CN101382528A - 烟草中蛋白质氮含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种烟草中蛋白质氮含量的测定方法，包括如下步骤：a)称取烟草；b)将称取的烟草放入足量的酸或者硫酸铜溶液中，加热至蛋白质固化完全；c)过滤并用步骤b中所述的酸或者硫酸铜溶液冲洗滤出物；d)合并滤液并定容；e)利用离子色谱法测定步骤d定容后滤液中的NH₄ ⁺含量；f)测定烟草中总氮含量；g)结合步骤e和步骤f的测定结果计算出烟草中蛋白质氮含量；其中，步骤f与步骤a～e没有先后顺序。本发明提供的测定方法是一种简便高效的测定烟草中蛋白质氮含量的方法。

Description

烟草中蛋白质氮含量的测定方法

技术领域

本发明涉及烟草中成分组成的测试方法，尤其涉及烟草中蛋白质氮含量的测定方法。

背景技术

烟草中的各成分的含量决定了烟草的质量，例如混合型香烟的焦油和尼古丁比是11：1，而烤烟型大多是13～14：1，因此混合型香烟和烤烟型香烟相比最大的优点就是香气量足而且焦油含量低。烟草中含有蛋白质，蛋白质在燃烧后会使烟气苦味增加，产生辛辣味和刺激感，因此蛋白质对卷烟吸味有不良影响，但是蛋白质含量如果过低，那么烟气就会显得平淡，吃味和香气也会变差。另外，蛋白质在调制过程中可水解为氨基酸，而氨基酸含量与烟气的香味和丰满度又有明显的正相关关系。

虽然蛋白质的总量在烟草的醇化过程中变化较小，但是烟草中的其他成分却会随着醇化过程而变化，从而也引起烟草中蛋白质含量的变化。相应地，对于烟草工业的研究开发以及生产，都需要在各个阶段掌握烟草中蛋白质的含量，测定烟草中蛋白质的含量，对了解烟叶品质十分重要。

目前，烟草行业对蛋白质的检测方法可以参照中华人民共和国烟草行业标准YC/T 166-2003进行，此方法的测试原理也是国内外通常采用的，其原理是，用乙酸等酸沉淀烟草样品中的蛋白质氮，通过将非蛋白质氮含氮物与蛋白质分离、洗脱，而后将蛋白质连同其他沉淀物一起消煮，将蛋白质氮在浓硫酸及催化剂作用下转化为硫酸铵，强碱蒸馏释放出氨，用标准酸液接收，反滴定，最后通过计算得出烟草中蛋白质的含量。这个方法本质上是测定烟草中蛋白质氮的含量，从而通过计算得出蛋白质的含量。此方法测定过程中，在对沉淀物进行消煮以后，还需要重新收集由强碱蒸馏释放出的氨，用标准酸液接收和反滴定，需要多次将试样转移，试验过程中人为因素造成的误差较大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种烟草中蛋白质氮含量的测定方法，测定结果准确、误差小。

为了解决以上的技术问题，本发明提供以下的技术方案：

一种烟草中蛋白质氮含量的测定方法，包括如下步骤：

a)称取烟草；

b)将称取的烟草放入足量的酸或者硫酸铜溶液中，加热至蛋白质固化完全；

c)过滤并用步骤b)中所述的酸或者硫酸铜溶液冲洗滤出物；

d)合并滤液并定容；

e)利用离子色谱法测定步骤d)定容后滤液中的NH₄ ⁺含量，

f)测定烟草中总氮含量；

g)结合步骤e)和步骤f)的测定结果计算出烟草中蛋白质氮含量；

其中，步骤f)与步骤a)～e)没有先后顺序。

对于这个烟草中蛋白质氮含量的测定方法，步骤a)和步骤b)完成的是固氮过程；步骤c)和步骤d)为过滤分离剔除蛋白质固化形成的沉淀；步骤e)为利用离子色谱法测定步骤d)定容后滤液中的NH₄ ⁺含量；步骤f)为测定烟草中总氮含量的步骤；步骤g)是结合前面步骤所测得的总氮含量和非蛋白质氮含量，做差值计算得出烟草中蛋白质氮含量。因为步骤a)～e)与步骤f)是相互独立的，因此可以没有先后顺序。步骤a)～e)为测定烟草中非蛋白质氮含量的步骤。

对于整个测定方法而言，首先通过固氮处理将烟草中的蛋白质以沉淀的形式剔除，然后利用测定总氮的方法(离子色谱法)测定滤液中的NH₄ ⁺含量即可得到烟草中非蛋白质氮的含量，结合烟草中测定出的总氮的含量，通过计算即可得出烟草中蛋白质氮的含量。通过蛋白质和氮元素的质量对应关系，还可以计算出烟草中蛋白质的含量。

通过测定烟草中非蛋白质氮对应的NH₄ ⁺含量，并且通过测定烟草中总氮的含量，可以很容易计算出烟草中蛋白质的含量，测定方法步骤少，不用再进行滤渣转移、收集气体和滴定等操作，而现有的直接测定蛋白质氮的方法中，需要进行抽滤处理并将滤渣转移到消化容器中，在将蛋白质氮转化为硫酸铵以后，还需要进行强碱蒸馏释放出氨，用标准酸液接收，反滴定，这些实验操作比较复杂而且因实验人员的不同而存在较大差异。可以看出，本发明提供的测定方法减少了人为的操作误差，是一种简便高效的测定烟草中蛋白质氮含量的方法。

下面对各个步骤进行详细的论述和介绍，并提供一些优选或者可以替代的技术方案。

步骤a)称取烟草

前已述及，这个步骤是固氮过程的一个步骤。在本发明中，固氮过程指的是烟草中的蛋白质与酸反应生成沉淀的过程。固氮过程也称为氮固化的过程等。确切的说，本步骤是一个称量步骤，为了简单起见，所以把这个称量步骤定义成固氮过程的一个步骤。

称量步骤在分析测试过程中是基本的操作之一。由于烟叶的比重比较小，所以称量使用的天平等称量设备选用精确度高的电子天平或者光电天平比较好，精确度一般需用能够精确到0.001g(克)或者精确度更高的测试仪器。

在进行此操作步骤之前，通常还需要测定烟草中的水分含量，一般采用的是烘箱法。也可以将烟草样品烘干并置于干燥的环境中待用。

步骤b)将称取的烟草放入足量的酸或者硫酸铜溶液中，加热至蛋白质固化完全

这个步骤是固氮反应发生的步骤，在此步骤中，烟草中的蛋白质与酸或者硫酸铜反应，生成沉淀。所述酸需要有一定的浓度，其本质是有一定的氢离子浓度。对于不同种类的酸，对酸的质量百分比浓度的要求也是不一样的，可以根据实际测试中需要的酸来进行选定。参与反应的酸一般选用酸性较强的有机酸，最常用的是乙酸。也可以是乙酸、丙酸、丙二酸、三氯乙酸等，或者它们的组合。其中乙酸是最常用的，当选用乙酸时，乙酸的浓度优选使用0.4％～0.6％；三氯乙酸也较为常用，当选用三氯乙酸时，三氯乙酸的浓度优选使用0.8％～2.0％。本发明不限于只使用有机酸，也可以使用其它溶剂如硫酸铜等，只要能够与烟草中的蛋白质发生变性，凝结沉聚，从而可以通过过滤与非蛋白质氮分离即可。

当采用乙酸进行蛋白质的固氮反应时，乙酸的浓度可以选用0.4％～0.6％，反应的温度选择为所选用乙酸溶液的沸腾温度，对于选用0.4％～0.6％的乙酸，需要保持乙酸沸腾15分钟以上，以使得固氮反应的完全发生。

步骤c)过滤并用步骤b)中所述的酸或者硫酸铜溶液冲洗滤出物

步骤c)为过滤分离剔除蛋白质固化形成的沉淀的主要步骤。此步骤的操作简单，采用常用的过滤操作即可，既可以选用普通过滤，也可以选用抽滤的过滤形式。这也是本发明的优势之一，现有技术中在直接测定蛋白质氮的过程中也有一个过滤过程，却最好采用抽滤的形式，本发明中则无此项要求，因为本发明的测定的目标物是滤液，所以，采用抽滤或者普通过滤的形式都可以，况且采用抽滤时存在滤液转移困难的问题，因此本步骤中的过滤优选使用普通过滤形式，也就是常压过滤。

过滤并用步骤b)中所述的酸或者硫酸铜溶液冲洗滤出物，可以使得滤纸或者沉淀中的残留的非蛋白质氮进入滤液，有利于提高测试的准确度。需要指出的是，此步骤中用到的酸或者硫酸铜溶液只是和步骤b)中所述的物质一致，并不表示一定是与步骤b)中用到的酸或者硫酸铜溶液的浓度也一样。例如，如果步骤b)中用到的是浓度为0.5％的乙酸，那么步骤c)中可以使用浓度为0.7％的乙酸。然而优选的方式还是，步骤c)中使用的酸或者硫酸铜溶液的浓度与步骤b)中使用的酸或者硫酸铜溶液的浓度相差不大，更有选地，使用浓度一致的酸或者硫酸铜溶液。

步骤d)合并滤液并定容

如前所述，这个步骤为过滤分离剔除蛋白质固化形成的沉淀的步骤之一，也可以认为是为下一步的操作做准备的一个步骤。从步骤c)来的滤液并没有一个准确的容积数值，在后续的计算过程中也无法给出确切的计算公式，所以需要定容。

定容是化学实验中的一个常用操作方式，即将不确定容积的液体，加入一定量的液体，使得其具有确定的容积。如果需要定容的液体是溶液，则通常加入的是溶剂。

由于从步骤c)来的滤液具有较高的温度，那么最好待滤液冷却后再定容，以免影响定容的准确性。

步骤e)利用离子色谱法测定步骤d)定容后滤液中的NH4+含量

步骤e)为测定滤液中氮的含量的过程，或者称之为测定滤液中NH4+含量的方法。步骤e)中实际测得的是NH₄ ⁺含量，因此，可以通过氮元素的对应关系求出烟草中非蛋白质氮含量。可以在此步骤求出烟草中非蛋白质氮含量，也可以在最后计算的过程中再求出，优选的当然是在所有测试步骤进行完之后再进行统一的计算，代入特定公式或者利用已经编好的计算机程序输入数据，很快即可以得到最终的结果。公式和计算机程序的变化也可以求出其它的一些参数。

离子色谱法是一种用于分析的分离技术，主要用于分离极性和部分弱极性的化合物。离子色谱法利用的是各种物质在色谱柱中的停留时间的不同而对其进行分离和检测的方法。离子色谱法一般采用的是离子交换柱。

离子色谱法中使用的洗脱剂优选为硝酸；碳酸氢根(有时也用碳酸根和碳酸氢根混合物)作为离子色谱法中的洗脱液已经有较长时间，然而在本发明所述的测定方法中，本发明人在多次试验后发现，硝酸作为洗脱液的测定结果较之令人满意。硝酸的浓度优选为0.6～0.8mmol/L(毫摩尔/升)。离子色谱法中所使用的柱填料优选为表面碘化双重网强酸性阳离子交换树脂。

步骤f)测定烟草中总氮含量

此步骤为测定烟草中总氮含量的步骤。因为步骤a)～e)与步骤f)是相互独立的，因此可以没有先后顺序。

测定烟草中总氮含量的方法很多，例如连续流动法、蒸馏滴定法、氨气敏电极法或者离子色谱法等。测定烟草中总氮含量的方法采用现有技术中的方法即可，并且这些方法也已经较为成熟，有很多均已经制定了行业标准。例如中华人民共和国烟草行业标准YC/T161-2002为《烟草及烟草制品总氮的测定连续流动法》、YC/T33-1996为《烟草及烟草制品总氮的测定克达尔法》。其中克达尔法就是上述的蒸馏滴定法。除了上述已制定标准中的总氮测定方法之外，也有利用氨气敏电极法，氨气敏电极的原理是，通过测定标准铵盐溶液和待测样品消化液之间的平衡电位差值，再利用公式计算出氮的含量。氨气敏电极法的典型具体操作步骤为，准确移取一定量的消化液于烧杯中，准确加入一定量的NaOH溶液，放入搅拌子，插入电极，在电磁搅拌下读取平衡电位值，可以记作E₁，再准确加入NH₄ ⁺标准溶液，在电磁搅拌下读取平衡电位值，可以记作E₂。然后通过平衡电位差和氮含量之间的关系，计算出氮含量。也可以利用离子色谱法来测定。以上对测定烟草中总氮的方法做了一下说明，选择哪一种方法来测定，可以根据测试者的实际情况来确定采用哪一种方法，例如有些实验条件的限制不能使用离子色谱法，那么可以选择其它的方法，有些需要快速测定，则可能需要离子色谱法或者氨气敏电极法等。测定氮的方法不限于此，如果根据科学原理可以确定测定氮的方法是可行的，则都可以用作本发明中的步骤f)。本步骤中不推荐使用蒸馏滴定法，因为这样的测定方法相对于已有的技术将会更加麻烦。但是，在烟草单位测定总氮含量是日常测试项目，那么如果该单位利用的是蒸馏滴定法来测定总氮的，那么再结合本发明的步骤a)～e)就可以很容易计算出烟草中的蛋白质含量而不需要再利用连续滴定法去直接测定烟草中蛋白质的氮含量，省略了对烟草溶液进行消化的步骤。

g)结合步骤e)和步骤f)的测定结果计算出烟草中蛋白质氮含量

结合步骤e)和步骤f)的测定结果，根据氮元素的对应关系就可以求出烟草中蛋白质氮含量，以及烟草中蛋白质的含量。或者根据氮元素的对应关系直接通过一个公式就可以计算出烟草中蛋白质的含量。

以上对本发明的各个步骤中的细节进行了说明，其中也叙述了一些改进和优选的方案。

测定出烟草中蛋白质氮的含量之后，就可以计算出蛋白质的含量。发明人通过设计这个测定方法的实现路线，可以大大减轻工作中的工作量。因为烟草中总氮含量的测定为各烟草企业的日常监测项目，所以在此方法中，只需要测定烟草中非蛋白质氮的含量即可，并不会增加工作量。通过试验证实，本发明提供的烟草中蛋白质氮含量的测定方法，也可以称之为烟草中蛋白质含量的测定方法，测定结果稳定，与原有的经典法获得的测定值也具有高度的一致性，满足实验准确性的要求。

上面对本发明的技术方案做了详尽的说明，对于本发明所提供的烟草中蛋白质氮含量的测定方法，首先通过固氮处理将烟草中的蛋白质以沉淀的形式剔除，然后利用离子色谱法测定滤液中的NH₄ ⁺含量，再利用测定总氮的方法测定烟草中的氮含量，通过计算可以得出烟草中的蛋白质氮含量以及蛋白质的含量。因为烟草中总氮含量的测定为各烟草企业的日常监测项目，相当于完成了本发明的步骤f)，所以只需要实验步骤a)～e)和计算步骤g)即可，而步骤a)～e)不是直接测定蛋白质氮含量，而是测定剔除蛋白质以后的滤液中氮的含量，避免了将蛋白质氮转化为硫酸铵以后，还需要利用强碱蒸馏释放出氨、用标准酸液接收、反滴定，减少了因实验人员不同而存在的较大差异。可以看出，本发明提供的测定方法减少了人为的操作误差，是一种简便高效的测定烟草中蛋白质氮含量的方法。

具体实施方式

为能进一步理解本发明，下面结合具体的实施方式对上述的技术方案做进一步的阐述和说明。

以下实施例中用到的试剂的具体情况见表1，对试剂有特殊说明的除外。

表1

 

试剂名称	浓度、纯度、来源等
		冰醋酸	AR，广东光华化学厂有限公司
硫酸铵	AR，广州化学试剂厂
		硝酸	AR，广州化学试剂厂
无氮定性滤纸	中速滤纸，杭州新华纸业有限公司
		电子天平	德国沙多利斯公司，H110型，感量为0.0001g
离子色谱仪	美国Dionex20201型

表1中，AR代表分析纯。

具体测定方法为：

1)按照中华人民共和国标准GB/T19616-2004抽取烟叶样品，按照中华人民共和国烟草行业标准YC/T31-1996将烟叶样品制备烟末试样，测定烟末中水分含量。

2)称取约2g烟末，称取精度精确至0.0001g，置于100mL(毫升)浓度为0.5％的乙酸溶液中，加热保持沸腾15分钟，迅速用无氮定性滤纸过滤，并用浓度为0.5％乙酸溶液冲洗沉淀物。合并滤液，待冷却到室温后定容到200mL。所述乙酸溶液的浓度指的是质量浓度，即质量百分数。

3)取定容后的滤液10ml，在1000mL中稀释100倍。

应该说，针对不同的烟叶品种需要稀释不同的倍数以取得满意试效果，例如，对于烤烟样品，这里稀释倍数为25～100倍较为合适，对于白肋烟样品，这里稀释倍数为50～200倍较为合适，在这里统一采用稀释100倍。

4)取步骤3)中的滤液进行离子色谱测定，色谱条件为洗脱剂：0.72mmol/L HNO₃；流速：0.7mL/min(毫升/分钟)；进样体积：30μL(微升)；分离柱：C1短柱(5mm i.d.×30mm(毫米))；柱填料：交换容量为0.01mmol/L的表面碘化双重网强酸性阳离子交换树脂；纸速：4mm/min；灵敏度：10mV满度；系统工作压力：196kPa；检测器量程：200Ω挡。

5)通过计算得出烟草中非白质氮含量。

6)按照中华人民共和国烟草行业标准YC/T161-2002所述方法测定烟草的总氮含量。

7)计算烟草中蛋白质的含量。计算公式为：

6.25×(t-c)，

其中，t代表步骤6)所测得的总氮含量，

c代表步骤5)中测定的非蛋白质氮的含量。

对16个烟叶样品，每个烟叶样品进行3次试验，所得的烟叶样品的非蛋白质氮含量的结果见表2，蛋白质含量的结果见表3。

表2 非蛋白质氮含量(质量百分比)检测结果

表3 蛋白质含量(质量百分比)检测结果

在每次试验中，以两个平行样检测结果的平均值作为填报数据，并且本发明人发现，每次试验的标准曲线相关系数皆大于0.999。

从表2数据可以看到，除一个样品外其它数据的变异系数皆小于5％。而从表3的数据更显示，该方法重复性较好，变异系数小于3％，绝大部分都小于2.4，通常都小于2。因此，符合分析检测的要求。

对比实施方式

按照中华人民共和国烟草行业标准YC/T166-2003烟草和烟草制品总蛋白质含量的测定方法，对上述16个烟叶样品进行总蛋白质含量的测定。得到的结果见表4。表4为本发明所测得的蛋白质含量和利用行业标准测定方法得出的蛋白质含量的比较表。

表4

 

样品编号	1	2	3	4	5	6	7	8
									本发明方法测定值	7.50	11.79	9.97	8.26	10.37	9.15	10.38	9.72
行业标准测定值	6.95	11.15	9.78	9.12	9.57	10.17	10.26	9.18
									相对偏差，％	3.72	2.73	1.10	5.01	3.96	5.35	0.55	2.82

表4(续)

 

样品编号	9	10	11	12	13	14	15	16
									本发明方法测定值	10.55	9.35	10.87	10.03	4.73	6.19	6.84	8.84
行业标准测定值	10.61	8.91	10.63	9.14	5.19	5.97	7.24	7.97
									相对偏差，％	0.25	2.36	1.36	4.58	4.71	1.73	2.94	5.12

从表4可以看出，各个样品的利用本发明方法和利用行业标准所测得的数据对比，每对数据的相对偏差均小于6％。把利用本发明方法所测得的16个数据作为一组，把利用行业标准所测得的16个数据作为一组，采用数理统计方法中的t检验对这两组数据进行分析，得到t值为1.082，小于查表值t(0.1，15)，t(0.1，15)＝1.753。可以看出在90％的置信区间内，两组数据没有明显的差异，因此得出结论：可以采用本发明所提供的测定方法代替原来的经典检测法。

氨气敏电极法测定烟草中总氮的方法也是可行的。方力、李樱等人分别利用烟草行业标准中的蒸馏滴定法和氨气敏电解法对7个烟叶样品中的氨量进行了测试，实验结果见表5。其中，消化过程中使用的消化剂均采用硫酸/双氧水。

表5

表5中数据为三次测定的结果的平均值。从表5可知，蒸馏滴定法和氨气敏电解法测定的结果是一致的，而且方力指出，氨气敏电极法测定结果的精密度略高于蒸馏滴定法。

因此，本发明所提供的烟草中蛋白质氮含量的测定方法完全可以满足烟草工作者的实际需要。

以上对本发明所提供的技术方案进行了详细介绍。本说明书中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想在具体实施方式及应用范围上可能在实施过程中会有改变之处。因此，本说明书记载的内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (9)

1、一种烟草中蛋白质氮含量的测定方法，包括如下步骤:

a)称取烟草；

b)将称取的烟草放入足量的酸或者硫酸铜溶液中，加热至蛋白质固化完全；

c)过滤并用步骤b)中所述的酸或者硫酸铜溶液冲洗滤出物；

d)合并滤液并定容；

e)利用离子色谱法测定步骤d)定容后滤液中的NH₄ ⁺含量，

f)测定烟草中总氮含量；

g)结合步骤e)和步骤f)的测定结果计算出烟草中蛋白质氮含量；

其中，步骤f)与步骤a)～e)没有先后顺序。

2、根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，b)中所述的酸为有机酸。

3、根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，步骤b)中所述有机酸为乙酸，浓度为0.4％～0.6％。

4、根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，步骤b)中所述加热至蛋白质固化完全为，加热至乙酸沸腾并保持15分钟以上。

5、根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，步骤b)中所述有机酸为三氯乙酸，浓度为0.8％～2.0％

6、根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤d)为合并滤液，待滤液冷却后再定容。

7、根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤e)中所述离子色谱法中使用的洗脱剂为硝酸。

8、根据权利要求7所述的测定方法，其特征在于，所述硝酸的浓度为0.6～0.8mmol/L。

9、根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤e)中所述离子色谱法中所使用的柱填料为表面碘化双重网强酸性阳离子交换树脂。