CN103728263B - 一种决明子多糖定量检测方法 - Google Patents

一种决明子多糖定量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于食品、药物分析领域，公开了一种决明子多糖定量检测方法。以决明子为原料，粉碎后，用丙酮浸泡脱脂去色，然后热水提取、过滤、浓缩，醇沉和聚乙烯聚吡咯烷酮处理除去多酚类和其他蛋白质，最后经离心、定容后得到决明子多糖。按照决明子多糖组成的单糖摩尔比，配制混合单糖标准样品，获得标准曲线回归方程，用显色法测定决明子多糖含量。采用本发明方法可对决明子多糖进行更为准确、快捷的定量检测。

Description

一种决明子多糖定量检测方法
技术领域
本发明属于食品、药物分析领域，具体涉及一种决明子多糖定量检测方法。
背景技术
目前，用于决明子多糖含量的测定方法主要借多糖的方法来测定决明子多糖的含量：包括显色法、同位素标记法、免疫学法、生物检测法、高效液相色谱-示差检测法和蒸发光散射检测法等。显色法不需要大型仪器、且操作简单，易满足快速测定的需要，因此广泛应用于决明子多糖的检测。例如蒽酮-硫酸法（钟先锋，谢明勇，黄桂东，决明子有效成分的提取.南昌大学学报，2004，28：96-98）和硫酸-苯酚法（郭晓强，颜军，邬晓勇，徐光域，范春华，苟小军.决明子水溶性多糖的纯化及抗氧化活性研究.食品科学，2007，08：205-208）。
但是显色法存在方法学干扰较大、重现性较差等缺点。首先，现有方法对于决明子含量的干扰物质考虑较少。常规决明子样品前处理方法“决明子-粉碎→脱脂→沸水提取→浓缩（得到粗多糖）→除蛋白→醇沉→离心转溶（得到精多糖）”，操作繁琐，样品量损失大。因此，对于显色法而言，找到影响最终结果的决明子干扰物，从而简化前处理步骤是非常必要的。聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）具有良好的生物安全性和吸附络合性，能够有效除去多酚物质、蛋白质，多酚类物质通过竞争吸附占据PVPP的吸附活性点，因此，多酚类物质被吸附的量远大于蛋白质（黎新明，崔英德，廖列文，PVPP对啤酒中多酚类物质和蛋白质的吸附作用比较.食品科学，2002，8：74-76）。目前PVPP已用于啤酒行业中除去多酚和蛋白质，从而提高稳定性（李超，刘东品，常智刚.PVPP吸附啤酒中多酚类物质的分析.酿酒科技，2009，02：110-112）。目前也有PVPP用于其他饮料中除去多酚物质的研究报道（易国斌，崔英德，廖列文，黎新明，PVPP吸附绿茶饮料中茶多酚的研究.食品科学.2001,22：14-16）。
其次，决明子多糖为多种单糖按照一定比例组成，而现有方法一般以葡萄糖为标准品，通过建立标准曲线来获取决明子多糖含量，所以结果往往与真实值偏差较大。因此该类方法测定决明子多糖含量时，对照品的选择尤为重要。
结合决明子多糖的理化性质，通过对前处理步骤、对照品的选择进行研究，研发一种标准化、简便化、快捷化的决明子专属的多糖定量检测方法，对于此类物质的生产、科研都具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种决明子多糖定量检测方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种决明子多糖定量检测方法，包括以下步骤：
（1）粉碎：将待测决明子进行粉碎，过20～80目筛得到决明子粉料，干燥后备用；
（2）脱脂去色：用丙酮浸泡决明子粉料，振摇30min后，静置30min，倒去上层清液；重复该步骤至上层清液无色后，固液分离得脱脂粉料；
（3）热水提取：用80～100℃热水对脱脂粉料进行提取2～3小时，合并滤液获得提取液；
（4）纯化处理：
a.聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）处理：按0.5～5g/100mL的浓度往步骤（3）的提取液中加入聚乙烯聚吡咯烷酮，慢速搅拌1～3小时后，过滤，合并滤液；将滤液加入去离子水，定容，得待测样品液；或，
b.聚乙烯聚吡咯烷酮/醇沉处理：按0.5～5g/100mL的浓度往步骤（3）的提取液中加入聚乙烯聚吡咯烷酮，慢速搅拌1～3小时后，过滤，合并滤液；缓慢加入相当于滤液3倍体积的无水乙醇，室温静置4小时，离心后取沉淀物；往沉淀物加入去离子水复溶，定容，得待测样品液；
（5）测定：以混合单糖标准样品建立标准曲线，以苯酚-硫酸法测定待测样品液的多糖浓度，即为待测决明子的多糖浓度；
所述混合单糖标准样品是由混合单糖配制而成，所述混合单糖包括摩尔百分数90%以上的甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖；甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖的摩尔比例为43:8:21:19。
步骤（1）所述的干燥后备用是将决明子粉料在60℃下干燥6小时，然后置于干燥器中备用。
步骤（2）所述的决明子粉料与丙酮的料液重量比为1:（15～30）。
步骤（3）所述的脱脂粉料与热水的料液比为1:（20～35）（g/mL）。
步骤（5）所述混合单糖在配成混合单糖标准样品前先于102℃烘干至恒重后备用。
步骤（5）所述混合单糖还包括葡萄糖醛酸、氨基半乳糖和阿拉伯糖；所述甘露糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖的摩尔比为43:4:1:8:21:19:5。
步骤（5）所述的苯酚-硫酸法包括如下步骤：取1mL待测样品液加入具塞试管中，加入质量分数5%的苯酚溶液2mL，混匀，缓慢加入7mL浓硫酸，混匀，沸水浴15min，取出，冰水冷却至室温，在490nm处测定吸光值；根据吸光值及标准曲线确定样品液浓度。
步骤（5）所述的苯酚-硫酸法是一种已公开并在本领域普遍使用的分析方法，如苯酚-硫酸法测定广东虫草菌丝体多糖含量（郑必胜，唐芳勇，闫文娟，李泰辉.苯酚-硫酸法测定广东虫草菌丝体多糖含量的研究.2008,08:17-21）、苯酚-硫酸法测定胶囊中多糖含量（司梁宏，张梅，马丹华，谈恒山.苯酚-硫酸显色法测定枸杞益肾胶囊中多糖的含量.中国医院药学杂志，2007，27(6)：836-837）。故任何可达到本发明该步骤目的，具体操作不同的苯酚-硫酸法，都应包含在本发明的保护范围之内。
决明子待测样品液可采用Folin-Ciocalteau(FC)法测量总多酚物质，采用Bicinchoninicacid(BCA)法测定蛋白质。
多糖、总多酚、蛋白质分别表示以波长490nm、765nm、562nm处的吸光度结合标准曲线计算浓度。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）结合决明子多糖的理化性质，通过对前处理步骤、标准样品的选择进行研究，提供一种标准化、简便化、快捷化的决明子专属的多糖定量检测方法，对于此类物质的生产、科研都具有重要意义。
（2）决明子多糖为多种单糖按照一定比例组成，按照决明子多糖组成的单糖摩尔比，建立混合单糖标准曲线，从而测定得到的决明子多糖含量与真实值偏差最小。
附图说明
图1实施例4、5及对比例2的测定多糖、总多酚以及蛋白质浓度的吸光度值；
图2葡萄糖、混合单糖I（甘露糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖）和混合单糖II(甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖)的标准曲线及公式。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
取5克决明子粉碎过20目筛，得到样品决明子粉料。
按照料液比1：15（w/w）用丙酮浸泡决明子粉料，振摇30min，静置30min；倒去上层清液，再按相同料液比重复操作，至上层无色，固液分离得决明子脱脂粉料。
经丙酮处理过的决明子脱脂粉料按照料液比1：35（g/mL），用80℃热水提取3小时，合并滤液得提取液。
PVPP/醇沉处理：按浓度0.5g/100ml往提取液中添加PVPP，慢速搅拌1小时后，过滤，合并滤液。在滤液加入相当于滤液三倍体积的无水乙醇，室温静置4小时，4500rpm转速下离心10min后取沉淀。加入去离子水复溶，定容到250mL，得待测样品液。
取待测样品液，采用硫酸-苯酚法测定多糖。多糖含量的计算按照图2混合单糖标准曲线方程Y2=5.9833x-0.0231（R2=0.9984）计算。其中混合单糖标准样品中各单糖的摩尔比例：甘露糖：葡萄糖醛酸：氨基半乳糖：葡萄糖：半乳糖：木糖：阿拉伯糖=43:4:1:8:21:19:5
实施例2
取5克决明子粉碎过40目筛，得到样品决明子粉料。
按照料液比1：15（w/w）用丙酮浸泡决明子粉料，振摇30min，静置30min；倒去上层清液，再按相同料液比重复操作，至上层无色，固液分离得决明子脱脂粉料。
经丙酮处理过的决明子脱脂粉料按照料液比1：35（g/mL），用80℃热水提取3小时，合并滤液得提取液。
PVPP/醇沉处理：按浓度2g/100ml往提取液中添加PVPP，慢速搅拌2小时后，过滤，合并滤液。在滤液加入相当于滤液三倍体积的无水乙醇，室温静置4小时，4500rpm转速下离心10min取沉淀。加入去离子水复溶，定容到250mL，得待测样品液。
取待测样品液，采用硫酸-苯酚法测定多糖。多糖含量的计算按照图2混合单糖标准曲线方程Y3=6.095x-0.0052(R2=0.9969)计算。其中混合单糖标准样品中各单糖的摩尔比例为甘露糖：葡萄糖：半乳糖：木糖=43:8:21:19。
实施例3
取5克决明子粉碎过40目筛，得到样品决明子粉料。
按照料液比1：15（w/w）用丙酮浸泡决明子粉料，振摇30min，静置30min。倒去上层清液，再按相同料液比重复操作，至上层无色，固液分离得决明子脱脂粉料。
经丙酮处理过的决明子脱脂粉料按照料液比1：35（g/mL），用80℃热水提取3小时，合并滤液得提取液。
PVPP/醇沉处理：按浓度2g/100ml往提取液中添加PVPP，慢速搅拌2小时后，过滤，合并滤液。在滤液加入相当于滤液三倍体积的无水乙醇，室温静置4小时，4500rpm转速下离心10min取沉淀。加入去离子水复溶，定容到250mL，得待测样品液。
取待测样品液，采用硫酸-苯酚法测定多糖。多糖含量的计算按照图2混合单糖标准曲线方程Y2=5.9833x-0.0231（R2=0.9984）计算。其中混合单糖标准样品中各单糖的摩尔比例：甘露糖：葡萄糖醛酸：氨基半乳糖：葡萄糖：半乳糖：木糖：阿拉伯糖=43:4:1:8:21:19:5。
实施例4
取5克决明子粉碎过40目筛，得到样品决明子粉料。
按照料液比1：15（w/w）用丙酮浸泡决明子粉料，振摇30min，静置30min；倒去上层清液，再按相同料液比重复操作，至上层无色，固液分离得决明子脱脂粉料。
经丙酮处理过的决明子脱脂粉料按照料液比1：35（g/mL），用80℃热水提取3小时，合并滤液得提取液。
PVPP处理：按浓度0.5g/100ml往提取液中添加PVPP，慢速搅拌3小时后，过滤，合并滤液，定容到250mL，得待测样品液。
取待测样品液，采用硫酸-苯酚法测定多糖，Folin-Ciocalteau(FC)法测量总多酚物质，采用Bicinchoninicacid(BCA)法测定蛋白质。多糖、总多酚、蛋白质浓度分别表示为在波长490nm、765nm、562nm的吸光度。结果见图1。
实施例5
取5克决明子粉碎过40目筛，得到样品决明子粉料。
按照料液比1：15（w/w）用丙酮浸泡决明子粉料，振摇30min，静置30min；倒去上层清液，再按相同料液比重复操作，至上层无色，固液分离得决明子脱脂粉料。
经丙酮处理过的决明子脱脂粉料按照料液比1：35（g/mL），用80℃热水提取3小时，合并滤液得提取液。
PVPP/醇沉处理：按浓度0.5g/100ml往提取液中添加PVPP，慢速搅拌2小时后，过滤，合并滤液。在滤液加入相当于滤液3倍体积的无水乙醇，室温静置4小时，4500rpm转速下离心10min取沉淀。加入去离子水复溶，定容到250mL，得待测样品液。
取待测样品，采用硫酸-苯酚法测定多糖，Folin-Ciocalteau(FC)法测量总多酚物质，采用Bicinchoninicacid(BCA)法测定蛋白质。多糖、总多酚、蛋白质浓度分别表示为在波长490nm、765nm、562nm的吸光度。结果见图1。
实施例6
取5克决明子粉碎过80目筛，得到样品决明子粉料。
按照料液比1：30（w/w）用丙酮浸泡决明子粉料，振摇30min，静置30min；倒去上层清液，再按相同料液比重复操作，至上层无色，固液分离得决明子脱脂粉料。
经丙酮处理过的决明子脱脂粉料按照料液比1：20（g/mL），用100℃热水对脱脂粉料进行提取1小时，合并滤液获得提取液。
PVPP/醇沉处理：按浓度5g/100ml往提取液中添加PVPP，慢速搅拌1小时后，过滤，合并滤液。在滤液加入相当于滤液3倍体积的无水乙醇，室温静置4小时，4500rpm转速下离心10min取沉淀。加入去离子水复溶，定容到250mL，得待测样品液。
取待测样品液，采用硫酸-苯酚法测定多糖。多糖含量的计算按照图2混合单糖标准曲线方程Y2=5.9833x-0.0231（R2=0.9984）计算。其中混合单糖标准样品中各单糖的摩尔比例：甘露糖：葡萄糖醛酸：氨基半乳糖：葡萄糖：半乳糖：木糖：阿拉伯糖=43:4:1:8:21:19:5。
对比例1
取5克决明子粉碎过20目筛，得到样品决明子粉料。
按照料液比1：15（w/w）用丙酮浸泡决明子粉料，振摇30min，静置30min；倒去上层清液，再按相同料液比重复操作，至上层无色，固液分离得决明子脱脂粉料。
经丙酮处理过的决明子脱脂粉料按照料液比1：35（g/mL），用80℃热水提取3小时，合并滤液得提取液。
PVPP/醇沉处理：按浓度0.5g/100ml往提取液中添加PVPP，慢速搅拌1小时后，过滤，合并滤液。在滤液加入相当于滤液三倍体积的无水乙醇，室温静置4小时，4000rpm转速下离心10min后取沉淀。加入去离子水复溶，定容到250mL，得待测样品液。
取待测样品液，采用硫酸-苯酚法测定多糖。多糖含量按照图2葡萄糖标准曲线方程Y1=7.525x+0.0113（R2=0.9994）计算。
对比例2
取5克决明子粉碎过40目筛，得到样品决明子粉料。
按照料液比1：15（w/w）用丙酮浸泡决明子粉料，振摇30min，静置30min；倒去上层清液，再按相同料液比重复操作，至上层无色，固液分离得决明子脱脂粉料。
经丙酮处理过的决明子脱脂粉料按照料液比1：35（g/mL），用80℃热水提取3小时，合并滤液得提取液。
醇沉处理：在提取液加入相当于提取液三倍体积的无水乙醇，室温静置4小时，4000rpm转速下离心10min后取沉淀。加入去离子水复溶，定容到250mL，得待测样品液。
取待测样品液，采用硫酸-苯酚法测定多糖，Folin-Ciocalteau(FC)法测量总多酚物质，采用Bicinchoninicacid(BCA)法测定蛋白质。多糖、总多酚、蛋白质浓度分别表示为在波长490nm、765nm、562nm的吸光度。结果见图1。
对照例
（1）称取5.0g过40目的决明子样品，用800目滤布包好，封口，置于安装好的索氏提取器中在水浴温度50℃的条件下，以石油醚（30-60℃）回流脱脂6h，取出决明子样品放入60℃的烘箱内干燥4h。
（2）将脱脂干燥后的决明子样品置于圆底烧瓶中，加水100ml，在80℃水浴并磁力搅拌3h，合并滤液。
（3）准确称取木瓜蛋白酶0.1g（决明子样品干重1/50的量），加入到滤液中，置于60℃恒温水浴振荡器中，设置振荡速度“1档”，缓慢振荡2h，冷却至室温。
（4）sevaga法除蛋白：Sevaga液：按氯仿：正丁醇=4:1的比例，配制sevaga液1000mL，备用。在上述酶解的糖提取液中加入34mL的sevaga液（按1/3体积提取液的量），在恒温振荡器上快速振荡15min，将混合液体转入50ml的离心管中，以4000rpm的转速离心5min，分相后取其上清液，再重复上述“sevaga法除蛋白”的过程，直至上下两相间无乳白色絮状沉淀，以除尽提取液中的植物蛋白。
（5）双氧水脱色过程：测量上述经“sevaga法除蛋白”后的提取液体积，按其体积加入15%（V/V）的质量分数30%的H2O2，置于60℃水浴中反应6h（注：水温不可超过60℃）。
（6）样品多糖成分的醇沉过程：将脱色后的提取液倒入500ml的烧杯中，用恒压滴液漏斗缓慢滴入无水乙醇（按其体积的3倍），同时置于磁力搅拌器上快速搅拌，室温静置4小时，4000rpm转速下离心10min取沉淀。
（7）往步骤（6）所得沉淀中加入9ml丙酮，于超声清洗器中超声5min，再以4000rpm的转速离心5min，重复一次。在离心后的残渣中加入9ml无水乙醚，超声洗涤5min，离心，以4000rpm的转速离心10min，重复洗涤一次，将离心后所得的残渣用氮气吹干，称重，密封，冰箱中保存，备用，即得到精制决明子多糖。多糖质量将步骤（4）到（6）、（8）的损失率（23.4%）考虑在内。
实施例4、5及对比例2的测定多糖、总多酚以及蛋白质浓度的吸光度值如图1所示。由图1可知PVPP对多酚和蛋白质均有吸附作用，效果相当于醇沉处理。同时使用PVPP和醇沉，可以大大降低多酚和蛋白质物质，最大程度消除了干扰物质对多糖测定结果的影响。
实施例1、实施例2、实施例3、对比例1以及对照例的多糖含量测定结果及相对差值如表1所示：
表1多糖含量测定结果及相对差值
说明：对照例产物为精制决明子多糖，将其多糖含量设为多糖质量含量的对照值。实施例1-3、6和对比例1均采用硫酸苯酚法测定多糖，其中实施例1-3、6通过混合单糖制得的标准曲线方程计算决明子多糖含量，对比例1通过葡萄糖制得的标准曲线方程计算决明子多糖含量。相对差值（%）=（测量值-对照值）×100/对照值，其中，对照值为对照例的多糖含量值，测量值是实施例1-3和对比例1的多糖含量值。
由表1结果可知，以混合单糖制得标准曲线测定决明子多糖的含量与精制决明子多糖的含量更为接近，说明采用本发明方法测定的结果比以葡萄糖为标准样品制标准曲线测定决明子多糖的结果更为准确。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种决明子多糖定量检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）粉碎：将待测决明子进行粉碎，过20～80目筛得决明子粉料，干燥后备用；
（2）脱脂去色：用丙酮浸泡决明子粉料，振摇30min后，静置30min，倒去上层清液；重复该步骤至上层清液无色后，固液分离得脱脂粉料；
（3）热水提取：用80～100℃热水对脱脂粉料进行提取1～3小时，合并滤液获得提取液；
（4）纯化处理：
a.聚乙烯聚吡咯烷酮处理：按0.5～5g/100mL的浓度往步骤（3）的提取液中加入聚乙烯聚吡咯烷酮，慢速搅拌1～3小时后，过滤，合并滤液；将滤液加入去离子水，定容，得待测样品液；或，
b.聚乙烯聚吡咯烷酮/醇沉处理：按0.5～5g/100mL的浓度往步骤（3）的提取液中加入聚乙烯聚吡咯烷酮，慢速搅拌1～3小时后，过滤，合并滤液；加入相当于滤液3倍体积的无水乙醇，室温静置4小时，离心后取沉淀物；往沉淀物加入去离子水复溶，定容，得待测样品液；
（5）测定：以混合单糖标准样品建立标准曲线，以苯酚-硫酸法测定待测样品液的多糖浓度，即为待测决明子的多糖浓度；
所述混合单糖标准样品是由混合单糖配制而成，所述混合单糖包括摩尔百分数90%以上的甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖；甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖的摩尔比例为43:8:21:19。
2.根据权利要求1所述的决明子多糖定量检测方法，其特征在于：步骤（1）所述的干燥后备用是将决明子粉料在60℃下干燥6小时，然后置于干燥器中备用。
3.根据权利要求1所述的决明子多糖定量检测方法，其特征在于：步骤（2）所述的决明子粉料与丙酮的料液重量比为1:（15～30）。
4.根据权利要求1所述的决明子多糖定量检测方法，其特征在于：步骤（3）所述的脱脂粉料与热水的料液比为1:（20～35）（g/mL）。
5.根据权利要求1所述的决明子多糖定量检测方法，其特征在于：步骤（5）所述混合单糖在配成混合单糖标准样品前先于102℃烘干至恒重后备用。
6.根据权利要求1所述的决明子多糖定量检测方法，其特征在于：步骤（5）所述混合单糖还包括葡萄糖醛酸、氨基半乳糖和阿拉伯糖；所述甘露糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖的摩尔比为43:4:1:8:21:19:5。
7.根据权利要求1所述的决明子多糖定量检测方法，其特征在于：步骤（5）所述的苯酚-硫酸法包括如下步骤：取1mL待测样品液加入具塞试管中，加入质量分数5%的苯酚溶液2mL，混匀，缓慢加入7mL浓硫酸，混匀，沸水浴15min，取出，冰水冷却至室温，在490nm处测定吸光值；根据吸光值及标准曲线确定样品液浓度。
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