CN112666356A - 一种检测痕量蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测痕量蛋白质的方法。将NanoOrange蛋白定量试剂盒中的荧光检测试剂和缓冲液混合，得到工作液，将标准品和待测样品分别与工作液混合，进行检测并计算结果。本发明中，将NanoOrange蛋白定量检测试剂盒中的荧光检测试剂和缓冲液混合，获得工作液，无需对荧光检测试剂和缓冲液进行稀释，简化了操作，此外，无需限制样品的进样量，提高了蛋白质含量检测的限度和灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种检测痕量蛋白质的方法。
背景技术
乳糖存在于大多数哺乳动物乳汁中，是一种由葡萄糖和半乳糖组成的天然二糖。乳糖可作为口服制剂、吸入剂辅料和注射剂辅料，是一种冻干粉针良好的赋形剂，但供注射用的乳糖使用时会受到一定的限制，乳糖在注射剂中慎用的原因在于其主要来源于动物，其中痕量的杂质蛋白可能引发人体的过敏反应，对用药安全造成极大的挑战，因此需要对其中杂质蛋白质进行严格控制。目前检测乳糖中蛋白质含量的方法主要有如下几种方法：
凯氏定氮法，现已发展为常量、微量、平微量凯氏定氮法以及自动定氮仪法等，其中较精密的半微量法(中国药典2020版四部0704第二法)，要求进样的含氮量为1.0mg～2.0mg，因此，该方法并不适用于定量检测乳糖中痕量的蛋白质；
考马斯亮蓝染料比色法(Bradford法)，考马斯亮蓝G-250染料游离状态下呈棕红色，与蛋白质结合后变为蓝色，在一定浓度范围内蛋白质-染料复合物吸光值与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处吸光值的变化即可定量检测蛋白质的含量。考马斯亮蓝染料比色法是目前最灵敏的蛋白质检测方法之一，如CN111060468A公开了一种快速检测甲壳素中蛋白质的方法，所述方法中以Bradford法为基础，检测甲壳素中蛋白质，最低检测量可达2.5μg/mL，然而，该方法仍无法满足精确检测乳糖中痕量蛋白质的需求；
NanoOrange方法，NanoOrange是一种新型的用于蛋白质精确定量的荧光染料，其灵敏度高于Bradford法，当NanoOrange处于溶液状态时没有荧光活性，与蛋白质作用后，在470～490nm处激发，产生570～590nm的发射光，可以使用荧光计进行检测。然而，根据现有试剂盒中提供的操作方法，荧光检测试剂和缓冲液均需进行稀释，再与待测样品混合，形成最终检测溶液，该操作方法中，当样品体积超过4％后，会导致荧光检测试剂的浓度降低，从而导致检测限和检测灵敏度受到极大限制，因此，样品进样量有限，不适用于检测含有痕量蛋白质的样品。
综上所述，提供一种能够检测痕量蛋白质的方法，对于医药领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种检测痕量蛋白质的方法，所述制备方法能够检测样品中痕量的蛋白质，在制药领域具有广阔的应用前景。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种检测痕量蛋白质的方法，所述方法包括：
将NanoOrange蛋白定量试剂盒中的荧光检测试剂和缓冲液混合，得到工作液，将标准品和待测样品分别与工作液混合，进行检测并计算结果。
本发明中，将NanoOrange蛋白定量检测试剂盒中的荧光检测试剂和缓冲液混合，获得工作液，无需对荧光检测试剂和缓冲液进行稀释，简化了操作，此外，无需限制样品的进样量，提高了蛋白质含量检测的限度和灵敏度。
优选地，所述NanoOrange蛋白定量检测试剂盒包括NanoOrange ProteinQuantitation Kit(美国英杰生命技术有限公司，Invitrogen)。
优选地，所述荧光检测试剂和缓冲液的体积比为(44～54):1，包括但不限于45:1、46:1、47:1、49:1、50:1、51:1、52:1或53:1。
优选地，所述标准品和工作液的体积比为(4～9):1，包括但不限于5:1、6:1、7:1或8:1。
优选地，所述待测样品和工作液的体积比为(4～9):1，包括但不限于5:1、6:1、7:1或8:1。
本发明可以将样品进样体积增加至最终检测溶液体积的80％～90％，从而极大地提高了蛋白质含量检测的限度和灵敏度。
优选地，所述方法还包括配制标准品的步骤。
优选地，所述配制标准品包括使用稀释剂将标准品进行稀释。
优选地，所述稀释剂包括去离子水。
优选地，所述标准品包括牛血清白蛋白和/或β-乳球蛋白。
优选地，所述将标准品和待测样品分别与工作液混合后，还包括孵育和冷却的步骤。
混合后还包括孵育和冷却的步骤。
优选地，所述孵育在避光条件下进行。
优选地，所述孵育的温度为90～96℃，包括但不限于91℃、92℃、93℃或95℃。
优选地，所述孵育的时间为8～12min，包括但不限于9min、10min或11min。
优选地，所述冷却在避光条件下进行。
优选地，所述冷却的温度为20～30℃，包括但不限于21℃、22℃、23℃、25℃、26℃、27℃或28℃。
优选地，所述冷却的时间为15～25min，包括但不限于16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min或24min。
优选地，所述检测为检测标准品和待测样品的荧光值。
优选地，所述检测的激发波长为470～500nm，包括但不限于475nm、485nm、490nm或495nm。
优选地，所述检测的发射波长为570～610nm，包括但不限于575nm、580nm、590nm、600nm或605nm。
优选地，所述计算结果包括根据标准品中蛋白质的浓度与荧光值建立标准曲线，得到线性方程，根据待测样品的荧光值及所述线性方程计算待测样品中蛋白质浓度。
作为优选的技术方案，所述检测痕量蛋白质的方法包括以下步骤：
(1)按体积比为(44～54):1将NanoOrange蛋白定量试剂盒中荧光检测试剂和缓冲液混合，得到工作液；
(2)使用去离子水对标准品进行稀释，并按体积比为(4～9):1将稀释后标准品和待测样品分别与工作液混合，随后于90～96℃避光孵育8～12min，于20～30℃避光冷却15～25min；
(3)以激发波长为470～500nm，发射波长为570～610nm，使用酶标仪检测标准品和待测样品的荧光值；
(4)根据标准品中蛋白质的浓度与荧光值建立标准曲线，得到线性方程，根据待测样品的荧光值及所述线性方程计算待测样品中蛋白质浓度。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明中，将NanoOrange蛋白定量检测试剂盒中的荧光检测试剂和缓冲液混合，获得工作液，无需分别对荧光检测试剂和缓冲液进行稀释，简化了操作；
(2)本发明使待测样品的进样体积提高到最终检测溶液体积的90％，提高了蛋白质含量检测的限度和灵敏度；
(3)本发明的检测痕量蛋白质的方法，操作简单，在制药领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中检测痕量蛋白质的方法的流程图；
图2为实施例1中标准品中蛋白质浓度和荧光强度关系图；
图3为对比例1中标准品中蛋白质浓度和荧光强度关系图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
本发明实施例所使用试剂：NanoOrange Protein Quantitation Kit(Invitrogen，Catlog No.N6666)试剂盒，其中包括荧光检测试剂NanoOrange proteinquantitation reagent(500X)，以下简称R，检测缓冲液NanoOrange proteinquantitation diluent(10X)，以下简称D；标准牛血清蛋白(20.7mg/瓶，中国食品药品检定研究院)；待测乳糖-1(DFE Pharma，RespitoseSV003，批号10424CP)；待测乳糖-2(DFEPharma，LactohaleLH200，批号10549N6)。
所使用仪器：多功能酶标仪(Perkin Elmer，EnSpire Multimode Plate Reader)；分析天平(Mettler Toledo XSE105)；恒温均匀仪(杭州米欧仪器有限公司，MTH-100)。
实施例1
本实施例提供一种检测痕量蛋白质的方法，所述检测痕量蛋白质的方法的检测过程如图1所示，具体过程包括以下步骤：
(1)使用移液器移取1mL D试剂，置于离心管中，加入20μL R试剂，涡旋混合均匀，得到工作液，并用铝箔封口，避光保存；
(2)取20.7mg牛血清白蛋白，用去离子水溶解，转移至10mL容量瓶中，使用去离子水定容，得到浓度为2070μg/mL的储备液，使用移液器吸取1mL储备液，置于100mL容量瓶中，使用去离子水定容，得到浓度为20.7μg/mL的标准品溶液，分别吸取标准品溶液2.5mL、5mL、7.5mL、10.0mL和12.5mL，置于50mL容量瓶中，使用去离子水定容，得浓度分别为1.035μg/mL、2.07μg/mL、3.105μg/mL、4.14μg/mL和5.175μg/mL的标准品溶液，取500μL浓度为1.035μg/mL的标准品溶液，加入500μL去离子水，混合均匀，得到浓度为0.518μg/mL的标准品溶液，以去离子水作为浓度为0μg/mL的标准品溶液；
称取待测乳糖-1和待测乳糖-2各3份，每份质量如下：待测乳糖-1(3157.82mg，3157.77mg，3157.79mg)，待测乳糖-2(3157.86mg，3157.79mg，3157.80mg)，将上述6份乳糖分别溶于60mL去离子水中，形成透明澄清的溶液，作为待测样品；
(3)分别取450μL标准品溶液及待测样品溶液，置于离心管中，加入50μL步骤(1)制备的工作液，涡旋混匀，于93℃恒温均匀仪孵育10min，避光，孵育后，25℃下避光冷却20min，将样品转移至96孔板(黑色透明底)，每孔200μL，每个样品做两个复孔，设置激发波长为485nm，发射波长为590nm，于酶标仪上测量所有标准品及样品的荧光值；
(4)根据标准品中蛋白质的浓度与荧光值建立标准曲线，如图2所示，并得到线性方程y＝411.16x+127.83，R2＝0.9889(y为荧光值，x为标准品中蛋白质浓度)，根据待测样品的荧光值及该线性方程计算乳糖样品中蛋白质浓度C，并由式(1)计算乳糖样品中蛋白质含量。
A＝C×60/m×100％ (1)
式(1)中，A为乳糖样品中蛋白质含量(％)，C为乳糖样品中蛋白质浓度(μg/mL)，m为称取的乳糖样品的质量(μg)。
按照上述方法计算得到乳糖-1中蛋白质含量为0.0031％±0.0005％，乳糖-2中蛋白质含量为0.0014％±0.0002％，最低检测限(可检测待测样品最低蛋白质浓度)为0.518μg/mL，按照乳糖浓度50mg/mL计算，可达0.0010％，按照乳糖浓度100mg/mL计算，可达0.0005％(注：不同仪器，灵敏度不同，可达到的检测限也可能有区别)。
对比例1
本对比例按NanoOrange Protein Quantitation Kit(Invitrogen，CatlogNo.N6666)试剂盒说明书进行蛋白质含量检测，包括以下步骤：
(1)取4.2mL试剂盒中NanoOrange Protein quantitation diluent(10×)，加入37.8mL去离子水，混合均匀，再加入84μL NanoOrange Protein quantitation reagent(500×)，混合均匀，作为工作液。并用铝箔封口，避光保存；
(2)取20.7mg牛血清白蛋白，用去离子水溶解，转移至10mL容量瓶中，使用去离子水定容，得到浓度为2070μg/mL的储备液，使用移液器吸取1mL储备液，置于100mL容量瓶中，使用去离子水定容，得到浓度为20.7μg/mL的标准品溶液，分别吸取2.5mL和5mL标准品溶液，置于50mL容量瓶中，使用去离子水定容，得浓度分别为1.035μg/mL和2.07μg/mL的标准品溶液。取750μL浓度为2.07μg/mL的标准品溶液，加入250μL去离子水，混合均匀，得到浓度为1.55μg/mL的标准品溶液，分别取800μL、600μL、400μL、200μL、100μL和50μL浓度为1.035μg/mL的标准品溶液置于离心管中，分别加入200μL、400μL、600μL、800μL、900μL和950μL去离子水，混合均匀，得浓度为0.828μg/mL、0.621μg/mL、0.414μg/mL、0.207μg/mL、0.104μg/mL、0.052μg/mL的标准品溶液，以去离子水作为浓度为0μg/mL的标准品溶液；
(3)取20μL标准品溶液，置于离心管中，加入480μL步骤(1)制备的工作液，涡旋混匀，于93℃恒温均匀仪孵育10min，避光，孵育后，室温下避光冷却20min，将样品转移至96孔板(黑色透明底)，每孔200μL，每个样品做两个复孔，设置激发波长为485nm，发射波长为590nm，于酶标仪上测量所有标准品及样品的荧光值；
(4)根据标准品中蛋白质的浓度与荧光值建立标准曲线，结果如图3所示，测得的荧光值与蛋白质浓度不存在线性关系，因此无法计算样品中蛋白质浓度。
综上所述，本发明中，将NanoOrange蛋白定量检测试剂盒中的荧光检测试剂和缓冲液混合，获得工作液，无需对荧光检测试剂和缓冲液进行稀释，简化了操作，此外，无需限制样品的进样量，提高了蛋白质含量检测的限度和灵敏度。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种检测痕量蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括：
将NanoOrange蛋白定量检测试剂盒中的荧光检测试剂和缓冲液混合，得到工作液，将标准品和待测样品分别与工作液混合，进行检测并计算结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光检测试剂和缓冲液的体积比为(44～54):1；
优选地，所述标准品和工作液的体积比为(4～9):1；
优选地，所述待测样品和工作液的体积比为(4～9):1。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括配制标准品的步骤；
优选地，所述配制标准品包括使用稀释剂将标准品进行稀释；
优选地，所述稀释剂包括去离子水；
优选地，所述标准品包括牛血清白蛋白和/或β-乳球蛋白。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述将标准品和待测样品分别与工作液混合后，还包括孵育和冷却的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述孵育在避光条件下进行；
优选地，所述孵育的温度为90～96℃；
优选地，所述孵育的时间为8～12min。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述冷却在避光条件下进行；
优选地，所述冷却的温度为20～30℃；
优选地，所述冷却的时间为15～25min。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述检测为检测标准品和待测样品的荧光值。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述检测的激发波长为470～500nm；
优选地，所述检测的发射波长为570～610nm。
9.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述计算结果包括根据标准品中蛋白质的浓度与荧光值建立标准曲线，得到线性方程，根据待测样品的荧光值及所述线性方程计算待测样品中蛋白质浓度。
10.根据权利1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)按体积比为(44～54):1将NanoOrange蛋白定量检测试剂盒中荧光检测试剂和缓冲液混合，得到工作液；
(2)使用去离子水对标准品进行稀释，并按体积比为(4～9):1将稀释后标准品和待测样品分别与工作液混合，随后于90～96℃避光孵育8～12min，于20～30℃避光冷却15～25min；
(3)以激发波长为470～500nm，发射波长为570～610nm，使用酶标仪检测标准品和待测样品的荧光值；
(4)根据标准品中蛋白质的浓度与荧光值建立标准曲线，得到线性方程，根据待测样品的荧光值及所述线性方程计算待测样品中蛋白质浓度。
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