CN101575627A - 一种利用木质纤维素生产甲壳素/壳聚糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用木质纤维素生产甲壳素/壳聚糖的方法：于以稀酸处理木质纤维素获得的以木糖为主的水解液直接作为发酵底物配制成发酵培养基，以霉菌作为发酵微生物进行发酵培养，得到富集甲壳素/壳聚糖的发酵产物。本发明将木质纤维素资源通过工艺成熟的酸水解法处理，将得到的主要含有木糖的水解液用于菌体生长获取细胞中的甲壳素/壳聚糖、以及其衍生物等高附加值产品，相对于现有技术中用木质纤维素生产乙醇等大宗化学品而言，更加有利用前景；而且，木质纤维素水解液能相对于现有技术的其他高成本底物而言，反而更加有效地促进了甲壳素/壳聚糖的积累。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其是微生物利用木质纤维素资源发酵生产高附加值产品的方法，具体涉及将木质纤维素用于微生物发酵生产甲壳素/壳聚糖的方法。
背景技术
甲壳素，又名几丁质，是2-乙酰氨基葡萄糖直链多聚体，广泛存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳、软体动物的器官(如乌贼的软骨)中。壳聚糖是β-1，4-氨基葡萄糖的直链聚合物，可通过甲壳素的化学热处理获取，或从真菌细胞壁中分离。壳聚糖是一重要的化工产品，由于其粘合性好、成纤成膜性能优良，无毒、无气味，被广泛应用于食品保鲜技术；由于其具有抗衰老、防皱、美容和保健等作用，在化妆品领域有较大应用；同时壳聚糖还可明显降血脂、降血糖、增强免疫，在医药领域应用广泛；此外，壳聚糖还可应用于环境治理过程，如去除污水中的重金属等。目前市场上出售的壳聚糖主要由虾、蟹等外壳提取的甲壳素经脱乙酰化后制得，该方法在处理过程需大量强酸、强碱，对设备要求高，环境污染大，且所获得的产品缺乏稳定的物理-化学性能，工业应用范围较窄。
研究表明，从真菌中提取的壳聚糖具有稳定的物理化学特性，且壳聚糖的分子大小可通过发酵参数的改变进行调整，能够满足不同工业应用要求，目前利用真菌发酵生产壳聚糖已成为各国的研究热点。发酵法制备甲壳素/壳聚糖常用菌种为曲霉、毛霉、根霉，如黑曲霉(Aspergillus niger)，鲁氏毛霉(Mucor rouxii)，米根霉(Rhizoups oryzae)，少根根霉(Rhizoups arrhizus)等。现有技术中，S.Chatterjee通过考察糖蜜(MSM)、土豆汁(PDB)、葡萄糖酵母膏蛋白胨(YPG)等碳源对鲁氏毛霉(Mucor rouxii)积累壳聚糖的影响，认为MSM最利于壳聚糖的积累；Kaplan通过延长鲁氏毛霉(Mucor rouxii)的培养时间及变更培养基成分，增加了生物量同时壳聚糖的积累量得到提高，且分子质量增大；Goksungur以糖蜜为原料发酵米根霉生产壳聚糖，通过改变通气速率、搅拌转速及初始糖浓度使壳聚糖产量从961mg/L提高至1109.32mg/L；Yoshihara在米根霉发酵产甲壳素/壳聚糖过程中，通过添加5～12g/L的D-psicose，大幅提高了二者的含量；Sudipta Chatterjee在米根霉生长过程中添加少量激素类物质增进了甲壳素的脱乙酰程度，壳聚糖的生成量获得提高；陈世年以YPG培养米根霉，72小时后细胞干重达19.31g/L，经提取壳聚糖产率为10.1％(按干重计)，脱乙酰度为92％。由此看来，微生物发酵法制备壳聚糖的研究已取得较大进展，但欲与化学工艺媲美，提高产品质量的同时，降低发酵成本仍是其关键要素。
木质纤维素是地球上储量最丰富的生物可再生资源，主要来源于农林废弃物，包括玉米秸秆、玉米芯、废木屑等，含35％～50％的纤维素，20％～35％的半纤维素和10％～15％的木质素。理论上，木质纤维素的降解产物中富含大量的糖类，主要有纤维素的降解产物葡萄糖，及半纤维素的降解产物木糖等，这些降解后的糖均可被微生物发酵转化。但目前较多的木质纤维素资源都被遗弃或焚烧，在资源浪费的同时还造成了严重的环境污染。若能以现代生物技术手段，将储量丰富、廉价的木质纤维素资源变废为宝，对于我国这样一个人口众多，人均资源贫乏的农业大国，将具有丰富的经济、环境和社会效率。目前关于微生物如何有效利用木质纤维素的研究主要集中于将木质纤维素降解得到的混合糖液用于乙醇、有机酸的发酵方面，产品多为大宗化学品，附加值低，且微生物在利用木质纤维素发酵过程中普遍存在对水解产物木糖利用率低，代谢效率差等诸多问题，造成了木质纤维素的低利用，发酵产品的高成本、低竞争力的现状，故有必要从木质纤维素的有效利用，及高附加值产品的开发这两方面对木质纤维素的应用进行更广泛的技术方案的设计和应用。
发明内容
本发明的技术目的是提供一种能有效利用木质纤维素的水解液用于微生物发酵生产高附加值产品——甲壳素/壳聚糖的方法，使得该技术方案在实现木质纤维素有效利用的同时，还具备高产甲壳素/壳聚糖的能力，有效降低甲壳素/壳聚糖的生产成本。
为了实现本发明的技术目的，本发明采用的技术方案如下：
一种利用木质纤维素生产甲壳素/壳聚糖的方法，其特征在于以稀酸处理木质纤维素获得的以木糖为主的水解液直接作为发酵底物配制成发酵培养基，以霉菌作为发酵微生物进行发酵培养，得到富集甲壳素/壳聚糖的发酵产物。
本发明技术方案的具体步骤如下：
(1)发酵培养基的配制
将木质纤维素酸水解后的水解液稀释或浓缩成木糖浓度为10～50g/L的溶液，将其直接作为发酵底物，并且加入菌体生长及产物积累所必需的营养物质配制成发酵培养基，灭菌并冷却；
由于木质纤维素酸水解后的水解液本身含有丰富的金属离子等培养基所必须的营养物质，故本发明所述的产物积累所必需的营养物质可以仅为现有技术中的任意氮源；
更优化的，培养基所必需的营养物质包括：KH2PO4 0.1～1g/L，MgSO4·7H2O 0.1～1g/L，ZnSO4·7H2O 0.0001～0.001g/L，FeSO4·7H2O 0.01～0.1g/L，尿素1～4g/L，添加中和剂控制pH为2.5～6.0；
其中，添加的中和剂为H2SO4或HCl；
(2)菌体培养及产物积累
向配制好的发酵培养基中接入霉菌孢子悬浮液，于温度30～35℃下培养42～84小时，得到富集甲壳素/壳聚糖的发酵产物。
具体的：摇瓶一级培养的条件为向培养基中接种霉菌孢子终浓度为105～107个/mL，接种量5％～10％，于温度30～35℃，150～220rpm转速下培养18～36小时，获得发酵种子；以5％～10％的接种量接入发酵罐，于30～35℃，150～400rpm，通气量0.5～1vvm，培养24～36小时，得到富集甲壳素/壳聚糖的发酵产物。
本发明所述的木质纤维素酸水解后的水解液即对木质纤维素进行酸降解，得到以木糖为主的水解液；而本发明所述的对木质纤维素的酸降解方法为现有技术中任意的酸水解木质纤维素的方法。
本发明所述的微生物发酵生产甲壳素/壳聚糖及其衍生物的方法得到的富集甲壳素/壳聚糖的发酵产物可以采用现有技术中任意的甲壳素的提取方法来提取甲壳素纯品。例如，将所述的得到的发酵产物过滤并收集菌体，加入2～10％的NaOH溶液，于90～120℃处理2～4小时脱除蛋白质，离心并过滤，于离心的沉淀中加入2～10％的乙酸溶液，60～100℃处理2～6小时后离心，将得到的沉淀水洗至中性，再分别用95％乙醇和丙酮洗涤3次，干燥后即得到纯品甲壳素。
本发明所述的微生物发酵生产甲壳素/壳聚糖及其衍生物的方法得到的富集甲壳素/壳聚糖的发酵产物可以采用现有技术中任意的壳聚糖的提取方法来提取壳聚糖纯品。例如，将所述的发酵产物过滤并收集菌体，加入2～10％的NaOH溶液，于90～120℃处理2～4小时脱除蛋白质，离心并过滤后得到的上清液用10～30％的NaOH溶液调节pH至8.0～10.0后离心，将得到的沉淀水洗至中性后分别用95％乙醇和丙酮洗涤3次，干燥即得到纯品壳聚糖。
本发明所述的霉菌包括曲霉属、青霉属、毛霉属、根霉属；
本发明所述的甲壳素/壳聚糖可以利用现有技术中任意的水解方法直接制得如脱乙酰氨基葡萄糖等衍生物。
本发明的有益效果在于：
(1)将木质纤维素资源通过工艺成熟的酸水解法处理，将得到的主要含有木糖的水解液用于菌体生长获取细胞中的甲壳素/壳聚糖、以及其衍生物等高附加值产品，相对于现有技术中用木制纤维素生产乙醇等大宗化学品而言，更加有利用前景；
(2)利用霉菌发酵产甲壳素/壳聚糖，所用原料为木质纤维素类物质，来源广泛，得到的水解液无需经过分离提纯就可直接用于生产，甚至不需要加入额外的金属离子等发酵必需的营养物质，仅加入适量氮源即可生物甲壳素/壳聚糖，有效降低了这类高附加值产物的生产成本；
(3)木质纤维素水解液能相对于现有技术的其他高成本底物而言，反而更加有效地促进了甲壳素/壳聚糖的积累，使发酵法生产甲壳素/壳聚糖具备更优异的工业化前景。
说明书附图
图1利用木质纤维素水解液发酵生产甲壳素/壳聚糖的工艺流程图
具体实施方式
实施例1
本实施例说明现有技术中一种酸水解法降解木质纤维素得到糖液的方法，但是本发明所述的降解木质纤维素的方法不受该方法的限制，应理解为现有技术中所有可适用于木质纤维素水解的酸水解法。
(1)将木质纤维素原料如玉米秸秆。用除尘设备将植物秸秆中的杂质除去，除杂后的秸秆经粉碎机粉碎，粉碎到粒径50目备用；
(2)用1％的稀酸浸泡过夜处理后过滤得到秸秆滤渣，向其中加入3％的稀硫酸并于100℃处理3小时；
(3)过滤处理后的上清溶液即木质纤维素的水解液，经过Ca(OH)2调节至pH8.0，过滤CaSO4沉淀以及不溶物，得到主要含有木糖的木质纤维素水解液即可直接作为发酵碳源，备用以下一步配制发酵培养基用。
实施例2
本实施例说明利用木质纤维素水解液发酵生产甲壳素/壳聚糖的步骤。
木糖的含量测定方法：
采用DNS法。1mL样品液加入3mL DNS溶液，于100℃煮沸5min，定容至25mL，540nm处测定吸光度，于纯木糖标曲上找出对应吸光度下木糖浓度，即为该样品中木糖的含量。
菌种：米根霉(Rhizopus oryzae CICC 3087)孢子悬浮液、少根根霉(Rhizopus arrhizusNRRL 1526)孢子悬浮液、黑曲霉(Aspergillus niger CICC 2160)孢子悬浮液、橘青霉(Penicillium citrinum CICC 4011)孢子悬浮液、毛霉(Mucor elegans CICC 3134)孢子悬浮液。
(1)配制发酵培养基
将实施例1中水解获得的木质纤维素混合溶液浓缩，得到木糖浓度为50g/L的溶液，以浓度为50g/L葡萄糖的溶液为对照，分别加入霉菌种子培养必需的营养物质：KH2PO40.6g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，ZnSO4·7H2O 0.000498g/L，FeSO4·7H2O 0.0176g/L，尿素2g/L，添加H2SO4控制pH为4.0。
其中水解液与尿素、金属离子分开灭菌，115℃灭菌30分钟。
(2)菌体培养
摇瓶一级培养的条件为向培养基中接种霉菌孢子终浓度为105个/mL，接入装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，接种量5％，于温度35℃，200rpm转速下培养36小时，获得发酵种子；以5％的接种量接入10L培养基的15L搅拌式发酵罐，于35℃，400rpm，通气量1vvm，培养36小时，得到富集甲壳素/壳聚糖的发酵产物。
(3)甲壳素的提取：
向菌体中加入10％的NaOH溶液120℃处理4小时脱蛋白质，离心，过滤，在沉淀中加入10％的乙酸溶液100℃处理6小时，离心，沉淀即为甲壳素，水洗至中性，分别用95％乙醇和丙酮洗涤3次，干燥得精制甲壳素。
(4)壳聚糖的提取
在甲壳素的提取过程中离心后得到的上清液即为壳聚糖溶液，用30％的NaOH溶液调pH至10.0，离心，水洗至中性，分别用95％乙醇和丙酮洗涤3次，干燥得精制壳聚糖。
(5)结果：对不同霉菌的菌体培养及甲壳素、壳聚糖的提取结果见表1及表2。
表1 以木质纤维素水解液(木糖浓度50g/L)为主要营养物的统计结果
表2 以50g/L葡萄糖为主要营养物的统计结果
由表1和表2可见，利用本发明所述的技术方案更加有效地促进了甲壳素/壳聚糖的积累，且大大降低了生产成本。
实施例3
本实施例的测定方法、发酵菌种等参数与实施例2方法相同。
(1)配制发酵培养基
将实施例1中水解木质纤维素得到的溶液稀释，使其中木糖浓度为35g/L，加入霉菌种子培养必需的营养物质：KH2PO4 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，ZnSO4·7H2O 0.0001g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，尿素1g/L，加HCl调节pH至2.5。以35g/L葡萄糖溶液为对照，添加其余必须营养物质及CaCO3 2g/L，调节pH至2.5。
其中水解液或葡萄糖、尿素、金属离子等分开灭菌，115℃灭菌30分钟。
(2)菌体培养
摇瓶一级培养的条件为向培养基中接种霉菌孢子终浓度为5×105个/mL，接入装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，接种量10％，于温度30℃，150rpm转速下培养18小时，获得发酵种子；以10％的接种量接入10L培养基的15L搅拌式发酵罐，于30℃，150rpm，通气量0.5vvm，培养24小时，得到富集甲壳素/壳聚糖的发酵产物。
(3)甲壳素的提取：
向菌体中加入2％的NaOH溶液90℃处理2小时脱蛋白质，离心，过滤，在沉淀中加入2％的乙酸溶液60℃处理2小时，离心，沉淀即为甲壳素，水洗至中性，分别用95％乙醇和丙酮洗涤3次，干燥得精制甲壳素。
(4)壳聚糖的提取
在甲壳素的提取过程中离心后得到的上清液即为壳聚糖溶液，用10％的NaOH溶液调pH至8.0，离心，水洗至中性，分别用95％乙醇和丙酮洗涤3次，干燥得精制壳聚糖。
(5)结果：对不同霉菌的种子培养结果见表3及表4。
表3 木质纤维素水解液(木糖浓度35g/L)为主要营养物的数据统计结果
表4 以35g/L葡萄糖为主要营养物的数据统计结果
实施例4
本实施例的测定方法、发酵菌种等参数与实施例2方法相同。
(1)配制发酵培养基
将实施例1中水解木质纤维素得到的溶液稀释，使其中木糖浓度为40g/L，加入尿素3g/L，加H2SO4调节pH至6.0。其中水解液、尿素分开灭菌，115℃灭菌30分钟。
(2)菌体培养
摇瓶一级培养的条件为向培养基中接种霉菌孢子终浓度为107个/mL，接入装有100mL种子培养基的500mL摇瓶中，接种量6％，于温度32℃，220rpm转速下培养24小时，获得发酵种子；以6％的接种量接入10L培养基的15L搅拌式发酵罐，于32℃，220rpm，通气量0.7vvm，培养30小时，得到富集甲壳素/壳聚糖的发酵产物。
(3)甲壳素的提取：
向菌体中加入5％的NaOH溶液100℃处理3小时脱蛋白质，离心，过滤，在沉淀中加入5％的乙酸溶液70℃处理3小时，离心，沉淀即为甲壳素，水洗至中性，分别用95％乙醇和丙酮洗涤3次，干燥得精制甲壳素。
(4)壳聚糖的提取
在甲壳素的提取过程中离心后得到的上清液即为壳聚糖溶液，用20％的NaOH溶液调pH至9.0，离心，水洗至中性，分别用95％乙醇和丙酮洗涤3次，干燥得精制壳聚糖。
(5)结果：对不同霉菌的培养结果见表5。
表5 数据统计结果
实施例5
本实施例的测定方法、发酵菌种等参数与实施例2方法相同。
(1)配制发酵培养基
将实施例1中水解获得的木质纤维素混合溶液浓缩，得到木糖浓度为10g/L的溶液，分别加入霉菌种子培养必需的营养物质：KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，ZnSO4·7H2O0.001g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，尿素4g/L，添加HCl控制pH为4.0。
(2)菌体培养
摇瓶一级培养的条件为向培养基中接种霉菌孢子终浓度为106个/mL，接入装有100mL种子培养基的500mL摇瓶中，接种量7％，于温度32℃，220rpm转速下培养24小时，获得发酵种子；以7％的接种量接入10L培养基的15L搅拌式发酵罐，于32℃，220rpm，通气量0.6vvm，培养24小时，得到富集甲壳素/壳聚糖的发酵产物。
(3)甲壳素的提取：
向菌体中加入10％的NaOH溶液90℃处理4小时脱蛋白质，离心，过滤，在沉淀中加入10％的乙酸溶液100℃处理2小时，离心，沉淀即为甲壳素，水洗至中性，分别用95％乙醇和丙酮洗涤3次，干燥得精制甲壳素。
(4)壳聚糖的提取
在甲壳素的提取过程中离心后得到的上清液即为壳聚糖溶液，用30％的NaOH溶液调pH至10.0，离心，水洗至中性，分别用95％乙醇和丙酮洗涤3次，干燥得精制壳聚糖。
(5)结果：对不同霉菌的培养结果见表6。
表6 数据统计结果
Claims (7)
1、一种利用木质纤维素生产甲壳素/壳聚糖的方法，其特征在于以稀酸处理木质纤维素获得的以木糖为主的水解液直接作为发酵底物配制成发酵培养基，以霉菌作为发酵微生物进行发酵培养，得到富集甲壳素/壳聚糖的发酵产物。
2、根据权利要求1所述的利用木质纤维素生产甲壳素/壳聚糖的方法，其特征在于所述的具体步骤如下：
(1)发酵培养基的配制
将木质纤维素酸水解后的水解液稀释或浓缩成为木糖含量10～50g/L的溶液，将其直接作为发酵底物，并且加入菌体生长及产物积累所必需的营养物质配制成发酵培养基，灭菌并冷却；
(2)菌体培养及产物积累
向配制好的发酵培养基中接入霉菌孢子悬浮液，于温度30～35℃下培养42～84小时，得到富集甲壳素/壳聚糖的发酵产物。
3、根据权利要求1至2所述的利用木质纤维素生产甲壳素/壳聚糖的方法，其特征在于所述的产物积累所必需的营养物质包括氮源。
4、根据权利要求1至2所述的利用木质纤维素生产甲壳素/壳聚糖的方法，其特征在于所述的产物积累所必需的营养物质包括：KH2PO4 0.1～1g/L，MgSO4·7H2O 0.1～1g/L，ZnSO4·7H2O 0.0001～0.001g/L，FeSO4·7H2O 0.01～0.1g/L，尿素1～4g/L，添加中和剂控制pH为2.5～6.0。
5、根据权利要求4所述的利用木质纤维素生产甲壳素/壳聚糖的方法，其特征在于所述的添加的中和剂为H2SO4或HCl。
6、根据权利要求2所述的利用木质纤维素生产甲壳素/壳聚糖的方法，其特征在于所述的步骤(2)的具体方法为：摇瓶一级培养的条件为向培养基中接种霉菌孢子终浓度为105～107个/mL，接种量5％～10％，于温度30～35℃，150～220rpm转速下培养18～36小时，获得发酵种子；以5％～10％的接种量接入发酵罐，于30～35℃，150～400rpm，通气量0.5～1vvm，培养24～36小时，得到富集甲壳素/壳聚糖的发酵产物。
7、根据权利要求1至6所述的利用木质纤维素生产甲壳素/壳聚糖的方法，其特征在于所述的霉菌包括曲霉属、青霉属、毛霉属、根霉属。
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|---|---|---|---|---|
| CN105177089A (zh) * | 2015-08-10 | 2015-12-23 | 江南大学 | 一种通过二次发酵提升菌丝体废渣几丁质含量的方法 |
| CN109827920A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-05-31 | 南京同凯兆业生物技术有限责任公司 | 一种橘青霉发酵液中还原糖的检测方法 |
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