CN107462713A - 蜂蜜快速检测试纸条的制备方法及其试纸条与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蜂蜜快速检测试纸条的制备方法及其试纸条与应用。制备方法包括（1）能够特异性识别MRJP1蛋白的多克隆抗体SP‑1和SP‑2的制备和纯化；（2）胶体金溶液的制备；（3）硝酸纤维素膜上包被质控线（C线）和检测线（T线）；（4）以蜜蜂内源性蛋白MRJP1为标志物的蜂蜜双抗体夹心快速检测试纸条的组装；（5）蜂蜜检测样品的准备。从蜂蜜样品中分离纯化的蛋白与该金标试纸条反应后，根据T线是否显色可以判别蜂蜜样品的真伪。本发明的蜂蜜双抗体金标试纸条适用于人造糖浆冒充的假蜂蜜的检测，为蜂蜜质量及掺假检测提供了一种非常可靠的快速检测新方法。

Description

蜂蜜快速检测试纸条的制备方法及其试纸条与应用

技术领域

本发明涉及一种蜂蜜快速检测试纸条的制备方法及其试纸条与应用。

背景技术

蜂蜜是蜜蜂釆集植物的花蜜、分泌物或蜜露与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜物质。作为营养丰富的天然甜味剂和保健品，蜂蜜深受全球消费喜爱，但它却是一种极易被掺假的食品。近些年来蜂蜜掺假愈演愈烈，掺假越来越不容易被识别，已严重扰乱蜂蜜市场秩序。中国蜂产品协会公布的2014年网售蜂蜜抽检结果显示，在淘宝、天猫和京东商城销量领先的20款蜂蜜中，有13款产品掺假，导致产品信任危机，行业整体价格和效益下降，对蜂蜜产业的健康发展造成严重影响。以前蜂蜜掺假的主要方式是在蜂蜜中加入水、糖、羧甲基纤维素、糊精或淀粉类物质，这些掺假蜂蜜可以通过简单的感官品评和化学反应方法识别出来，也可以通过现代分析检测技术对其进行判别，所以这些掺假手段现已不常见。目前市场上最常见的蜂蜜掺假方式是在蜂蜜中加入果葡糖浆、玉米糖浆、甜菜糖浆等，尤其是用大米糖浆勾兑的假蜂蜜，其理化指标和风味完全可以通过欧盟标准，蜂蜜中的果糖和葡萄糖比例与掺入糖浆的成分比例十分相似，难以检测，严重影响了我国国际贸易声誉。2015年3月，在十二届全国人大三次会议上，10名全国人大代表提交了“严厉打击假劣蜂产品的建议”的提案。2015年7月，国家食品药品监督管理总局在其官网正式作出回应：我国现行蜂蜜国家标准无法鉴别蜂蜜的真假，将积极推动蜂蜜食品安全国家标准的修订和蜂蜜掺假补充检验方法的建立。

为解决掺假蜂蜜的检测技术问题，国内外已开展了大量研究探索。已有报道的理化检测方法分为以下几类：

（一）传统方法

（1）常规理化指标检测。通过水分、糖分、酸度、灰分等的检测判定蜂蜜质量[丁梅，吴鸣， 辛若竹，何逸伟， 闫吉昌. 利用常规检测指标鉴定蜂蜜质量的研究. 中国食物与营养. 2009， (10): .40-43.]。这些检测可以针对较为“低级”的掺水、掺糖方式进行监控，但造假者很容易通过适当调配而使掺假蜂蜜的理化指标达到标准要求，随着造假技术的提高，已不能达到鉴别蜂蜜真假的目的。

（2）花粉鉴别。用显微技术对蜂蜜样中的花粉进行形态识别，从而对蜂蜜掺假进行鉴定[Lutier， P M， Vaissiere B E. An improved method for pollen analysis ofhoney. Review of Palaeobotany and Palynology. 1993.78: 129-144]，由于受采蜜方式、蜜源等因素影响，存在很多不确定性，制假者也很容易通过添加花粉的规避。

（二）理化方法

（1）稳定性碳同位素比率法。其依据是所有蜜源植物都属于C3植物，甜菜、大米属于C3植物，玉米、甘蔗等属于C4植物。为此《蜂蜜》行业标准（GH/T 18796-2012）要求采用GB/T18932.1-2002规定的“元素分析-同位素比值质谱法”对蜂蜜真实性进行鉴定，以检测掺入蜂蜜中的C4植物糖含量。有报道表明，采用液相色谱-同位素比率质谱联用仪（LC-IRMS）可检出C3糖（甜菜糖）和C4糖（蔗糖、蔗糖糖浆、高果玉米糖浆）；采用液相色谱/元素分析-同位素比值质谱联用法（LC/EA-IRMS）可检出多种掺入C3糖浆和C4糖浆的假蜂蜜 [Fei X，Wu B，Shen CY， Ding T， Li LH， Lu Y. Honey adulteration detection using liquidchromatography/elemental analysis-isotope ratiomass spectrometry. ChineseJournal of Chromatography， 2011， (1) : 15-19]。

（2）高效液相色谱法。根据蜂蜜和高果糖浆中高寡糖的不同，采用该法检测检测蜂蜜中是否掺有C4植物高果糖浆、C3植物高果糖浆，检测灵敏度可达2.5%[张存洁，董伟，曾纪琰.高效液相色谱法检测蜂蜜中高果糖浆掺假.食品科学， 1993，158(2):71-75] 。

（3）光谱技术鉴别。如近红外光谱分析（NIR）法，通过NIR与DPLS化学计量学方法结合建立数学模型，以C4植物糖检测结果为判定依据，快速识别掺入蜂蜜的甜菜糖浆和高果玉米糖浆[Zhang YL， Chen LZ， Xue XF， Wu LM， Li Yu，Yang J. Discrimination ofrice syrup adulterant of Acacia honey based using near-infrared spectroscopy.Spectroscopy and Spectral Analysis ， 2015. 35(9): 2536-2539.]用拉曼光谱结合化学计量学方法，建立PLS-LDA模型，预测掺入蜂蜜中的甜菜糖浆含量。

（4）核磁共振法（NMR）鉴别法。用一维和二维核磁共振法，结合多变量统计分析，检测蜂蜜中掺入不同浓度的糖浆 [Liu，JP，Hu LQ，Cai YL，Yin CL. Progress on theidentification of honey type and adulterated honey abroad. Journal of HenanUniversity of Technology-Natural Science Edition，2011，(4): 87-94.]。

（5）元素组成分析法。如用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS结合主成分分析和判别分析，通过测定洋槐蜜、葵花蜜和油菜蜜中各种矿物质元素含量的方法，建立判别模型；也有根据掺假大米糖浆砷的含量高于纯正蜂蜜的差别，通过ICP-MS法检测进行检测 [WuZB， Chen F， Chen LZ， Zhao J， Li Y， Wu LM，Ye ZH. Application of inductivelycoupled plasma mass spectrometry with chemometric methods in classificationof honeys according to their types .Spectroscopy and Spectral Analysis，2015，(1): 217-222.]。

（6）其他方法。如基于羟甲基糠醛的检测法，用糖浆制作过程中产生羟甲基糠醛作为鉴别指标。由于新鲜天然蜂蜜中不含羟甲基糠醛，通过液相色谱紫外检测法和分光光度法可对蜂蜜中是否含有羟甲基糠醛进行检测，以此来作为蜂蜜品质评价的依据 [ ZappalaA， Fallico B， Arena E， Verzera A. Methods for the determination of HMF inhoney: a comparison. Food Control，2005，16(3): 273-277.]。

（三） 指纹图谱检测方法

该方法是利用色谱、光谱、电子鼻等技术手段采集多种特征性指标，整合产地、蜜源等信息，运用正交偏最小二乘-逐级聚类(OPLS-HCA)等方法进行数据分析和挖掘，建立一套数学模型用于后续的判断。此类方法通常用于蜂蜜的产地、蜜源的溯源研究。由于气候、环境条件、加工、贮藏、运输过程的影响，蜂蜜特征性指标会经常改变，需要反复建立模型，工作量大。另外，由多种蜜源的蜂蜜组成的百花蜜其组分变化大，难以建立对应的数学模型，模型适用性不大 [Cao W，Zheng JB. Application of the HPLC fingerprints in honeycategory identification. Apiculture of China，2006. 57(3): 7-8.]。

（四） 酶活力测定

如行业标准《蜂蜜》GH/T （18796-2012）要求蜂蜜的淀粉酶活性不小于2 (1%淀粉溶液)/[mL/(g·h)]，并规定采用《蜂蜜中淀粉酶值的测定方法—分光光度法》（GB/18932）进行分析。但来源不同的蜂蜜淀粉酶活性差异较大，易出现假阳性和假阴性结果。制假者通过加入人工淀粉酶的方法提高淀粉酶值，甚至在同工酶谱方面进行优化，使其难以与天然淀粉酶区分开来[费晓庆，丁涛， 汤娟， 沈崇钰， 吴斌， 张睿， 张晓燕， 陈磊， 蒋原. 淀粉酶值常规检测方法用于鉴别掺假蜂蜜的研究. 轻工标准与质量，2013，(6): 45-482] 。

（五）生物标志物技术为假蜂蜜检测提供了有效方法

近20多年来，由于质谱、高通量的抗体以及生物信息学和生物统计学算法方面的进展，基于基因组学、蛋白组学和代谢组学的生物标志物研究和应用在相关领域都已奠定了扎实的基础。生物标志物（Biomarker）包括基因、蛋白质和代谢物、指纹图谱等，最初是学领域用于疾病诊断、预测临床结果的分子物质。目前生物标志物已广泛应用于生命科学和农业领域，如在食品科学领域用于鉴别生物原料的种类与真实性、安全性[Zhao D， Du RP， LiuPF， Pan C， Ge JP. A review of applications of metabolomics techniques inplant-derived food research. Food science，2015，(3): 212-216.]。

真实蜂蜜的成分来源主要分为两大类：一是来自蜜蜂的内源性分泌物，二是来自蜜源植物的外源性成分。蜂蜜的内源性成分蛋白、酶，外源性物质和成分包括花粉、多酚、黄酮、糖类物质、酚类物质、蛋白质、氨基酸、脂肪酸蛋白、微量元素等，并因花源不同而存在差别[Wang X， Zhang J. Research survey of evaluating indicator and methodologyfor honey’s quality. Food Research and Development， 2015. 36(18): 178-181.]。近年来国内外研究表明，从真实蜂蜜成分中筛选和寻找生物性标志物是未来开展蜂蜜真假鉴别、花源鉴别的有效途径。如不同蜜源的植物化学物挥发性化合物、黄酮类、酚酸类和生物碱成分存在差别[沈蓬，张双庆. 蜂蜜蜜源识别中的植物化学物研究进展. 中国抗生素杂志，2016，41（11）：817-818.]。不同蜂蜜样品游离氨基酸存在差别，所建主成分判断模型可用于不同花蜜判别[Sun Z，Cheng N，Cao W. A review of applications of aminoacids in honey. Food and Fermentation Industries， 2016，(1): 260-263.]。近年来用蜜源花粉DNA扩增的DNA条码已开始运用于蜜源植物鉴别研究[Hawkins J， de Vere N，Griffith A， Ford C R， Allainguillaume J， Hegarty M J， Baillie L，Adams-GroomB. Using DNA Metabarcoding to Identify the Floral Composition of Honey: A NewTool for Investigating Honey Bee Foraging Preferences. PLOS ONE ，2015，DOI:10.1371/ journal.pone.0134735.]。但迄今为止，国内尚未见基于系统性基因组学、蛋白组学和代谢组学的生物标志物技术在蜂蜜真伪和花蜜鉴别的研究报道。

蜂蜜含1-2%蛋白，通过高效液相色谱串联质谱（HPLC–MS/MS）分析明确，蜂蜜蛋白中含有蜜蜂头部王浆腺分泌的王浆主蛋白MRJP-1、MRJP-2、MRJP-5和MRJP-7，其中以MRJP-1含量最高，同时MRJP1也是蜂蜜中固有的、稳定存在的成分，不能被其他掺入蜂蜜中的外源物质所取代。根据MRJP1在蜂蜜中的稳定性及免疫特性，以其作为蜂蜜内源性生物活性标记物，用于蜂蜜质量检测是可行的。已有以MRJP-1作为抗原制备的抗体可应用于蜂蜜的假蜂蜜ELISA快速检测[Bilicova K，Simuth J 2010，New Criterion for Evaluation ofhoney: quantification of royal jelly protein Apalbumin 1 in honey by ELISA.Journal of Agriculture and Food Chemistry. 58，8776–8781.]。

以上现代分析技术能够有效鉴别蜂蜜真伪，有利于蜂蜜质量控制。但是所需仪器价格昂贵、操作复杂、检测时间长、需要有专业背景、操作地点固定是现有分析技术的无法避免的缺点。另外各种检测技术综合分析显示，目前蜂蜜真假检测技术落后于新的掺假技术，所以蜂蜜掺假现象屡禁不止。因此，有必要建立一种不依赖于掺假物的蜂蜜真实性的快速检测方法，来解决国内外面临的技术困境 [Zhou HB，Deng JJ，Hu MM，Cao W. Advancein identifying honey adulteration based on the protein differentiation. Foodand Fermentation Industries， 2013，(6): 116-119.] 。

CN105693858A公开了针对蜂蜜中MRJP1抗体对的制备方法、检测方法及试剂盒，但一般需要有专业背景的人员来操作，且耗时比较长。

发明内容

本发明要解决的问题是，克服以外加添加物为主，不是以蜂蜜本身特有的成分为检测对象等现有技术的不足，提供一种蜂蜜快速检测试纸条的制备方法及其试纸条与应用。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

一种蜂蜜快速检测试纸条的制备方法，步骤如下：

1）针对MRJP1的多克隆抗体SP-1和SP-2的制备和纯化：

1.1通过对MRJPs蛋白家族氨基酸序列作同源性分析，筛选出MRJP1不同于其他家族成员的氨基酸序列：分别位于MRJP1第56-70位的寡肽1-SGEYDYKNNYPSDID，第360-372位的寡肽2- IKEALPHVPIFD，即分别为抗体SP-1和SP-2所对应的抗原多肽；

1.2根据寡肽1和寡肽2的氨基酸序列，进行化学合成，将多肽与KLH偶联，作为免疫抗原；

1.3分别将2个免疫抗原与缓冲液和佐剂混合，在第1d、15d、29d、43d分别多点注射新西兰大白兔2只；

1.4第53 d，颈动脉取血，收集血清，通过抗原亲和柱纯化、透析，分别得到MRJP1的特异性抗体SP1和SP2；

2）胶体金溶液的制备：取氯金酸水溶液制备成含有粒径为20-40 nm的胶体金颗粒的胶体金溶液；

3）胶体金标记抗体：取SP-1抗体加入到胶体金溶液中，制备成免疫胶体金溶；

4）在硝酸纤维素膜上包被C线和T线，其中C线为质控线，包被商用羊抗兔lgG，T线为检测线，包被上述步骤1）制得的SP-2抗体；用划膜机点在硝酸纤维素膜上即得C线和T线，使C线和T线相距5 mm；室温晾干，得到包被后的硝酸纤维素膜；

5）胶体金免疫层析快速检测试纸条的组装：将样品垫、上述步骤4）所得包被后的硝酸纤维素膜和吸水垫一次粘贴到聚氯乙烯（PVC）底板上，切割成2~3 mm宽的条状，即得快速检测试纸条；4℃避光干燥保存。

一种如所述的制备方法得到的蜂蜜快速检测试纸条。

一种所述的蜂蜜快速检测试纸条的应用，包括以下步骤：

（a）蜂蜜样品检测液的准备：将蜂蜜样品用纯水以质量比1：1稀释，混匀，4℃抽提过夜；将抽提液离心，12000 rpm，离心30 min，取上清，得蜂蜜样品水提液；将蜂蜜样品水提液移入透析袋，在去离子水中透析过夜，得到蜂蜜透析液；

（b）用移液枪吸取步骤（a）所得待检样品溶液80-100 μL，滴加于96孔酶标板内；

（c）将金标试纸条从干燥器中取出，于试纸条样品垫上点加金标抗体浓缩液8 μL；将试纸条样品垫一端插入待检样品溶液中；

（d）在插入试纸条5-10 min读取结果，读取时，将试纸条以样品垫一端向下的方式垂直至于观察者正面；

（e）结果判断：C线显示为红色线条，当T线显色，结果为阳性，待测样品中含有MRJP1；当T线不显色，结果为阴性，待测样品中不含MRJP1：即所测蜂蜜为掺假蜂蜜；C线不显示的为红色线条，结果无效。

本发明的有益效果：本发明的蜂蜜双抗体金标试纸条具有制备成本低、使用简便、检测时间短等优势，适用于人造糖浆冒充的假蜂蜜的检测。

附图说明

图1为试纸条对阳性样品及阴性样品的检测结果示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明做进一步的阐述。

实施例1：针对MRJP1的特异性多克隆抗体SP-1和SP-2的制备和纯化

通过对MRJPs蛋白家族的氨基酸序列作同源性分析，筛选出MRJP1不同于其他家族成员的两段特异性寡肽，即分别位于MRJP1氨基酸序列第56-70位的寡肽-1 SGEYDYKNNYPSDID和第360-372位的IKEALPHVPIFD寡肽-2，这两个多肽之间无重复的连续序列。用两种序列的合成多肽分别免疫大白兔，得到MRJP1特异性抗体SP-1和SP-2；

根据所选得到的多肽序列，分别进行化学合成。分别将5 mg合成多肽与KLH偶联(偶联剂为Sulfo-SMCC)，作为免疫抗原，将另5 mg合成多肽与BSA偶联(偶联剂为戊二醛)作为检测抗原；分别用PBS稀释至浓度为1 mg/mL，分装，冻存于-20℃。

分别选择健康新西兰白兔2只，在第1、15、29、43天进行免疫。免疫操作如下:第1天，每种抗原取1 mL加入1 mL福氏完全佐刘，乳化(检验乳化程度: 将一滴乳化抗原液滴入生理盐水中，若不散开，表明已达到要求)，颈背部皮下多点(至少8点)注射，每种抗原免疫2只新西兰白兔；第15d、29d、43d，每种抗原取1 mL加入1 mL福氏不完全佐剂，乳化，颈背部皮下多点(至少8点)注射，每种抗原免疫2只新西兰白兔，第53d，免子颈动脉取血，将兔血置4℃过夜，4℃、10000 rpm、30 min离心，收集上清。

以1 mL Sulfolink Resin与1 mg合成MRJP-1特异性多肽偶联，将5 mg合成MRJP-1多肽连接到活化的Sulfolink Resin上，制备成抗原亲和柱，亲和柱用10倍柱体积PBS平衡，流尽溶液；将第53天收集上清得到的多克隆抗体血清用0.45 μm滤膜过滤，然后过抗原亲和柱，排尽溶液，收集流穿；再用10倍柱体积的PBS缓冲液平衡，排尽溶液；加入5 mL抗体洗脱液，按1 mL/tube分管收集洗脱液。用分光光度计在280 nm处检测收集到的洗脱液，将吸光度大于1.0的组分合并，置于截留分子量14 kDa的透析袋中，在超纯水中透析12 h，中间换水一次，透析后即为纯化的MRJP-1特异性抗体溶液，冻存于-20℃。

实施例2：针对MRJP1的多克隆抗体SP-1和SP-2的效价的测定

1. 针对MRJP1的多克隆抗体SP-1和SP-2的效价的测定具体操作步骤如下：

（1）包被：将MRJP1用碳酸盐缓冲液(CBS，Na₂CO₃ 1.59 g，NaHCO₃ 2.93 g，ddH₂O 950mL，调节pH值至9.6，加ddH₂O定容至1000 mL，4 ℃保存)稀释至1 μg/mL，按100 μL/well加入到96孔酶标板，4℃过夜；

（2）洗板：弃尽包被液，将酶标板置于洗板机上，用PBST（PBS+0.05% 吐温-20）洗涤缓冲液洗板5次，取下甩干；

（3）封闭：每孔加入200 μL含5%脱脂奶粉的磷酸缓冲液封闭，37℃反应1.5 h；

（4）洗板：弃尽封闭液，洗板方法同（2）；

（5）加入一抗：用PBS将多克隆抗体按梯度稀释，每孔加入100 μL，空白兔血清（1：1250稀释）作为对照，37℃反应1 h；

（6）洗板：弃尽酶标板内液体，洗板方法同（2）；

（7）加入酶标二抗：用PBS将HRP-羊抗兔以1：250稀释（根据抗体说明书操作），每孔加入100 μL，37℃反应30 min；

（8）洗板：弃尽酶标板内液体，洗板方法同（2）；

（9）显色：每孔加入200 μL TMB显色液（按试剂盒说明书操作），37℃避光反应15 min；

（10）终止显色：每孔加入50 μL终止液；

（11）读数：立即置于酶标仪上，读取450 nm、630 nm处的吸光值。

2. 结果：将吸收值为阴性对照孔两倍以上的孔判断为阳性孔，MRJP1蛋白多克隆抗体SP-1和SP-2效价分别见表1、表2，结果显示，SP-1和SP-2抗体的效价均大于1：80000。

实施例3：蜂蜜中MRJP1多克隆抗体的胶体金快速检测试纸条

1.胶体金溶液的制备及鉴定

取质量浓度为0.01 %氯金酸水溶液100 mL，用磁力搅拌回流装置加热至沸腾，一次性迅速加入质量浓度为1 %柠檬酸三钠溶液1 mL，在搅拌下恒温回流反应制得，继续煮沸8min，直至溶液呈酒红色，室温冷却，即可制备得到含有粒径为40 nm的胶体金颗粒的胶体金溶液，胶体金溶液4℃保存；烧制好的胶体金肉眼观察为紫红色，透明、澄清：用紫外光谱扫描仪测定其最大吸收峰为532 nm；透过电镜观察烧制的胶体金大部分颗粒呈现圆形，无多角形，且颗粒大小均匀。

2.免疫胶体金标记的MRJP1多克隆抗体结合物的最佳pH值测定

在蛋白等电点（pI）略偏碱的条件下胶体金和蛋白的结合力最好，调节胶体金溶液pH值分别为3、4、5、6、7、8、9、10；取3 μL 浓度为1 mg/mL的SP-1多克隆抗体分别加入到100 μL不同pH值胶体金溶液的酶标板中混匀；15 min后在在上述孔内分别加入20 μL 10%NaCl，混匀；10min后观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH(X)；调节体金溶液pH值分别为X-0.6，X-0.3，X，X+0.3，X+0.6，X+1，重复上述步骤；静置2 h后观察结果（见表3）。

由上表可见，当最低pH值为8.3时，胶体金红色保持不变，因为最佳pH值要略偏高于最低值，所以抗体结合胶体金的最佳pH值为8.6。

3.免疫胶体金标记的MRJP1多克隆抗体结合物的最佳抗体结合量测定

将SP-1多克隆抗体稀释为1 mg/mL后分别取0、1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、5 μL，分别加入到1 mL pH值为8.6的胶体金溶液的离心管中；15 min后，在上述各管中分别加入100 μL10% NaCl溶液，混匀；在静置15 min、30 min、1 h、2 h时观察结果（见表4）；未加入蛋白和蛋白量不足的管中，胶体金不稳定，会呈现由红变紫的聚沉现象；二加入蛋白量达到或超过最低稳定量时，胶体金稳定，保持红色不变。记录颜色保持不变的最低抗体用量，以最低量的基础上适当过量即为1 mL胶体金溶液待标记抗体的实际用量。

由上表可见，标记用抗体为4 μL/每毫升胶体金（4 μL/mL）时，胶体金保持红色不变，且抗体用量最少，在此基础上适当过量，本发明中使用最低标记抗体量为5 μL/mL。

4. 胶体金标记抗体：取上述所得的胶体金溶液4 mL，用0.1 mol/L碳酸钾溶液将其pH值调至8.6；取400 μL浓度为5 μg/mL的 SP-1抗体加入到胶体金溶液中，混匀，静置1h；加入含浓度为1%牛血清白蛋白 和0.01%的聚乙二醇的PBS溶液（pH调至8.6）4 mL，混匀，静置1 h；将标记后的胶体金溶液于10000 r/min 离心30 min，弃去上清液，往所得沉淀中加入质量浓度分别为1% 、0.01%的牛血清白蛋白和聚乙二醇的PBS溶液（pH调至8.6）4 mL溶解，于10000 r/min 离心30 min，弃去上清液；重复上述操作2次后，沉淀用含质量浓度为1%牛血清白蛋白和5%蔗糖的 PBS溶液（pH调至8.6）400 μL重悬，即为免疫胶体金溶液，4℃保存备用。

5. 硝酸纤维素膜上包被C，T线：在硝酸纤维素膜上包被C线和T线，其中C线为质控线，包被商用羊抗兔lgG；T线为检测线，包被上述步骤4中SP-2抗体，浓度为1.37 mg/mL；用划膜机将上述抗体点在硝酸纤维素膜上即得C线和T线，使C线和T线相距5 mm；室温晾干，得到包被后的硝酸纤维素膜。

6. 胶体金免疫层析快速检测试纸条的组装：将样品垫、上述步骤5所得包被后的硝酸纤维素膜和吸水垫一次粘贴到PVC底板上，切割成2~3 mm宽的条状，即得快速检测试纸条；4℃避光干燥保存。

实施例4：以内源性蛋白MRJP1为标志物的蜂蜜双抗体夹心快速检测试纸条的应用，包括以下步骤：

1. 样品检测液的准备：准确称取蜂蜜样品100 g与纯水以质量比1：1稀释，混匀，4℃抽提过夜；将抽提液4℃离心，12000 rpm，离心30 min，取上清，得蜂蜜水提液；将蜂蜜水提液倒入透析袋中透析，过夜，得到蜂蜜透析液；

2. 用移液枪吸取步骤1所得待检样品溶液80-100 μL，滴加于96孔酶标板内；

3. 将金标试纸条从干燥器中取出，于试纸条样品垫上点加上述实施例3步骤4所述金标抗体浓缩液8 μL；将试纸条样品垫一端插入待检样品溶液中；

4. 在插入试纸条5-10 min读取结果，读取时，将试纸条以样品垫一端向下的方式垂直至于观察者正面；

5. 结果判断：如图1所示，C线显示为红色线条，当T线显色，结果为阳性，待测样品中含有MRJP1；当T线不显色，结果为阴性，待测样品中不含MRJP1：即所测蜂蜜为掺假蜂蜜；C线不显示为红色线条，结果无效。

Claims (3)

1.一种蜂蜜快速检测试纸条的制备方法，其特征在于，步骤如下：

1）针对MRJP1的多克隆抗体SP-1和SP-2的制备和纯化：

1.1通过对MRJPs蛋白家族氨基酸序列作同源性分析，筛选出MRJP1不同于其他家族成员的氨基酸序列：分别位于MRJP1第56-70位的寡肽1-SGEYDYKNNYPSDID，第360-372位的寡肽2- IKEALPHVPIFD，即分别为抗体SP-1和SP-2所对应的抗原多肽；

1.2根据寡肽1和寡肽2的氨基酸序列，进行化学合成，将多肽与KLH偶联，作为免疫抗原；

1.3分别将2个免疫抗原与缓冲液和佐剂混合，在第1d、15d、29d、43d分别多点注射新西兰大白兔2只；

1.4第53 d，颈动脉取血，收集血清，通过抗原亲和柱纯化、透析，分别得到MRJP1的特异性抗体SP1和SP2；

2）胶体金溶液的制备：取氯金酸水溶液制备成含有粒径为20-40 nm的胶体金颗粒的胶体金溶液；

3）胶体金标记抗体：取SP-1抗体加入到胶体金溶液中，制备成免疫胶体金溶；

4）在硝酸纤维素膜上包被C线和T线，其中C线为质控线，包被商用羊抗兔lgG，T线为检测线，包被上述步骤1）制得的SP-2抗体；用划膜机点在硝酸纤维素膜上即得C线和T线，使C线和T线相距5 mm；室温晾干，得到包被后的硝酸纤维素膜；

5）胶体金免疫层析快速检测试纸条的组装：将样品垫、上述步骤4）所得包被后的硝酸纤维素膜和吸水垫一次粘贴到聚氯乙烯（PVC）底板上，切割成2~3 mm宽的条状，即得快速检测试纸条；4℃避光干燥保存。

2.一种如权利要求1所述的制备方法得到的蜂蜜快速检测试纸条。

3.一种如权利要求2所述的蜂蜜快速检测试纸条的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（a）蜂蜜样品检测液的准备：将蜂蜜样品用纯水以质量比1：1稀释，混匀，4℃抽提过夜；将抽提液离心，12000 rpm，离心30 min，取上清，得蜂蜜样品水提液；将蜂蜜样品水提液移入透析袋，在去离子水中透析过夜，得到蜂蜜透析液；

（b）用移液枪吸取步骤（a）所得待检样品溶液80-100 μL，滴加于96孔酶标板内；

（c）将金标试纸条从干燥器中取出，于试纸条样品垫上点加金标抗体浓缩液8 μL；将试纸条样品垫一端插入待检样品溶液中；

（d）在插入试纸条5-10 min读取结果，读取时，将试纸条以样品垫一端向下的方式垂直至于观察者正面；

（e）结果判断：C线显示为红色线条，当T线显色，结果为阳性，待测样品中含有MRJP1；当T线不显色，结果为阴性，待测样品中不含MRJP1：即所测蜂蜜为掺假蜂蜜；C线不显示的为红色线条，结果无效。