CN112945883A - 一种酶法制备医药中间体的酶残留检测方法 - Google Patents
一种酶法制备医药中间体的酶残留检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112945883A CN112945883A CN202110342182.0A CN202110342182A CN112945883A CN 112945883 A CN112945883 A CN 112945883A CN 202110342182 A CN202110342182 A CN 202110342182A CN 112945883 A CN112945883 A CN 112945883A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- enzyme
- standard curve
- preparing
- working
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 42
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 50
- 239000012224 working solution Substances 0.000 claims abstract description 35
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 claims abstract description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000012490 blank solution Substances 0.000 claims abstract description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical group OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 15
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 12
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- 239000012450 pharmaceutical intermediate Substances 0.000 claims description 7
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- AUPXFICLXPLHBB-UHFFFAOYSA-L disodium;2-(4-carboxylatoquinolin-2-yl)quinoline-4-carboxylate Chemical class [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)[O-])=CC(C([O-])=O)=C21 AUPXFICLXPLHBB-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 5
- HELHAJAZNSDZJO-OLXYHTOASA-L sodium L-tartrate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O HELHAJAZNSDZJO-OLXYHTOASA-L 0.000 claims description 5
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000001433 sodium tartrate Substances 0.000 claims description 5
- 229960002167 sodium tartrate Drugs 0.000 claims description 5
- 235000011004 sodium tartrates Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000012085 test solution Substances 0.000 claims description 3
- PTVDYARBVCBHSL-UHFFFAOYSA-N copper;hydrate Chemical compound O.[Cu] PTVDYARBVCBHSL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- WDLWHQDACQUCJR-ZAMMOSSLSA-N (6r,7r)-7-[[(2r)-2-azaniumyl-2-(4-hydroxyphenyl)acetyl]amino]-8-oxo-3-[(e)-prop-1-enyl]-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylate Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)/C=C/C)C(O)=O)=CC=C(O)C=C1 WDLWHQDACQUCJR-ZAMMOSSLSA-N 0.000 description 2
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 229960002580 cefprozil Drugs 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N Atorvastatin Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N 0.000 description 1
- XUKUURHRXDUEBC-UHFFFAOYSA-N Atorvastatin Natural products C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 XUKUURHRXDUEBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229960005370 atorvastatin Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012152 bradford reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
- G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/38—Diluting, dispersing or mixing samples
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及酶蛋白残留检测技术领域,尤其是一种酶法制备医药中间体的酶残留检测方法,包括以下步骤:(1)配制两种工作液;(2)配制标准曲线溶液;(3)制备供试品测定溶液;(4)制备空白溶液;(5)计算酶蛋白残留量。该方法打破了常规只能水相检测蛋白的壁垒,通过双相体系作为供试品的检测溶液,解决了大部分医药中间体均不能很好的水溶,无法使用常规方法进行其酶蛋白残留检测的问题。该方法操作简单,试剂耗材经济实惠,重现性较好,准确性高,是一种经济化的通用检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及酶蛋白残留检测技术领域,具体领域为一种酶法制备医药中间体的酶残留检测方法。
背景技术
随着绿色化学的倡导,越来越多的手性医药中间体的制备使用生物酶作为手性催化剂,在常规的产物萃取手段中,会涉及到催化剂残留问题,酶作为一种外源性生物大分子,可能会引起诸多不良反应,与药品安全性密切相关。
以合成总路线中,需要使用到多步酶法反应的阿托伐他汀中间体A8(CAS号:209995-38-0)为例(路线如下),A8难溶于水,通用的Bradford或BCA法或Lowry 法均不适用于该产品中的酶残留测定,因此,从药品质控角度和法规要求考虑,均有必要严格监控终产品中酶残留量,因此,酶残留检测方法的开发是非常有必要的。
CN110954392A提供了一种酶法制备头孢丙烯中酶蛋白残留的检测方法,该方法以Braford法作为原有方法,在此基础上添加了一步碳酸氢钠促溶解的方法进行头孢丙烯中的蛋白残留检测。该方法在碳酸氢钠能够促进溶解的供试品中有很好的检测效果,但很多化药中间体或原料药并不溶于水,也不能够被碳酸氢钠促溶。
因此针对该类供试品,开发一种能够检测化药合成中的酶残留量的方法,是非常具有实用意义的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酶法制备医药中间体的酶残留检测方法,对单相BCA检测体系进行了改进,该方法通过有机相(甲醇、乙醇等)与水相互溶的体系作为供试品的检测溶液,解决了大部分医药中间体均不能很好的水溶,无法使用常规方法进行其酶蛋白残留检测的问题。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种酶法制备医药中间体的酶残留检测方法,包括以下步骤:
(1)配制两种工作液
配置A、B两种工作液,工作液A:1.4g BCA二钠盐,2.8g无水碳酸钠,0.224g酒石酸钠,0.56g氢氧化钠,1.33g碳酸氢钠定容至100mL;工作液B:0.56g硫酸铜加水定容至100mL;将工作液A与工作液B以50:1充分混匀获得工作液C;
取标准蛋白储备溶液BSA溶液,经过梯度稀释获得制备标准曲线的标准蛋白稀释液,将该稀释液与工作液C混匀,并添加一定体积的助溶剂混匀保温反应后,即可得标准曲线溶液;
(3)制备供试品测定溶液
将一定量的医药中间供试品溶解于助溶剂中,与等体积工作液C混匀后,纯水补齐与制备标准曲线溶液体积等同后,进行保温反应,作为供试品测定溶液;
(4)制备空白溶液
取与上述标准曲线溶液等体积的工作液C、助溶剂混匀后,纯水补齐与制备标准曲线溶液体积等同后,进行保温反应,作为空白溶液对照;
(5)计算酶蛋白残留量
使用酶标仪作为检测仪器,选用562nm作为检测波长,通过空白溶液扣除本底,采用标准曲线溶液测定吸光度值,同时添加供试品测定溶液,在同等条件下测定吸光度值,根据标准曲线溶液吸光度值自动生成标准曲线,同时计算出供试品中的酶蛋白残留量。
其中,所述助溶剂在测定溶液占总体积比为10%~70%。
其中,每220μl测定溶液中的所述医药中间体供试品的添加量为1~100mg。
其中,所述助溶剂为甲醇、乙醇或DMSO。
其中,所述保温反应时间为20~40min,保温温度为30~50℃。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
该方法打破了常规只能水相检测蛋白的壁垒,通过双相体系作为供试品的检测溶液,解决了大部分医药中间体均不能很好的水溶,无法使用常规方法进行其酶蛋白残留检测的问题。该方法操作简单,试剂耗材经济实惠,重现性较好,准确性高,是一种经济化的通用检测方法。
附图说明
图1为实施例1的标准曲线图;
图2为实施例2的标准曲线图;
图3为实施例3的标准曲线图;
图4为对比例的标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1 60%甲醇添加量,酶残留测定
以A8:(4R-cis)-6-氰甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯为例,进行酶残留测定,具体步骤为:
(1)溶液配制
工作液A:配制1.4%BCA二钠盐,2.8%无水碳酸钠,0.224%酒石酸钠,0.56%氢氧化钠,1.33%碳酸氢钠定容至100mL,4℃保存待用。
工作液B:配制0.56%硫酸铜定容至100mL,4℃保存待用。
工作液C:工作液A:工作液B=50:1进行混溶后获得工作液C,备用。
BSA溶液:配置1mg/mL BSA溶液,4℃保存待用。
供试品A8-甲醇待测液:称取供试品A8 0.6060g,用甲醇溶解定容至20mL,配制成A8-甲醇溶液。
(2)绘制标准曲线
以BSA为绘制标准曲线的标准蛋白,进行标准曲线绘制。其中,取标准蛋白储备溶液 BSA溶液,经过梯度稀释获得制备标准曲线的标准蛋白稀释液,将该稀释液与工作液C混匀,并添加一定体积的助溶剂混匀保温反应后,即可得标准曲线溶液。
孔号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
BSA/μL | 0 | 2 | 4 | 8 | 16 | 24 | 32 | 40 |
去离子水/μL | 40 | 38 | 36 | 32 | 24 | 16 | 8 | 0 |
工作液C/μL | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 |
A8-甲醇待测液/μL | 660 | 660 | 660 | 660 | 660 | 660 | 660 | 660 |
体系/μL | 1100 | 1100 | 1100 | 1100 | 1100 | 1100 | 1100 | 1100 |
38℃,保温30min。取220μL添加至96孔酶标板,使用酶标仪Epoch,进行562nm 处检测。获得标准曲线如图1。
曲线名称 | 曲线公式 | A | B | R2 |
标准曲线 | Y=A*X+B | 0.012 | 0.094 | 0.996 |
(3)A8(4R-cis)-6-氰甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯酶残留测定
分别取6组660μL步骤(1)配制的A8-甲醇待测溶液,加入到工作液C中,并添加 40μL去离子水混匀后,保温反应37℃,30min后,取220μL至酶标板进行测量。
孔号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
去离子水/μL | 40 | 40 | 40 | 40 | 40 | 40 |
工作液C/μL | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 |
A8-甲醇待测溶液/μL | 660 | 660 | 660 | 660 | 660 | 660 |
体系/μL | 1100 | 1100 | 1100 | 1100 | 1100 | 1100 |
测量结果如下:
(4)准确度考察
在供试品中添加不同含量的BSA,测量回收率,并测量多组,进行准确度及重现性考察。
结果如下:
(5)LOD与LOQ的计算
配制10组空白样品:
38℃,保温30min。取220μL添加至96孔酶标板,使用酶标仪Epoch,进行562nm 处检测并计算10组空白样品检测值的平均值和标准差,结果如下:
平均值x | 0.0387 |
标准差σ | 0.001059 |
A(斜率) | 0.012(见步骤2) |
通过上述结果可以看出,该方法的检测限满足检测需求。
实施例2 40%甲醇添加量下,标准曲线的建立
(1)溶液配制
工作液A:配制1.4%BCA二钠盐,2.8%无水碳酸钠,0.224%酒石酸钠,0.56%氢氧化钠,1.33%碳酸氢钠定容至100mL,4℃保存待用。
工作液B:配制0.56%硫酸铜定容至100mL,4℃保存待用。
工作液C:工作液A:工作液B=50:1进行混溶后获得工作液C,备用。
BSA溶液:配置1mg/mL BSA溶液,4℃保存待用。
(2)绘制标准曲线
以BSA为绘制标准曲线的标准蛋白,进行标准曲线绘制。
38℃,保温30min。取220μL添加至96孔酶标板,使用酶标仪Epoch,进行562nm 处检测。获得标准曲线如图2。
曲线名称 | 曲线公式 | A | B | R2 |
标准曲线 | Y=A*X+B | 0.0174 | 0.0683 | 0.996 |
实施例3 80%甲醇添加量下,标准曲线的建立
(1)溶液配制
工作液A:配制1.4%BCA二钠盐,2.8%无水碳酸钠,0.224%酒石酸钠,0.56%氢氧化钠,1.33%碳酸氢钠定容至100mL,4℃保存待用。
工作液B:配制0.56%硫酸铜定容至100mL,4℃保存待用。
工作液C:工作液A:工作液B=50:1进行混溶后获得工作液C,备用。
BSA溶液:配置1mg/mL BSA溶液,4℃保存待用。
(2)绘制标准曲线
以BSA为绘制标准曲线的标准蛋白,进行标准曲线绘制。
孔号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
BSA/μL | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 12 | 16 | 20 |
去离子水/μL | 20 | 19 | 18 | 16 | 12 | 8 | 4 | 0 |
工作液C/μL | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 |
甲醇/μL | 880 | 880 | 880 | 880 | 880 | 880 | 880 | 880 |
体系/μL | 1100 | 1100 | 1100 | 1100 | 1100 | 1100 | 1100 | 1100 |
38℃,保温30min。取200μL添加至96孔酶标板,使用酶标仪Epoch,进行562nm 处检测。获得标准曲线如图3。
曲线名称 | 曲线公式 | A | B | R2 |
标准曲线 | Y=A*X+B | 0.00642 | 0.0292 | 0.5 |
结果:R2值过低,80%添加量不能准确测量供试品中低浓度的蛋白含量。
对比例Bradford法添加甲醇验证
(1)溶液的准备
BSA溶液:配置1mg/mL BSA溶液,4℃保存待用。
市购2×Bradford Reagent(诺唯赞)。
(2)绘制标准曲线
以BSA为绘制标准曲线的标准蛋白,进行标准曲线绘制。
室温放置5min。取200μL添加至96孔酶标板,使用酶标仪Epoch,进行595nm处检测。获得标准曲线如图4。
曲线名称 | 曲线公式 | A | B | R2 |
标准曲线 | Y=A*X+B | 0.00426 | 0.616 | 0.756 |
结果:添加甲醇检测酶残留的方法在Bradford及其类似的考马斯亮蓝检测蛋白含量的方法中不适用。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.一种酶法制备医药中间体的酶残留检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)配制两种工作液
配置A、B两种工作液,工作液A:1.4g BCA二钠盐,2.8g无水碳酸钠,0.224g酒石酸钠,0.56g氢氧化钠,1.33g碳酸氢钠定容至100mL;工作液B:0.56g硫酸铜加水定容至100mL;将工作液A与工作液B以50:1充分混匀获得工作液C;
(2)配制标准曲线溶液
取标准蛋白储备溶液BSA溶液,经过梯度稀释获得制备标准曲线的标准蛋白稀释液,将该稀释液与工作液C混匀,并添加一定体积的助溶剂混匀保温反应后,即可得标准曲线溶液;
(3)制备供试品测定溶液
将一定量的医药中间供试品溶解于助溶剂中,与等体积工作液C混匀后,纯水补齐与制备标准曲线溶液体积等同后,进行保温反应,作为供试品测定溶液;
(4)制备空白溶液
取与上述标准曲线溶液等体积的工作液C、助溶剂混匀后,纯水补齐与制备标准曲线溶液体积等同后,进行保温反应,作为空白溶液对照;
(5)计算酶蛋白残留量
使用酶标仪作为检测仪器,选用562nm作为检测波长,通过空白溶液扣除本底,采用标准曲线溶液测定吸光度值,同时添加供试品测定溶液,在同等条件下测定吸光度值,根据标准曲线溶液吸光度值自动生成标准曲线,同时计算出供试品中的酶蛋白残留量。
2.根据权利要求1所述的酶法制备医药中间体的酶残留检测方法,其特征在于:所述助溶剂在测定溶液占总体积比为10%~70%。
3.根据权利要求1所述的酶法制备医药中间体的酶残留检测方法,其特征在于:每220μl测定溶液中的所述医药中间体供试品的添加量为1~100mg。
4.根据权利要求1所述的酶法制备医药中间体的酶残留检测方法,其特征在于:所述助溶剂为甲醇。
5.根据权利要求1所述的酶法制备医药中间体的酶残留检测方法,其特征在于:所述保温反应时间为20~40min,保温温度为30~50℃。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110342182.0A CN112945883A (zh) | 2021-03-30 | 2021-03-30 | 一种酶法制备医药中间体的酶残留检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110342182.0A CN112945883A (zh) | 2021-03-30 | 2021-03-30 | 一种酶法制备医药中间体的酶残留检测方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112945883A true CN112945883A (zh) | 2021-06-11 |
Family
ID=76230948
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110342182.0A Pending CN112945883A (zh) | 2021-03-30 | 2021-03-30 | 一种酶法制备医药中间体的酶残留检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN112945883A (zh) |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001289862A (ja) * | 2001-03-22 | 2001-10-19 | Konica Corp | 蛋白質の検出方法及び蛋白質検出用キット |
CN102252987A (zh) * | 2011-06-27 | 2011-11-23 | 南京师范大学 | 一种蛋白质含量检测方法 |
CN103819475A (zh) * | 2014-02-11 | 2014-05-28 | 浙江新和成股份有限公司 | 一种西他列汀及其盐的合成方法 |
CN105671126A (zh) * | 2016-03-16 | 2016-06-15 | 四川大学华西第二医院 | 一种精子质量评估的方法 |
CN105717307A (zh) * | 2016-03-16 | 2016-06-29 | 四川大学华西第二医院 | 一种精子质量评估的试剂盒及其使用方法 |
CN106885778A (zh) * | 2017-03-24 | 2017-06-23 | 依科赛生物科技(太仓)有限公司 | 一种提高蛋白浓度测定准确性的快速测定试剂及其测定方法 |
CN110954392A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-04-03 | 广药白云山化学制药(珠海)有限公司 | 一种酶法制备头孢丙烯中酶蛋白残留的检测方法 |
-
2021
- 2021-03-30 CN CN202110342182.0A patent/CN112945883A/zh active Pending
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001289862A (ja) * | 2001-03-22 | 2001-10-19 | Konica Corp | 蛋白質の検出方法及び蛋白質検出用キット |
CN102252987A (zh) * | 2011-06-27 | 2011-11-23 | 南京师范大学 | 一种蛋白质含量检测方法 |
CN103819475A (zh) * | 2014-02-11 | 2014-05-28 | 浙江新和成股份有限公司 | 一种西他列汀及其盐的合成方法 |
CN105671126A (zh) * | 2016-03-16 | 2016-06-15 | 四川大学华西第二医院 | 一种精子质量评估的方法 |
CN105717307A (zh) * | 2016-03-16 | 2016-06-29 | 四川大学华西第二医院 | 一种精子质量评估的试剂盒及其使用方法 |
CN106885778A (zh) * | 2017-03-24 | 2017-06-23 | 依科赛生物科技(太仓)有限公司 | 一种提高蛋白浓度测定准确性的快速测定试剂及其测定方法 |
CN110954392A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-04-03 | 广药白云山化学制药(珠海)有限公司 | 一种酶法制备头孢丙烯中酶蛋白残留的检测方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106556663A (zh) | 一种1-[2-(2,4-二甲基苯基硫烷基)苯基]哌嗪或其盐的检测方法 | |
Morelli | Spectrophotometric determination of paracetamol in pure form and in tablets | |
CN103698424A (zh) | 一种测定难溶性铝盐药物中有机溶剂的检测方法 | |
CN112945883A (zh) | 一种酶法制备医药中间体的酶残留检测方法 | |
Fan et al. | Flow-injection spectrophotometric determination of sulfadiazine and sulfamethoxazole in pharmaceuticals and urine | |
CN114965720B (zh) | 一种测定氢溴酸伏硫西汀有关物质的方法 | |
CN109696509A (zh) | 一种液质联用检测药品中硫酸二甲酯残留的方法 | |
JP2005500532A (ja) | 溶解度を測定するための方法 | |
CN113125602A (zh) | 一种哌柏西利中残留溶剂的检测方法 | |
CN108037230A (zh) | 一种精准测定别嘌醇固体制剂主药含量的分析方法 | |
CN112730641A (zh) | 一种n-甲基哌嗪的离子色谱测定法 | |
CN109406684A (zh) | 一种测定含色氨酸的复方氨基酸注射液中杂质b、c、d含量的检测方法 | |
CN109060978A (zh) | 一种丙烯酰氯含量的气相检测方法 | |
CN110007039A (zh) | 食用酒中甲酸的定性测定方法及其含量测定方法 | |
CN113655012A (zh) | 一种高cod废水总氮测试方法 | |
CN117554535B (zh) | 一种液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法以及试剂盒 | |
CN109212097A (zh) | 一种乙交酯含量的高效液相色谱检测方法 | |
CN117169394A (zh) | 一种亚美尼斯和可比落的检测方法 | |
CN112198237B (zh) | 一种盐酸奈康唑杂质检测控制分析方法 | |
RU2517489C1 (ru) | Способ определения пикамилона | |
CN108072709A (zh) | 测定琥珀酸曲格列汀原料药中对映异构体含量的方法 | |
CN117269345A (zh) | 小分子有机胺类物质的液相检测方法 | |
CN107462537A (zh) | 一种注射液中枸橼酸含量的测试方法 | |
JP2017040603A (ja) | Nmrを用いた薬剤のスクリーニング方法 | |
CN107561018A (zh) | 一种测定复方制剂中葡萄糖或者葡萄糖聚合物含量的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210611 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |