CN102252987A

CN102252987A - 一种蛋白质含量检测方法

Info

Publication number: CN102252987A
Application number: CN2011101752083A
Authority: CN
Inventors: 卢山; 董源
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2011-06-27
Filing date: 2011-06-27
Publication date: 2011-11-23
Anticipated expiration: 2031-06-27
Also published as: CN102252987B

Abstract

本发明涉及一种蛋白质含量检测方法，该方法是先配制标准蛋白样品、试剂①、②、③，将标准蛋白样品制成梯度，采用微孔法或标准试管法将试剂①、②、③加入到梯度样品和待测样品中，测定吸光度，绘制标准曲线，再根据待测样品的吸光值推算浓度。本发明方法既能准确检测蛋白质含量，还能适用于含多种干扰物质的蛋白质溶液。本发明提高了蛋白质分析检测过程中对表面活性剂、还原剂、螯合剂以及含氮化合物等干扰物质的包容性，是一种简单、快速、灵敏度高而稳定性好的蛋白质浓度检测方法，在生命科学研究领域具有广泛应用前景。

Description

一种蛋白质含量检测方法

技术领域

本发明属于生物化学分析检测技术领域，具体涉及一种蛋白质含量检测方法。

背景技术

常规蛋白质浓度的检测方法主要有Lowry法、BCA(Bicinchoninic acid)法和Bradford法。Lowry法主要依据是碱性条件下Cu²⁺与肽骨架的-CO-NH-基团形成蓝色络合物，然后将福林酚试剂中的鳞钨酸和鳞钼酸还原为钨和钼蓝进一步呈色的结果。BCA方法是利用BCA能够与Lowry法第一步反应形成的Cu⁺结合而生成的蓝紫色复合物来测定的。Bradford法的依据是染料考马斯亮蓝G-250能够与蛋白质或分子量3 kD以上的肽中的赖氨酸和精氨酸结合形成有色物。这三种常用方法都是利用发色物质颜色的深浅与蛋白质浓度间存在线性关系而绘制标准曲线来测定样品中蛋白浓度的，但在实际应用中都有局限。

Lowry法操作繁琐，而且还会受到很多化学成分的影响，例如表面活性剂Triton X-100或 SDS含量仅达1％时，或者金属离子螯合剂EDTA浓度达到10 mM时，或者尿素含量达3 M，或者硫酸铵浓度达0.25 M等就会严重干扰检测结果；虽然BCA方法受表面活性剂干扰影响小，但对还原剂、金属离子螯合剂以及硫酸铵的存在很敏感。Bradford方法操作简单，但与Lowry法类似，对表面活性剂的耐受性差，当0.1% SDS或者0.5％的TritonX-100存在时，蛋白质样品吸光值会受到较大影响。所以这些方法的具体使用总会因为测定液或者蛋白质裂解液的构成而局限，或者说，如果有干扰物质存在，蛋白质浓度测定就需要针对不同的干扰物质采取不同的方法，这样给蛋白质含量测定带来不便。

因此，基于上述需要，本发明是上述方法为基础，提高了对表面活性剂、还原剂、金属离子螯合剂等干扰物质的耐受性，而且也是具有较好稳定性的蛋白质检测方法。

【英文缩写、全称及中文对照】

DTT Dithiothretol/二硫苏糖醇

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid/乙二胺四乙酸

EGTA Ethylene Glycol Tetraacetic Acid/乙二醇二乙醚二胺四乙酸

β-ME ?-Mercaptoethanol/ ?-巯基乙醇

NP-40 Nonidet P-40/乙基苯基聚乙二醇

SDS Sodium Dodecyl Sulfate/十二烷基硫酸钠

BSA Bovine serum albumin/牛血清蛋白。

发明内容

本发明为提高蛋白质检测对表面活性剂如SDS、TritonX-100和NP-40，还原剂DTT和β-巯基乙醇，螯合剂EDTA和EGTA以及含氮化合物硫酸铵和尿素等干扰物质的包容性，提供一种简单、快速而稳定性好的蛋白质浓度检测方法。

本发明所述的蛋白质含量检测方法，流程如图11所示，包括如下步骤：

1)标准蛋白溶液的制备：称取牛血清蛋白（BSA）溶解于蒸馏水中，将终浓度调配为4 mg/mL，即为配制的标准蛋白溶液样品；

2）试剂配制

试剂 ① 　

碳酸钠 1.89 mol/L

氢氧化钠 1.00 mol/L

试剂 ②

酒石酸钠 0.25 %

硫酸铜 0.125 %

SDS 2.5 %

配制试剂 ②时，先将酒石酸钠和硫酸铜混合静置后再加入SDS；

试剂 ③

将2 N 福林酚溶液稀释，然后调整pH为1，最后定容至10倍体积；

3)检测蛋白质含量

将配制好的标准蛋白溶液按照二倍稀释法采用蒸馏水稀释至不同梯度浓度，然后于96孔细胞培养板或者试管中分别加入同体积的标准蛋白溶液各梯度样品、待测样品、蒸馏水；

将试剂①和试剂②以50/1的体积比混合配成混合液，向上述96孔或者试管中分别加入样品体积5倍的试剂①和试剂②的混合液；再分别加入样品体积40倍的试剂 ③，混合均匀，在室温下放置30 min，在570-630 nm范围任一波长下测定吸光值，根据标准蛋白溶液各梯度样品对应的数据绘制标准曲线，并推定线性回归方程，再将待测样品吸光值导入标准曲线回归方程计算样品中蛋白质含量。

本发明步骤3）中检测蛋白质含量的标准流程(微孔法和标准试管法)：将配制完成的BSA标准蛋白溶液按照二倍稀释法采用蒸馏水稀释至最低浓度为0.0625 mg/mL的7个梯度浓度，然后于96孔细胞培养板或者试管中分别加入 5 μL或者100 μL的BSA标准溶液各梯度样品，空白对照为同体积的蒸馏水。另外按照标准蛋白溶液同样体积将0.1-4 mg/mL浓度区间的蛋白样品分别加入96孔板或者试管中，每个标准或者待测样品至少有3个重复样；

根据实际计算所需用量按照2）试剂配制说明准备试剂①和试剂②的混合液，对96孔或者试管内各样品需分别加入25 μL或者500 μL的试剂①和试剂②的混合液；

然后于96孔或试管各样品中分别加入200 μL或者4 mL试剂 ③，混合均匀，在室温下放置30 min，在570-630 nm范围任一波长下测定吸光值。微孔法样品可直接利用酶标仪进行测定，试管法样品则将1 mL发色液倒入塑料比色杯在分光光度计中进行检测。获得数据后绘制标准曲线，并推定线性回归方程，再将待测样品吸光值导入标准曲线回归方程计算样品中蛋白质含量。

本发明是在Lowry法基础上进行改进完善的。Lowry法是首先在蛋白质样品溶液加入NaOH溶液而使之处于碱性条件下，然后与现配的由2% Na₂CO₃:1% CuSO4:2％酒石酸钾钠(100/1/1)组成的混合液混合，室温放置10 min，再加入福林酚试剂放置30-60 min，于550 nm波长测定吸光度。本发明将Lowry法的第一步和第二步反应试剂做了重新安排，并且加入了表面活性剂成分SDS。此外，第三步反应步骤没有直接使用福林酚试剂，而是将其稀释使用，检测吸光值的波长处于570-630 nm之间都可以，以590 nm为最佳，且发色液可以保持数小时内没有显著变化。本发明是对干扰物质耐受性好及发色液稳定的蛋白质检测方法。

本发明以Lowry法为基础，结合三种常规蛋白质浓度测定方法的优点，绘制的标准曲线线性关系好，对干扰物质耐受性提高，见表1：

表1. 已测试的常见干扰物质及最大抗干扰浓度

干扰物质	最大干扰浓度
		SDS	10%
NP-40	2％
		TritonX-100	1%
EDTA	25 mM
		EGTA	1 mM
DTT	1 mM
		?-ME	1 mM
(NH₄)₂SO4	0.5 M
		Urea	4 M

本发明操作简单，速度快，灵敏度高，可检测浓度低至0.1 mg/mL，实验结果重复性好，测定成本低，在生命科学研究领域具有广泛应用前景。

附图说明

图1是BSA标准曲线。

图2是最大浓度吸光值随时间的变化曲线。

图3是表面活性剂SDS存在下蛋白质含量的测定。

图4是表面活性剂TritonX-100或NP-40存在下蛋白质含量的测定。

图5是还原剂DTT存在下哺乳动物细胞蛋白质的测定。

图6是还原剂β-巯基乙醇存在下哺乳动物细胞蛋白质的测定。

图7是金属离子螯合剂EDTA存在下蛋白质含量的测定。

图8是金属离子螯合剂EGTA存在下蛋白质含量的测定。

图9是含氮物质硫酸铵对蛋白质含量测定的影响。

图10是含氮物质尿素对蛋白质含量测定的影响。

图11是本发明检测流程示意图。

具体实施方式

下述实施例说明本发明而不限制本发明的保护范围。

【实施例1】波长分别为570、595和630 nm 的BSA标准曲线及发色产物稳定性实验

1）标准样品的制备

称取牛血清蛋白(BSA)溶解于蒸馏水中，将终浓度调配为4 mg/mL，即为配制的标准样品。

2）试剂配制

试剂 ①：　

碳酸钠 1.89 mol/L

氢氧化钠 1.00 mol/L

试剂 ②：

酒石酸钠 0.25 %

硫酸铜 0.125 %

SDS 2.5 %

配制时，需先将酒石酸钠和硫酸铜混合静置后再加入SDS。

使用时，试剂①和试剂②以50/1比例混合现配现用。

试剂 ③：

将2 N 福林酚溶液稀释，然后调整pH为1，最后定容为10倍体积。

3）蛋白质浓度标准曲线的制备(微孔法和标准试管法)

将配制完成的BSA标准蛋白溶液按照二倍稀释法采用蒸馏水连续稀释至最低浓度为0.0625 mg/mL，总共7个BSA梯度浓度，然后于96孔细胞培养板或者试管中分别加入 5 μL或者100 μL的BSA标准溶液各梯度样品，空白对照为同体积的蒸馏水，每个标准或者待测样品至少有3个重复样。

接下来根据实际所需计算用量，按照上述2）试剂配制中说明准备试剂①和试剂②的混合液，然后对96孔和试管内各样品分别加入25 μL或者500 μL的试剂①和试剂②的混合液。

再将96孔或试管内各样品中分别加入200 μL或者4 mL试剂 ③，混合均匀，室温下放置30 min，在570、595或630 nm波长下测定吸光值。微孔法样品可直接利用酶标仪进行测定，试管法样品则将1 mL发色液倒入塑料比色杯在分光光度计中进行检测。另外，标准样品各溶液在放置1 h，2 h，4 h，8 h和24 h后还继续在630 nm波长下检测吸光值，比较标准曲线稳定性。获取前者数值后输入Excel软件，横坐标为样品浓度，纵坐标为对应吸光值，然后添加趋势线，如图1中所示，即为实际使用的蛋白质浓度测定标准曲线，也取得不同波长下的回归方程及线性相关系数。由图1A可见，当波长为570、595或630 nm的时候相应的回归曲线R²值分别为0.997，0.998或0.998，均大于标准曲线的常规R²标准（0.996），说明在570-630 nm波长范围下本发明都可以用来绘制标准曲线。630 nm波长下检测吸光值持续到24 h，微孔内BSA浓度为4 mg/mL下随时间变化的吸光值曲线结果见图2，可以看出最大浓度最大吸光值在4 h内几乎没有变化，8 h后吸光值下降1.8%，24 h后吸光值下降14％，但仍然可以绘制线性相关性好的标准曲线，证实本发明应用于检测蛋白质含量时在数小时内发色产物颜色能够保持稳定，实际应用中有利于检测操作。

所有实验至少有2次重复。在此显示的测定数值都以平均值±SEM表示，当2组数据进行比较时，采用GraphPad Prism software (version 5.0)的学生双尾T检验(P<0.05)，平均值水平有显著差异以*表示。

【实施例2】表面活性剂干扰下哺乳动物细胞蛋白质含量的测定

1）标准样品的制备

2）试剂配制

试剂 ① 　

碳酸钠 1.89 mol/L

氢氧化钠 1.00 mol/L

试剂 ②

酒石酸钠 0.25 %

硫酸铜 0.125 %

SDS 2.5 %

配制时，需先将酒石酸钠和硫酸铜混合静置后再加入SDS。

使用时，试剂①和试剂②以50/1比例混合现配现用。

试剂 ③

3）哺乳动物细胞培养及细胞全蛋白质提取

将1.0X10⁶人前列腺癌PC-3 细胞接种于10 mL含5％FBS-MEM培养基的100 mm细胞培养皿，在5% CO₂，37 ℃细胞培养箱内培养，生长至70-90％饱和时，用4℃预冷的PBS(-)洗涤2次后，加入500 μL预冷的PBS(-)用刮棒冰上收集细胞，并平均分配细胞液于1.5 mL离心管，然后4℃，10000xg，10 min离心去上清，再各自加入不同成分的细胞裂解液，涡旋振荡，放置冰上30 min，收集上清液用于蛋白质含量测定，也可以-20 ℃保存备用。

4） 10X哺乳动物细胞裂解液配制

Tris-HCl (pH7.5) 200 mM

NaCl 1.5 M

EDTA 10 mM

配制完成后，将上述溶液贮存于-20^oC。使用时稀释10倍，并加入1 mM Na₃VO₄，1 mM PMSF和蛋白酶cocktail抑制剂(Sigma)，然后添加SDS，调整其含量分别为0，1％，2.5％，5％，7.5％和10％；或者添加TritonX-100，浓度分别为0，1％，2%，3%和4％，NP-40的添加与TritonX-100相似。

5）表面活性剂存在下对蛋白质含量测定的影响(微孔法和标准试管法)

将配制完成的BSA标准蛋白溶液按照二倍稀释法采用蒸馏水连续稀释至最低浓度为0.0625 mg/mL，然后于96孔细胞培养板或者试管中分别加入 5 μL或者100 μL的BSA标准溶液各梯度浓度样品，空白对照为同体积的蒸馏水。同时，采用不同细胞裂解液收集哺乳动物细胞蛋白质样品，并调整细胞蛋白质浓度至0.1-4 mg/mL浓度区间，再将含有不同表面活性剂浓度的细胞蛋白样品按照BSA标准蛋白样品同样的体积分别加入96孔板或者试管中，每个标准或者待测样品至少有3个重复样。

再将96孔或者试管内各标准和待测样品分别加入200 μL或者4 mL试剂 ③，混合均匀，室温下放置30 min，在595 nm波长下测定吸光值。微孔法样品可直接利用酶标仪进行测定，试管法样品则将1 mL发色液倒入塑料比色杯在分光光度计中进行检测。如实施例1所述，获取BSA标准样品的数值后输入Excel软件，横坐标为浓度，纵坐标为对应吸光值，然后添加线性回归方程，即为蛋白质浓度测定标准曲线。再将待测样品吸光值导入方程，计算各种表面活性剂存在下及不同浓度下细胞蛋白质含量。结果见图3、图4，分别显示哺乳动物细胞分别在不同浓度SDS，TritonX-100和NP-40存在下的蛋白质含量检测结果，可以看出蛋白质溶液中SDS，TritonX-100和NP-40含量分别达到10％，1％和2％时，蛋白质含量测定几乎不受影响。

【实施例3】还原剂干扰下哺乳动物细胞蛋白质含量的测定

1）标准样品的制备

2）试剂配制

试剂 ① 　

碳酸钠 1.89 mol/L

氢氧化钠 1.00 mol/L

试剂 ②

酒石酸钠 0.25 %

硫酸铜 0.125 %

SDS 2.5 %

配制时，需先将酒石酸钠和硫酸铜混合静置后再加入SDS。

使用时，试剂①和试剂②以50/1比例混合现配现用。

试剂 ③

3）哺乳动物细胞培养及全蛋白提取

将1.0X10⁶人前列腺癌PC-3 细胞接种于10 mL含5％FBS-MEM培养基的100 mm细胞培养皿，在5% CO₂，37 ℃细胞培养箱内培养，生长至70-90％饱和时，用4℃预冷的PBS(-)洗涤后2次后，加入500 μL预冷的PBS(-)用刮棒冰上收集细胞，并平均分配细胞液于1.5 mL离心管，然后4℃，10000xg，10 min离心去上清，再加入不同成分的细胞裂解液，涡旋振荡，放置冰上30 min，收集上清液用于蛋白质含量测定，也可以-20 ℃保存备用。

4） 10X哺乳动物细胞裂解液配制

Tris-HCl (pH7.5) 200 mM

NaCl 1.5 M

EDTA 10 mM

SDS 10 %

配制完成后，将上述溶液-20^oC贮存。使用时稀释10倍，并加入1 mM Na₃VO₄，1 mM PMSF和蛋白酶cocktail抑制剂(Sigma)，然后分别加入DTT或者β-巯基乙醇，使前者浓度分别调整为0，0.5，1，2 mM，后者分别为0，1，2，3，4，5 mM。

5）还原剂干扰下对蛋白质含量测定的影响(微孔法和标准试管法)

将配制完成的BSA标准蛋白溶液按照二倍稀释法采用蒸馏水连续稀释至最低浓度为0.0625 mg/mL，然后于96孔细胞培养板或者试管中分别加入 5 μL或者100 μL的BSA标准溶液各梯度浓度样品，空白对照为同体积的蒸馏水。同时，采用不同细胞裂解液收集哺乳动物细胞蛋白质样品，并调整细胞蛋白质浓度至0.1-4 mg/mL浓度区间，再将含有不同浓度还原剂的细胞蛋白样品按照BSA标准蛋白样品同样的体积分别加入96孔板或者试管中，每个标准或者待测样品至少有3个重复样。

接下来根据实际所需计算用量，按照上述2）试剂配制说明准备试剂①和试剂②的混合液，然后对96孔和试管内各样品分别加入25 μL或者500 μL的试剂①和试剂②的混合液。

再将96孔或者试管内各标准和待测样品分别加入200 μL或者4 mL试剂 ③，混合均匀，室温下放置30 min，在595 nm波长下测定吸光值。微孔法样品可直接利用酶标仪进行测定，试管法样品则将1 mL发色液倒入塑料比色杯在分光光度计中进行检测。如实施例1所述，获取BSA标准样品的数值后输入Excel软件，横坐标为浓度，纵坐标为对应吸光值，然后添加线性回归方程，即为蛋白质浓度测定标准曲线。再将待测样品吸光值导入方程，计算两种还原剂不同浓度下细胞蛋白质含量。结果见图5、图6，比较了哺乳动物细胞在还原剂DTT或β-巯基乙醇存在下对蛋白质含量测定的影响，可以看出蛋白质溶液的DTT和β-巯基乙醇浓度在1 mM以下对蛋白质检测没有显著影响。

【实施例4】金属离子螯合剂干扰下哺乳动物细胞蛋白质含量的测定

1）标准样品的制备

2）试剂配制

试剂 ① 　

碳酸钠 1.89 mol/L

氢氧化钠 1.00 mol/L

试剂 ②

酒石酸钠 0.25 %

硫酸铜 0.125 %

SDS 2.5 %

配制时，需先将酒石酸钠和硫酸铜混合静置后再加入SDS。

使用时，试剂①和试剂②以50/1比例混合现配现用。

试剂 ③

3）哺乳动物细胞培养及全蛋白提取

将1.0X10⁶人前列腺癌PC-3 细胞接种于10 mL 含5％FBS-MEM培养基的100 mm细胞培养皿，在5% CO₂，37 ℃细胞培养箱内培养，生长至70-90％饱和时，用4℃预冷的PBS(-)洗涤后2次后，加入500 μL预冷的PBS(-)用刮棒冰上收集细胞，并平均分配收集液于1.5 mL离心管，然后4℃，10000xg，10 min离心去上清，再加入含有不同浓度螯合剂的细胞裂解液，涡旋振荡，放置冰上30 min，收集上清液用于蛋白质含量测定，也可以-20 ℃保存备用。

4） 10X哺乳动物细胞裂解液配制

Tris-HCl (pH7.5) 200 mM

NaCl 1.5 M

SDS 10 %

配制完成后，将上述溶液-20^oC贮存。使用时稀释10倍，并加入1 mM Na₃VO₄，1 mM PMSF和蛋白酶cocktail抑制剂(Sigma)，然后分别加入EDTA或者EGTA，使前者浓度分别调整为0，10，20，30，40和50 mM，后者分别为0，0.5，1和2 mM。

5）金属离子螯合剂干扰下对蛋白质含量测定的影响(微孔法和标准试管法)。

将配制完成的BSA标准蛋白溶液按照二倍稀释法采用蒸馏水连续稀释至最低浓度为0.0625 mg/mL，然后于96孔细胞培养板或者试管中分别加入 5 μL或者100 μL的BSA标准溶液各梯度浓度样品，空白对照为同体积的蒸馏水。同时，采用含有不同浓度螯合剂的细胞裂解液收集哺乳动物细胞蛋白质样品，并调整细胞蛋白质浓度至0.1-4 mg/mL浓度区间，再将溶解于不同裂解液的细胞蛋白样品按照BSA标准蛋白样品同样的体积分别加入96孔板或者试管中，每个标准或者待测样品至少有3个重复样。

再将96孔或者试管内各标准和待测样品分别加入200 μL或者4 mL试剂 ③，混合均匀，室温下放置30 min，在595 nm波长下测定吸光值。微孔法样品可直接利用酶标仪进行测定，试管法样品则将1 mL发色液倒入塑料比色杯在分光光度计中进行检测。如实施例1所述，获取BSA标准样品的数值后输入Excel软件，横坐标为浓度，纵坐标为对应吸光值，然后添加线性回归方程，即为蛋白质浓度测定标准曲线。再将待测样品吸光值导入方程，计算两种金属离子螯合剂存在下细胞蛋白质含量的变化。结果见图7、图8，对哺乳动物细胞蛋白质含量测定在金属离子螯合剂EDTA或EGTA存在下的影响进行了比较，可以看出蛋白质溶液EDTA和EGTA浓度分别为25 mM和1 mM以下对蛋白质检测没有明显干扰。

【实施例5】含氮物质干扰下哺乳动物细胞蛋白质含量的测定

1）标准样品的制备

2）试剂配制

试剂 ① 　

碳酸钠 1.89 mol/L

氢氧化钠 1.00 mol/L

试剂 ②

酒石酸钠 0.25 %

硫酸铜 0.125 %

SDS 2.5 %

配制时，需先将酒石酸钠和硫酸铜混合静置后再加入SDS。

使用时，试剂①和试剂②以50/1比例混合现配现用。

试剂 ③

3）哺乳动物细胞培养及全蛋白提取

将1.0X10⁶人前列腺癌PC-3 细胞接种于10 mL含5％FBS-MEM培养基的100 mm细胞培养皿，在5% CO₂，37 ℃细胞培养箱内培养，生长至70-90％饱和时，用4℃预冷的PBS(-)洗涤后2次后，加入500 μL预冷的PBS(-)用刮棒冰上收集细胞，并平均分配收集液于1.5 mL离心管，然后4℃，10000xg，10 min离心去上清，再加入不同成分的细胞裂解液，涡旋振荡，放置冰上30 min，收集上清液用于蛋白质含量测定，也可以-20 ℃保存备用。

4） 10X哺乳动物细胞裂解液配制

Tris-HCl (pH7.5) 200 mM

NaCl 1.5 M

EDTA 10 mM

SDS 10 %

配制完成后，将上述溶液-20^oC贮存。使用时稀释10倍，并加入1 mM Na₃VO₄，1 mM PMSF和蛋白酶cocktail抑制剂(Sigma)，然后分别加入硫酸铵或者尿素，使前者浓度分别调整为0，0.5和1 M，后者分别为0，2，4，6和8 M。

5）含氮化合物对蛋白质含量测定的影响(微孔法和标准试管法)。

将配制完成的BSA标准蛋白溶液按照二倍稀释法采用蒸馏水连续稀释至最低浓度为0.0625 mg/mL，然后于96孔细胞培养板或者试管中分别加入 5 μL或者100 μL的BSA标准溶液各梯度浓度样品，空白对照为同体积的蒸馏水。同时，采用含有不同浓度硫酸铵或者尿素的细胞裂解液收集哺乳动物细胞蛋白质样品，并调整细胞蛋白质浓度至0.1-4 mg/mL浓度区间，再将混有不同浓度含氮化合物的细胞蛋白样品按照BSA标准蛋白样品同样的体积分别加入96孔板或者试管中，每个标准或者待测样品至少有3个重复样。

再将96孔或者试管内各标准和待测样品分别加入200 μL或者4 mL试剂 ③，混合均匀，室温下放置30 min，在595 nm波长下测定吸光值。微孔法样品可直接利用酶标仪进行测定，试管法样品则将1 mL发色液倒入塑料比色杯在分光光度计中进行检测。如实施例1所述，获取BSA标准样品的数值后输入Excel软件，横坐标为浓度，纵坐标为对应吸光值，然后添加线性回归方程，即为蛋白质浓度测定标准曲线。再将待测样品吸光值导入方程，计算含氮化合物干扰下的细胞蛋白质含量。结果见图9、图10，不同浓度硫酸铵或尿素对哺乳动物细胞蛋白质含量检测的影响进行了比较，可以看出蛋白质溶液中硫酸铵或尿素浓度分别为0.5和4 M以下对蛋白质检测没有显著干扰。

Claims

1.一种蛋白质含量检测方法，包括如下步骤：

1)标准蛋白溶液的制备：称取牛血清蛋白溶解于蒸馏水中，将终浓度调配为4 mg/mL，即为配制的标准蛋白溶液样品；

2）试剂配制

试剂 ① 　

碳酸钠 1.89 mol/L

氢氧化钠 1.00 mol/L

试剂 ②

酒石酸钠 0.25 %

硫酸铜 0.125 %

SDS 2.5 %

试剂 ③

检测蛋白质含量

2.根据权利要求1所述的蛋白质含量检测方法，其特征在于，步骤3）中待测样品在检测前浓度调整至0.1-4 mg/mL。