CN110441410B - 沙棘提取物中化合物的色谱分析检测方法 - Google Patents

沙棘提取物中化合物的色谱分析检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了沙棘提取物中化合物的色谱分析检测方法，采用液相色谱法进行化合物I的定性检测，所述化合物I为本发明首次发现并成功从沙棘提取物中分离提纯，本发明检测方法对所述化合物I具有良好的杂质检出能力，对沙棘提取物中化合物I进行检测和含量、浓度确定。本发明化合物I具有α‑葡萄糖苷酶活性抑制效果，本发明的提出对该化合物的进一步研究和沙棘的综合开发利用提供方便。

Description

沙棘提取物中化合物的色谱分析检测方法
技术领域
本发明涉及沙棘中有效物质的提取领域，特别是涉及沙棘三萜提取物的化合物分析检测方法。
背景技术
沙棘(拉丁学名：Hippophae rhamnoides Linn.)，是一种胡颓子科、沙棘属落叶性灌木，其特性是耐旱、抗风沙，可以在盐碱化土地上生存，因此被广泛用于水土保持。中国西北部大量种植沙棘，用于沙漠绿化。
沙棘果实营养丰富，据测定其果实中含有多种维生素、脂肪酸、微量元素、亚油素、沙棘黄酮、超氧化物等活性物质和人体所需的各种氨基酸。其中维生素C含量极高，每100克果汁中，维生素C含量可达到825～1100毫克，是猕猴桃的2～3倍，素有维生素C之王的美称。现被广泛应用于沙棘果汁、沙棘原浆液的生产，在生产过程中，需要去皮，去掉的沙棘果皮往往当作废料丢弃，或生产成干粉当作饲料，价格非常低廉。
现在已经被报道过沙棘果皮中含有熊果酸和齐墩果酸这两个三萜酸，具有保肝护肝、降低血糖和抗皮肤氧化等功效，对沙棘提取物中化合物进行检测和含量、浓度确定，有利于对沙棘的综合开发利用。
发明内容
本发明提供一种沙棘提取物中化合物的色谱分析检测方法，有利于沙棘的综合开发利用。
本发明提供一种沙棘提取物中化合物的色谱分析检测方法，采用液相色谱法进行化合物的定性检测，包括以下色谱条件：
色谱柱：C18色谱柱，优选规格为(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：A为水，B为乙腈，等度洗脱条件：20％～30％A，80％～70％的B。
进一步地，所述化合物包括式I所示化合物
Figure BDA0002103320960000011
进一步地，还包括以下条件中的至少一种：检测波长：203±10nm；柱温为：30±5℃；更进一步地，所述波长为203±5nm，所述柱温为30±2℃。
进一步地，所述沙棘提取物通过以下方法制备得到：
(1)将沙棘浸膏上硅胶柱，以石油醚，以及不同体积比例混合的石油醚和乙酸乙酯的混合液为流动相进行洗脱，其中石油醚与乙酸乙酯混合比例为(9～1)：(1～9)，收集三萜化合物洗脱液；
(2)将步骤(1)所得洗脱液依次进行液相正相色谱分析、正相色谱制备、反相液相色谱分析和反相色谱制备，最后进行液相色谱分析纯度，获得所述式I化合物。
进一步地，步骤(2)包括以下内容：
将步骤(1)所得馏分进行正相液相色谱分析，色谱条件包括：
色谱柱：亲水HILIC色谱柱；优选为规格为4.6mm*250mm，5μm，更有选为XAmide4.6mm*250mm，5μm色谱柱；
流动相：A为乙醇，B为正己烷；等度洗脱条件：2％～4％A，98％～96％B；
进一步的，还包括以下条件中的至少一种：
检测波长：203±10nm；优选为203±5nm；
柱温：30±5℃；优选为30±2℃；
流速：1±0.5mL/min；优选为1±0.2mL/min；
进样量：10±5μL；优选为10±2μL；
所述正相色谱制备条件包括：
色谱柱：HILIC色谱柱；优选规格为20mm*250mm，5μm；更优选为XAmide20mm*250mm，5μm色谱柱；
流动相：A为乙醇，B为正己烷；等度洗脱条件：2％～4％A，98％～96％B；
进一步地，还包括以下制备色谱条件中的至少一种：
检测波长：203±10nm；优选为203±5nm
柱温：30±5℃；优选为30±2℃
流速：19±2mL/min；优选为19±1mL/min；
进样量：1±0.5mL；优选为1±0.2mL；
收集式I所示化合物对应的组分，将所得组分再进行反相液相色谱分析、反相色谱制备，获得所述三萜化合物。
进一步地，进行反相液相色谱分析、反相色谱制备包括以下内容：
反相液相色谱分析的色谱条件包括：
色谱柱：C18色谱柱，优选规格为4.6mm*250mm，5μm，更优选为Kromasil C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：A为水，B为乙腈，等度洗脱条件：20％～30％A，80％～70％的B；
进一步地，还包括以下色谱分析条件中的至少一种：
检测波长：203±10nm；
柱温：30±5℃；
流速：1±0.5mL/min；
反相制备色谱条件包括：
色谱柱：C18色谱柱，优选规格为21.2mm*250mm，5μm，Kromasil 100～5～C18(21.2×250mm,5μm)；
柱温：30℃；
流动相：A为水，B为乙腈，等度洗脱条件：20％-30％的A，80％～70％B；
进一步地，还包括以下色谱制备条件中的至少一种：
检测波长：203±10nm；
柱温：30±5℃；
流速：21±2mL/min。
将制备后的溶液浓缩，再进行相同条件的液相分析，判断所得组分的纯度；若纯度大于98％，获得目标化合物；若纯度小于98％，则再进行色谱制备。
本发明的上述方案中，柱温、检测波长、进样量、流速等可在常见范围内选择。其中检测波长可以在前述公开的范围内通过常规手段进行调节选择。在寻找最佳检测波长时，可以使用紫外分光光度法、HPLC配套使用的全波段扫描等方式进行，再配合HPLC检测器的检测效果(如避免溶剂干扰等)，采用常规技术找到适宜的检测波长。本发明一个具体实施方式中，检测波长选自201～205nm，例如在203nm。
进一步地，步骤(1)依次采用的石油醚与乙酸乙酯混合比例为9:1，8:2，7:3，6:4，5:5，4:6，3:7，2:8，1:9。
进一步地，步骤(1)洗脱过程中通过薄层色谱分析法确定石油醚：乙酸乙酯为7:3时的馏分为三萜化合物含量最高的馏分。
进一步地，正相色谱制备后，收集保留时间为14～19min对应的组分，进行下一步分析。
进一步地，步骤(1)中所述沙棘浸膏采用乙醇对沙棘进行提取得到；进一步地，采用体积浓度为95％乙醇进行提取；更进一步地；将沙棘果渣与乙醇按照料液比为1：(10～30)kg/L混合在70～80℃下提取，每次提取1.5～2.5h，提取3～4次，合并提取液除去溶剂得到浸膏。
本发明中定性检测，可以使用常规方法进行，例如选用对照品通过外标法进行对应分析，又或者通过HPLC将各成分分开以后，通过常规鉴定手段进行定性分析，如质谱、薄层、紫外等等。
本发明中定量检测，可根据色谱结果定量，如采用外标法、面积归一法等常规方法进行含量计算。
另外，需要说明的是，本发明中的分离度、杂质限度的控制均通过本领域的常规技术手段进行调节，杂质限度可参照USP或EP药典。
在定量分析时，若使用外标法，采用常规手段制作标准曲线进行计算即可；但在定性分析时，则无需制作标准曲线，可以通过保留时间来判定。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了沙棘提取物中一种首次发现的化合物的色谱检测方法，对所述化合物具有良好的杂质检出能力，对沙棘提取物中化合物进行检测和含量、浓度确定。通过实验验证，所述化合物具有α-葡萄糖苷酶活性抑制效果，本发明的提出对该化合物的进一步研究和沙棘的综合开发利用提供方便。
附图说明
图1标准品Obtusol的标准曲线图；
图2标准品的液相色谱图；
图3沙棘提取物中液相色谱图。，
图4为正相液相色谱分析图谱；
图5为正相色谱制备图谱；
图6为反相液相色谱分析图谱；
图7为反相色谱制备图谱；
图8为制备后的液相色谱分析液图谱。
图9不同浓度的阿卡波糖抑制曲线；
图10不同浓度Obtusol的抑制剂的抑制曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式和相关实验对本发明做进一步说明。
以下实施例中，Obtusol为本发明所述式I化合物
Figure BDA0002103320960000051
实施例1制备Obtusol1.制备浸膏
取沙棘果渣5kg，95％乙醇在中药煎药机中进行提取，每次2h，料液比为1:10kg/L，共提取3次，合并3次提取液减压浓缩后得到浸膏约500g。
2.制备化合物
主要仪器和试剂
仪器：安捷伦1260系列高效液相色谱仪，配备G1311C四元梯度泵、G1329B自动进样器、G1316A柱温箱、G1315D检测器。
试剂：分析和制备级乙腈均来自云南新蓝景化学工业有限公司，色谱用水为娃哈哈纯净水。
2.1将浸膏与硅胶进行拌样后，以石油醚和不同比例的石油醚与乙酸乙酯进行冲柱，其中石油醚和乙酸乙酯比例分别为9:1，8:2，7:3，6:4，5:5，4:6，3:7，2:8，1:9，经过硅胶柱点板确定石油醚：乙酸乙酯7:3中的馏分部位为三萜酸含量较高的部位，将7:3馏分中4～13部分(是指每500mL收集一瓶，取第4瓶～第13瓶的馏分)进行正相色谱分析和制备。
2.2液相色谱分析方法建立
将7:3馏分中4～13部分在XAmide(4.6×250mm,5μm)分析柱上进行分析，色谱条件如下：流动相：A为乙醇，B为正己烷；等度洗脱条件：0～45min，4％A，96％B；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测波长：203nm，进样量为10μL。
2.3正相色谱制备
将7:3馏分中4～13部分在XAmide(20mm×250mm，5μm)制备柱上进行正相色谱制备。制备时进样量为1mL，流速：19mL/min，其它条件与XAmide分析柱分析条件相同。组分收集：3～3.8min为F～1；3.9～4.6min为F～2；6.2～8min为F～3；8.5～10min为F～4；10～14min为F～5；14～19min为F～6；20～23min为F～7；23～25min为F～8；25～30min为F～9；30～35min为F～10；35～37min为F～11。
2.4反向色谱制备
将F～6(7:3馏分中4～13部分经正相色谱制备后得到的第6个馏分)在Kromasil100～5～C18(4.6×250mm,5μm)分析柱上进行分析后，在Kromasil 100～5～C18(21.2×250mm,5μm)制备柱上进行反相色谱制备，之后以同样的液相条件在Kromasil 100～5～C18(4.6×250mm,5μm)分析柱上进行分析。
色谱分析条件为：流动相：A：水，B：乙腈；等度洗脱条件：0～40min，20％A，80％B；分析流速：1mL/min；检测波长：203nm；柱温：30℃。本分析条件也是化合物定性定量检测的液相色谱条件。
色谱制备条件为：流动相：A：水，B：乙腈；等度洗脱条件：0～40min，20％A，80％B；流速：21mL/min；检测波长：203nm；柱温：30℃；
对制备的组分进行液相色谱分析，结果见图5，色谱峰纯度为96.8％。对获得的化合物进行NMR鉴定：
该化合物的NMR信息如下：Obtusol化合物，分子式：C30H50O2，白色粉末，1H NMR(600MHz,MeOD)δ5.14(1H,t,J＝3.6Hz,H～12)，3.56,3.03(2H,(a)d,J＝11.0Hz；(b)d,J＝11.0Hz,H～27)，3.16(1H,dd,J＝11.4,4.8Hz,H～3)，1.95(1H,m,H～18)，1.94(2H,m,H～16)，1.91(2H,m,H～11)，1.62(2H,m,H～21)，1.61(1H,m,H～19)，1.57(2H,m,H～22)，1.55(2H,m,H～1)，1.41(2H,m,H～7)，1.39(2H,m,H～6)，1.32(1H,m,H～9)，1.25(2H,m,H～2)，1.23(2H,m,H～15)，1.12(3H,s,H～28)，1.03(3H,s,H～26)，1.0(1H,m,H～20)，0.98(3H,s,H～23)，0.97(3H,s,H～24)，0.93(3H,d,J＝6.6Hz,H～30)，0.81(3H,d,J＝6.6Hz,H～29)，0.78(3H,s,H～25)，0.76(2H,dd,J＝12.0,1.2Hz,H～5).
13C NMR(151MHz,MeOD)δ140.21(s,C～13),126.32(s,C～12),79.68(s,C～3),70.20(s,C～27),56.68(s,C～18),55.64(s,C～5),49.57(s,C～9),49.00,43.18(s,C～17),41.29(s,C～8),40.86(s,C～19),40.74(s,C～4),40.14(s,C～1),39.86(s,C～14),39.17(s,C～20),37.99(s,C～10),36.61(s,C～22),34.04(s,C～7),31.82(s,C～15),28.73(s,C～2),27.92(s,C～23),27.11(s,C～21),24.45(s,C～11),24.13(s,C～30),23.86(s,C～16),21.78(s,C～29),19.46(s,C～6),17.93(s,C～28),17.34(s,C～24),16.37(s,C～25),16.22(s,C～26).
确定该化合物分子式:C30H50O2
分子量:442.3811
结构式为
Figure BDA0002103320960000071
实施例2 Obtusol的检测和含量计算
1.主要仪器和试剂
仪器：安捷伦1260系列高效液相色谱仪，配备G1311C四元梯度泵、G1329B自动进样器、G1316A柱温箱、G1315D检测器。
试剂：分析和制备级乙腈均来自云南新蓝景化学工业有限公司，色谱用水为娃哈哈纯净水。
2色谱条件
色谱柱为Kromasil C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈和水；流速1mL/min；检测波长203nm；柱温为30℃，液相条件：0～40min，流动相80％乙腈水溶液。
3对照品溶液制备
精密称定Obtusol对照品10.00mg，置于10mL棕色容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为1.0mg/mL对照品溶液。分别稀释至0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、0.03125mg/mL和0.015625mg/mL。
4标准曲线的绘制及定量限和检测限
标准曲线：进样量为20μL，质量分别为20μg、10μg、5μg、2.5μg、1.25μg、0.625μg和0.3125μg。以对照品的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，作线性方程进行线性回归分析y＝322.79x+15.406，R2＝1。线性范围为：0.3125～20μg。
检出限(limit of determination，LOD)为3倍信噪比0.42μg/mL，定量限(limitof quantification，LOQ)为10倍信噪比1.78μg/mL。
5精密度试验
精密吸取对照品溶液，连续进样5次，以峰面积计算色谱系统精密度，Obtusol RSD(n＝5)分别为0.32％、0.51％、0.43％、0.39％和0.56％，证明仪器精密度良好。
6回收率实验
精密称定已知Obtusol含量的样品，准确加入一定量的Obtusol标品，测定Obtusol的含量，计算加标回收率。加标回收率分别为95.45％、96.28％和95.86％，相应的RSD分别为1.25％、4.32％和3.57％，表明该方法回收率较高且准确度良好。
7.实际样品中Obtusol含量的测定
采用同样的方法对沙棘提取物(此处为反相色谱制备的提取物)中Obtusol含量进行检测，精密称取20.00mg沙棘提取物(此处为制备过程中的提取物)，溶于20mL的乙腈溶液中，制成浓度为1.0mg/mL的样品溶液。液相检测方法同标准品的检测方法一致。根据标准曲线可得出该提取物中Obtusol的含量为6.23mg，提取物中所含Obtusol浓度为31.15％。
实施例3 Obtusol对α-葡萄糖苷酶的活性抑制效果实验
原理：对硝基苯-α-D-葡萄糖苷(pNPG)经α-葡萄糖苷酶水解可产生对硝基苯酚，其在405nm呈特异性吸收，因此可以通过检测对硝基苯酚的生成量检测α-葡萄糖苷酶的活性。
实验分为空白组、对照组、样品空白组和样品组，制备方法：各反应物按表1中剂量在96孔板中进行加样，每组3个平行，将抑制剂、乙醇、缓冲液和酶溶液混合均匀，在恒温振荡器中37℃保温10min，结束后，取出，加入50μL 0.5mmol/L pNPG溶液，充分混匀，于37℃水浴反应20min，结束后加入50μL 0.1mol/L的Na2CO3溶液中止反应，即得各试验组(空白组、对照组、样品空白组和样品组)。
由于PNPG在α-葡萄糖苷酶的作用下能水解产生葡萄糖和PNP，PNP在405nm处有最大吸收，使用酶标仪测定其吸光度，根据公式便可计算出各样品α-葡萄糖苷酶的抑制率及IC 50值。
公式：
Figure BDA0002103320960000081
其中，Ac为空白组吸光值，AB为对照组吸光值，As为样品组吸光值，ASB为样品空白组吸光值。
表1各反应物添加计量和顺序(单位：μL)
Figure BDA0002103320960000082
Figure BDA0002103320960000091
阿卡波糖不同浓度与不同浓度Obtusol的抑制剂的抑制率见表2、表3，在分别对两组数据绘制拟合曲线，如图1、图2所示，以浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，不同浓度的阿卡波糖抑制曲线见图1，不同浓度Obtusol的抑制剂的抑制曲线见图2。再由拟合的曲线得到曲线方程：
不同浓度的阿卡波糖抑制曲线方程为：y＝0.3639x+0.0767，R2＝0.9926。
不同浓度Obtusol的抑制剂的抑制曲线方程为：y＝19.107x+0.0546，R2＝0.9963。
通过上述两个曲线方程即可分别求得阿卡波糖和Obtusol对α-葡萄糖苷酶50％的抑制率时的浓度，求得阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度IC 50值为1.1632mg/mL，Obtusol对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度IC 50值为0.0233mg/mL。
表2阿卡波糖不同浓度的抑制率(n＝3)
浓度(mg/mL) 抑制率(％) RSD
0.07 9.82 14.32％
0.139 13.22 18.68％
0.278 19.11 8.53％
0.556 25.79 7.79％
1.112 48.82 2.72％
IC50值为1.1632mg/mL
表3不同浓度Obtusol的抑制剂的抑制率(n＝3)
浓度(mg/mL) 抑制率(％) RSD
0.05 100.54％(合理) 1.67％
0.025 55.29％ 7.99％
0.0125 27.59％ 12.82％
0.00625 15.01％ 7.23％
0.003125 13.97％ 5.81％
IC50值为0.0233mg/mL
可见，本发明所述化合物具有显著的α-葡萄糖苷酶的活性抑制效果，并且其IC50远低于阿卡波糖。

Claims (3)

1.沙棘提取物中化合物的色谱分析检测方法，其特征在于，所述沙棘提取物通过以下方法制备得到：
(1)将沙棘浸膏上硅胶柱，以石油醚以及不同体积比例混合的石油醚和乙酸乙酯的混合液为流动相进行洗脱，其中石油醚与乙酸乙酯混合比例为9:1，8:2，7:3，6:4，5:5，4:6，3:7，2:8，1:9，收集洗脱液7:3； 所述沙棘浸膏采用体积浓度95%乙醇对沙棘进行提取得到；
(2)将步骤(1)所得洗脱液依次进行液相正相液相色谱分析、正相色谱制备、反相液相色谱分析和反相色谱制备，最后进行液相色谱分析纯度，获得式I化合物；
Figure DEST_PATH_IMAGE001
；
步骤(2)包括以下内容：正相液相色谱分析条件包括：
色谱柱：亲水HILIC色谱柱；规格为4 .6mm*250mm，5μm；
流动相：A为乙醇，B为正己烷；等度洗脱条件：2％～4％的A，98％～96％的B，
检测波长：203±10nm；
柱温：30±5℃；
流速：1±0 .5mL/min；
进样量：10±5μL；
所述正相色谱制备条件包括：
色谱柱：HILIC色谱柱；规格为20mm*250mm，5μm；
流动相：A为乙醇，B为正己烷；等度洗脱条件：2％～4％A，98％～96％B；
检测波长：203±10nm；
柱温：30±5℃；
流速：19±2mL/min；
进样量：1±0 .5mL；
收集式I所示化合物对应的组分，将所得组分进行反相液相色谱分析、反相色谱制备，获得所述化合物；
反相液相色谱分析包括以下色谱条件：
色谱柱：C18色谱柱，规格为4 .6mm*250mm，5μm；
流动相：A为水，B为乙腈，等度洗脱条件：20％～30％A，80％～70％的B；
检测波长：203±10nm；
柱温：30±5℃；
流速：1±0 .5mL/min；
反相制备色谱条件包括：
色谱柱：C18色谱柱，规格为21 .2mm*250mm，5μm；
流动相：A为水，B为乙腈，等度洗脱条件：20％～30％A，80％～70％的B；
检测波长：203±10nm；
柱温：30±5℃；
流速：21±2mL/min；
将制备后的溶液浓缩，再进行相同条件的液相分析，判断所得组分的纯度；若纯度大于98％，获得目标化合物；若纯度小于98％，则再进行色谱制备。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)正相色谱制备后，收集保留时间为14～19min对应的组分，进行下一步分析。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)中所述沙棘浸膏的提取方法为：将沙棘果渣与乙醇按照料液比为1：(10～30)kg/L混合在70～80℃下提取，每次提取1 .5～2.5h，提取3～4次，合并提取液除去溶剂得到浸膏。
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