CN103207154B - 一种蛋白质定量分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛋白质定量分析方法，属于蛋白质材料分析领域，利用蛋白质中游离酪氨酸或酪氨酸残基重氮偶合产物的紫外可见光谱特性，建立吸光度与酪氨酸含量的标准曲线，实现对酪氨酸的定量分析，进而推导出蛋白质成分的含量，本发明测试对象广，不需要对蛋白质材料进行水解，消除了水解过程对蛋白质测试精确度的影响，消除含N元素色素或染料对材料蛋白质分析结果的影响，测量简便易行、准确度高。

Description

一种蛋白质定量分析方法

技术领域

本发明属于化学分析领域，尤其涉及一种蛋白质材料定量分析的方法，特别用于指导真丝、合成蛋白质纤维、羽绒等材料的低损伤加工工艺的优化与表征。

背景技术

目前的蛋白质成分的标准定量分析方法是基于N元素含量测试的凯氏定氮法，这种方法的最大问题是只认N元素，而不考虑其来源，这就给食品、材料等领域中的蛋白质分析带来很多的麻烦，乃至给不法分子提供了可乘之机，如在奶粉中添加含N量极高的三聚氰胺，造成了及其恶劣的社会问题。同时，丝绸、羊毛、羽绒等蛋白质纤维在染整加工、服用过程中，当经受不合适的酸碱、氧化剂等化学药剂，或使用中的紫外光照、热量等外在因素的影响，会造成蛋白质成分损失。中国专利号为CN200910172516.3公开了一种食品中蛋白质含量快速检测方法，根据样品中蛋白质与检测试剂起显色反应，反应产物在610nm处有最大吸收峰，通过比较不同浓度蛋白质标准样品的Abs₆₁₀(吸光度)值，制定标准曲线，进而计算待测物中蛋白质的含量，该检测方法具有检测方便、测量速度快且检测成本较低等优点，可以满足快速检测蛋白质的需要。但这种检测方法且需要配制较为复杂的溶液，十二烷基盐组合等多种助剂的加入将使溶液浑浊，直接影响测量吸光度值的准确性，且蛋白质材料中多糖类等其他非蛋白质成分可与染料形成基色，测量不能真实反映蛋白质吸光值，并且本方法测量对象较为局限。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种准确度高、实验简便易行的蛋白质材料中蛋白质定量分析的方法。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为提供一种蛋白质定量分析方法，包括如下步骤：

(1)制备芳香胺类重氮盐；

(2)蛋白质材料与芳香胺类重氮盐进行重氮偶合；

(3)对上述重氮偶合产物进行光谱测试；

(4)根据光谱特征建立吸光度与酪氨酸含量的标准曲线；

(5)取待测样品经上述前三个步骤处理后得到其重氮偶合产物的吸光度；

(6)根据上述标准曲线的线性关系推导出其酪氨酸含量；

(7)根据待测样品的酪氨酸含量，推导出其蛋白质含量。

优选的，所述的蛋白质材料为丝素粉、丝素膜、酪素、羊毛粉、真丝、合成蛋白质纤维或羽绒材料。

优选的，所述的芳香胺类重氮盐为苯胺重氮盐、邻硝基苯胺重氮盐、间硝基苯胺重氮盐、对硝基苯胺重氮盐或者间苯二胺重氮盐。

优选的，所述的蛋白质材料为亲水性，将蛋白质材料与重氮盐进行浸染偶合工艺。

优选的，所述的蛋白质材料为疏水性，将蛋白质材料溶于有机溶剂后再与重氮盐进行浸染偶合工艺。

优选的，所述的吸光度采用分光光度计测试。

采用本发明的技术方案，不需要对蛋白质材料进行水解，消除了水解过程对蛋白质测试精确度的影响，同时本发明还可以消除含N元素色素或染料对材料蛋白质分析结果的影响，本方法简便易行、测量更准确、测试对象更广，通过对偶合反应温度和时间的控制，得到的重氮偶合产物较纯，便于后面光谱测量的进行。

对于蛋白质材料采取浸染偶和工艺使蛋白材料与重氮盐充分发生偶合反应。对于亲水性蛋白质材料，保证重氮盐稍过量；对于疏水性蛋白质材料，将材料溶于有机溶剂，便于偶合反应的充分进行。

本发明方法为蛋白质定量分析提供一种全新的思路，实验操作简便，具有重要的科学意义和实际应用的价值。

附图说明

图1是本发明酪氨酸残基重氮偶合反应机理图；

图2是本发明的偶合反应装置，其中：1-搅拌机，2-温度计，3-滴液漏斗，4-三口烧瓶，5-低温浴槽；

图3是本发明实施例偶合产物的光谱侧视图；

图4是本发明根据光谱特征建立的吸光度与酪氨酸含量的标准曲线。

具体实施方式

芳香族伯胺和亚硝酸作用生成重氮盐的反应称为重氮化。

Ar-NH₂+2HX+NaNO₂-→Ar-N₂X+NaX+2H₂O

重氮化反应要在强酸中进行，实际上是亚硝酸作用于铵离子。由于亚硝酸不稳定，通常使用亚硝酸钠和盐酸或硫酸，使反应生成的亚硝酸立刻与芳伯胺反应，避免亚硝酸的分解。为了使反应能顺利进行，必须首先把芳伯胺转化为铵正离子。芳胺的碱性较弱，因此重氮化要在较强的酸中进行。有些芳胺碱性非常弱，要用特殊的方法才能进行重氮化。重氮化是放热反应，重氮盐对热不稳定，因此要在冷却的情况下进行，并调节亚硝酸钠的加入速度，维持反应温度在0℃附近，由于重氮盐不稳定，一般就用它们的溶液，随做随用。

自重氮化反应发现以来，人们为了弄清楚其反应的影响因素，对重氮化反应的机理进行了反复研究，已普遍接受了重氮化反应的亚硝化学说即重氮化反应是由亚硝酸产生的亲电质点对游离芳伯胺基进行亲电取代反应的机理。

蛋白质材料中各氨基酸成分与比例是相对固定的，材料的聚集态结构，即无定形区的比例也是相对固定的。蛋白质材料特别是纤维材料的无定形区中，各氨基酸残基可以表现出其特征的反应活性，如酪氨酸残基对羟基苯亚甲基，即可发生特征的重氮偶合反应。本发明中蛋白质材料中酪氨酸残基与重氮盐发生重氮偶合特征反应后，其蛋白质母体将会产生特殊的光谱特性，通过酪氨酸重氮偶合产物特征波长下吸光度数值即可定量分析出酪氨酸残基的含量，进而推导出蛋白质成分的含量。重氮偶合显色反应机理如图1所示。

重氮偶合产物具有在紫外可见光谱中，具有特征吸收波长，吸收峰值与成分含量对应。

1、制备芳香胺类重氮盐：邻硝基苯胺重氮盐；

在带有电动搅拌机和冷凝器的三口烧瓶中，加入10±1ml浓盐酸和10±2ml水，剧烈搅拌，然后缓缓加入0.03±0.001mol邻硝基苯胺，加热至75℃左右，搅拌使之充分溶解，然后加入冰水，将温度降至0℃，称取0.032mol亚硝酸钠，溶解于水中，向含有邻硝基苯胺的三口烧瓶中缓慢滴加亚硝酸钠溶液，并将反应温度保持在0℃，滴加结束后继续反应20min，用淀粉-碘化钾试纸检测亚硝酸是否过量，待反应结束后，用尿素除去过量的亚硝酸，再搅拌10min，得到澄清透明的邻硝基苯胺重氮盐黄色溶液，最后保存在冰水中待用。

2、蛋白质材料与芳香胺类重氮盐进行重氮偶合；

如图2所示，在带有电动搅拌机1和冷凝器6的三口烧瓶4中，把丝素粉混合物加入到含有碳酸钠的溶液，由温度计2观察反应温度，并通过低温浴槽5使反应温度控制在2℃；剧烈搅拌，然后通过滴液漏斗3逐滴加入邻硝基苯胺重氮盐溶液，滴加结束后继续反应2h，最后用渗圈法检测反应终点。反应结束后将其酸析、静置，隔夜抽滤，室温下阴干得到黄色重氮偶合产物。

3、对上述重氮偶合产物进行光谱测试；

通过分光光度计的测试，邻硝基苯胺重氮盐与丝素粉的偶合产物在DMF中的吸收光谱如图3所示，最大吸收波长处在紫外线的UVA波段，在328nm处有最大吸收峰，记录此处的吸光度值。

4、根据光谱特征建立吸光度与酪氨酸含量的标准曲线；

丝素粉中酪氨酸含量是公知的，从而在已知丝素粉混合物浓度的情况下可计算出酪氨酸的浓度。再通过上述方法测量不同丝素粉混合物浓度下重氮偶合产物的特征(最大吸收峰值)吸光度值，绘制吸光度-酪氨酸含量标准曲线，如图4所示。

5、取待测样品经上述前三个步骤处理后得到其重氮偶合产物的吸光度，即特征(最大吸收峰值)吸光度值。

6、根据上述标准曲线的线性关系推导出其酪氨酸含量，即通过吸光度值，根据吸光度-酪氨酸含量标准曲线图可得出其对应的酪氨酸含量。

7、根据待测样品的酪氨酸含量，推导出其蛋白质含量。

酪氨酸含量在蛋白中的占比是固定的，通过氨基酸分析仪测定待测样品中酪氨酸的占比，进而通过酪氨酸的含量除以该占比即可推导出蛋白质含量。

Claims (6)

1.一种蛋白质定量分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备芳香胺类重氮盐；

(2)蛋白质材料与芳香胺类重氮盐进行重氮偶合；

(3)对上述重氮偶合产物进行光谱测试；

(4)根据光谱特征建立吸光度与酪氨酸含量的标准曲线；

(5)取待测样品经上述步骤(1)、(2)和(3)处理后得到其重氮偶合产物的吸光度；

(6)根据上述标准曲线的线性关系推导出其酪氨酸含量；根据待测样品的酪氨酸含量，推导出其蛋白质含量。

2.根据权利要求1所述的一种蛋白质定量分析方法，其特征在于：所述的蛋白质材料为丝素粉、丝素膜、酪素、羊毛粉、真丝、羽绒材料或者合成蛋白质纤维。

3.按照权利要求1或2所述的一种蛋白质定量分析方法，其特征在于：所述的芳香胺类重氮盐为苯胺重氮盐、邻硝基苯胺重氮盐、间硝基苯胺重氮盐、对硝基苯胺重氮盐或者间苯二胺重氮盐。

4.按照权利要求1或2所述的一种蛋白质定量分析方法，其特征在于：所述的蛋白质材料为亲水性，将蛋白质材料与重氮盐进行浸染偶合工艺。

5.按照权利要求1或2所述的一种蛋白质定量分析方法，其特征在于：所述的蛋白质材料为疏水性，将蛋白质材料溶于有机溶剂后再与重氮盐进行浸染偶合工艺。

6.按照权利要求1所述的一种蛋白质定量分析方法，其特征在于：所述的吸光度采用分光光度计测试。