CN104897656A - 烟草蛋白质含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种烟草蛋白质含量的测定方法，该方法将待测的干烟叶粉末制备成烟叶样品原液；将样品原液中的蛋白质沉淀去除得到样品处理液，测定工作液和待测液在562nm处的吸光度值得到标准回归方程；再分别测定上述两种待测液的吸光度值，通过计算得到待测烟叶样品中总蛋白的含量。本发明所述方法能快速、准确测定烟草中蛋白质含量，并且操作简单，成本低。

Description

烟草蛋白质含量的测定方法

技术领域

本发明涉及一种蛋白质的测定方法，特别涉及烟草中的蛋白质含量的测定方法。

背景技术

烟草是我国重要的经济作物之一，在我国国民经济中占有举足轻重的地位。蛋白质是烟叶的主要成分物质之一。过多的蛋白质会增加烟叶燃吸时的苦味和烧焦羽毛味，但是蛋白质含量过低，产生的烟气就会显得平淡，口感和香味也会变差，因此准确的测定烟草中的蛋白质含量对评价烟叶的质量有重要的意义。目前烟草行业主要采用克达尔法(参见《中华人民共和国烟草行业标准》YC/T33-1996)评价烟叶的质量。克达尔法的原理是有机含氮物质中的氮，在浓硫酸及催化剂作用下，经加热消化分解，氮被分解为氨，与溶液中过量的硫酸结合成硫酸铵，保留于溶液中。向消化液中加入强碱，释放出氨，将氨蒸馏于标准酸液中，用碱标准滴定溶液返滴定，求出试样的含氮量。近年来，国内烟草检测部门引进了烟草化学自动分析仪，在克达尔法的基础上进行了改进，将克达尔法中蛋白质的前处理方法与连续流动分析测定烟草总氮的方法相结合(例如：《烟草科技/烟草化学》2004年第1期，P19)。虽然这些方法有测定准确的优点，但由于操作繁琐，测定周期长如克达尔法和连续流动分析法测定周期都大于3h，成本高，不能快速大批量的测定，因此限制了它的应用。

发明内容

针对现有技术中烟草蛋白质含量测定的缺陷，本发明提供一种烟草蛋白质含量的测定方法，该方法能快速、准确测定烟草中蛋白质含量，并且操作简单，成本低。

本发明的技术方案是：

烟草蛋白质含量的测定方法，有以下步骤：

1)取待测干烟叶粉末，加入浓度为0.05mol/L，pH＝7的磷酸缓冲液研磨，至匀无明显的丝状或块状物，得到的匀浆液，4℃下离心分离，取上清过滤；

2)步骤1)离心分离得到的残渣采用同步骤1)的方法研磨、离心、过滤，加入磷酸缓冲液，所得沉淀充分溶解、离心、过滤；两次滤液合并，用磷酸缓冲液定容，混匀，得到烟叶样品液；

3)取步骤2)所述的烟叶样品液，加入烟叶样品液的3倍体积的磷酸缓冲液，混匀，标记为1号待测液；另取步骤2)所述的烟叶样品液，加入3倍体积的15％三氯乙酸，震荡30S,37℃恒温水浴10min，再于20-25℃下离心分离，将离心后的上清液标记为2号待测液；

4)制备工作液

5)测定工作液和待测液在562nm处的吸光度值；

6)采用步骤5)的方法用已知的不同浓度牛血清白蛋白，测定相应的吸光度得到标准回归方程；在562nm处测定1号待测液的吸光度值，在562nm处测定2号待测液的吸光度值，计算1号待测液中与BCA工作液发生显色反应的总物质量，减去2号待测液中与BCA工作液发生反应的干扰物质量，所得的差值即为1号待测液中蛋白质的量，计算待测烟叶样品中总蛋白的含量。

步骤2)所述的离心分离的转速为4800r/min，离心时间5min。

步骤3)所述的离心分离的转速为10000r/min，离心10min。

步骤4)所述的每100体积份A液中BCA二钠为1重量份，Na₂CO₃为2重量份，酒石酸钠为0.16重量份，NaOH为0.4重量份，NaHCO₃为0.95重量份。

步骤4)所述的工作液的配制方法如下，A液的配置：取BCA二钠、Na₂CO₃、酒石酸钠、NaOH、NaHCO₃，充分溶解后，用6mol/L NaOH溶液调整溶液为pH为11.25，定容；B液的配置：配置4％的硫酸铜溶液；将A，B液按体积比为50：2混合得BCA工作液；

步骤5)所述的测定吸光度值时，先将待测液震荡30秒，37℃恒温水浴30min，快速冷却至室温，再进行测定。

步骤6)所述的BCA工作液的总的物质量是蛋白质+干扰物质。

步骤6)所述的计算待测烟叶样品中总蛋白的含量，用下列公式：

$X=\frac{4*V*(C_1-C_2)}{m*1000000}*100\%$

式中，X—样品中蛋白的百分含量(％)，V—样品定容后的总体积(ml)，C₁—1号待测液中与BCA反应总物质的浓度(ug/ml)，C₂—2号待测液中与BCA反应的干扰物质的浓度(ug/ml)，4—稀释倍数。

步骤6)所述的计算待测烟叶样品中总蛋白的含量，用下列公式：

干重烟叶蛋白含量(％)＝蛋白含量百分数(％)÷G

式中：G—1克被测烟叶烘烤至恒重的质量。

本发明的有益效果为：

(1)克达尔法在对样品进行前处理时需要根据烟叶中的蛋白质的等电点加入不同pH值的提取液，使蛋白质发生变性、沉淀。由于烟叶中所含蛋白质的种类很多，不同的蛋白质有不同的等电点，因此提取液的选择繁琐，并且对测定结果的影响很大。本发明的检测方法对烟叶样品的前处理的提取试剂没有特殊要求，用磷酸缓冲液作为提取液即可，简化了提取条件。

(2)本发明的待测样品处理过程不需要高温加热，并且不使用强酸(浓硫酸)强碱(氢氧化钠)，具有操作简单，使用安全，处理时间短的优点。

(3)本发明采用酶标仪检测，一次能测定多个样品，能对烟叶样品进行批量测定。

(4)本发明整个测定全过程时间只需要1h左右，极大的改善了目前国内烟叶蛋白测定方法的测定周期长的缺点。

(5)本发明将待测液中蛋白质浓度的控制在20-500ug/ml,提高了检测的精确度(RSD％<2％)，并且还具有高灵敏度。

本发明所述体积份为毫升时，其重量份为克；体积份为升时，其重量份为千克。

本发明所述碳酸钠、酒石酸钾钠、碳酸氢钠、硫酸铜、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、牛血清蛋白均采用市售的分析纯产品。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。

附图说明

图1为用牛血清蛋白的浓度和吸光度绘制的标准工作曲线。

具体实施方式

一.材料和仪器

1.试剂

本实施例BCA二钠(2,2'-联喹啉-4,4'-二甲酸二钠)(生工生物工程(上海)股份有限公司)；碳酸钠(AR)；酒石酸钾钠(AR)；碳酸氢钠(AR)；硫酸铜(AR)；磷酸二氢钠(AR)；磷酸氢二钠(AR)；牛血清蛋白(AR)(以上试剂厂家均是成都市科龙化工试剂厂)；

烟叶样品为重庆市武隆县生产的成品烟叶云烟97。

2.仪器

酶标仪(美国宝特Bio-Tek)；TGL-16M高速台式冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；ACCULAB型精密电子天平(精度0.0001g，北京赛多利斯仪器系统有限公司)；KD-98-1型电热恒温水浴锅(金坛市精达仪器制造有限公司)；SHZ-D9型循环水式真空泵(巩义市子华仪器有限公司)；梅特勒—托利多实验室PH计(FE20)；85-1数显恒温磁力搅拌器(金坛市精达仪器制造有限公司)；MP2002型电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；XK-96A快速混匀器(江苏新康医疗器械有限公司)。

二.实施例

实施例1

(1)待测液制备

准确称取0.5g干烟叶粉末样品于玻璃匀浆器中，用液料比(40ml/g)0.05mol/LpH＝7的磷酸缓冲液充分研磨，直至匀浆器壁上无看到任何明显的丝状或块状物，将上述匀浆液装于10ml离心管中，之后用5ml相同的磷酸缓冲液洗匀浆器二次，然后4800r/min，4℃离心5min。上清液用中速滤纸过滤，残渣在相同条件下重复以上研磨、离心、过滤操作1次。最后加入磷酸缓冲液，将第二次离心后沉淀充分溶解、离心、过滤。合并滤液，转入至250mL容量瓶中，用磷酸缓冲液定容至刻度线，混合均匀。取定容后的烟叶样品液2ml，加入3倍体积的磷酸缓冲液混匀，标为1号待测液。另取容后的烟叶样品液2mL，加入3倍体积的15％三氯乙酸，涡旋震荡30S,在37℃恒温水浴10min，10000r/min离心10min,将上清液标为2号待测液；

(2)BCA工作液准备

A液100ml：准确称取1g BCA二钠、2g Na₂CO₃、0.16g酒石酸钠、0.4g NaOH、0.95NaHCO₃，用适量的蒸馏水充分溶解后，用6mol/L NaOH溶液将PH调至11.25，于100ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度线；

B液50ml：准确称取2g CuSO4·5H₂O于烧杯中溶解后，用蒸馏水定容至50ml即为4％硫酸铜溶液；

将A，B液按体积比50：2混合得BCA工作液；

(3)测定步骤

按每支1.5ml离心管中加入600μL BCA工作液,75μL待测液。用涡旋振荡器充分震荡30秒后，在37℃恒温水浴30min，快速冷却至室温，用酶标仪测定562nm处的吸光度值；

(4)定量方法

按步骤(3)的方法用已知的不同浓度牛血清白蛋白，用酶标仪测定562nm处的吸光度值，所得相应的吸光度值绘制标准工作曲线，得到标准回归方程。具体方法如下：

取6个离心管，编号为A-F，分别按表1的配制方法将(2mg/mL)牛血清蛋白母液配制成终浓度为500ug/ml、250ug/ml、125ug/ml、50ug/ml、25ug/ml浓度梯度的标准蛋白溶液。

所测得的标准牛血清蛋白(BSA)回归方程如图1所示，以BSA的浓度(ug/mL)作为横坐标，用酶标仪测定562nm波长处各浓度标准蛋白的吸收值为纵坐标作图，得到标准曲线方程：y＝0.001x+0.089(y-吸光度，x-蛋白浓度ug/ml)，相关系数为R2＝0.997>0.995,该曲线可视为测定烟叶蛋白的标准曲线，将待测液吸光度带入标准曲线方程可得待测液中蛋白质浓度。该方程表明蛋白质浓度在0～0.5mg/mL范围内与BCA反应后的吸光度值和蛋白质浓度呈良好的线性关系，表明在0～0.5mg/mL范围内测定的待测液中蛋白质浓度准确。

在562nm处测定1号待测液的吸光度值，在562nm处测定2号待测液的吸光度值。计算1号待测液中与BCA工作液发生显色反应的总物质浓度，减去2号待测液中与BCA工作液发生反应的干扰物质浓度，所得的差值即为1号待测液中蛋白质的浓度，计算待测烟叶样品中总蛋白的含量，具体计算方法如下：

(1)样品中蛋白质的含量(X)计算公式：

$X=\frac{4*V*(C_1-C_2)}{m*1000000}*100\%$

(2)干重烟叶蛋白含量(％)＝X÷G

式中：X—样品中蛋白的百分含量(％)，V—样品定容后的总体积(ml)，C₁—1号待测液中与BCA反应总物质的浓度(ug/ml)，C₂—2号待测液中与BCA反应的干扰物质的浓度(ug/ml)，m—样品质量(g)，4—稀释倍数，G—1克被测烟叶烘烤至恒重的质量。

实施例2：

称取烟叶样品(C3F云85)0.5g，按实施例1所述方法得到待测液，按每支1.5ml离心管中加入600μL BCA工作液，75μL待测液，用涡旋振荡器充分震荡30秒后，在37℃恒温水浴30min，快速冷却至室温，用酶标仪测定562nm处的吸光度值其结果为：

C₁＝258.7262,C₂＝216.6875,V＝100，G＝0.913

精密度实验

采用本发明的测定方法测定成品烟叶云烟97(2012年武隆县产)上、中部烟叶中所含蛋白含量，按实施例1所述方法测定，其结果见表2。表2所述的上、中部样品的变异系数分别为1.45％、1.44％，均小于2％，说明本方法精密度较高，有较好的重复性。

加标回收率实验

(2)加标回收率P计算公式：

$P\left(\%\right)=\frac{m_3-m_1}{m_2}*100\%$

式中：m₁—本底蛋白质量(g)，m₂—加入标准蛋白质量(g)，m₃—待测液中加入标准蛋白后实际测得蛋白质量(g)。

分别在上、中部样品蛋白提取液加入不同含量的标准蛋白，然后按本法测定步骤测定待测液液蛋白含量m₁和其加入标准蛋白后的蛋白含量m₃，通过公式(2)计算其回收率，结果见表3，该方法的平均加标回收率为100.13％，表明本方法测定烟草中蛋白质的含量准确性较高。

因此，本发明的检测方法精确度好(RSD％<2％)，回收率高(100.13％)，且操作简单，处理时间短，一次能测定多个样品，更适用于烟草中蛋白质含量的测定。

Claims (9)

1.一种烟草蛋白质含量的测定方法，其特征在于，有以下步骤：

1)取待测干烟叶粉末，加入浓度为0.05mol/L，pH＝7的磷酸缓冲液研磨，至无明显的丝状或块状物，得到的匀浆液，4℃下离心分离，取上清过滤；

2)步骤1)离心分离得到的残渣采用同步骤1)的方法研磨、离心、过滤，加入磷酸缓冲液，所得沉淀充分溶解、离心、过滤；两次滤液合并，用磷酸缓冲液定容，混匀，得到烟叶样品液；

3)取步骤2)所述的烟叶样品液，加入烟叶样品液的3倍体积的磷酸缓冲液，混匀，标记为1号待测液；另取步骤2)所述的烟叶样品液，加入3倍体积的15％三氯乙酸，震荡30S,37℃恒温水浴10min，再于20-25℃下离心分离，将离心后的上清液标记为2号待测液；

4)制备工作液

5)测定工作液和待测液在562nm处的吸光度值；

6)采用步骤5)的方法用已知的不同浓度牛血清白蛋白，测定相应的吸光度得到标准回归方程；在562nm处测定1号待测液的吸光度值，在562nm处测定2号待测液的吸光度值，计算1号待测液中与BCA工作液发生显色反应的总物质量，减去2号待测液中与BCA工作液发生反应的干扰物质量，所得的差值即为1号待测液中蛋白质的量，计算待测烟叶样品中总蛋白的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)所述的离心分离的转速为4800r/min，离心时间5min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)所述的离心分离的转速为10000r/min，离心10min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4)所述的每100体积份A液中BCA二钠为1重量份，Na₂CO₃为2重量份，酒石酸钠为0.16重量份，NaOH为0.4重量份，NaHCO₃为0.95重量份。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4)所述的工作液的配制方法如下，A液的配置：取BCA二钠、Na₂CO₃、酒石酸钠、NaOH、NaHCO₃，充分溶解后，用6mol/L NaOH溶液调整溶液为pH为11.25，定容；B液的配置：配置4％的硫酸铜溶液；将A，B液按体积比为50：2混合得BCA工作液；

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤5)所述的测定吸光度值时，先将待测液震荡30秒，37℃恒温水浴30min，快速冷却至室温，再进行测定。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤6)所述的与BCA工作液反应的总的物质是蛋白质+干扰物质。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)所述的计算待测烟叶样品中总蛋白的含量，用下列公式：

$X=\frac{4*V*(C_1-C_2)}{m*1000000}*100\%$

式中，X—样品中蛋白的百分含量(％)，V—样品定容后的总体积(ml)，C₁—1号待测液中与BCA反应总物质的浓度(ug/ml)，C₂—2号待测液中与BCA反应的干扰物质的浓度(ug/ml)，4—稀释倍数。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)所述的计算待测烟叶样品中总蛋白的含量，用下列公式：

干重烟叶蛋白含量(％)＝蛋白含量百分数(％)÷G

式中：G—1克被测烟叶烘烤至恒重的质量。