CN1286554C - 离子交换剂介质的产生 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包含结合到基质上的混合型阳离子交换剂配体的分离介质的产生方法，该方法包括：提供包含官能团并具有环状核心结构的支架；用包含结合到残基R的反应性基团的试剂使支架衍生，其通过使所述支架的官能团与所述反应性基团反应而进行；打开所得衍生物的环状结构；和使该产物与包含反应性基团的基质反应。所述支架存在至少两个官能团，一个用于结合到基质上的含硫基团和一个可以转变成离子基团的基团。

Description

离子交换剂介质的产生
技术领域
本发明涉及分离领域，特别是使用混合型阳离子交换剂配体通过离子交换进行的分离。更具体地，本发明涉及产生混合型阳离子交换剂介质的方法，还涉及试剂盒，该试剂盒包含产生该混介质必需的原料。
背景技术
术语色谱法包括一族密切相关的分离方法。将色谱法与大多数其它物理和化学分离方法区分的特征是使两个相互不混溶的相接触，其中一相是固定的，另一相是移动的。样品混合物引入到移动相中，当它被移动相携带通过该系统时，它在移动相和固定相前多次经过一系列相互作用(分配)。该相互作用利用样品中各组分的物理或化学性质差异。这些差异决定在通过含有固定相的柱中移动的移动相的影响下各个组分的迁移速度。分离后的组分按照与固定相相互作用增大的顺序排出。最小延迟的组分首先流出，最强保留物料最后流出。当一个成分被充分延迟以防止样品从柱中流出时与相邻溶质的区域重叠的时候，就获得了分离。
所述柱是色谱的核心，其在可以通过单一仪器获得的仪器种类中提供多样性。特别是正在不断努力设计用于每种具体用途的最佳固定相。这样的固定相通常由支持体或基础基质构成，该基础基质已经附着了包含官能团(即结合基团)的配体。正如容易认识到的那样，可能的配体的选择是大量的，但是为了说明，以下将给出许多不同类型的配体。
在亲合性吸附中，丝氨酸蛋白酶已经吸附到基质上或从基质中脱附，其上已经通过对位的氨基共价连接了对氨基苯甲眯。
混合型阴离子交换剂已经公开在例如WO 9729825(AmershamPharmacia Biotech AB)，其提供基于电荷和氢键的相互作用，该相互作用涉及离带正电荷的胺氮在2-3个碳距离上的氧和氨基氮。该出版物基于以下发现：这种配体可以给出阴离子交换剂，该交换剂要求较高的离子强度，用于洗脱被结合的物质。
在WO 9965607(Amersham Pharmacia Biotech AB)中已经提出其中存在混合型配体的阳离子交换剂，其要求较高的离子强度，用于洗脱被束缚物质。此外，WO 9729825(US 6,090,288)和WO 9965607描述了阴离子和阳离子交换配体，二者都要求较高的洗脱离子强度。
在WO 9808603(Upfront Chromatography)中公开了通式结构M-SP1-L的分离介质，其中M是支持体介质，该支持体介质可以是亲水的，SP1是隔离物，L包含单环或双环同芳族或杂芳族部分，其可以是被取代的(同芳族部分包含仅通过碳原子形成的芳环)。取代基基本是酸性的。对于蛋白质的吸附，特别是免疫球蛋白，提出通过疏水作用而不是离子交换的分离介质。
WO 9600735、WO 9609116和US 5,652,348(Burton等人)还公开了基于疏水作用的分离介质。吸附和脱附通过分别增大或减小液体的盐浓度或改变配体上的电荷和/或通过改变pH值吸附/脱附的物质来支持。配体通常包含可以包含芳族结构的疏水部分。一些配体另外还含有可带电的结构，允许通过pH值的变化变换介质的疏水/亲水平衡。可带电荷的结构可以是胺基。
最后，US 5,789,578(Burton等人)建议通过在附着到支持体基质的碳碳双键上加入硫醇基来固定含有硫醇基的配体，例如3-巯基丙酸、谷胱甘肽等。
但是，一旦已经决定希望的配体结构，进一步重要的问题将在于其合适制备方法的选择。
例如，近来已经公开了称为高盐配体的一类新型配体，参见例如WO0011605(Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)。由于这些配体可以作为混合型的阳离子交换剂配体，它们已经表现出在许多工业用途中具有重要意义，例如蛋白质提纯，因为它们可以承受高盐浓度，因此不需要样品的任何明显稀释。这样，高盐配体有利地用于分离，因为与以前描述的方法相比，它们减小所需的样品总体积，因此降低了设备的总成本以及在这些用途中所需的工作。
但是，即使混合型阳离子交换剂配体在用于分离时降低了成本和减少了工作，但是到目前为止所描述的其制备方法存在一些缺点，使它们在实践中不太有利。一般来说，为了获得良好的多样性，这样的配体制备包括四个步骤，即：
(i)反应性基团在色谱载体上的引入及其任选的活化；
(ii)使所得的修饰后载体与含有酸官能团的硫醇化合物反应。
(iii)在有机溶剂中用合适的试剂(例如在DCC存在下的NHS)活化载体的酸性官能团。
(iv)加入包含合适残基R的氨基酸衍生物，以产生附着到载体上的最终配体。
以上公开的步骤顺序的一个问题是，它将产生实际上含有两种不同配体的产物，即含有酸官能团的硫醇醚连接基，这是由于在步骤(iii)和(iv)的不成功转化而产生的，以及希望的最终产物。由两种这样的不同配体构成的色谱载体在用于分离过程中时可能引起严重的问题。例如，分析将变得困难，导致比一般需要的更不稳定的制备和使用方法。由于相同的原因，如果以两种配体混合物形式获得该介质，对于每种具体用途优化这样的色谱载体的制备和使用将更加困难。此外，这样的混合物固有地将导致比更好限定的介质更低的特定分离。
此外，在上述常规方法中所涉及的另一个问题是，大色谱载体分子将存在于步骤(i)的过程中。不同的是，整个过程将需要在大的体积内进行，要求非常特别的大型设备，并涉及显著的成本，这是这种类型设备运行所固有的。
以上公开的现有技术方法的仍然另一个缺点是，所有的步骤在固体载体上进行。上述大型特定设备的使用还包括与更费时和更复杂的洗涤过程相关的附加缺点。对于步骤(ii)-(iii)和(iii)-(iv)尤其如此，在这些过程中，需要从水相到有机溶剂和反过来进行。
由于目前对上述方法没有有效的替代方法，因此在该领域内需要改进的方法来制造用于分离过程的混合型阳离子交换剂配体。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种生产包含混合型阳离子交换剂配体的分离介质的方法，其中所获得的配体的组成容易控制。通过使用新型支架(scaffold)或支架衍生物作为原料可以实现该目的，如所附权利要求中所述。
本发明的另一个目的是提供一种生产包含混合型阳离子交换剂配体的分离介质的方法，该方法是简化的并且比前述方法成本低。通过一种方法可以实现该目的，在该方法中，直到最后一步才引入包含试剂的固体载体或凝胶，从而可以避免以前要求的大体积试剂。这一目的还通过一种总体上比前面公开的方法更少步骤的方法来实现，如所附权利要求中所公开的。
本发明的再一个目的是提供一种生产包含混合型阳离子交换剂配体的分离介质的方法，该方法比前述方法构成了一种环境更能接受的替代方法。这一目的可以通过所附权利要求中所述的方法来实现，该方法比现有技术方法需要更少的溶剂。以上讨论的总体上可以在更小体积内进行的根据本发明方法的技术特征还构成了对环境更有利的替代方案，因为更小的体积将需要更少的洗涤液并且能量消耗也更少。
由以下的详细描述，本发明的其他目的和优点将是显而易见的。
定义
术语“带负电荷”和“带负电”是指该物质携带一个或多个负电荷和/或具有负净电荷。
术语“混合型阳离子交换剂配体”和“多重模态(multimodal)阳离子交换剂配体”在本发明范围内是指能够提供至少两个不同的但是共同作用的位点的配体，所述位点与被束缚物质相互作用。这些位点之一在配体与所关注物质之间给出吸引型的电荷-电荷相互作用。第二个位点通常给出电子受主-施主相互作用和/或疏水和/或亲水相互作用。电子施主-受主相互作用包括诸如氢键、π-π、电荷传递、偶极子-偶极子、感应偶极子等的相互作用。
术语“介质”(复数形式)包括配体，即结合到基础基质上的结合基团，即用于色谱分析中的载体。本文所用的术语不包括任何液体。
术语“高盐”配体是指在较高浓度盐(例如0.3M NaCl)存在下能结合蛋白质的配体，其相对于在相同条件下操作的对比离子交换剂而言。这可以使用前沿分析法(frontal analysis)确定，如以下在实验部分中所述。
“电子施主-受主相互作用”是指具有自由电子对的电负性原子作为施主并结合到缺电子原子，该缺电子原子作为施主电子对的受主。(见例如Karger等人的“An Introduction into Separation Science，John Wiley & Sons(1973)第42页)。
典型的受主原子/基团是缺电子原子或基团，例如金属离子、氰基、硝基中的氮等，并且包括结合到电负性原子上的氢，如羟基和羧基中的HO-，在酰胺和胺中的-NH-、硫醇中的HS-等。
阳离子交换剂是指被除去的物质携带正电荷且阳离子交换剂带负电(＝阳离子交换剂条件)。对于含水液体中存在的两性物质，这意味着pH≤pI+0.5，优选pH≤pI。
附图说明
图1表示多重模态阳离子交换剂介质的传统分析的实例，如在以上“背景技术”中用一般术语所讨论的。
图2表示本发明的一个实施方案，其使用高半胱氨酸硫代内酯(thiolactone)作为支架合成多重模态阳离子交换剂介质。
图3表示借助于示例性支架高半胱氨酸硫代内酯的多重组态阳离子交换剂介质文库的潜在多样性的实例。
图4以示意方式表示用相同组的反应溶液合成不同文库介质的一般过程。
具体实施方式
本发明的一个方面是一种包含结合到基础基质上的混合型阳离子交换剂配体的分离介质的产生方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供至少一种支架，其每一种包含官能团F并具有环状核心结构；
(b)通过使所述支架的基团F与所述试剂的反应性基团反应，用包含结合到残基R的反应性基团的试剂使支架衍生，并保持支架的环状结构；
(c)打开所得衍生物的环状结构；和
(d)使所获得的开环产物与包含反应性基团的基础基质反应，所述反应性基团任选通过间隔物结合到基础基质上；
其中所述支架存在至少两个官能团，其中之一是含硫基团，用于结合到基础基质的活性基团，其另一个是可以转变成离子基团的基团，所述官能团以相邻位置存在于环状结构上，并且其中在步骤(c)中，通过破坏在两个官能团之间的键打开环。根据步骤(c)的水解可以例如通过加入碱或任何其他合适的方法进行。含硫基团的作用是提供到色谱载体的容易且稳定的附着点。已知例如S-H基团的高亲核性，通过亲核取代或通过基团加成在结合中获得了高效率。
在一个实施方案中，通过水解，例如加入氢氧化钠，如在以下实验部分A中举例说明的，实现根据步骤(c)的环状结构的打开。在一个替代的实施方案中，通过加入亲核试剂，例如通过加入氨基酸或胺，如在以下实验部分B中举例说明的，实现所述开环。但是，为了打开环状结构，可以加入产生亲核取代反应的任何化合物。唯一的要求是环的打开产生可以转变成离子基团的一个基团和一个硫醇基团，该硫醇基团随后可以用于结合到凝胶和/或间隔物。
更具体地，在本方法的一个实施方案中，所述支架由通式(I)定义：
Figure C0281783700091
其中A、B和X相互独立地是sp2或sp3杂化碳原子或任何杂原子，如氧、硫、氮和/或二氧化硅。在一个简单的实施方案中，A、B和X都是碳原子。m是0-4之间的任何整数，例如1-3，优选1或2，对于许多用途为1。正如本领域技术人员所认识的，数字m对最终分离介质中配体的长度有影响。所以它根据例如在混合型阳离子交换剂配体上的选定活性基团、预计的分离、在基础基质与其上的反应性基团之间是否存在间隔物等来决定。官能团F由一个X表示，即作为环状结构的整体部分，或者结合到A、B和X的任一个上，可能通过连接基。这样的连接物取决于最终分离介质的希望性质可以由1-50构成，所考虑的主要因素是它不应当在产生分离介质的本方法中导致任何不希望的副作用。希望的连接基性质在很大程度上对应于基质与反应性基团之间的间隔物的性质。
更具体地，上述间隔物是传统离子交换剂中常见的，并且因此可以包含直链、支链、环状的饱和、不饱和的以及芳族的烃基(例如具有最多1-20个，例如1-10个碳原子)。所述基团可以携带羟基、卤素、烷氧基和芳氧基以及相应的硫代类似物和/或氨基。对于某些用途，碳链可以在一个或多个位置上被氨基的氮原子、醚的氧、硫醚的硫等打断。还可以存在羰基，例如在酰胺和酮中的羰基，和对水解有类似稳定性的其他基团。选自氧、硫和氮的最多一个原子优选结合到一个或相同的sp3杂化碳原子。此外，间隔物可以提供一个或多个电子施主或受主原子或基团，增强物质到阳离子交换剂的结合，如上所讨论的，例如通过参与氢键、π-相互作用、疏水或亲水相互作用等。
因此，根据本发明的方法比以前的方法包含更少的步骤，所以在运行时将节省时间，因此节约成本。此外，由于直到最后一步才引入基质，基质有利的是凝胶，通过限制以前需要的更长的洗涤过程，也产生了大量节约。
在根据本发明的方法的一个实施方案中，在式(I)中，官能团F选自含有离去基团的基团，如亲核取代中常用的，例如C-Y，其中Y表示例如Br、Cl、I、甲磺酸根或甲苯磺酸根基团；酸或活化的酸如WC＝O，其中W例如由N-氢琥珀酰亚胺、五氟苯酚、对硝基苯或氯代甲酸异丙酯形成的；亲核基团例如-OH、-SH或-NH2；以及C＝C。
在该方法的有利的实施方案中，在式(I)中，A、B和X是碳原子，m是1且F是-NH2，
在特别有利的实施方案中，所用的支架是高半胱氨酸硫代内酯，其是一种容易获得的商品(例如得自Aldrich或任何其他公知的实验化学品供应商)。
该实施方案目前是实施本发明的最佳方式。在本申请的实验部分中，已经使用了所述支架的外消旋混合物。但是，正如本领域技术人员了解的，对于某些用途，使用D或L形式或包含其特定比例的混合物可能是更有利的。最合适的形式可以用常规实验容易地试验。
在根据本发明的方法的一个实施方案中，在步骤(b)中所用的衍生试剂由以下通式描述：
                 -Z-R-              (II)
其中Z构成反应性基团，其功能是与支架的官能团F反应。因此，对于每个实施方案，选择Z的性质以便与如上讨论的F反应；R可以包含直链、支链、环状的饱和、不饱和的以及芳族的烃基(例如具有最多1-20个，如1-10个碳原子)。这样基团可以带有羟基、卤素、烷氧基和芳氧基以及相应的硫代类似物和/或氨基基团。对于某些用途，碳链可以在一个或多个位置被氨基的氮、醚的氧、硫醚的硫等打断。还可以存在羰基，例如在酰胺和酮中的，以及对水解具有类似稳定性的其它基团。选自氧、硫和氮的最多一个原子优选结合到一个碳原子和相同的sp3杂化碳原子。此外，R提供一个或多个电子施主或受主原子或基团，以便能将一种物质结合到阳离子交换剂上，如上所讨论的。R也可以含有带电荷的基团，只要最终的配体给出完整的间隔范围(fullinterval window)，这里它整体是带负电的并且可以用作阳离子交换剂。
因此，由于最终的分离介质用于离子交换模式，残基R根据要求用来引入其多重模态特征。正如本领域技术人员所了解的，最终的介质可以包含其中R由两个或多个部分构成的配体，所述两个或多个部分在由以上讨论的间隔物分开的结合中起作用。
本发明还包括根据本发明的方法的产品，即混合型阳离子交换剂配体，如高盐配体。根据本发明的配体可以比现有技术方法均匀得多的化合物形式生产。本发明所包括的具体实例如以下实验部分中的表格所公开的。
在根据本发明的方法的一个实施方案中，该方法还包括单独的且在步骤(b)之前溴化基质的反应性基团的步骤，其中所述反应性基团包含碳-碳双键。这样的溴化在本领域中是公知的。
在一个替代实施方案中，本发明方法改为包含单独且在步骤(b)之前在有利于自由基反应的条件下活化基质的反应性基团的步骤，其中所述反应性基团包含碳-碳双键。自由基反应可以用任何公知的方法引发，例如通过加入称为自由基引发剂的引发反应的化学物质，利用光如UV等。这类反应及其条件是本领域公知的并且在文献中已经广泛讨论。
但是，正如本领域技术人员所了解的，限制基质上存在的反应性基团的唯一标准是：它应当能够在足够的程度上与打开支架环结构所产生的端部之一反应。此外，它还应当与开环的支架衍生物其余部分基本不反应，以便不会破坏最终分离介质上所需要的任何结构。因此，应当进行支架官能团之一的选择和基质上存在的反应性基团的选择，使得它们相互反应。并且即使它不是最简单的实施方案，但是也应当理解，在基质上的反应性基团可以是相同的，也可以是不同的。
关于基础基质，其基于有机或无机物或其组合，例如Streamline型复合材料(Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)。基础基质优选是亲水的并且是聚合物形式的，其在水中是不溶性且或多或少是可溶胀的。已经衍生变成亲水的疏水聚合物包括在该定义中。合适的聚合物是多羟基聚合物，例如基于多糖如琼脂糖、葡聚糖、纤维素、淀粉、支链淀粉等和完全合成的聚合物如聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚(羟基烷基乙烯基醚)、聚(羟基烷基丙烯酸酯)、和聚甲基丙烯酸酯(例如聚甲基丙烯酸缩水甘油酯)、聚乙烯醇和基于苯乙烯和二乙烯基苯的聚合物，以及其中包括对应于上述聚合物的两种或多种单体的共聚物。溶解于水的聚合物可以被衍生变成不溶性的，例如通过交联和通过吸附或共价结合结合到不溶性主体上。通过具有可以转变成OH的基团的单体聚合，或者通过最终聚合物的亲水化例如通过合适化合物如亲水聚合物的吸附，可以在疏水聚合物上(例如在单乙烯基和二乙烯基苯的共聚物上)引入亲水基团。在基础基质中使用的合适的无机材料是二氧化硅、氧化锆、石墨、氧化钽等。所述基质可以被阳离子交换剂配体均匀衍生或者仅以特别设计的方式部分衍生。
优选的基质没有对水解不稳定的基团，如硅烷(silan)、酯、酰胺基团和在二氧化硅上存在的基团等。这对于与所用液体直接接触的基团是特别适用的。基质可以是多孔或无孔的。这意味着对于要除去的物质可以是完全透过的或部分透过的(多孔的)或者完全不透过的。基质还可以是不规则或球形颗粒形式的，尺寸在1-1000微米范围内，对于高性能用途优选为5-50微米，对于预备用途为50-300微米。基质的一种有意义的形式具有比液体更高或更低的密度。对于流化床或膨胀床色谱法以及对于不同的批料过程如在搅拌罐中，这种基质特别适用于大规模操作。流化床和膨胀床过程描述在WO9218237(Amersham Pharmacia Biotech AB)和WO9200799(Kem-En-Tek)中。术语亲水基质是指基质的可接近表面是亲水的，其意义是水性液体能够渗入该基质。亲水基础基质上的可接近表面通常暴露许多极性基团，例如包含氧和/或氮原子的极性基团。这样的极性基团的实例是羟基、氨基、羧基、酯、低级烷基的醚(例如(-CH2CH2O-)nH，其中n是整数)。
本发明的第二方面是一种包含结合到基础基质上的混合型阳离子交换剂配体的分离介质的产生方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供具有环状结构的至少一种支架衍生物；
(b)打开该衍生物的环状结构；和
(c)使所获得的开环产物结合到包含反应性基团的基础基质，所述反应性基团任选通过间隔物结合到基础基质上；
其中所述支架可以由通式(III)定义：
Figure C0281783700131
其中A、B和X独立地是sp2或sp3杂化的碳原子或任何杂原子，如氧、硫、氮和/或二氧化硅，m是0-4之间的任何整数，例如1-3，优选1或2，所述官能团以相邻的位置存在于环状结构上，并且其中在步骤(c)，通过破坏所述两个相邻位置之间的键提供环的打开，并且其中Z-R结合到A、B和X的任一个上，优选结合到B。
步骤(b)可以按以上关于本发明第一方面所讨论的进行。
正如本领域技术人员所了解的，这一方面对应于本发明的第一方面，但是一种起始产物是容易制备的支架衍生物。因此，第二方面是第一方面的一种简化替代方案，在支架和衍生试剂的性质可以产生容易储存的产物时是特别有利的。预计在某些情况下，这样的衍生物可能是可以购得的或者同时生产并储存等到以后使用。关于这一方面中所用的支架衍生物的性质和性能的进一步细节可以分别见以上关于支架和衍生试剂的讨论。
本发明的第三方面是一种试剂盒，其包含由以上定义的通式(I)所限定的化合物或者由以上定义通式(III)所限定的衍生物。该试剂盒以固体形式包含这样的化合物或衍生物及其在制造混合型阳离子交换剂配体中的使用说明书，所述混合型阳离子交换剂配体结合到基质上，用作分离介质。在一种替代的实施方案中，所述化合物或衍生物以溶解在适当溶剂中的形式存在。
本发明的另一个方面是一种筛选方法，其中用于阳离子交换的分离介质被鉴别。如上所述，可以在许多不同分子中进行R的选择，这取决于最终分离介质的希望性质。在以下的实验部分中，将提供试验的R-基团的某些实例，但是它们的提供仅用于说明本发明的多样性并用作想要在本发明范围内设计具体实施方案的本领域技术人员的一些指导。在实验部分中，应当理解R’与R相当。因此，本发明能设计许多种类的希望的混合型阳离子交换剂配体分离介质。例如，为了试验可能的混合型阳离子交换剂配体，可以产生R-基团的组合文库，其中一个原始分子的特定部分系统地变化以找出对特定靶获得最佳特性的组合。这样的组合文库当今是公知的并在许多领域中利用，所以，本领域技术人员基于任何有机化学工作者或生物化学工作者普通的一般知识范围内的考虑，可以设计其自己的文库。
例如，文库的试验可以例如包括以下步骤：
(a)提供一种文库，其包括：
(i)待测的一种或多种阳离子交换剂(测试阳离子交换剂，交换剂1、2、3、4......n；n＝整数＞0)，这些阳离子交换剂的每一种在配体种类方面都是不同的(配体1、2、3、4......n)，和
(ii)具有参比配体的参考阳离子交换剂，载体基质、反离子等在交换剂1、2、3、4...中与在参比阳离子交换剂中基本相同；
(b)在预定条件下，对于该物质在pH间隔2-12中确定交换剂1的最大临界容量；
(c)在与步骤(b)相同的条件下，对于该物质在pH间隔2-12中确定参比阳离子交换剂的最大临界容量；
(d)借助在步骤(b)和(c)中所获得的最大临界容量之间的关系，总结阳离子交换剂(1)是否适合用于除去该物质；和
(e)如果必要，对交换剂2、3、4......n重复步骤(b)-(c)。
在参比阳离子交换剂与各种待测阳离子交换剂之间取代度变化的情况下，在进行步骤(d)时，这应该是原因。如果取代度变化大，例如对于阳离子交换剂1、2......n的倍数大于3、5或10，这是特别适用的。
本发明的最后一个方面是一种方法，优选是一种筛选方法，该方法优化包含混合型阳离子交换剂配体的分离介质的结合性质，其包括以下步骤：
(a)在水溶液中提供活化的支架衍生物；
(b)使该溶液与由第一种性质限定并能够结合所述支架衍生物的基质颗粒的悬浮液接触；
(c)将溶液与颗粒分离；
(d)使分离后的溶液与由不同于所述第一种性质的性质限定并能够结合所述支架衍生物的基质颗粒的悬浮液接触；
(e)将溶液与颗粒分离；
(f)任选重复步骤(d)和(e)一次或多次；和
(g)通过常规离子交换实验评价这样获得的分离介质的容量。
在一个实施方案中，所述性质是能够结合活化的支架的基质颗粒上存在的反应性基团的密度。在一个替代实施方案中，所述性质是在能够结合活化的支架的基质颗粒上存在的反应性基团的性质。然而，本方法实际上可以用于许多性质如颗粒尺寸、孔隙率、刚性或结合条件，例如pH、时间、温度等，一个必要特征是反应性溶液通过一组不同的此类条件，以确定最佳值。在本发明的一个有利的实施方案中，已经根据上述方法生产了在该方面中所用的支架衍生物。
本发明中所用的阳离子交换剂中阳离子交换配体的含量通常在0.001-4毫摩尔/毫升基质范围内选择，例如0.002-0.5毫摩尔/毫升基质，参考值为0.005-0.3毫摩尔/毫升基质。其中可能的和优选的范围由基质种类、配体、待除去物质等决定。因此，对于基于琼脂糖的基质，阳离子交换配体的含量通常在0.01-0.3范围内，参考值为0.06-0.2毫摩尔/毫升。对于基于葡聚糖的基质，该范围通常为0.01-0.6毫摩尔/毫升基质，该范围为0.01-0.2毫摩尔/毫升基质。在某些变化中，例如当R为芳族时，混合型配体的含量通常在这些范围的下半部分。在本发明这些变化中，阳离子交换配体的含量因此小于0.150毫摩尔/毫升基质和/或小于1毫摩尔/克干重的基质。表述“毫摩尔/毫升基质”是指用水饱和的完全沉降的基质。容量范围是指处于完全去质子化形式的基质滴定酸官能团的容量。它包括来自除了配体中的主离子基团以外的带负电基团的可能贡献，例如在间隔物或残基R中的。
根据本发明生产的分离介质可以用本领域技术人员公知的常规方法使用，如在阳离子交换中，特别是混合型阳离子交换中。目前，根据本发明的方法产生的分离介质的最有利用途是作为高盐配体。但是，本发明分离介质在正常条件下在传统阳离子交换过程中与以前已知的介质一样具有良好的容量，所述条件可以由在约10mS以下操作来确定。根据本发明的方法产生的分离介质在上述正常条件与高盐条件之间的范围内也能令人满意地操作，如以下所讨论的。
因此，根据本发明产生的分离介质可以有利地用作阳离子交换剂，其在较高离子强度下吸附特定物质，称为高盐配体。这样的阳离子交换剂应当能够：
(a)在离子强度相当于0.25M NaCl的水性参考液体中结合所关注的物质，和
(b)对于所述物质，允许在2-12的pH范围内某处的最大临界容量≥200％，例如≥300％或≥500％或≥1000％的常规阳离子交换剂对该物质的临界容量。
术语“临界容量”是本领域内公知的术语，其计算方法是众所周知的并且在以下本申请的实验部分还将描述。这些百分数主要应用于在阳离子交换剂条件期间进行的测量。
更具体地，在吸附过程中，在导致所述物质通过阳离子交换与配体结合的条件下，使含有带正电物质的样品与阳离子交换剂接触。选择pH值使得所述物质至少部分地带正电并且至少一部分阳离子交换配体带负电。在优选的变化中，使用弱阳离子交换剂(例如阴离子基团是-COO-)，且液体的pH值缓冲到pKa±2，如±1个pH单位。阳离子交换剂的pKa值被取为该阳离子交换剂用NaOH滴定时的拐点。对于阳离子交换剂、待结合物质、温度和pH、溶剂组成等的特定组合，离子强度(按盐浓度或电导率测定)通常低于洗脱离子强度。使用多重模态阴离子交换剂的优点之一是：与传统阳离子交换剂相比，它然后可能也在较高离子强度下进行吸附/结合。通过使阳离子交换剂与要除去的物质相匹配，可以在高于使用参比离子交换剂时的离子强度下进行吸附(在相同的pH且否则在相同条件下测量)。取决于阳离子交换剂，可以获得用参比阳离子交换剂获得的临界容量的≥200％，例如≥300％或≥500％或≥1000％的临界容量。
在结合过程中使用的准确离子强度取决于所用的配体、其在基质上的密度、待结合物质及其浓度等。有用的离子强度通常对应于NaCl浓度(纯水)≥0.1M，例如≥0.3M或者甚至≥0.5M。
在脱附中，通常使用本领域熟知的过程，例如将盐浓度(离子强度)提高到脱附所要求的最小洗脱离子强度以上；降低pH以降低配体的负电荷；提高pH以降低物质上的正电荷；和/或通过包含降低所用水性液体极性的配体类似物或一种试剂(例如溶剂添加剂)。这些变化相对于含有所述物质的水性液体而言。
在阳离子交换条件下脱附意味着用于脱附的液体提供使至少一部分要吸附的物质带正电的条件(例如pH值)，和离子强度设定到高于这些条件下的最小洗脱离子强度。对于两性化合物，首先提到的选项是指pH≥pI，例如pH≥pI+0.5。
也可以在被吸附物质具有0或更小的净电荷和/或基本全部阳离子交换配体被去掉电荷的条件下进行脱附。
在色谱法和/或间歇法中，具有被吸附物质的基质存在于柱中或其它合适的容器中，与吸附液体接触。由该液体提供的条件然后被如上所述改变，直至希望的物质被释放并从基质中洗出。对于在阳离子交换条件下进行的脱附过程，与吸附相比，离子强度通常增大，并常常相当于至少0.6M NaCl。实际值取决于以上讨论的各种因素。
以上讨论的条件的变化可以用一个或多个步骤(阶梯梯度)或连续(连续梯度)地实现。与基质接触的液体的各种变量可以逐一改变或组合改变。
用于改变离子强度的典型的盐选自磷酸盐、硫酸盐的适当铵盐或金属盐等，特别是碱金属和/或碱土金属盐。相同的盐也可以用在吸附步骤中，但是其常常处于更低的浓度。
用于阳离子交换过程中的典型缓冲组分可以在酸/碱对中选择，其中碱部分是阴离子的。典型的实例是羧酸/羧酸盐(例如乙酸/乙酸盐)、磷酸盐等。在脱附步骤或更早步骤中pH的增大将减小从基质中施放物质所需的离子强度。取决于所用配体的pKa和物质的pI，pH的降低可能导致物质从阳离子交换基质中施放或结合到阳离子交换基质上。
与吸附液相比，通过调节脱附液的极性也有助于脱附。这可以通过在脱附液中包含水混溶性和/或亲水性较小的有机溶剂来实现。这样的溶剂的实例是丙酮、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、乙腈等。脱附液极性的降低可能有助于脱附，因此也降低从基质中施放化合物所需的离子强度。通过在脱附液中包含阳离子交换配体的可溶性结构类似物(配体类似物)也可以有助于脱附。这样的类似物的足够浓度至少大于其在吸附液中的浓度。
附图详述
图1表示在以上“背景技术”一节中用一般术语讨论的多重模态阳离子交换剂介质的传统合成的实例。从附图中明显看出，作为进行配体合成的固体载体的凝胶必须存在。
图2表示使用高半胱氨酸硫代内酯作为支架合成多重模态阳离子交换剂介质的本发明的一个实施方案。在原理上，根据本发明的方法由两个步骤构成，与现有技术的4步过程相比，配体的凝胶部分仅需要在最后一步中包含。
图3说明借助于示例性支架高半胱氨酸硫代内酯的多重模态阳离子交换剂介质文库的潜在多样性。可能的R残基数量是巨大的并且在以上更详细讨论了，而具体实例将在以下实验部分中讨论。
图4说明一种示意性方式，即从相同组的反应性溶液中合成不同介质文库的一般过程。这样的方法实际上可以用于许多性质如颗粒尺寸、孔隙率、刚性或结合条件如pH、时间、温度等。
以下利用实施例说明本发明。但是，应当理解，提供本发明实施例仅用于说明的目的，并且不应当限制本发明，如所附权利要求所限定的。在本申请中以下及其它地方给出的全部对比文件并入本文作为参考。
实验部分
使用DL-高半胱氨酸硫代内酯产生新介质的一般过程：
A.通过水解打开硫代内酯
方案1：一般合成方案
一般过程
步骤1：
步骤1a：
将DL-高半胱氨酸硫代内酯Ia和二异丙基胺(DIPEA)在二氯甲烷(DCM)中的溶液A冷却到0℃。将在DCM中含有酰基氯或磺酰氯或酸酐或活化的酸的溶液B冷却到0℃，并滴加到保持在0-5℃的溶液A中。该混合物在室温整夜搅拌。
步骤1b：
将DL-高半胱氨酸硫代内酯Ia和二异丙基胺(DIPEA)在二氯甲烷(DCM)中的溶液A冷却到0℃。将碘代乙酰氯在DCM中的溶液滴加到保持在0-5℃的溶液A中。该混合物在室温整夜搅拌。然后将在DCM中含有硫醇的溶液B滴加到该反应混合物中并且再保持搅拌17小时。
步骤2：
在真空下从步骤1a或步骤1b得到的混合物中除去溶剂。在0℃缓慢加入氢氧化钠溶液5N到该原料中，其在室温进一步搅拌2小时。
步骤3：
将按公知过程获得的溴化Sepharose6FF(Amershambiosciences AB，Uppsala，Sweden)与来自步骤2的碱溶液混合并整夜在最高50℃加热。在反应后，将凝胶(1份体积)过滤并用水(2×15份体积)、乙醇(2×15份体积)、乙酸0.2M(2×15份体积)和水(2×15份体积)洗涤。然后通过酸滴定测量凝胶的离子容量(Chauhan V.S.等人，Tetrahedron，44(8)，2359-2366，1988(酸活化))。这些凝胶的色谱评价(保持率和容量)表示在下表1A中。
实施例
使用不同的R-Z-基团产生根据本发明的分离介质
实施例1-4
以下实施例使用作为支持物的D，L高半胱氨酸硫代内酯Ia以及所描述的化学物质(参考以上方案1)。在通过使高半胱氨酸Ia与酰基氯、磺酰氯、酸酐或活化的酸反应形成结合的酰胺或磺酰胺后，用碱水解实现硫代内酯环的打开，所得的化合物进一步结合到活化的Sepharose6FF或Sepharose4FF(二者都得自AmershamBiosciences AB，Uppsala，Sweden)。
所有的溶液A都是新制备的，但是可以再利用来自结合反应(步骤3中)后的过滤的溶液混合物并使其与另一种凝胶进一步反应。在以下实施例中，来自第一个反应(烯丙基含量为411微摩尔/毫升的凝胶)的滤液根据步骤1a、2和3进一步与烯丙基含量为250微摩尔/毫升的凝胶一起使用。在表1A中，得自烯丙基含量为411微摩尔/毫升的凝胶的结果用a)表示，而得自烯丙基含量为250微摩尔/毫升的凝胶的结果用b)表示，得自烯丙基含量为230微摩尔/毫升的结果用c)表示。
对于实施例1-4，溶液A根据步骤1a制备，使用1.58g的DL-高半胱氨酸硫代内酯、HCl(10.3mmol)和3.58mL的二异丙基-乙基胺(DIPEA)(20.6mmol)在6mL的DCM中。
实施例1：酰基氯
1a.用2.37g(10.3mmol)的3，4，5-三甲氧基-苯甲酰氯在4mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1a，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入6mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入5mL烯丙基含量为411微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF(Amersham Biosciences AB，Uppsala，Sweden)。凝胶1a的离子容量为232.6微摩尔/毫升。
1b.用1.80g(10.3mmol)的4-氯苯甲酰氯在4mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1a，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入6mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入5mL烯丙基含量为411微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶1b的离子容量为251.1微摩尔/毫升。
1c.用2.15g(10.3mmol)的2，4-二氯苯甲酰氯在4mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1a，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入6mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入5mL烯丙基含量为411微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶1c的离子容量为253.3微摩尔/毫升。
1d.用2.14g(10.3mmol)的3-(三氟甲基)苯甲酰氯在4mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1a，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入6mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入5mL烯丙基含量为411微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶1d的离子容量为239.9微摩尔/毫升。
1e.用2.14g(10.3mmol)的4-(三氟甲基)苯甲酰氯在4mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1a，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入6mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入5mL烯丙基含量为411微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶1e的离子容量为247.1微摩尔/毫升。
1f.用1.83g(10.3mmol)的烟酰氯在4mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1a，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入6mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入5mL烯丙基含量为411微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶1f的离子容量为253.3微摩尔/毫升。
1g.用1.65g(10.3mmol)的噻吩-2-乙酰氯在4mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1a，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入6mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入5mL烯丙基含量为411微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶1g的离子容量为261.5微摩尔/毫升。
1h.用1.10g(10.3mmol)的丁酰氯在4mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1a，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入6mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入5mL烯丙基含量为411微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶1h的离子容量为260.6微摩尔/毫升。
1i.用1.67g(10.3mmol)的辛酰氯在4mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1a，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入6mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入5mL烯丙基含量为411微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶1i的离子容量为233.6微摩尔/毫升。
1j.用1.24g(10.3mmol)的异戊酰氯在4mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1a，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入6mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入5mL烯丙基含量为411微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶1j的离子容量为232.4微摩尔/毫升。
1k.用1.57g(10.3mmol)的2-(2-甲氧基-乙氧基)乙酰氯在4mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1a，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入6mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入5mL烯丙基含量为411微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶1k的离子容量为234.0微摩尔/毫升。
实施例2：磺酰氯
2a.用1.96g(10.3mmol)的甲苯-4-磺酰氯在4mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1a，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入6mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入5mL烯丙基含量为411微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶2a的离子容量为199.0微摩尔/毫升。
2b.用2.43g(10.3mmol)的2，5-二甲氧基苯磺酰氯在4mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1a，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入6mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入5mL烯丙基含量为411微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶2b的离子容量为182.6微摩尔/毫升。
2c.用2.40g(10.3mmol)的4-乙酰胺基苯磺酰氯在4mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1a，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入6mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入5mL烯丙基含量为411微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶2c的离子容量为159.7微摩尔/毫升。
2d.用2.25g(10.3mmol)的2，4，6-三甲基苯磺酰氯在4mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1a，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入6mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入5mL烯丙基含量为411微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶2d的离子容量为176.5微摩尔/毫升。
2e.用1.18g(10.3mmol)的甲磺酰氯在4mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1a，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入6mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入5mL烯丙基含量为411微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶2e的离子容量为163.2微摩尔/毫升。
实施例3：酸酐
3a.用2.33g(10.3mmol)的苯甲酸酐在4mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1a，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入6mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入5mL烯丙基含量为411微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶3a的离子容量为255.1微摩尔/毫升。
3b.用1.34g(10.3mmol)的丙酸酐在4mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1a，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入6mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入5mL烯丙基含量为411微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶3b的离子容量为238.3微摩尔/毫升。
实施例4：活化的酸
4a.活化的酸用羧酸新制备如下：把1.84g(10.3mmol)马尿酸和1.13mL的N-甲基吗啉在20mL四氢呋喃(THF)中的溶液冷却到-8℃，然后缓慢加入1.33mL氯甲酸异丁酯在5mL的THF中的溶液。该混合物在0℃搅拌2h，在室温搅拌整夜，然后蒸发溶剂。将该原料溶解在4mL的DCM中制备溶液B，并根据步骤1a加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入6mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入5mL烯丙基含量为411微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶4a的离子容量为182.4微摩尔/毫升。
实施例5：碘代乙酰氯和硫醇
以下实施例使用作为支架的D，L高半胱氨酸硫代内酯Ia以及所述化学物质(参见上述方案1)。通过使高半胱氨酸硫代内酯Ia与碘代乙酰氯反应形成酰胺。通过残余卤素的亲核取代在所得的配体上引入硫醇。用碱水解实现硫代内酯环的打开，所得的化合物进一步结合到活化的Sepharose6FF或Sepharose4FF上。
对于全部的实施例5，用0.35g的DL-高半胱氨酸硫代内酯、HCl(2.3mmol)和0.841μL的二异丙基-乙基胺(DIPEA)(4.8mmol)在4mL的DCM中根据步骤1b制备溶液A。向冷却后的反应混合物中加入0.52g的碘代乙酰氯(2.5mmol)在2mL的DCM中的溶液。
5a.用284μL(2.3mmol)的苄硫醇在1mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1b，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入5mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入4mL烯丙基含量为230微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶5a的离子容量为118.2微摩尔/毫升。
5b.用243μL(2.3mmol)的糠基硫醇在1mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1b，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入5mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入4mL烯丙基含量为230微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶5b的离子容量为114.1微摩尔/毫升。
5c.用373mg(2.3mmol)的4-巯基-苯甲酸在1mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1b，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入5mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入4mL烯丙基含量为230微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶5c的离子容量为184.8微摩尔/毫升。
5d.用251μL(2.3mmol)的2-甲基-1-丙硫醇在1mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1b，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入5mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入4mL烯丙基含量为230微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶5d的离子容量为155.0微摩尔/毫升。
5e.用205μL(2.3mmol)的2，2，2-三氟乙硫醇在1mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1b，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入5mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入4mL烯丙基含量为230微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶5e的离子容量为125.4微摩尔/毫升。
表1A
                         表1A
表1A(续)
a：用烯丙基含量为411微摩尔/毫升的凝胶Sepharose6FF获得的离子容量。
b：用烯丙基含量为250微摩尔/毫升的凝胶Sepharose6FF获得的离子容量。
c：用烯丙基含量为230微摩尔/毫升的凝胶Sepharose6FF获得的离子容量。
Nd：未测定。
B.通过亲核试剂打开硫代内酯：
1.氨基酸：
Figure C0281783700271
方案2：用氨基酸打开硫代内酯
实施例6：苯甲酰氯和苯基丝氨酸
以下实施例使用作为支架的D，L高半胱氨酸硫代内酯Ia以及所述化学物质(参见上述方案2)。通过使高半胱氨酸硫代内酯Ia与酰基氯反应形成结合的酰胺后，用氨基酸衍生物实现硫代内酯环的打开，并且所得的化合物进一步结合到活化的Sepharose。
在下表1B中，得自烯丙基含量为230微摩尔/毫升的凝胶的结果用c)表示。
制备1.58g的DL-高半胱氨酸硫代内酯、HCl(10.3mmol)和3.58mL的二异丙基-乙胺(DIPEA)(20.6mmol)在6mL的DCM中的溶液A并将其冷却到0℃。用1.45g(10.3mmol)苯甲酰氯在4mL的DCM中制备另一种溶液，并滴加到溶液A中。在室温搅拌17小时后，去除溶剂。向该原始混合物中加入50ml的THF和1.8mL(10.3mmol)的DIPEA和3.52g(20.6mmol)的DL-苯基丝氨酸水合物。把反应物在50℃整夜加热。在真空中除去溶剂，加入50mL碳酸钾的10％水溶液。用乙酸乙酯(EtOAc)(3×15mL)洗涤水相，用柠檬酸酸化，用EtOAc(3×15mL)萃取。用硫酸钠干燥有机相并在真空下浓缩。
向该原料中加入6mL氢氧化钠的5N溶液。向该碱性混合物中加入5mL烯丙基含量为230微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF，整夜在最高50℃加热。在反应后，将凝胶(1份体积)过滤并用水(2×15份体积)、乙醇(2×15份体积)、乙酸0.2M(2×15份体积)和水(2×15份体积)洗涤。然后通过酸滴定测量凝胶的离子容量。这些凝胶的色谱评价表示在下表1B中。
凝胶6的离子容量为148.3微摩尔/毫升。
2.胺
Figure C0281783700281
方案：用胺打开硫代内酯
实施例7：琥珀酸酐和苯胺
以下实施例使用作为支架的D，L高半胱氨酸硫代内酯Ia以及所述化学物质(参见上述方案3)。通过使高半胱氨酸硫代内酯Ia与酸酐反应形成结合的酰胺后，用胺实现硫代内酯环的打开，并且所得的化合物进一步结合到活化的Sepharose。
在下表1B中，得自烯丙基含量为230微摩尔/毫升的凝胶的结果用c)表示。
制备1.58g的DL-高半胱氨酸硫代内酯、HCl(10.3mmol)和3.58mL的二异丙基-乙胺(DIPEA)(20.6mmol)在50mL的甲醇中的溶液并将其冷却到0℃。分小份向该硫代内酯中加入0.93g(9.3mmol)的琥珀酸酐。在室温搅拌17小时后，去除溶剂。向原始混合物中加入20ml的THF和1.3mL(15.3mmol)的。把反应物整夜回流。在真空中除去溶剂，加入50mL碳酸钾的10％水溶液。用乙酸乙酯(EtOAc)(3×15mL)洗涤水相，用柠檬酸酸化，用EtOAc(3×15mL)萃取。用硫酸钠干燥有机相并在真空下浓缩。
向该原料中加入6mL氢氧化钠的5N溶液。向该碱混合物中加入5mL烯丙基含量为230微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF，整夜在最高50℃加热。在反应后，将凝胶(1份体积)过滤并用水(2×15份体积)、乙醇(2×15份体积)、乙酸0.2M(2×15份体积)和水(2×15份体积)洗涤。然后通过酸滴定测量凝胶的离子容量。这些凝胶的色谱评价表示在下表1B中。
凝胶7的离子容量为155.1微摩尔/毫升。
                             表1B
Figure C0281783700291
c：用烯丙基含量为230微摩尔/毫升的凝胶Sepharose6FF获得的离子容量。
实施例8-11
基质的优化
反应混合物可以使用若干次，以便与不同的基质反应，和/或用于不同级别烯丙基含量的相同基质。
实施例8
第1级：
凝胶1j的制备如上所述。用1.24g(10.3mmol)异戊酰氯在4mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1a，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入6mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入5mL烯丙基含量为411微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶1j的离子容量为232.4微摩尔/毫升。该凝胶的色谱评价(保持率和容量)表示在表2中。
第2级：
由直接在结合到411微摩尔/毫升(第1级)的基质后过滤得到的溶液，与烯丙基含量为250微摩尔/毫升的活化Sepharose6FF反应。根据步骤3进行结合。所产生的凝胶1j-2给出162.8微摩尔/毫升的离子容量。该凝胶的色谱评价(保持率和容量)表示在表2中。
第3级：
由直接在结合到250微摩尔/毫升(第2级)的基质后过滤得到的溶液，与烯丙基含量为138微摩尔/毫升的活化Sepharose6FF反应。根据步骤3进行结合。所产生的凝胶1j-3给出104.2微摩尔/毫升的离子容量。该凝胶的色谱评价(保持率和容量)表示在表2中。
实施例9
第1级：
凝胶3a的制备如部分A中所述。用2.33g(10.3mmol)苯甲酸酐在4mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1a，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入6mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入5mL烯丙基含量为411微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose6FF。凝胶3a的离子容量为255.1微摩尔/毫升。该凝胶的色谱评价(保持率和容量)表示在表2中。
第2级：
由直接在结合到411微摩尔/毫升的基质后过滤获得的溶液，与烯丙基含量为250微摩尔/毫升的活化Sepharose6FF反应。根据步骤3进行结合。所产生的凝胶3a-2给出196.0微摩尔/毫升的离子容量。该凝胶的色谱评价(保持率和容量)表示在表2中。
第3级：
由直接在结合到250微摩尔/毫升的基质后过滤获得的溶液，与烯丙基含量为138微摩尔/毫升的活化Sepharose6FF反应。根据步骤3进行结合。所产生的凝胶3a-3给出117.4微摩尔/毫升的离子容量。该凝胶的色谱评价(保持率和容量)表示在表2中。
实施例10
第1级：
用1.24g(10.3mmol)异戊酰氯在4mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1a(一般过程)，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入6mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入5mL烯丙基含量为580微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose4FF。凝胶1j-4的离子容量为108.4微摩尔/毫升。该凝胶的色谱评价(保持率和容量)表示在表2中。
第2级：
直接在结合到580微摩尔/毫升(第1级)的基质后过滤所得的溶液，与烯丙基含量为240微摩尔/毫升的活化Sepharose4FF反应。根据步骤3进行结合。所产生的凝胶1j-5给出128.1微摩尔/毫升的离子容量。该凝胶的色谱评价(保持率和容量)表示在表2中。
实施例11
第1级：
用2.33g(10.3mmol)苯甲酸酐在4mL的DCM中制备溶液B并根据步骤1a，加入到溶液A中。在步骤2后，去除溶剂，向该原料中加入6mL氢氧化钠5N的溶液。根据步骤3，向该混合物中加入5mL烯丙基含量为580微摩尔/毫升凝胶的溴化Sepharose4FF。凝胶3a-4的离子容量为148.1微摩尔/毫升。该凝胶的色谱评价(保持率和容量)表示在表2中。
第2级：
直接在结合到580微摩尔/毫升的基质后过滤所得的溶液，与烯丙基含量为240微摩尔/毫升的活化Sepharose4FF反应。根据步骤3进行结合。所产生的凝胶3a-5给出144.7微摩尔/毫升的离子容量。该凝胶的色谱评价(保持率和容量)表示在表2中。
                             表2
Figure C0281783700321
实施例12-14
离子交换剂的实验参比过程
材料
缓冲溶液
缓冲溶液1：20mM磷酸钠、0.3M NaCl、pH＝6.8
缓冲溶液2：20mM乙酸钠、0.25M NaCl、pH＝4.0
缓冲溶液3：20mM乙酸钠、0.25M NaCl、pH＝4.5
缓冲溶液4：20mM磷酸钠、2M NaCl、pH＝6.8
缓冲溶液5：100mM磷酸钠、pH＝7.0(用于BSA和IgG的洗脱)
蛋白质溶液
1.BSA：4mg/mL在缓冲溶液2中
2.IgG：4mg/mL在缓冲溶液3中
在使用前，所有的缓冲溶液和蛋白质溶液通过0.45微米Millipore Millex HA过滤器过滤。
色谱系统
所有的实验使用装备Unicorn 3.1软件的AKTA Explorer 100色谱系统(Amersham Pharmacia Biothech AB)在室温下进行。将样品通过150mL的长毛圈织物(superloop)施加到柱。整个过程使用1mL/min(约300cm/h)的流量。通过使用10mm贯流分析池在280nm的吸收率测量连续监测洗出物。
实施例12：前沿分析，“高盐”配体
将每种样品阳离子交换剂堆积在HR5/5柱(堆积床体积＝1mL)并用合适的pH值和盐浓度的缓冲液平衡。通过在非结合条件下向柱中施加合适蛋白质的溶液，确定系统的空隙体积。流出物的A280达到所施加蛋白质的A280的10％所消耗的时间被定义为系统的空隙体积(用分钟表示)。
向用合适的缓冲溶液(缓冲溶液1、2或3)平衡的柱中，连续送入(例如通过150mL的长毛圈织物)溶解在合适的平衡缓冲液(见以上)中的样品蛋白质，流量为1mL/min(即约300cm/h)。继续样品的施加直至流出物的A280达到施加到该柱的样品A280的10％。基于如此获得的数据[即堆积凝胶床的体积(Vc)，其空隙体积、流量和送入该柱的蛋白质浓度]，可以计算出在施加到堆积凝胶的蛋白质浓度的10％水平下该堆积凝胶的临界容量。
实施例13：临界值和评价
在吸附最大值的10％(Qb10％)水平下的临界值使用以下关系式进行计算：
               Qb10％＝(TR10％-TRD)×C/Vc
这里：TR10％＝在吸附最大值的10％时的保持时间(min)，
TRD＝系统的空隙体积(用min表示)，
C＝原料蛋白质的浓度(4mg/mL)和
Vc＝柱的堆积床体积(mL)。
实施例14：结合到“高盐”阳离子交换配体的蛋白质的回收
“高盐”阳离子交换配体优选还相对于在其上结合的蛋白质的回收进行筛选。这是选择正确种类配体的附加且重要的标准，所述配体将较高吸附容量与施加到其上的蛋白质高比例或定量回收结合在一起。

Claims (17)

1.一种包含结合到基础基质上的混合型阳离子交换剂配体的分离介质的产生方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供至少一种支架，其每一种均包含官能团F并具有环状核心结构；
(b)用包含结合到残基R上的反应性基团Z的试剂使所述支架衍生，其通过使所述支架的基团F与所述试剂的反应性基团反应并同时保持支架的环状结构而进行；
(c)打开所得衍生物的环状结构；和
(d)使所获得的开环产物与包含反应性基团的基础基质反应，所述反应性基团任选地通过间隔物结合到基础基质上；
其中所述支架存在至少两个官能团，其中之一是含硫基团，用于结合到基础基质的活性基团上，其另一个是可以转变成离子基团的基团，所述官能团以相邻位置存在于环状结构上，并且其中在步骤(c)中，通过破坏在两个官能团之间的键提供开环。
2.权利要求1的方法，其中所述支架可以由通式(I)限定：
Figure C028178370002C1
其中A、B和X相互独立地是sp2或sp3杂化的碳原子或任何杂原子，m是0-4之间的任何整数，官能团F由一个X表示，或者结合到A、B和X的任一个上。
3.权利要求2的方法，其中杂原子是氧、硫、氮和/或二氧化硅。
4.权利要求2的方法，其中m为1或2。
5.权利要求2-4中任一项的方法，其中F通过由1-50个原子组成的连接基结合到A、B和X中的任一个上。
6.权利要求2-4中任一项的方法，其中在式(I)中，官能固F选自含有在亲核取代中常用的离去基团的基固；酸或活化的酸；亲核基团；以及C＝C。
7.权利要求6的方法，其中在亲核取代中常用的离去基团的定义为C-Y，其中Y表示Br、Cl、I、甲磺酸根或甲苯磺酸根基团。
8.权利要求6的方法，其中酸或活化的酸的定义为WC＝0，其中W由N-氢琥珀酰亚胺、五氟苯酚、对硝基苯酚或氯代甲酸异丙酯形成。
9.权利要求6的方法，其中亲核基团是-OH、-SH或-NH2。
10.权利要求2的方法，其中在式(I)中，A、B和X是sp2或sp3杂化的碳原子，m为1，F是-NH2。
11.权利要求2的方法，其中在式(I)中，支架是高半胱氨酸硫代内酯：
12.权利要求1的方法，其中在步骤(b)中所用的衍生试剂可以由以下通式描述：
              -Z-R                  (II)
其中：
Z是能够与支架的官能团F反应的基团；R是直链、支链、环状的饱和、不饱和的和芳族的烃基。
13.权利要求12的方法，其中R包含1-20个碳原子。
14.权利要求1的方法，其还包含单独的并且在步骤(b)之前的溴化基础基质的反应性基团的步骤，其中所述反应性基团是碳-碳双键。
15.权利要求1的方法，其还包含单独的并且在步骤(b)之前在有利于自由基反应的条件下活化基础基质的反应性基团的步骤，其中所述反应性基团是碳-碳双键。
16.一种试剂盒，其包含如权利要求2-5中任一项限定的由以上定义的通式(I)所定义的化合物，该试剂盒以固体形式包含所述化合物或衍生物及其在制造混合型阳离子交换剂配体中的使用说明书，所述混合型阳离子交换剂配体结合到基础基质上，用作分离介质。
17.权利要求16的试剂盒，其是一种用于产生高盐配体的试剂盒。
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