CN102262056A - 一种用于还原糖浓度测定的补色光度自动滴定装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可以快速准确测定出各种样品中还原糖浓度的补色光度滴定装置，属于生化分析仪器技术领域。样品中的还原糖与费林试剂或者还原糖与铁氰化钾-氢氧化钠试剂在微沸状态下发生氧化还原反应，在添加指示剂次甲基蓝的反应体系中，微过量的滴定用还原糖，会使反应体系颜色产生变化，采用与反应溶液体系补色的光源系统照射反应溶液体系，采用光电转换装置检测透射光，反应终点时接收信号会产生突变，由以上方法建立的补色光度滴定装置，可以用于各种样品中还原糖浓度的快速测定。补色光度减少透光率波动，提升了突变信号的强度，几乎没有干扰信号，因此该方法测定还原糖浓度不受样品颜色、浑浊度、加热气泡的干扰。

Description

一种用于还原糖浓度测定的补色光度自动滴定装置

技术领域

本发明涉及一种可以快速准确测定出各种样品中还原糖浓度的补色光度滴定装置，属于生化分析仪器技术领域。

背景技术

还原糖是指分子中含有游离醛基或酮基的具有还原性的糖。在糖类中，单糖(葡萄糖、果糖)及双糖中的乳糖和麦芽糖等均具有还原基(醛基或酮基)，故为还原糖；二糖、三糖乃至多糖只要有还原端，亦为还原糖。因此，还原糖是指分子中含有游离醛基或酮基的具有还原性的一类糖的统称。许多糖没有还原端如双糖中的蔗糖、多糖中糊精、淀粉、纤维素等，其本身不具有还原性，属于非还原性糖，但可以通过水解生成还原性单糖，测定水解液的还原糖质量分数即可求得样品中相应糖类的含量。由于糖的分析涉及发酵、食品、医药、药学、生物学等各个领域，所以糖分析技术一直是国内外研究的热点。

食品发酵工业是我国国民经济的重要支柱产业之一。主要包括酒类、有机酸、抗生素、酶制剂、淀粉糖与传统制糖、氨基酸、核苷酸、维生素、微生物杀虫剂、单细胞蛋白等产业。应用领域涉及食品、医药、卫生、轻工、化工、农业、能源、环保等诸多行业。还原糖(葡萄糖)作为微生物的主要碳源和能源，是发酵过程中重要的生化控制参数，它在培养基中的含量及在发酵过程中的浓度变化直接影响发酵产品的质量、收率和生产成本。快速和准确地检测还原糖的含量对发酵过程控制具有重要的意义。

测定还原糖的方法甚多，目前国内外常用的主要有滴定分析法、可见分光光度法、生物传感分析法、仪器分析法等。分光光度法也是一种传统的分析手段，其特点是操作简单、准确度高。国内大部分研究仅限于对试剂配方的改良或操作方法的变动。但分光光度法对测试样品要求高，样品的颜色、浊度常常对测试产生较大干扰。酶传感器法专一性强，且快速、准确，操作方便，但是易受溶液温度、离子强度等因素的干扰，稳定性差，实际应用受到限制。红外光谱、核磁共振(NMR)、色谱、质谱分析等皆可进行糖的定性、定量及结构分析，但目前还没有适合于工业生产中常规、大批量测定还原糖的仪器产品。HPLC或GLC常用于多种糖的分析，其优点是可以同时测定样品中糖的含量和多种组分，但是测试周期长，对样品的要求严格，并且测试成本高，设备昂贵。

目前，国内主要靠手工测定法完成，如费林试剂滴定法、DNS比色法等。这些方法操作繁琐，较为费时，有时人为误差较大，特别是对浑浊样品或颜色较深的样品，颜色变化不明显，无法判断终点。针对以上情况，我们在原先“一种不受干扰的光度滴定装置”(ZL 01107845.6)、“还原糖在线自动检测装置”(ZL 03217001.7)和“检测还原糖的自动滴定装置”(ZL 200420038786.8)的研究基础上，采用补色技术原理，根据待测样品与费林试剂在热滴定过程中的颜色变化特点，参照滴定终点反应液体颜色状态，自动选择与测试样品的补色光源系统，提高光透射信号变化率和光透射强度。选择适当的元件，设计适用的电路，对整体系统进行优化设计，建立了还原糖浓度的补色光度滴定装置，大大增强了系统抗干扰的能力，提高了还原糖测定的准确度和稳定性。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种可以不受样品颜色、浑浊度、加热气泡的干扰，且能简便、快速、准确检测出各种样液的还原糖含量的自动滴定装置。本发明解决其技术问题所采用的技术方案：

1、根据待测样品溶液颜色及反应试剂溶液颜色的特点选择补色光源的波长范围。参照终点反应溶液体系的颜色，以接收的透射光信号最大变化率及透射光光强度为目标，最终选用的透射光源波长。费林试剂系统的补色光源波长范围在560--590nm。

2、以最佳补色光源和光电转换器组成反应终点判断的补色光度传感器滴定控制系统。光电转换器一般采用硒光电池、硅光电池或光电管。

3、用于还原糖测定的溶液反应体系采用欧姆加热方式进行加热，欧姆加热的电极棒材采用特定不锈钢或者铂金棒材。加热方式也可采用石英镀导电膜加热方式或者其他间接加热方式。采用灵敏度高温度传感器组反应溶液体系的精确温度控制系统。

4、还原糖测定的反应的基本原理与费林试剂手工滴定方法相同。费林试剂甲液由硫酸铜和次甲基蓝组成，费林试剂乙液由氢氧化钠和酒石酸钾钠、亚铁氰化钾组成。补色还原糖光度传感器微量热滴定法测定还原糖的机理为：根据经典的费林试剂测定还原糖氧化还原反应，该反应是在较高反应温度下，带有还原基-醛基的还原糖(葡萄糖)被费林试剂氧化。该方法是以次甲基蓝作为颜色指示剂。开始滴定时，液体呈次甲基蓝的深蓝色；在滴定过程中，定量的费林试剂被葡萄糖逐步还原；在接近滴定终点时，过量的一滴还原糖，将指示剂次甲基蓝还原成无色型，溶液的颜色有蓝色变为无色，据此确定反应终点。根据固定的费林试剂对应的还原糖当量，以及标准葡萄糖消耗量，就可计算出被滴定样品的葡萄糖含量，计算出待测样品还原糖浓度。

费林试剂的化学反应过程：

费林试剂由甲、乙液组成。甲液为硫酸铜溶液，乙液为氢氧化钠与酒石酸钾钠溶液。平时甲、乙液分别贮存，测定时甲、乙液等体积混合。混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀：

2NaOH+CuSO4＝Cu(OH)2↓+Na2SO4    公式1

所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钾钠反应，生成酒石酸钾钠铜络合物，使氢氧化铜溶解反应如下：

公式2

酒石酸钾纳铜络合物中二价铜是一个氧化剂，能使还原糖中羰基氧化，而二价铜被还原生成一价的氧化亚铜沉淀：

公式3

反应生成的氧化亚铜沉淀与费林试剂中的亚铁氰化钾(黄血盐)反应生成可溶性复盐，减少溶液混浊，便于观察颜色变化。

Cu2O+2K4Fe(CN)6+H2O→K4Fe(CN)6+H2OK2Cu2Fe(CN)6+2KOH

公式4

反应终点用次甲基蓝指示剂显示。因次甲基蓝氧化能力较二价铜弱，故待二价铜全部被还原后，一滴过量还原糖立即使次甲基蓝还原，溶液蓝色消失显示终点：

公式5

5、采用步进电机驱动的计量泵(试剂泵)用于反应试剂的精确试剂的精确计量加入。采用步进电机驱动的计量泵(滴定泵)用于整个反应的滴定用泵，并对加入反应体系滴定液精确计量。采用蠕动泵作为排空反应完成体系废液用排空泵。采用蠕动泵进入蒸馏水，作为反应体系清洗用排空泵整个反应体系采用电磁搅拌方式。

6、采用聚四氟乙烯反应池或其他合适材料加工成反应池，滴定池两侧有入射单色光源系统和光电转换器；滴定池侧面有液体进出管道；计量泵(试剂泵)连接液体进入管道可以加入试剂；计量泵(滴定泵)连接液体进入管道可以加入滴定液；蠕动泵连接蒸馏水进入反应池；蠕动泵连接反应池排出废液；电磁搅拌在反应池的底部，用于滴定液体均匀混合的；滴定池上部是进样口，可用微量进样器将被测样品注入滴定池。

7、自动控制系统包括电源电路、控制板、显示面板和微型打印机，可以用计算机或者单片机进行控制，按设定程序控制滴定池液体的进出、液体加热及温度控制、搅拌、光电信息的收集和转换，结果计算、显示、输出和打印。

综上所述，一种检测还原糖的自动滴定装置，补色还原糖光度传感器包括补色光源系统、补色光接收光电转换系统、液体加热与温度控制系统、滴定计量系统、液体流动系统、电磁搅拌系统、试剂计量系统、操作系统、显示打印系统等。以上系统由主板等硬件及软件的单片机系统测控下组成用于还原糖浓度测定得补色光度滴定装置。

本发明的特点有以下几个方面：

1、操作简单，滴定时只需用微量进样器将被测样品注入滴定池即可自动完成。

2、根据滴定需要设定反应系统和液体系统的温度控制。

3、有与液体颜色补色的单色光系统，可最大限度减少滴定干扰。

4、有精密螺杆推进式柱塞计量泵，试剂计量准确快速。

5、结果准确，重复测定的误差小于手工滴定。

6、测定速度快，滴定周期小于3分钟，特别适合于大批量样品的测定。

7、抗干扰性能强，不受样品颜色和浊度的影响。

8、性能稳定，适用范围广，可应用于工业生产控制，分析检验，科研，教学等领域，具有广阔的市场前景和显著的社会经济效益。

附图说明

图1还原糖测定装置的系统组成

补色还原糖光度传感器包括补色光源系统、补色光接收光电转换系统、液体加热与温度控制系统、滴定计量系统、液体流动系统、电磁搅拌系统、试剂计量系统、操作系统、显示打印系统等。以上系统由主板等硬件及软件的单片机系统测控组成测定装置，实现还原糖的测定。

图2还原糖测定装置工作流程图

还原糖测定装置的工作流程：设定液体流量泵流速和流量，启动注射泵，将斐林试剂工作液A和B液分别泵入管道→微量热滴定池→样品注入滴定池→液体加热至98℃左右→传感器测定温度，在到达预定温度后启动滴定泵→光电转换器检测电压变化→控制系统自动记录电压信号和滴定液消耗体积→滴定终点颜色突变，输出电压变化明显，确定滴定终点滴定泵停止→计算和显示被测样品还原糖含量→启动排空泵，将反应池内液体排出→然后进入下一次测定。整个测定过程可按设定程序控制反应液体的进出、液体温度、搅拌、光电反应信息的收集和转换，结果计算、显示和打印。

具体实施方式

实施例

补色光度自动滴定装置主要性能及样品测试

1、精密度和准确度

(1)材料与方法

补色还原糖自动滴定装置

开机：按“开/关”键，自动启动准备程序。

定标：按定标健，自动进入定标程序。试剂泵完成后，用微量注射器将标准品注入反应池，完成后仪器自动定标，并打印；

测定：按测定键，自动进入测定程序。试剂泵完成后，用微用微量注射器将标准品注入反应池，完成后仪器自动定标，并打印；

(2)结果与分析

用1.0％葡萄糖标准溶液，进样量500μl，连续10次测定，结果见表1。

表1：传感器精密度和准确度测试

对上述统计结果处理：

N＝10，均值x＝1.001，s＝0.0074

准确度：(90％的置信范围)1.001±0.009

精密度：RSD＝0.74％

2、线性测试

(1)方法

方法：分别取1.0％的葡萄糖标准溶500μl、400μl、300μl、200μl、100μl、0μl进行测定，测定方法同上。

(2)结果与分析

对不同体积的1％葡萄糖标准液进行测定，测定结果见表2

表2：线性试验结果

对上述结果进行线性回归分析，r＝0.9998，还原糖浓度在0-1.0％范围内线形良好。

3、样品测试

取发酵28小时谷氨酸发酵液，利用补色还原糖自动滴定装置测定其还原糖含量，样品重复8次测定，结果见表3发酵液试验结果。

表3：发酵液试验结果

4、回收率试验

用补偿法向同一样品发酵液(28小时)添加无水葡萄糖标准样品，用补色还原糖自动滴定装置对加样样品和未加样样品进行测定，计算加入葡萄糖的回收率。

表4：回收率试验结果

由表4可知补色还原糖光度滴定装置的回收率为99.2％，这说明补色还原糖自动滴定装置分析测定结果可靠性强。

Claims (8)

1.还原糖浓度测定的补色光度自动滴定装置有如下体系组成：

①采用与样品和反应液组成整体颜色体系补色并兼顾终点整体反应液体系透射率变化大且透射率高的单色光源；

②采用响应时间短，稳定性高的光电转换器与①组成滴定终点判断补色光度传感器系统；

③用于还原糖测定的溶液反应体系采用欧姆加热方式进行加热，也可采用石英镀导电膜加热方式加热或者其他加热方式；

④采用高灵敏度温度传感器与③组成反应溶液体系的动态精确温度控制系统；

⑤采用伺服电机驱动的计量泵用于反应试剂的精确计量；

⑥采用伺服电机驱动的计量泵用于整个反应的滴定用泵，并对加入反应体系滴定液精确计量；

⑦采用蠕动泵作为排空反应完成体系废液用排空泵；

⑧采用蠕动泵进入蒸馏水，作为反应体系清洗用排空泵；

⑨反应池采用电磁搅拌方式；

⑩采用聚四氟乙烯反应池或其他合适材料加工成反应池，滴定池两侧有入射单色光源①和光电转换器②；滴定池侧面有液体进出管道与加热装置③及温度传感器④；计量泵⑤连接液体进入管道可以加入试剂；计量泵⑥连接液体进入管道可以加入滴定液进行定量滴定；蠕动泵⑦连接蒸馏水进入反应池；蠕动泵⑧连接反应池排出废液；电磁搅拌⑨在反应池的底部；以上系统有微处理器或计算机编制程序进行控制，有控制面板，主板组成控制系统及打印机或数据输出系统。

2.根据权利要求1反应体系指还原糖测定费林试剂方法，费林试剂甲液由硫酸铜和次甲基蓝组成，费林试剂乙液由氢氧化钠和酒石酸钾钠、亚铁氰化钾组成。

3.根据权利要求1反应体系或指还原糖测定铁氰化钾法，铁氰化钾法试剂包括铁氰化钾溶液、氢氧化钠溶液和次甲基蓝溶液组成。

4.根据权利要求1所述补色单色光源采用LED光源、激光单色光源或光栅光源。

5.根据权利要求1所述欧姆加热的加热棒采用不锈钢或者铂金材料。加热采用交流50赫兹或者高频加热。

6.根据权利要求1所述高灵敏度温度传感器采用AD590集成电路传感器或其它高灵敏度温度传感器。

7.根据权利要求2、3所述的试剂可根据反应体系确立还原糖测定的浓度范围。

8.本发明的补色光度自动滴定装置可适用于所有滴定终点有颜色变化滴定反应测试。

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