CN106841079A - 一种测定富含还原糖的蛋白样品中蛋白质含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种测定富含还原糖的蛋白样品中蛋白质含量的方法。本发明先用DNS法测出富含还原糖的蛋白样品中还原糖的浓度，再通过还原糖与BCA试剂反应的等比关系计算出在利用BCA试剂测定富含还原糖的蛋白样品中蛋白质含量时扣除还原糖的贡献值，最后利用蛋白质与BCA试剂反应的等比关系计算出蛋白质的准确含量。本发明所述方法能排除富含还原糖的蛋白样品中还原糖的干扰，快速、精确的测定出富含还原糖的蛋白样品中蛋白质的含量。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质检测领域，具体为一种测定富含还原糖的蛋白样品中蛋白质含量的方法。
背景技术
蛋白含量是生物样品品质的重要特征参数之一，如烟叶蛋白含量高，表明其商品品质较低，奶粉中蛋白含量决定其营养品质。此外，某些病理情况下体液标本如糖尿中血红蛋白定量检测能够直观反映血糖控制效果，对糖尿病患者的临床检查和治疗具有重要意义。
二喹啉甲酸(BCA)法是广为应用的蛋白定量方法。其原理是在强碱性条件下，蛋白质分子中的肽键结构首先与硫酸铜电离出的二价铜离子发生络合反应生成络合物，将Cu2+还原成Cu+，然后BCA工作液特异性的与Cu+结合生成紫红色的稳定复合物，这种稳定复合物在λ＝562nm附近处有最大吸光度，故可根据颜色的吸光度来计算蛋白质的含量。BCA法操作简便、灵敏度高(20-2000ug/L)、快速(约40min)、试剂稳定性好、测定结果准确、经济适用，对不同蛋白质着色力一致，并且具有抗干扰能力强的优势，低于一定浓度的缓冲盐、表面活性剂及螯合剂等干扰物质均对BCA法定量蛋白无影响。
然而，BCA反应试剂最初用于还原糖的测定，因此，采用BCA法测定富含还原糖的蛋白样品中蛋白质含量时必定受还原糖的干扰，故采用BCA法测定蛋白含量时需样品中的葡萄糖等还原糖的含量控制在500mg/L以下，无法准确定量检测富含还原糖的蛋白样品中的蛋白。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种测定富含还原糖的蛋白样品中蛋白质含量的方法，通过排除蛋白样品中还原糖的干扰，能快速、精确的测定出富含还原糖的蛋白样品中蛋白的含量，对鉴定样品品质、临床检查和治疗具有重大意义。
本发明的技术方案是：测定富含还原糖的蛋白样品中蛋白质含量的方法，具有以下步骤，
1)采用DNS法制备葡萄糖标准曲线，采用BCA法制备葡萄糖标准曲线，采用BCA法制备牛血清蛋白标准曲线；
2)将富含还原糖的蛋白样品研磨、离心，取上清液定容，得到富含还原糖的蛋白样品液；
3)在步骤2)所得蛋白样品液中取样，采用DNS法测定样品中还原糖的OD值，记为OD1，将OD1代入步骤1)DNS法制备葡萄糖标准曲线中，得到步骤2)所得蛋白样品液中还原糖的浓度，记为C1；
4)将步骤3)所得C1代入步骤1)BCA法制备葡萄糖标准曲线中，得到对应的OD值，记为OD2；
5)在步骤2)所得蛋白样品液中取样，采用BCA法测定样品中还原糖+蛋白质的OD值，记为OD3；
6)步骤5)所得OD3减去步骤4)所得OD2，得OD4，将OD4代入步骤1)BCA法制备牛血清蛋白标准曲线中，得到步骤2)所得蛋白样品液中蛋白质的浓度，记为C2，C2与步骤2)定容体积相乘得到富含还原糖的蛋白样品中蛋白质含量。
步骤2)中所述研磨是将富含还原糖的样品与pH＝7的磷酸缓冲液在研钵中混合后研磨，所述离心的转速为12000r/min，取上清液。
步骤1)采用DNS法制备葡萄糖标准曲线的步骤为，
1)分别配置浓度为0mg/ml、0.48mg/ml、0.56mg/ml、0.64mg/ml、0.72mg/ml的葡萄糖标准溶液；
2)按5体积份葡萄糖标准溶液混合4体积份DNS反应试剂的比例添加DNS反应试剂混匀,混匀后，沸水浴5min，快速冷却，用蒸馏水定容；
3)步骤2)各定容后的葡萄糖标准溶液在UV波长540nm测定，得到对应吸光值；
4)以各葡萄糖标准溶液浓度为横坐标，各葡萄糖标准溶液吸光值为纵坐标，制备得到葡萄糖标准曲线。
步骤1)采用BCA法制备葡萄糖标准曲线的步骤为，
1)分别配置浓度为0mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml的葡萄糖标准溶液；
2)按5体积份葡萄糖标准溶液混合4体积份BCA反应试剂的比例添加BCA反应试剂混匀,混匀后，沸水浴5min，快速冷却，用蒸馏水定容；
3)步骤2)各定容后的葡萄糖标准溶液在UV波长562nm测定，得到对应吸光值；
4)以各葡萄糖标准溶液浓度为横坐标，各葡萄糖标准溶液吸光值为纵坐标，制备得到葡萄糖标准曲线。
步骤1)采用BCA法制备牛血清蛋白标准曲线的步骤为，
1)分别配置浓度为0mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、1mg/ml的蛋白标准溶液；
2)按5体积份牛血清标准溶液混合4体积份BCA反应试剂的比例添加BCA反应试剂混匀，混匀后，沸水浴5min，快速冷却，用蒸馏水定容；
3)步骤2)各定容后的蛋白标准溶液在UV波长562nm测定，得到对应吸光值；
4)以各蛋白标准溶液浓度为横坐标，各蛋白标准溶液吸光值为纵坐标，制备得到蛋白标准曲线。
本发明测定方法先用DNS法测定富含还原糖的蛋白样品中还原糖的浓度，测得的还原糖OD值为富含还原糖的蛋白样品中还原糖的准确OD值，代入DNS法制备葡萄糖标准曲线得出的浓度为富含还原糖的蛋白样品中还原糖的准确浓度。再将得到的还原糖的准确浓度代入BCA法制备的葡萄糖标准曲线中，换算得到的OD值为富含还原糖的蛋白样品采用BCA法测定的OD值中还原糖的OD值。最后，采用BCA法测定富含还原糖的蛋白样品时，BCA反应试剂与还原糖、蛋白均着色，得出的OD值减去BCA法测蛋白时应该扣除的还原糖OD贡献值，即得出富含还原糖的蛋白样品采用BCA法测蛋白质的OD值，代入BCA法制备的蛋白标准曲线中，即可得出富含还原糖的蛋白样品中蛋白质的准确浓度。
采用上述技术方案可以实现以下有益效果：
通过排除富含还原糖的蛋白样品中还原糖的干扰，实现对富含还原糖的蛋白样品中蛋白质浓度测定，经申请人实验验证，采用本发明所述方法能快速、准确定量检测富含还原糖的蛋白样品(烟叶、苹果果肉、糖尿)中蛋白的含量，实现对送检样品品质鉴定、临床检查等目的。本发明使用的试剂普通、易得，操作步骤简单、快捷，对设备要求标准底，适用于各级质检站、医院等对富含还原糖的蛋白样品进行蛋白含量测定。
附图说明
图1为采用DNS法制备的葡萄糖标准曲线；
图2为采用BCA法制备的葡萄糖标准曲线；
图3为采用BCA法制备的牛血清蛋白标准曲线。
具体实施方式
本发明使用的试剂如下：
牛血清蛋白为市售产品，纯度为98％；
葡萄糖为市售分析纯；
pH＝7磷酸缓冲液浓度为0.05mol/L，配置方法如下，
取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)配置浓度为0.05mol/L的磷酸氢二钠溶液，取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)配合浓度为0.05mol/L磷酸二氢钠溶液；取上述磷酸氢二钠溶液61ml、磷酸二氢钠溶液39ml，混合均匀后用pH计测量，pH不足7.0的添加适量的磷酸氢二钠，反之加入一定量的磷酸二氢钠溶液，直到混合后的缓冲液pH＝7.0为止。
DNS反应试剂：
称取酒石酸钾钠182.0g，溶于500ml蒸馏水中，加热(不超过50℃)，于热溶液中依次加入3，5二硝基水杨酸6.3g，NaOH 21.0g，苯酚5.0g，无水亚硫酸钠5.0g，搅拌至溶解完全，冷却后用蒸馏水定容至1000ml，贮存于棕色瓶中，室温保存。
BCA反应试剂：
A液100ml：准确称取1g BCA二钠、2g Na2CO3、0.16g酒石酸钠、0.4g NaOH、0.95NaHCO3，用适量的蒸馏水充分溶解后，用6mol/L NaOH溶液将pH调至11.25，于100ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度线；
B液50ml：准确称取2g CuSO4·5H2O于烧杯中溶解后，用蒸馏水定容至50ml即为4％硫酸铜溶液；
将A液和B液按体积比50：2混合得BCA反应试剂，现用现配(也可采用BCA试剂盒按说明书配制)。
蛋白标准溶液：
准确称取0.100g牛血清蛋白，溶于少量蒸馏水中，再用蒸馏水定容至50ml，摇匀，即为2mg/ml标准蛋白质母液；取牛血清蛋白标准母液各1ml，分别定容，得到不同浓度梯度的蛋白标准溶液。
本发明使用的仪器如下：
UV2000紫外可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)；酶标仪(美国宝特Bio-Tek)；TGL-16M高速台式冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；
ACCULAB型精密电子天平(精度0.0001g)；LJC-70型离子交换纯水器(无锡科达仪器厂)；KD-98-1型电热恒温水浴锅；85-1数显恒温磁力搅拌器(金坛市精达仪器制造有限司)；SHZ-D9型循环水式真空泵(巩义市子华仪器有限公司)；超低温保存箱(青岛海尔特种电器有限公司)；梅特勒—托利多实验室pH计(FE20)；MP2002型电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；
XK-96A快速混匀器(江苏新康医疗器械有限公司)；GZXGFNBS1(9053A)电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂)。
采用DNS法制备葡萄糖标准曲线
按表1配置葡萄糖标准溶液，葡萄糖标准溶液为2.5ml，各自加入2ml DNS反应试剂混匀后，沸水浴5min，快速冷却5min，补充蒸馏水定容体积至15ml充分混合，于UV波长540nm下快速测定OD值，OD值分别为-0.005、0.272、0.318、0.364、0.410，以各葡萄糖标准溶液的浓度为横坐标，各葡萄糖标准溶液的OD值为纵坐标，制备得到图1葡萄糖标准曲线。
该标准曲线线性方程y＝0.5772x-0.0051，相关系数R2＝0.996＞0.995该曲线可以视为DNS法葡萄糖标准曲线，在浓度0-0.72mg/ml具有良好的线性关系。
表1葡萄糖标准曲线参数
采用BCA法制备葡萄糖标准曲线
配制1mg/ml的葡萄糖标准母液，各取1ml葡萄糖标准母液分别定容配制浓度为0、0.4、0.6、0.8、1mg/ml的葡萄糖标准溶液，取各葡萄糖标准溶液2.5ml，分别加入2mlBCA反应试剂混匀后，沸水浴5min，快速冷却5min，补充蒸馏水定容体积至15ml充分混合，于UV波长562mm下快速测定OD值，测得对应吸光度为0.001、0.222、0.323、0.446、0.542，以各葡萄糖标准溶液的浓度为横坐标，各葡萄糖标准溶液的OD值为纵坐标，制备得到图2葡萄糖标准曲线。
标准曲线线性方程y＝0.5445x+0.0019，相关系数R2＝0.999>0.995，可以视为BCA法葡萄糖标准曲线，在浓度0—1mg/ml范围内具有良好的线性关系。
采用BCA法制备牛血清蛋白质标准曲线
按表2配置不同浓度梯度的牛血清蛋白标准溶液，取各牛血清蛋白标准溶液2.5ml，分别加入2mlBCA反应试剂混匀后，沸水浴5min，快速冷却5min，补充蒸馏水定容体积至15ml充分混合，于UV波长562mm下快速测定OD值，各牛血清蛋白标准溶液测得的吸光度OD值分别为0、0.06、0.142、0.205、0.285、0.402、0.66，以各牛血清蛋白标准溶液的浓度为横坐标，各牛血清蛋白标准溶液的OD值为纵坐标，制备得到图3牛血清蛋白标准曲线。
表2牛血清蛋白标准曲线参数
该标准曲线线性方程y＝0.662x+0.0047，相关系数R2＝0.998>0.995，可以视为蛋白标准曲线，在浓度0—1mg/ml范围内具有良好的线性关系。
实施例一
鲜烟叶中含有17－20％的还原糖，作为富含还原糖的蛋白检测样品。
以重庆川渝烟草公司提供的红大C37、云南K322、云南K326A02、云南K326A01、西昌为样品。
取各样品置于烤箱中，100℃干燥2小时，再称取0.2g，置于干燥的研钵中，混合10mlpH＝7的磷酸缓冲液充分研磨后，经转速为12000r/min高速离心后，取上清液并过滤，定容至100ml。
用移液枪取各定容液1ml，采用DNS法，测得各定容样品液中还原糖的吸光度OD1值，分别为0.2280、0.1160、0.115、0.088、0.1902。
用移液枪取各定容液0.1ml，采用BCA法，测得各样品定容液中还原糖+蛋白质的吸光度OD3值，分别为0.5827、0.3906、0.4374、0.411、0.459。
数据处理
1、烟叶中还原糖的含量：
将各样品定容液测出的OD1值分别代入DNS法制备的葡萄糖标准曲线线性方程y＝0.5772x-0.0051中，得到各样品定容液中还原糖的浓度值，记为C1。
2、计算BCA法制备葡萄糖标准曲线的对应值
将C1代入BCA测葡萄糖标准曲线线性方程y＝0.5445x+0.0019中，得到采用BCA法测定各样品定容液中还原糖的OD值，记为OD2。
3、烟叶中蛋白的含量测定和校正
先将含还原糖的蛋白样品用BCA法测得的OD3减去对应OD2的差值代入BCA法制备牛血清蛋白质标准曲线线性方程y＝0.662x+0.0047中，计算出BCA法测定烟叶蛋白质时其中去除还原糖干扰的蛋白的浓度，为C2。
蛋白质含量的计算方公式如下：
式中：X——样品中蛋白的百分含量(％)；
V——样品定容后的总体积(ml)；
m——所称样品质量(g)；
C2——所测样品蛋白浓度(mg/ml)；
n——稀释倍数；
得到如表3所示各样品还原糖、蛋白含量
表3五种烟叶样品中还原糖、蛋白含量
烟叶中正常的蛋白百分含量范围为5-12％，以上五个不同烟草样品的测定结果在10％左右，其均属于正常范围，说明这种方法烟叶样品中排除了还原糖对BCA测蛋白质的干扰，能够准确烟叶样品中的蛋白百分含量。
实施例二
以苹果为样品
称取苹果果肉13g，经充分研磨后置于250ml容量瓶中，加水200ml，在45℃条件下加热1h，振摇，冷却后加水定容至250ml，混匀、静置，用移液枪吸取25ml上清液于另一250ml容量瓶中定容。
用移液枪取各定容液1ml，采用DNS法，测得样品定容液中还原糖的吸光度OD1值，为0.169。
用移液枪取各定容液0.1ml，采用BCA法，测得样品定容液中还原糖+蛋白质的吸光度OD3值，为0.1813。
数据处理
1、苹果果肉中还原糖的含量：
将样品定容液测出的OD1值代入DNS法制备的葡萄糖标准曲线线性方程y＝0.5772x-0.0051中，得到各样品定容液中还原糖的浓度值，记为C1。
2、计算BCA法制备葡萄糖标准曲线的对应值
将C1代入BCA测葡萄糖标准曲线线性方程y＝0.5445x+0.0019中，得到采用BCA法测定样品定容液中还原糖的OD贡献值，记为OD2。
3、苹果果肉中蛋白的含量测定和校正
先将OD3减去对应OD2的差值代入BCA法制备牛血清蛋白质标准曲线线性方程y＝0.662x+0.0047中，计算出BCA法测定苹果果肉蛋白质时其中去除还原糖干扰的蛋白的浓度，为C2。
蛋白质含量的计算方公式如下：
式中：X——样品中蛋白的百分含量(％)；
V——样品定容后的总体积(ml)；
m——所称样品质量(g)；
C2——所测样品蛋白浓度(mg/ml)；
n——稀释倍数；
测得苹果果肉中还原糖含量为8.9％，蛋白质含量为0.28％。
实施例三
以糖尿为样品
尿常规包括尿糖、尿酮体、尿蛋白、白细胞等多项指标。这些指标可以间接反映病人的血糖水平，明确是否存在酮症酸中毒、有无泌尿系感染等情况，尿糖测定主要是测尿中的葡萄糖，可作为糖尿病诊断的参考依据，也是患者自我监测病情的最简单、最常用的手段，糖尿病病人出现蛋白尿是诊断糖尿病肾病的重要依据，因此，定量测定尿液中微量白蛋白的含量对早期发现治疗至关重要。
量取10ml糖尿(取自饭后糖尿病人)，取0.1ml糖尿稀释定容至100ml。
用移液枪取糖尿定容液1ml，采用DNS法，测得糖尿定容液中还原糖的吸光度OD1值，为0.038。
用移液枪取糖尿定容液0.1ml，采用BCA法，测得糖尿定容液中还原糖+蛋白质的吸光度OD3值，为0.141。
数据处理
1、糖尿中还原糖的含量：
将样品定容液测出的OD1值代入DNS法制备的葡萄糖标准曲线线性方程y＝0.5772x-0.0051中，得到各样品定容液中还原糖的浓度值，记为C1。
2、计算BCA法制备葡萄糖标准曲线的对应值
将C1代入BCA测葡萄糖标准曲线线性方程y＝0.5445x+0.0019中，得到采用BCA法测定样品定容液中还原糖的OD值，记为OD2。
3、糖尿中蛋白的含量测定和校正
先将OD3减去对应OD2的差值代入BCA法制备牛血清蛋白质标准曲线线性方程y＝0.662x+0.0047中，计算出BCA法测定糖尿蛋白质时其中去除还原糖干扰的蛋白的浓度，为C2。
蛋白质含量的计算方公式如下：
式中：X——样品中蛋白的百分含量(％)；
V——样品定容后的总体积(ml)；
ρ——所称样品密度(mg/ml)；
C2——所测样品蛋白浓度(mg/ml)；n——稀释倍数；
测得糖尿中还原糖含量为16.83mg/ml，蛋白质含量为7.9％。
Claims (5)
1.一种测定富含还原糖的蛋白样品中蛋白质含量的方法，其特征在于，具有以下步骤，
1)采用DNS法制备葡萄糖标准曲线，采用BCA法制备葡萄糖标准曲线，采用BCA法制备牛血清蛋白标准曲线；
2)将富含还原糖的蛋白样品研磨、离心，取上清液定容，得到富含还原糖的蛋白样品液；
3)在步骤2)所得蛋白样品液中取样，采用DNS法测定样品中还原糖的OD值，记为OD1，将OD1代入步骤1)DNS法制备葡萄糖标准曲线中，得到步骤2)所得蛋白样品液中还原糖的浓度，记为C1；
4)将步骤3)所得C1代入步骤1)BCA法制备葡萄糖标准曲线中，得到对应的OD值，记为OD2；
5)在步骤2)所得蛋白样品液中取样，采用BCA法测定样品中还原糖+蛋白质的OD值，记为OD3；
6)步骤5)所得OD3减去步骤4)所得OD2，得OD4，将OD4代入步骤1)BCA法制备牛血清蛋白标准曲线中，得到步骤2)所得蛋白样品液中蛋白质的浓度，记为C2，C2与步骤2)定容体积相乘得到富含还原糖的蛋白样品中蛋白质含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述研磨是将富含还原糖的蛋白样品与pH＝7的磷酸缓冲液在研钵中混合后研磨，所述离心的转速为12000r/min，取上清液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)采用DNS法制备葡萄糖标准曲线的步骤为：
1)分别配置浓度为0mg/ml、0.48mg/ml、0.56mg/ml、0.64mg/ml、0.72mg/ml的葡萄糖标准溶液；
2)按5体积份葡萄糖标准溶液混合4体积份DNS反应试剂的比例添加DNS反应试剂混匀,混匀后，沸水浴5min，快速冷却，用蒸馏水定容；
3)步骤2)各定容后的葡萄糖标准溶液在UV波长540nm测定，得到对应吸光值；
4)以各葡萄糖标准溶液浓度为横坐标，各葡萄糖标准溶液吸光值为纵坐标，制备得到葡萄糖标准曲线。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)采用BCA法制备葡萄糖标准曲线的步骤为：
1)分别配置浓度为0mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml的葡萄糖标准溶液；
2)按5体积份葡萄糖标准溶液混合4体积份BCA反应试剂的比例添加BCA反应试剂混匀,混匀后，沸水浴5min，快速冷却，用蒸馏水定容；
3)步骤2)各定容后的葡萄糖标准溶液在UV波长562nm测定，得到对应吸光值；
4)以各葡萄糖标准溶液浓度为横坐标，各葡萄糖标准溶液吸光值为纵坐标，制备得到葡萄糖标准曲线。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)采用BCA法制备牛血清蛋白标准曲线的步骤为：
1)分别配置浓度为0mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、1mg/ml的蛋白标准溶液；
2)按5体积份牛血清标准溶液混合4体积份BCA反应试剂的比例添加BCA反应试剂混匀，混匀后，沸水浴5min，快速冷却，用蒸馏水定容；
3)步骤2)各定容后的蛋白标准溶液在UV波长562nm测定，得到对应吸光值；
4)以各蛋白标准溶液浓度为横坐标，各蛋白标准溶液吸光值为纵坐标，制备得到蛋白标准曲线。
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