的控制中药肿节风相关产品质量。

Claims (7)

1、一种肿节风提取物及其制剂的质量控制方法，其特征在于采用反相高效液相色谱法建立的肿节风提取物标准指纹图谱，包含十二个色谱峰，其中十个色谱峰的化学结构已经被准确指认，以迷迭香酸的色谱保留时间为1计算得到的各色谱峰的相对保留时间，分别为新绿原酸0.24±0.01、绿原酸0.39±0.01、0.41±0.01、隐绿原酸0.44±0.01、咖啡酸0.49±0.01、嗪皮素0.56±0.02、异嗪皮啶0.70±0.02、迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷0.90±0.02、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷0.97±0.02、迷迭香酸1.00、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷1.09±0.02、1.15±0.02；肿节风提取物及其制剂的供试品指纹图谱与标准指纹图谱的相似度不小于0.65。

2、根据权利要求1所述的肿节风提取物及其制剂的质量控制方法，其特征在于包括如下步骤：

a、肿节风提取物标准指纹图谱的建立：

取中药肿节风干燥地上部分500g，用10倍量水回流两次，每次两小时，合并提取液，减压回收溶剂，浓缩后冷冻干燥，即得肿节风标准提取物51.2g；

取上述肿节风标准提取物以适量水溶解，制成每1mL水中含有肿节风提取物5.0mg的溶液，过0.45μm滤膜后，即得肿节风提取物的供试品溶液；

取迷迭香酸对照品，以适量甲醇溶解，制成每1mL甲醇中含有迷迭香酸1mg的溶液，即得迷迭香酸的对照品溶液；

分别精密取上述供试品及对照品溶液10μL，参照国家药典附录中规定的高效液相分析方法，注入高效液相色谱仪进行色谱分析，记录色谱图；以迷迭香酸的色谱保留时间为1计算的各色谱峰的相对保留时间，得到标准指纹图谱；

b、肿节风提取物及其制剂的指纹图谱的建立：

取肿节风提取物或其制剂，以适量水溶解，过0.45μm滤膜，取滤液作为供试液；迷迭香酸对照品溶液按步骤a所述制备；按步骤a所述条件对上述供试品和对照品溶液进行色谱分析，记录色谱图；以迷迭香酸的色谱保留时间为1计算的各色谱峰的相对保留时间，得到指纹图谱；

c、肿节风提取物及其制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度不小于0.65。

3、根据权利要求2所述的肿节风提取物及其制剂的质量控制方法，其特征在于：所述反相高效液相色谱法的条件是：采用十八烷基硅氧键合硅胶为固定相；以含有0.2％醋酸的甲醇-水溶液作为流动相，梯度洗脱；流速为0.8mL/min；检测波长为330nm；色谱柱温度为35℃；以迷迭香酸计算，理论塔板数不低于20000。

4、根据权利要求2所述的肿节风提取物及其制剂的质量控制方法，其特征在于还可包括以下步骤：

d、建立指纹图谱中一种或几种色谱峰面积与其对应活性物质浓度的标准曲线；

e、通过步骤d所述标准曲线计算相关活性物质的含量。

5、根据权利要求2所述的肿节风提取物及其制剂的质量控制方法，其特征在于：所述活性物质包括：绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷、迷迭香酸或由它们中两种以上组成的混合物。

6、权利要求1所述的肿节风提取物及其制剂的质量控制方法的用途，其特征在于：包括对中药材肿节风提取物以及该提取物与药学上所允许的药用辅料或载体按照常规方法制成的制剂进行质量控制以及利用肿节风提取物及其制剂的高效液相指纹图谱和其中一种或几种已被指认的色谱峰，采用工作曲线法测定肿节风提取物及其制剂中相应活性物质的含量。

7、根据权利要求6所述的肿节风提取物及其制剂的质量控制方法的用途，其特征在于：所述制剂包括散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、栓剂、滴丸剂、肠溶剂、注射剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、酊剂、膏剂或喷雾剂。

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