CN107449753A - 近红外光谱快速测定槐花炮制品中芦丁含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了近红外光谱快速测定槐花炮制品中芦丁含量的方法。包括如下步骤：S1.光谱数据的采集；S2.参考值的测定；S3.确定特征谱段：除去温湿度和样品水分影响波段，结合芦丁对照品近红外光谱图，确定建模波段；S4.校正模型的建立：采用偏最小二乘法，标准正态变换和一阶导数法为光谱预处理方法，通过模型评价参数建立校正模型；S5.校正模型的验证：对未参加建模的槐花样品进行预测以验证模型；S6.未知样品含量测定。本发明的近红外光谱法与HPLC比较，简单快速、模型稳定、准确性高，可同时应用于槐花不同炮制品中芦丁含量的预测。本发明为槐花品质的测定检验提供新的鉴定方法，对市场槐花炮制品的质量监管提供科学依据。
Description
技术领域
本发明属于药材指标性成分分析技术领域。更具体地，涉及一种近红外光谱快速测定槐花炮制品中芦丁含量的方法。
背景技术
槐花为豆科植物槐Sophora japonica L.的干燥花，主产于河北、山东、河南、天津等地。本品味苦，微寒，具有清肝泻火、清热凉血的作用，临床用于血痢、便血、吐血、肝热目赤等。槐花主要含有黄酮类化合物、皂苷类化合物和甾类等化学成分，具有抗炎、抗病毒、抗真菌、抗肿瘤、止血、降血脂、对心血管有降压扩冠等作用，在治疗痔病出血方面有显著疗效。
槐花生品有清肝泻火、清热凉血的作用，多用于血热妄行，肝热目赤，头痛眩晕，疮毒肿痛；炒品则缓和其苦寒之性，清热凉血的作用较生品差，有凉血止血作用，保存药效；炭品凉血止血强，可用于各种出血症等。
芦丁(Rutin)广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米(为植物Sophora japonica的未开放的花蕾)和荞麦中含量最高。
目前，对槐花中芦丁含量的测定常用分析方法是高效液相色谱法，周期长、需要前处理、对环境污染。近红外光谱反映的是含氢基团振动的倍频和合频吸收，结合化学计量学技术分析使用。近红外光谱分析方法与高效液相色谱法相比，具有不需要对样品进行复杂繁琐的预处理，操作简便，分析速度快，对样品无损害，无化学污染等优点，近年来该方法也越来越多地在应用中药分析中，特别集中于对中药材的真伪鉴定、中药定量分析、中药质量评价和中药炮制过程在线控制等。
现有技术未见有采用近红外光谱技术快速测定槐花炮制品中芦丁含量的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有槐花中芦丁含量分析方法的缺陷和不足，提供一种近红外光谱快速测定槐花炮制品中芦丁含量的方法。所述方法简单快速、模型稳定、准确性高，可同时应用于槐花不同炮制品中芦丁含量的预测。
本发明的目的是提供一种近红外光谱快速测定槐花炮制品中芦丁含量的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种近红外光谱快速测定槐花炮制品中芦丁含量的方法，包括如下步骤：
S1.光谱数据的采集：收集不同批次的槐花炮制品，预处理后采集近红外光谱数据；
S2.参考值的测定：采用高效液相色谱测定槐花炮制品中芦丁的含量；
S3.确定特征谱段：除去槐花温湿度及样品含水量影响，结合芦丁对照品的近红外光谱数据，利用相关系数分析法、一阶导数处理和二阶导数处理，确定芦丁的特征谱段为10000～7500cm-1、6545～5600cm-1和4700～4000cm-1；
S4.定量校正模型的建立：根据步骤S1采集的槐花炮制品近红外光谱数据，以步骤S2测得的芦丁含量为参考值，在步骤S3确定的特征谱段10000～7500cm-1、6545～5600cm-1和4700～4000cm-1范围内，以标准正态变换和一阶导数法为预处理方法，采用偏最小二乘法建立槐花炮制品芦丁近红外定量校正模型；
S5.校正模型的验证：对未参加建模的槐花样品进行预测，计算预测值和真实值的相关性；
S6.未知样品含量测定：采集未知芦丁含量的槐花炮制品的近红外光谱数据，应用步骤S4建立的定量校正模型测定芦丁含量。
优选的，所述S1所述采集近红外光谱数据的方法为采用Bruker公司MPA型傅里叶变换近红外光谱仪，应用样品旋转器，积分球漫反射采集近红外光谱，扫描次数为64次，分辨率16cm-1，光谱采集范围12500～4000cm-1，PbS检测器，每个样品重复测定3次，取平均光谱作为样品光谱；采集温度(16.0±0.5)℃，湿度(55±2)％。
优选地，步骤S1所述采集近红外光谱数据的方法为取各批次样品粉末约10g，过五号筛，置于石英样品杯中，使样品自然摊平，校准干涉峰位和扣除背景后，采集近红外光谱，得到近红外光谱图。
优选地，近红外光谱采集软件为OPUS 6.0光谱分析软件，近红外光谱数据处理软件为TQ-Analyst 8.0光谱分析软件。
本发明根据高效液相色谱法测定槐花炮制品中芦丁的含量为参考值，采集近红外光谱图，由芦丁的特征谱段，标准正态变换+一阶导数法为预处理方法，采用偏最小二乘法建立了波段为10000～7500cm-1、6545～5600cm-1和4700～4000cm-1，主因子数为7的槐花炮制品芦丁的近红外定量校正模型，最后取未知芦丁含量的槐花炮制品进行预测。所得模型内部质量评价参数为R＝0.98536、RMSEC＝0.424、RMSEP＝0.456、RMSECV＝0.66930，RMSEP/RMSEC＝1.08≤1.2，预测的相对分析误差为5.39>5，这说明本发明建立的模型稳定，结果准确，可用于槐花炮制品中芦丁含量的快速无损的检测。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明建立的槐花炮制品中芦丁的近红外定量校正模型稳定，结果准确，可用于槐花炮制品中芦丁含量的快速无损的检测。
(2)本发明为槐花品质的测定检验提供新的鉴定方法，对市场槐花炮制品的质量监管提供科学依据，具有较大的应用前景。
附图说明
图1为85批槐花炮制品的傅里叶变换近红外光谱图。
图2为芦丁对照品的傅里叶变换近红外光谱图。
图3为芦丁对照品的近红外一阶导数光谱图。
图4为槐花炮制品的内部交叉验证均方差图。
图5为85批槐花炮制品的芦丁含量预测值与参考值的相关图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明具体实施方式所用仪器：MPA傅立叶变换近红外光谱仪(Bruker公司，德国)，配有漫反射积分球，样品旋转器，石英样品杯，PbS检测器，OPUS6.0光谱分析软件；TQ8.0光谱分析软件(Thermo公司，美国)；Agilent 1200高效液相色谱仪(安捷伦科技公司，美国)，包括四元泵处理器、自动处理器、紫外检测器、柱温箱及在线过滤器；高速万能粉碎机(永光明医疗仪器有限公司，北京)；超声波清洗器KQ-300DE(昆山市超声仪器有限公司，江苏)；电子分析天平(Sartorius公司，瑞士)；Millipore Mill－Q纯水系统(Millipore公司，美国)。
本发明具体实施方式所用试药和试剂：芦丁(批号：100080-201409，中国食品药品检定研究院，含量以91.9％计)；乙腈(霍尼韦尔贸易上海有限公司，色谱醇)、甲醇(霍尼韦尔贸易上海有限公司，色谱醇)；冰醋酸(天津富宇精细化工有限公司，分析纯)，MIlipore超纯水。
实施例1槐花炮制品中芦丁含量的近红外光谱测定方法的建立
1、样品的收集：槐花炮制品为市场收集，均经广东省药品检验所林锦锋副主任中药师鉴定，均为豆科植物槐Sophora japonica L.的干燥花。槐花炮制品合计99批，其中35批生品，36批炒品，28炭品。样品购自北京、成都、广州、河北、山东、河南、深圳等地，产地包括河南、河北、山东、天津、安徽、北京等地。
2、芦丁含量参考值测定：高效液相色谱法测定槐花炮制品中芦丁的含量，按照2015年版《中国药典》第一部槐花中芦丁含量的测定方法进行：
(1)制备芦丁对照品溶液：精密称取芦丁对照品适量，甲醇定容，制成每1ml含芦丁0.9401mg的对照品母液，精密移取芦丁对照品母液适量，用甲醇溶液配成每1ml含0.0940mg的芦丁对照品溶液。
(2)制备样品溶液：分别取槐花样品粗粉约0.2g，精密称定于具塞锥形瓶，精密加入50ml甲醇，称定重量，超声处理30分钟，放冷甲醇补足重量，摇匀滤过，精密量取续滤液2mL于10mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液即得。
(3)色谱条件：色谱柱Luna 5μC18(4.6×250mm，5μm)，流动相为甲醇-1％冰醋酸(40:60)，采用等度洗脱，检测波长为257nm，流速是1mL·min-1；柱温为35℃，进样量为10μL。利用高效液相色谱法仪分析，以外标法计算样品中芦丁含量，结果如表1所示。
表1槐花炮制品中芦丁含量结果表(n＝2)
3、采集样品傅里叶变换近红外光谱图：分别取85批槐花炮制品(30批生品、30批炒品、25批炭品)粉末10g(过五号筛)，于石英样品杯中，扫描次数为64次，分辨率16cm-1，光谱范围12500～4000cm-1，PbS检测器，积分球漫反射采集近红外光谱，重复测定3次，取平均光谱，得到85批槐花炮制品傅里叶变换近红外光谱谱图，结果如图1所示。采集温度(16.0±0.5)℃，湿度(55±2)％。
4、特征谱段的确定：按照步骤3的光谱条件采集芦丁对照品的傅里叶变换近红外光谱图，其结果如图2所示，其一阶导数光谱图如图3所示；发现光谱信息在10000～4000cm-1波段范围内。结合前期实验，除去温湿度及样品含水量影响，初步确定建模范围10000～7500cm-1、6545～5600cm-1和4700～4000cm-1，并最终确定特征谱段为10000～7500cm-1、6545～5600cm-1和4700～4000cm-1。
5、确定光谱处理方法：定量模型的多元校正方法有多元回归(MLR)、主成分回归(PCR)、偏最小二乘法(PLS)等。不同的多元校正方法有不同的优缺点，MLR可用于线性关系较好的简单体系，但波长数量受到限制；PCR可分析复杂体系，预测能力较MLR好，但不能保证主成分一定与待测成分相关；PLS克服MLR和PCR的弱点，建立最佳的校正模型，且在光谱分析中应用最广泛是PLS，因此选择PLS作为校正方法。
常用光谱预处理方法有：一阶导数法、二阶导数法、平滑去噪法(移动平均平滑法和Savitzky-Golay卷积平滑法)、标准正态变换(SNV)、多元散射校正(MSC)等。近红外定量校正模型的评价参数有相关系数(R)、校正均方差(RMSEC)、预测均方差(RMSEP)、交叉验证均方差(RMSECV)等，其中R越接近1，模型的预测结果越好；RMSEC越小，RMSEP越小，模型回归越好，为了避免过拟合现象，RMSEP/RMSEC≤1.2，模型准确性越高。不同预处理方法对模型的影响见表2，当预处理方法为SNV+一阶导数法时，模型R为0.98536、RMSEC＝0.424、RMSEP＝0.456、RMSEP/RMSEC＝1.08≤1.2。综合考虑，取SNV+一阶导数法对光谱进行预处理。
表2不同预处理方法对模型的影响
6、确定主因子数：用RMSECV对主因子数作图，为避免模型拟合不充分或过度，通常RMSECV大于RESEC，且RMSECV值应随主因子数增加而递减，当RMSECV值达到最低值后出现细微上升，结果如图4所示，确定最佳主因子数为7，RMSECV值为0.66930，大于RESEC。
7、建立定量校正模型：运用TQ8.0分析软件，PLS为多元校正方法，预处理方法是SNV+一阶导数法，建模波段为10000～7500cm-1、6545～5600cm-1和4700～4000cm-1，主因子数为7，建立85批槐花炮制品芦丁的近红外定量校正模型，芦丁含量的预测值与参考值相关图如图5所示。模型内部质量评价参数R＝0.98536、RMSEC＝0.424、RMSEP＝0.456、RMSECV＝0.66930，RMSEP/RMSEC＝1.08≤1.2，说明模型预测值与参考值之间存在良好的相关性。
实施例2槐花炮制品中芦丁含量的近红外光谱方法的验证
1、傅里叶变换近红外光谱测定方法的精密度、重复性和稳定性
对样品做了精密度(n＝6)，精密度模型预测值的RSD值为1.36％；重复性实验(n＝6)，重复性模型预测值的RSD值为1.61％；重复性5天的模型预测值的RSD值为1.22％。说明该方法稳定可靠。
2、傅里叶变换近红外光谱方法的验证
应用所建立的定量校正模型，对剩下未参与建模的14批槐花样品(5批生品、6批炒品、3批炭品)进行预测，模型预测值与参考值的绝对偏差在-0.49％～0.71％，结果见表3(S31～S35为生品，C31～C36为炒品，T26～T28为炭品)。
相对分析误差(RPD)是验证集标准偏差与预测标准偏差的比值，当RPD>5时，模型准确度良好。根据实验，计算得RPD值为5.39>5，说明模型预测准确性较高。对模型预测值与参考值进行配对t检验，得到P＝0.258>0.05，光谱预测值与参考值之间无显著的差别，表明近红外光谱法与高效液相色谱法之间不存在系统误差，较好的验证所建立的近红外定量校正模型的准确性，可用于槐花炮制品中芦丁含量的快速预测分析。
表3 14批槐花炮制品中芦丁的预测结果
Claims (4)
1.近红外光谱快速测定槐花炮制品中芦丁含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.光谱数据的采集：收集不同批次的槐花炮制品，预处理后采集近红外光谱数据；
S2.参考值的测定：采用高效液相色谱测定槐花炮制品中芦丁的含量；
S3.确定特征谱段：除去槐花温湿度及样品含水量影响，结合芦丁对照品的近红外光谱数据，利用相关系数分析法、一阶导数处理和二阶导数处理，确定芦丁的特征谱段为10000～7500 cm-1、6545～5600 cm-1和4700～4000 cm-1；
S4.定量校正模型的建立：根据步骤S1采集的槐花炮制品近红外光谱数据，以步骤S2测得的芦丁含量为参考值，在步骤S3确定的特征谱段10000~7500 cm-1、6545～5600 cm-1和4700～4000 cm-1范围内，以标准正态变换和一阶导数法为预处理方法，采用偏最小二乘法建立槐花炮制品芦丁近红外定量校正模型；
S5.校正模型的验证：对未参加建模的槐花样品进行预测，计算预测值和真实值的相关性；
S6.未知样品含量测定：采集未知芦丁含量的槐花炮制品的近红外光谱数据，应用步骤S4建立的定量校正模型测定芦丁含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1所述采集近红外光谱数据的方法为采用Bruker公司MPA型傅里叶变换近红外光谱仪，应用样品旋转器，积分球漫反射采集近红外光谱，扫描次数为64次，分辨率16 cm-1，光谱采集范围12500～4000 cm-1，PbS检测器，每个样品重复测定3次，取平均光谱作为样品光谱；采集温度（16.0±0.5）℃，湿度（55±2）％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述采集近红外光谱数据的方法为取各批次样品粉末约10 g，过五号筛，置于石英样品杯中，使样品自然摊平，校准干涉峰位和扣除背景后，采集近红外光谱，得到近红外光谱图。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，近红外光谱采集软件为OPUS 6.0光谱分析软件，近红外光谱数据处理软件为TQ-Analyst 8.0光谱分析软件。
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