CN109827920A - 一种橘青霉发酵液中还原糖的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测技术领域，公开了一种微生物发酵液中还原糖的检测方法，包括最佳DNS溶液配方选择的方法、最适反应时间选择和最优紫外测定波长确定。本发明使用DNS还原显色的方法检测橘青霉发酵液中还原糖的含量，通过还原糖含量的变化，判断橘青霉生长状态和生长环境，实现发酵生产过程中的有效控制，该方法简单易操作。本发明使用3,5‑二硝基水杨酸显色代替传统的碘酸滴定，还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5‑二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3‑氨基‑5‑硝基水杨酸，在碱性溶液中此化合物呈橘红色，在一定的浓度范围内还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的还原糖的含量。本发明的检测方法可以定量检测橘青霉发酵液中还原糖含量，容易操作，准确性和稳定性高。

Description

一种橘青霉发酵液中还原糖的检测方法

技术领域

本发明属于检验测定技术领域，具体而言涉及橘青霉发酵液中还原糖的检测方法。

背景技术

葡萄糖和麦芽糖都是还原性单糖，是目前发酵酶液中以及酶解生产中普遍存在物质。测定还原糖含量是糖定量的基本方法，如分析测定水果和蔬菜中的可溶性糖、各种食品和饮品中的总糖、乳制品中的乳糖与蔗糖等，均可通过测定还原糖进行定量。

3,5-二硝基水杨酸(DNS)法是测还原糖的经典方法，DNS与还原糖共热后生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，在一定的范围内，还原糖的含量和反应液颜色成正比，可利用比色法测定。同时也可以间接测出多糖的含量，由于多糖的水解产物为还原糖，通过多糖水解前后所测还原糖与总糖含量的差值，即可换算多糖的含量。DNS法测多糖的方法操作简便、快速、准确性高、重现性好。

目前，测定还原糖的方法很多，斐林试剂滴定法、高锰酸钾滴定法、次亚典酸滴定法、葡萄糖氧化酶法、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶法以及3,5一二硝基水杨酸比色法，与这些方法相比DNS定糖法具有操作简便、快速、精确、测定成本低等优点，尤其适合于低浓度糖样的测定而被广泛采用。

DNS水杨酸比色法测定还原糖浓度的基本原理是：其测定原理是：在碱性条件下，DNS与还原糖共热后被还原生成棕红色的氨基化合物3-氨基-5-硝基水杨酸，在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比。

还原糖浓度(mg/ml)＝X*稀释倍数N

A为反应样品紫外光密度值在标准曲线上查的毫克数，mg；

B为空白样品紫外光密度值在标准曲线上查的毫克数，mg；

X为由(B-A)查得葡萄糖标准曲线还原糖的毫克数mg；

N为稀释倍数N＝稀释液体积V/25；

但是DNS水杨酸比色法测定微生物还原糖存在以下缺点：红棕色反应终点的观察因人而异，反应终点不明显，存在误差较大，同时微生物还原糖最佳紫外测定波长位置对结果影响也很大，致使检测结果准确性降低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种橘青霉发酵液中还原糖的检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

(1)取待测橘青霉发酵液与显色试剂DNS溶液混合，得到混合液，所述DNS溶液的配方如下：

配方1、将6.3g 3,5-二硝基水杨酸和262ml 2mol/L NaOH溶液，加到500ml含有192g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g苯酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中一周后使用；

配方2、精确称取1g 3,5-二硝基水杨酸溶于20mL 1mol/L氢氧化钠中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100ml，静置一段时间后使用；

(2)在DNS溶液中加入与待测样品等体积的去离子水，作为空白对照；

(3)将步骤(1)得到的混合液和空白对照在沸水浴中加热，再冷却至室温，紫外分光光度计520nm处测定吸光度；

按下式计算橘青霉发酵液中还原糖含量：

还原糖浓度(mg/ml)＝X*N

式中

A为混合反应样测得紫外吸光度；

B为空白样测得紫外吸光度；

X为由(B-A)查得葡萄糖标准曲线还原糖的毫克数mg；

N为稀释倍数N。

2.根据权利要求1所述的橘青霉发酵液中还原糖的检测方法，其特征在于，所述葡萄糖标准曲线制作方法如下：

配置不同浓度梯度的葡萄糖溶液，将其与DNS溶液混合，在沸水浴中加热，再冷却至室温，紫外分光光度计520nm处测定吸光度，以吸光度值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，做出标准曲线。

本发明技术方案的优点和有益效果如下：(1)本发明提供了一种更稳定，更准确的DNS溶液配制方法；(2)本发明提供的方法，给出了最佳反应时间，此方法可以真实反映样品中还原糖的含量，保证了检测结果的准确性。(3)同时本发明也提供了一种确定线性最优的紫外测定波长的方法。该方法可以快速、准确找到线性最好的波长，贴近工业生产，易于工厂简易条件下操作，能够缩小检测结果的误差。

附图说明

图1葡萄糖标准曲线。

图2不同波长下葡萄糖的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不局限实施例表示的范围、亦可应用于其他微生物样品的检测。

实施例1：DNS比色法测定橘青霉发酵液中还原糖含量。

1.在25ml的定量管中，取待测样品与适量显色试剂DNS溶液混合得到混合液。

2.将上述混合液在沸水浴中准确加热最适反应温度，取出冷水迅速冷却至室温，用去离子水定容至25mL，加塞后颠倒混匀，在最佳紫外测定波长处进行比色。

3.设置空白对照：在步骤1中不加所述待测样品，只加入同体积的去离子水，按下式计算橘青霉发酵液中还原糖含量：

还原糖浓度(mg/ml)＝X*稀释倍数N

式中：

A为混合反应样测得紫外吸光度；

B为空白样测得紫外吸光度；

X为由(B-A)查得葡萄糖标准曲线还原糖的毫克数mg；

N为稀释倍数N＝稀释液体积V/25；

实施例2：显色试剂DNS溶液配方的选择。

配方1、将6.3g 3,5-二硝基水杨酸和262ml 2mol/L NaOH溶液，加到500ml含有192g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g苯酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中一周后使用。

配方2、精确称取1g 3,5-二硝基水杨酸溶于20mL 1mol/L氢氧化钠中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100ml，静置一段时间后使用。

表1橘青霉发酵液中的还原糖含量测定结果

结果分析：橘青霉发酵液与DNS溶液反应后，经紫外分光光度计检测得到还原糖的含量，得出橘青霉发酵液的还原糖含量(表1)。由表中数据可以看出，DNS配方一的检测结果与HPLC的检测结果较为接近，DNS配方二的检测结果误差较大，这说明苯酚和亚硫酸钠有利于还原糖和DNS的氧化还原反应，因此选用DNS配方一为测定橘青霉发酵液还原糖的DNS溶液。

实施例3：葡萄糖标准曲线制作。

取6支25mL定量管编号，按表分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。

表2葡萄糖测试结果

将各管摇匀，在沸水浴中准确加热10min，取出，用冷水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至25mL，摇匀。调分光光度计波长至520nm，用0号管调零点，测出吸光度值。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖含量(mg)为横坐标，做出标准曲线。

实施例4最适反应时间的选择

步骤1、在25ml的定量管中，取待测样品与适量显色试剂DNS溶液混合得到混合液，混合后，在5～25min内设置反应时间的梯度，取出冷水迅速冷却至室温，用去离子水定容至25mL，加塞后颠倒混匀，在最优紫外测定波长520nm处进行比色；

表3不同反应时间下橘青霉发酵液的还原糖含量检测结果

反应时间/min	2	5	8	10	13	15	25
								还原糖含量	2.875	5.025	8.547	10.627	10.613	10.625	10.620

表3中结果显示，利用本发明检测橘青霉发酵液还原糖的方法，在与显色试剂DNS溶液反应10min后，还原糖含量达到最大值，延长反应时间还原糖含量维持在10.600左右稳定不变，这说明在反应10min后，酶液中的还原糖上还原性基团醛基，基本已经被DNS氧化，因此反应时间为10～15min时，检测橘青霉发酵液还原糖的方法准确性较高。

实施例5最适测量波长的确定。

实施方法：

1.移取适量反应后的测还原糖溶液于容量瓶中，稀释到合适的倍数，制成测试样。

2.吸取适量测试样于紫外石英比色皿中，在紫外分光光度计上扫描出300～600nm图谱。

3.记录下测试样波峰所占波长的区域。

4.选取所占波长的区域不同波长，测试等梯度标准葡萄糖数值。

5.绘制不同波长的还原糖标准曲线。

6.对比各标准曲线的线性优劣，即R2数值。

为了确定线性最好的波长，在测试样所占波段450～600nm中，选取450nm、480nm、波峰500nm、520nm、580nm作为测试波长，用前述等梯度浓度的检测方法进行还原糖检测，作图看线性结果。

表5线性检测结果

表5和图2的数据图结果显示，可检测橘青霉发酵液还原糖的最优波长为520nm，打破了以往选定波长所认识的吸收最大，干扰最小的概念，而且本发明利用DNS比色法方法检测微生物橘青霉发酵液还原糖所适宜测定的线性范围广。

表6重复性检测结果

序号	1	2	3	4	5	6	7	8
									还原糖含量g/L	10.572	10.634	10.600	10.641	10.549	10.591	10.587	10.623

根据表6中的测定值，微生物橘青霉发酵液还原糖含量基本稳定在10.600左右，这说明本发明利用DNS比色检测微生物还原糖的方法稳定性和重复性好。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (5)

1.一种橘青霉发酵液中还原糖的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取待测橘青霉发酵液与显色试剂DNS溶液混合，得到混合液，所述DNS溶液的配方如下：0.028mol/L 3,5-二硝基水杨酸、2mol/L NaOH、0.914mol/L酒石酸钾钠、0.053mol/L苯酚、0.040mol/L亚硫酸钠；

(2)在DNS溶液中加入与待测样品等体积的去离子水，作为空白对照；

(3)将步骤(1)得到的混合液和空白对照在沸水浴中加热，再冷却至室温，在最适紫外波长处测定吸光度；

按下式计算橘青霉发酵液中还原糖含量：

还原糖浓度(mg/ml)＝X*N

式中

A为混合反应样测得紫外吸光度；

B为空白样测得紫外吸光度；

X为由(B-A)查得葡萄糖标准曲线还原糖的毫克数mg；

N为稀释倍数N。

2.根据权利要求1所述的橘青霉发酵液中还原糖的检测方法，其特征在于，所述葡萄糖标准曲线制作方法如下：

配置不同浓度梯度的葡萄糖溶液，将其与DNS溶液混合，在沸水浴中加热，再冷却至室温，紫外分光光度计520nm处测定吸光度，以吸光度值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，做出标准曲线。

3.根据权利要求1所述的橘青霉发酵液中还原糖的检测方法，其特征在于，橘青霉酶液与DNS的体积比为1:3。

4.根据权利要求2所述的所述的橘青霉发酵液中还原糖的检测方法，其特征在于，步骤(3)中沸水浴中加热时间为4～25min。

5.根据权利要求2所述的橘青霉发酵液中还原糖的检测方法，其特征在于，步骤(3)中测定的紫外波长为450～580nm。