CN103822918A - 烟草或其制品中可溶性蛋白质含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种烟草或其制品中可溶性蛋白质含量的测定方法，包括以下步骤：称取烟草或其制品样品，加水溶解，超声震荡、离心得待测样品溶液；将牛血清蛋白溶于水中，配制牛血清白蛋白储备液，然后稀释成不同浓度的牛血清白蛋白标准液；将考马斯亮蓝G-250溶于90%的乙醇中，加入质量浓度为850g/L的磷酸，用水定容，再加入Brij-35，配成考马斯亮蓝G-250标准液；将牛血清白蛋白标准液分别与考马斯亮蓝G-250标准液和待测样品溶液结合，通过连续流动分析仪的程序运行将各试剂按序进样，在595nm波长下检测待测样品中可溶性蛋白质的含量。本方法直接检测可溶性蛋白质的含量，不需要与标准曲线人为对比，操作简便、自动化程度高、样品回收方便，准确率和重复性都较高。

Description

烟草或其制品中可溶性蛋白质含量的测定方法

技术领域

本发明涉及烟草的检测技术，具体是一种烟草或其制品中可溶性蛋白质含量的测定方法。

技术背景

在烟叶众多成分中，蛋白质的含量最为丰富，如白肋烟中蛋白质含量高达20.48%。烟叶中的蛋白质分为可溶性蛋白质和不溶性蛋白质。可溶性蛋白质中一半左右是叶绿体蛋白质（Fraction I protein, FI蛋白），另一半为其他可溶性蛋白质的复合物（Fraction II protein, FII蛋白）。研究结果表明，植物叶片中可溶性蛋白质的含量以烟草叶片中含量最高，FI蛋白中的各种必需氨基酸含量不仅均高于世界粮农组织(FAO)制定的蛋白制品中必需氨基酸的含量标准，其中酪氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸和亮氨酸都超过该标准一倍左右，比一些主要粮食作物如水稻、小麦、玉米、大豆蛋白质中的必需氨基酸含量都高，表明烟叶中FI蛋白具有较高的营养价值。

目前，植物中可溶性蛋白质的检测方法主要有Lowry法和考马斯亮蓝法，Lowry法具有测定范围窄、使用试剂多、耗时等缺点，而考马斯亮蓝法在一定范围内准确度高，而且前处理相对简单，但大批量检测时比较耗时。有些研究人员采用流动分析法检测烟草中的蛋白质含量，其原理是利用烟草中可溶性蛋白质在0.5%的热醋酸溶液中发生变性沉淀，从而将可溶性蛋白质分离后再测定其中的非蛋白质氮，蛋白质的量由6.25×（总氮—非蛋白质氮）计算烟草中总蛋白质的含量。这种方法根据经验值计算，结果准确度稍差，前处理比较麻烦。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种烟草或其制品中可溶性蛋白质含量的测定方法，该方法利用连续流动分析仪直接检测烟草或其制品中可溶性蛋白质的含量，不需要与标准曲线人为对比，不仅操作简便、自动化程度高、样品回收方便，而且准确率和重复性都较高。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种烟草或其制品中可溶性蛋白质含量的测定方法，包括以下具体步骤： 

（1）称取烟草样品或烟草制品样品0.25～1.0 g，加入蒸馏水25～100 mL溶解，然后超声震荡20～45 min、以3000-10000转/分钟的转速离心5～20 min，将上清液通过中速定量无灰滤纸过滤至样品杯中，得到待测样品溶液；

（2）称取1.0 g牛血清蛋白溶于蒸馏水中，定容至100 mL，中速定量无灰滤纸过滤，得到10 mg/mL的牛血清白蛋白储备液，然后将储备液稀释成浓度为1.0 mg/mL、0.8 mg/mL、0.6 mg/mL、0.4 mg/mL和0.2 mg/mL的牛血清白蛋白标准溶液各100 mL；

（3）量取900 mL无水乙醇加入到1000 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至1000 mL，中速定量无灰滤纸过滤，得到90%的乙醇溶液；

（4）称取100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 mL上述 90%的乙醇中，加入质量浓度850 g/L的磷酸100 mL，最后用蒸馏水定容至1000 mL，加入0.5 mL Brij-35（十二烷基聚乙二醇醚），中速定量无灰滤纸过滤，得到考马斯亮蓝G-250标准溶液；

（5）将牛血清蛋白标准溶液和待测样品溶液分别与考马斯亮蓝G-250标准溶液结合，通过连续流动分析仪的程序运行将各试剂按序进样，在595 nm波长下检测待测样品中可溶性蛋白质的含量。

（6）按YC/T31-1996标准方法测定烟草或其制品样品中的水分含量，进而结合步骤（5）测得的可溶性蛋白质的含量计算待测样品中可溶性蛋白质的绝干含量（质量百分含量）。

可溶性蛋白质的绝干含量W（%）的计算公式为：

式中，c为连续流动分析仪上读出的可溶性蛋白质的含量，单位为g/mL；

V为待测样品溶液的体积，单位为mL；

M为待测样品的质量，单位为g；

W_水为按YC/T31-1996标准方法测得的待测样品的含水量，单位为%。

步骤（5）中连续流动分析仪的进样速率为30～40个样品/小时，进样清洗比例为1:1。

本发明所用试剂除有说明外均采用分析纯试剂，都是用蒸馏水或同等纯度的水配制，使用前都经过中速定量无灰滤纸进行过滤。 

本发明的原理为：在酸性（磷酸）条件下，1.0 mL的牛血清蛋白标准溶液或待测样品溶液分别与5.0 mL考马斯亮蓝G-250标准溶液结合后呈青蓝色，2～5 min后即达到最大吸光度，吸光度与可溶性蛋白质浓度呈正比，将牛血清蛋白作为标准对比物，首先进样绘制标准曲线，然后进样待测样品，并自动与标准曲线对比，显示出可溶性蛋白质的浓度，并可从连续流动分析仪中直接读出。

本发明所述YC/T31-1996标准方法测定烟草或其制品样品中的水分含量为公知技术手段，具体为：将烟草或其制品样品放入烘箱中，在不高于40 ℃的烘箱中烘干，直至可用手指捻碎；从烘箱中取出烘好的烟草或其制品样品，马上研磨，持续研磨时间不超过2 min，然后过筛，未过筛的细脉重新研磨过筛；将过筛粉末立即装入洁净干燥的广口瓶中密闭，充分摇动、混匀，制得试样；将编写有号码的洁净称量皿打开盖子，一同放入烘箱中，在（100±1）℃下烘干2 h，加盖取出称量皿，放入硅胶干燥器中冷却至室温，立即称重m₀；向称量皿中加入2～3 g试样，称重m₁，将称量皿打开盖子，一同放入烘箱中，在（100±1）℃下烘干2 h，加盖取出称量皿，放入硅胶干燥器中冷却至室温，立即称重m₂。试样中水分的质量百分含量W_水（%）按下式计算：

与传统的考马斯亮蓝法相比，本发明利用连续流动分析法测定烟草或其制品中的可溶性蛋白质的含量，不需要人为地与标准曲线对比，操作简便、自动化程度高、准确度高和重复性好的优点；与现有的流动分析法相比，本发明准确率高、测试后的样品回收方便。

说明书附图

图1是本发明烟草或其制品中可溶性蛋白质的连续流动检测法配置图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对发明作进一步说明。此处所描述的具体实施方式仅以解释发明，并不用于限定本发明的保护范围。

烟草或其制品中可溶性蛋白质含量的测定方法，包括以下具体步骤： 

（1）称取烟草样品或烟草制品样品0.25～1.0 g，加入蒸馏水25～100 mL溶解，然后超声震荡20～45 min、以3000-10000转/分钟的转速离心5～20 min，将上清液通过中速定量无灰滤纸过滤至样品杯中，得到待测样品溶液；

（2）称取1.0 g牛血清蛋白溶于蒸馏水中，定容至100 mL，中速定量无灰滤纸过滤，得到10 mg/mL的牛血清白蛋白储备液，然后将储备液稀释成浓度为1.0 mg/mL、0.8 mg/mL、0.6 mg/mL、0.4 mg/mL和0.2 mg/mL的牛血清白蛋白标准溶液各100 mL；

（3）量取900 mL无水乙醇加入到1000 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至1000 mL，中速定量无灰滤纸过滤，得到90%的乙醇溶液；

（4）称取100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 mL上述 90%的乙醇中，加入质量浓度850 g/L的磷酸100 mL，最后用蒸馏水定容至1000 mL，加入0.5 mL Brij-35（十二烷基聚乙二醇醚），中速定量无灰滤纸过滤，得到考马斯亮蓝G-250标准溶液；

（5）将牛血清蛋白标准溶液和待测样品溶液分别与考马斯亮蓝G-250标准溶液结合，通过连续流动分析仪的程序运行将各试剂按图1所示的配置图进行进样检测，在595 nm波长下检测待测样品中可溶性蛋白质的含量。

（6）按YC/T31-1996标准方法测定烟草或其制品样品的含水量，进而结合步骤（5）中连续流动分析仪的读书计算待测样品中可溶性蛋白质的绝干含量。

具体使用情况1

称取0.25 g烟叶样品，加25 mL蒸馏水溶解于50 mL三角瓶中，震荡20 min，转移到离心管内进行离心，离心机转速为3000转/分钟，离心20分钟，取上清液通过中速定量无灰滤纸过滤至样品杯中，按照图1所示的连续流动分析仪配置图进行检测，进样速率为30个/小时，进样清洗比为1:1。

检测结果显示，标准曲线线性相关系数r=0.9995，峰形较好，连续流动分析仪的读数为0.000517（g/mL），则样品中可溶性蛋白质含量为5.17%。

取同批次烟叶样品，按YC/T31-1996标准方法测定其中的含水量，经测定含水量为12%，计算得出烟叶样品中可溶性蛋白质的绝干含量为5.87%。

具体使用情况2

称取1.0 g烟叶样品，加100 mL蒸馏水溶解于200 mL三角瓶中得到溶液，震荡30 min，转移到离心管内进行离心，离心机转速为10000转/分钟，离心5分钟，取上清液通过中速定量无灰滤纸过滤至样品杯中，按照本发明的连续流动分析仪配置图进行检测，进样速率为35个/小时，进样清洗比为1:1。

检测结果显示，标准曲线线性相关系数r=0.9998，峰形较好，连续流动分析仪的读数为0.000581（g/mL），则样品中可溶性蛋白质含量为5.81%。

取同批次烟叶样品，按YC/T31-1996标准方法测定其中的含水量，经测定含水量为10%，计算得出烟叶样品中可溶性蛋白质的绝干含量为6.46%。

具体使用情况3

称取0.5 g烟叶制品样品，加50 mL蒸馏水溶解于100 mL三角瓶中得到溶液，震荡45 min，转移到离心管内进行离心，离心机转速为8000转/分钟，离心15分钟，取上清液通过中速定量无灰滤纸过滤至样品杯中，按照本发明的连续流动分析仪配置图进行检测，进样速率为30个/小时，进样清洗比为1:1。

检测结果显示，标准曲线线性相关系数r=0.9997，峰形较好，连续流动分析仪的读数为0.000408（g/mL），则样品中可溶性蛋白质含量为4.08%。

取同批次烟叶制品样品，按YC/T31-1996标准方法测定其中的含水量，经测定含水量为18%，计算得出烟叶制品样品中可溶性蛋白质的绝干含量为4.97%。

Claims (4)

1.烟草或其制品中可溶性蛋白质含量的测定方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）称取烟草或其制品样品，加入蒸馏水溶解，然后超声震荡、离心得到待测样品溶液；

（2）将 98%的牛血清蛋白溶于蒸馏水中，配制牛血清白蛋白储备液，然后将储备液稀释成不同浓度的牛血清白蛋白标准溶液；

（3）将无水乙醇加入到容量瓶中，用蒸馏水定容，配成90%的乙醇溶液；

（4）将考马斯亮蓝G-250溶于上述 90%的乙醇中，加入质量浓度为850 g/L的磷酸，最后用蒸馏水定容，再加入Brij-35，配成考马斯亮蓝G-250标准溶液；

（5）将牛血清白蛋白标准溶液分别与考马斯亮蓝G-250标准溶液和待测样品溶液结合，通过连续流动分析仪的程序运行将各试剂按序进样，在595 nm波长下检测待测样品中可溶性蛋白质的含量。

2.如权利要求1所述的烟草或其制品中可溶性蛋白质含量的测定方法，其特征在于包括以下具体步骤： 

（1）称取烟草或其制品样品0.25～1.0 g，加入蒸馏水25～100 mL溶解，然后超声震荡20～45 min、以3000-10000转/分钟的转速离心5～20 min，将上清液通过中速定量无灰滤纸过滤至样品杯中，得到待测样品溶液；

（2）称取1.0 g牛血清蛋白溶于蒸馏水中，定容至100 mL，中速定量无灰滤纸过滤，得到10 mg/mL的牛血清白蛋白储备液，然后将储备液稀释成浓度为1.0 mg/mL、0.8 mg/mL、0.6 mg/mL、0.4 mg/mL和0.2 mg/mL的牛血清白蛋白标准溶液各100 mL；

（3）量取900 mL无水乙醇加入到1000 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至1000 mL，中速定量无灰滤纸过滤，得到90%的乙醇溶液；

（4）称取100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 mL上述 90%的乙醇中，加入质量浓度850 g/L的磷酸100 mL，最后用蒸馏水定容至1000 mL，加入0.5 mL Brij-35，中速定量无灰滤纸过滤，得到考马斯亮蓝G-250标准溶液；

（5）将牛血清蛋白标准溶液和待测样品溶液分别与考马斯亮蓝G-250标准溶液结合，通过连续流动分析仪的程序运行将各试剂按序进样，在595 nm波长下检测待测样品中可溶性蛋白质的含量。

3.如权利要求2所述的烟草或其制品中可溶性蛋白质含量的测定方法，其特征在于：步骤（5）中连续流动分析仪的进样速率为30～40个样品/小时，进样清洗比例为1:1。

4.如权利要求1或2所述的烟草或其制品中可溶性蛋白质含量的测定方法，其特征在于：还包括步骤（6），所述步骤（6）为按YC/T31-1996标准方法测定待测样品中的水分含量，进而计算待测样品中可溶性蛋白质的绝干含量。

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