JP4188832B2 - イオン交換体の製造 - Google Patents
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Description
本発明は分離、特に混合モード陽イオン交換リガンドを用いたイオン交換による分離の分野に関する。より詳しくは、本発明は、混合モード陽イオン交換体を製造する方法、また、このような製造のために必須の出発材料を含むキットに関する。
クロマトグラフィーとは、密接に関連する一連の分離方法を包含する。クロマトグラフィーと他のほとんどの物理的・化学的分離方法とを区別する特徴は、一方の相は固定されており、他方の相が移動する2つの相互に不混の相を接触させるということである。移動相へ導入したサンプル混合物は移動相によってシステムを通って運ばれるので、固定相および移動相以前に何回も一連の相互作用(分配)を受ける。相互作用はサンプル中の成分の物理的または化学的特性の違いを用いている。これらの違いは、固定相を含むカラムを移動する移動相の影響下で個々の成分の移動速度を規定する。固定相との相互作用が高まる順に分離された成分が現れる。最も保持性の低い成分が最初に溶離し、最も強く保持された物質が最後に溶離する。サンプル成分がカラムから溶離する際に、ある成分が隣り合った溶質の領域と重ならないように十分に遅れる場合に分離が得られる。
(i)クロマトグラフィー支持体に反応基を導入し、所望によりこれを活性化する
(ii)結果的に修飾された支持体を酸性基を含有するチオール化合物と反応させる
(iii)固相支持体の酸性基を有機溶媒中好適な試薬(例えば、DCCの存在下でのNHS)で活性化させる
(iv)好適な残基Rを含むアミノ酸誘導体を付加して、支持体に結合された最終的なリガンドを得る。
上記に開示された一連のステップに伴う1つの問題は、実際には結果として2種の異なるリガンド、すなわちステップ(iii)または(iv)においてうまくいかなかった変換から生じる酸基を含有するチオエーテルリンカーと目的の最終生成物を含む生成物が得られるということである。このような2種の異なるリガンドの混合物からなるクロマトグラフィー支持体を分離工程に用いた場合にはいくつかの問題が起こりうる。例えば、分析が困難となり、一般に必要とされているような確実な調製および使用方法でなくなる。同じ理由から、媒体が2種のリガンドの混合物として得られる場合、特定の各々の適用のためにこのようなクロマトグラフィー支持体の調製および使用を至適化することが困難となる。また、このような混合物は本質的に、よく定義された媒体よりも特異的分離が劣る。
よって、本発明の1つの目的は、混合モード陽イオン交換リガンドを含む分離媒体を製造する方法であって、得られたリガンドの組成の制御が容易な方法を提供することである。この目的は付属のクレームに記載のような新規なスキャフォールドまたはスキャフォールド誘導体を出発材料として用いることにより達成することができる。
「負電荷を有する」および「負に帯電する」とは、その物質が1以上の負電荷を有し、かつ/または正味の負電荷を有することを意味する。
本発明の第一の態様は、ベースマトリックスと結合した混合モード陽イオン交換リガンドを含む分離媒体を製造する方法であって、
(a)各々が官能基Fを含み、環状コア構造を示す少なくとも1つのスキャフォールドを準備し、
(b)スキャフォールドの環状構造を保持したまま、残基Rと結合した反応基を含む試薬を用いて、該スキャフォールドのF基と該試薬の反応基を反応させることによりスキャフォールドを誘導体化し、
(c)得られた誘導体の環状構造を開環させ、
(d)このようにして得られた開環生成物と、反応基を含むベースマトリックス(所望によりスペーサーを介してベースマトリックスに結合させてもよい)を反応させる
ステップを含み、該スキャフォールドが少なくとも2つの官能基(1つはベースマトリックスの反応基と結合させるための硫黄含有基であり、1つはイオン基へと転換可能な基である)を提供し、これらの官能基は環状構造上の隣接した位置に存在し、ステップ(c)において開環が2つの官能基間の結合を切断することによってなされる方法である。ステップ(C)の加水分解は例えば塩基の付加またはその他いずれかの好適な方法によって行うことができる。硫黄含有基の機能は、クロマトグラフィー支持体に容易かつ安定な接着点を提供することである。例えばS-H基の求核性が高くなれば、求核置換またはラジカル付加によるカップリングにおいて高い効率が得られる。
で定義される。簡単な実施形態では、A、BおよびXは全て炭素原子である。mは0〜4、例えば1〜3の任意の整数、好ましくは1または2であり、多くの適用では1である。当業者には分かるであろうが、数値mは最終的な分離媒体におけるリガンドの長さに影響を及ぼす。従ってこれは、例えば混合モード陽イオン交換リガンド上の選択された活性基、意図する分離、ベースマトリックスとその上にある反応基の間にスペーサーがあるかないかによって決める。官能基Fは1つのXで表されるか(すなわち、環状構造に組み込まれている一部として)、またはおそらくリンカーを介してA、BおよびXのいずれか1つと結合した形で表される。このようなリンカーは最終的な分離媒体の目的の特性によって、1〜50個からなり、この際に主として考慮することは本分離媒体製造法に望ましくない副作用が起こらないようにするということである。このリンカーの所望の特性は、主としてベースマトリックスと反応基の間のスペーサーの特性に対応している。
(a)環状構造を有する少なくとも1つのスキャフォールド誘導体を準備し、
(b)誘導体の環状構造を開環させ、
(c)このようにして得られた開環生成物と、反応基を含むベースマトリックス(所望によりスペーサーを介してベースマトリックスに結合させてもよい)を結合させる
ステップを含み、該スキャフォールド誘導体が一般式(III)
で定義できる方法である。
ステップ(b)は本発明の第一の態様に関して上述されたように実施することができる。
(a)(i)各々リガンドの種類が異なる(リガンド1、2、3、4....n)、試験する1種以上の陽イオン交換体(試験陽イオン交換体、交換体1、2、3、4....n;n=整数>0)、および
(ii)対照リガンドを有する対照陽イオン交換体(交換体1、2、3、4....nと対照陽イオン交換体とでは、支持体マトリックス、対イオンなどは実質的に同じ)
を含むライブラリーを準備し;
(b)所定の条件にて、その物質に対して交換体1の、pH範囲1〜12のどこかでの最大貫流容量を求め;
(c)ステップ(b)と同じ条件にて、その物質に対して対照陽イオン交換体の、pH範囲1〜12のどこかでの最大貫流容量を求め;
(d)ステップ(b)と(c)で得られた最大貫流容量の間の関係をもとに、陽イオン交換体(1)がその物質の除去に用いるのに適当であるかどうかを判定し;
(e)必要であれば、交換体2、3、4....nの少なくとも1つについてステップ(b)〜(c)を繰り返す
というステップを含みうる。
(a)活性化スキャフォールド誘導体水溶液を準備し、
(b)この溶液を、第一の特性によって定義され、該スキャフォールド誘導体と結合しうるベースマトリックス粒子の懸濁液と接触させ、
(c)溶液を粒子から分離し、
(d)この分離した溶液を、第一の特性とは異なる特性によって定義され、該スキャフォールド誘導体と結合しうるベースマトリックス粒子の懸濁液と接触させ、
(e)溶液を粒子から分離し、
(f)所望によりステップ(d)および(e)を1回または数回繰り返し、
(g)このようにして得られた分離媒体の容量を通常のイオン交換実験によって評価する
ステップを含む。
(a)0.25M NaCl相当のイオン強度にて、水性対照液中で対象物質と結合することができなければならず、かつ、
(b)その物質に関して、pH2〜12の範囲のどこかに、従来の陽イオン交換体に対するその物質の貫流容量の200%以上、例えば300%以上または500%以上または1000%以上の最大貫流容量が可能となるものでなければならない。
図1は、上記「背景」の節の一般用語で述べたように多モード陽イオン交換体の通常の合成の一例を示す。リガンドの合成が起こる固相支持体であるゲルがどのように存在している必要があるかは図面から明らかであろう。
図2は、スキャフォールドとしてホモシステインチオラクトンを用いた多モード陽イオン交換体の合成のための本発明の1つの実施形態を示す。基本的に本発明の方法は4ステップの先行技術に比べて2ステップからなり、リガンドのゲル部分は最終のステップに含める必要があるだけである。
図3は、例としてのスキャフォールドホモシステインチオラクトンによる、多モード陽イオン交換体ライブラリーの潜在的多様性を示す。可能性のあるR残基の数は膨大であり、上記により詳しく述べられているが、下記実験の部で具体例が示される。
図4は、同じセットの反応性溶液から異なる媒体ライブラリーを合成する一般法を図示する。このような方法は粒径、多孔度、剛性、またはpH、時間、温度などのカップリング条件といった実用上様々な特性とともに用いることができる。
ステップ1:
ステップla:
ジクロロメタン(DCM)中、DL-ホモシステインチオラクトンIaおよびジイソプロピルアミン(DIPEA)の溶液Aを0℃まで冷却した。DCM中に塩化アシルまたは塩化スルホニルまたは無水物または活性化酸を含有する溶液Bを0℃まで冷却し、0〜5℃の間で維持した溶液Aに滴下した。この混合物を室温で一晩攪拌した。
ジクロロメタン(DCM)中、DL-ホモシステインチオラクトンIaおよびジイソプロピルアミン(DIPEA)の溶液Aを0℃まで冷却した。DCM中の塩化ヨードアセチル溶液を0〜5℃の間で維持した溶液Aに滴下した。この混合物を室温で一晩攪拌した。次いでDCM中にチオールを含有する溶液Bを反応混合物へ滴下し、攪拌をさらに17時間続けた。
ステップ1aまたはステップ1bから得られた混合物から溶媒を真空下で除去した。0℃でこの粗生成物に5N水酸化ナトリウム溶液をゆっくり加え、さらに室温で2時間攪拌した。
公知の手順に従って得た臭素化セファロース(登録商標)6FF(Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden)をステップ2で得たアルカリ溶液と混合し、50℃まで一晩温めた。反応後、このゲル(1容量)を濾過し、水(2×15容量)、エタノール(2×15容量)、0.2M酢酸(2×15容量)および水(2×15容量)で洗浄した。次いでこのゲルのイオン交換容量を酸で滴定して測定した(Chauhan V. S. et al., Tetrahedron, 44 (8), 2359-2366, 1988 (酸活性化))。これらのゲルのクロマトグラフによる評価(保持率およびイオン交換容量)を下記の表1Aに示す。
実施例1〜4
以下の実施例は、D,LホモシステインチオラクトンIaをスキャフォールドとして用い、また記載の化学反応を用いた(上記スキーム1参照)。ホモシステインチオラクトンIaと塩化アシル、塩化スルホニル、無水物または活性化酸との反応によってアミドまたはスルホンアミド結合を形成した後、塩基性加水分解と得られた化合物を活性化したセファロース(登録商標)6FFまたはセファロース(登録商標)4FF(双方ともAmersham Biosciences AB, Uppsala, Swedenより入手)とさらに結合させたものを用いて、チオラクトン環の開環を実現した。
1a. 溶液Bを、4mL DCM中の3,4,5-トリメトキシ-ベンゾイルクロリド2.37g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FF(Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden)をこの混合物へ加えた。ゲル1aのイオン交換容量は232.6μmol/mLであった。
1b. 溶液Bを、4mL DCM中の4-クロロベンゾイルクロリド1.80g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル1bのイオン交換容量は251.1μmol/mLであった。
1c. 溶液Bを、4mL DCM中の2,4-ジクロロベンゾイルクロリド2.15g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル1cのイオン交換容量は253.3μmol/mLであった。
1d. 溶液Bを、4mL DCM中の3-(トリフルオロメチル)ベンゾイルクロリド2.14g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル1dのイオン交換容量は239.9μmol/mLであった。
1e. 溶液Bを、4mL DCM中の4-(トリフルオロメチル)ベンゾイルクロリド2.14g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル1eのイオン交換容量は247.1μmol/mLであった。
1g. 溶液Bを、4mL DCM中のチオフェン-2-アセチルクロリド1.65g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル1gのイオン交換容量は261.5μmol/mLであった。
1h. 溶液Bを、4mL DCM中の塩化ブチリル1.10g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル1hのイオン交換容量は260.6μmol/mLであった。
1i. 溶液Bを、4mL DCM中の塩化オクタノイル1.67g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル1iのイオン交換容量は233.6μmol/mLであった。
1j. 溶液Bを、4mL DCM中の塩化イソバレリル1.24g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル1jのイオン交換容量は232.4μmol/mLであった。
1k. 溶液Bを、4mL DCM中の2-(2-メトキシ-エトキシ)アセチルクロリド1.57g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル1kのイオン交換容量は234.0μmol/mLであった。
2a. 溶液Bを、4mL DCM中のトルエン-4-スルホニルクロリド1.96g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル2aのイオン交換容量は199.0μmol/mLであった。
2b. 溶液Bを、4mL DCM中の2,5-ジメトキシベンゼンスルホニルクロリド2.43g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル2bのイオン交換容量は182.6μmol/mLであった。
2c. 溶液Bを、4mL DCM中の4-アセトアミドベンゼンスルホニルクロリド2.40g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル2cのイオン交換容量は159.7μmol/mLであった。
2d. 溶液Bを、4mL DCM中の2,4,6-トリメチルベンゼンスルホニルクロリド2.25g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル2dのイオン交換容量は176.5μmol/mLであった。
2e. 溶液Bを、4mL DCM中の塩化メタンスルホニル1.18g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル2eのイオン交換容量は163.2μmol/mLであった。
3a. 溶液Bを、4mL DCM中の無水安息香酸2.33g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル3aのイオン交換容量は255.1μmol/mLであった。
3b. 溶液Bを、4mL DCM中の無水プロピオン酸1.34g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル3bのイオン交換容量は238.3μmol/mLであった。
4a. 活性化酸をカルボン酸から次のように新たに調製した。20mLテトラヒドロフラン(THF)中の馬尿酸1.84g(10.3mmol)およびN-メチルモルホリン1.13mLの溶液を-8℃まで冷却した後、5mL THF中のイソブチルクロロホルメート1.33mLをゆっくり添加した。この混合物を0℃で2時間、さらに室温で一晩攪拌して溶媒を蒸発させた。溶液Bを4mL DCM中に粗物質を溶解して調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル4aのイオン交換容量は182.4μmol/mLであった。
以下の実施例は、D,LホモシステインチオラクトンIaをスキャフォールドとして用い、また記載の化学反応を用いた(上記スキーム1参照)。ホモシステインチオラクトンIaと塩化ヨードアセチルとの反応によってアミドを形成した。チオールを、残りのハロゲンの求核置換反応により得られたリガンド上に導入した。塩基性加水分解と得られた化合物と活性化したセファロース(登録商標)6FFまたはセファロース(登録商標)4FFを結合させたものを用いてチオラクトン環の開環を実現した。
5b. 溶液Bを、1mL DCM中のフルフリルメルカプタン243μl(2.3mmol)を用いて調製し、ステップ1bに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液5mLを加えた。ステップ3に従い、アリル230μmol/ゲルmLを加えた4mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル5bのイオン交換容量は114.1μmol/mLであった。
5c. 溶液Bを、1mL DCM中の4-メルカプト安息香酸373mg(2.3mmol)を用いて調製し、ステップ1bに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液5mLを加えた。ステップ3に従い、アリル230μmol/ゲルmLを加えた4mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル5cのイオン交換容量は184.8μmol/mLであった。
5d. 溶液Bを、1mL DCM中の2-メチル-1-プロパンチオール251μL(2.3mmol)を用いて調製し、ステップ1bに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液5mLを加えた。ステップ3に従い、アリル230μmol/ゲルmLを加えた4mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル5dのイオン交換容量は155.0μmol/mLであった。
5e. 溶液Bを、1mL DCM中の2,2,2-トリフルオロエタンチオール205μL(2.3mmol)を用いて調製し、ステップ1bに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液5mLを加えた。ステップ3に従い、アリル230μmol/ゲルmLを加えた4mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル5eのイオン交換容量は125.4μmol/mLであった。
以下の実施例は、D,LホモシステインチオラクトンIaをスキャフォールドとして用い、また記載の化学反応を用いた(上記スキーム2参照)。ホモシステインチオラクトンIaと塩化アシルとの反応によってアミド結合を形成した後、アミノ酸誘導体と得られた化合物を活性化したセファロース(登録商標)とさらに結合させたものを用いてチオラクトン環の開環を実現した。
ゲル6のイオン交換容量は148.3μmol/mLであった。
以下の実施例は、D,LホモシステインチオラクトンIaをスキャフォールドとして用い、また記載の化学反応を用いた(上記スキーム3参照)。ホモシステインチオラクトンIaと無水物との反応によってアミド結合を形成した後、アミンおよび得られた化合物を活性化したセファロース(登録商標)とさらに結合させたものを用いてチオラクトン環の開環を実現した。
ゲル7のイオン交換容量は155.1μmol/mLであった。
反応混合物は異なるマトリックスとの反応に数回用いることができ、かつ/または異なるレベルのアリルを加えた同じマトリックスにも使用できる。
レベル1:
ゲル1jを上記のように調製した。溶液Bを、4mL DCM中の塩酸イソバレリル1.24g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1bに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル1jのイオン交換容量は232.4μmol/mLであった。このゲルのクロマトグラフによる評価(保持率およびイオン交換容量)を表2に示す。
411μmol/mLでマトリックスと結合させた(レベル1)後、そのまま濾過して得た溶液を、アリル250μmol/mLを加えた活性化セファロース(登録商標)6FFと反応させた。カップリングはステップ3に従って行った。生じたゲル1j-2はイオン交換容量162.8μmol/mLを示した。このゲルのクロマトグラフによる評価(保持率およびイオン交換容量)を表2に示す。
250μmol/mLでマトリックスと結合させた(レベル2)後、そのまま濾過して得た溶液を、アリル138μmol/mLを加えた活性化セファロース(登録商標)6FFと反応させた。カップリングはステップ3に従って行った。生じたゲル1j-3はイオン交換容量104.2μmol/mLを示した。このゲルのクロマトグラフによる評価(保持率およびイオン交換容量)を下記表2に示す。
レベル1:
ゲル3aをAの部で記載したように調製した。溶液Bを、4mL DCM中の無水安息香酸2.33g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル3aのイオン交換容量は255.1μmol/mLであった。このゲルのクロマトグラフによる評価(保持率およびイオン交換容量)を表2に示す。
411μmol/mLでマトリックスと結合させた後、そのまま濾過して得た溶液を、アリル250μmol/mLを加えた活性化セファロース(登録商標)6FFと反応させた。カップリングはステップ3に従って行った。生じたゲル3a-2はイオン交換容量196.0μmol/mLを示した。このゲルのクロマトグラフによる評価(保持率およびイオン交換容量)を表2に示す。
250μmol/mLでマトリックスと結合させた後、そのまま濾過して得た溶液を、アリル138μmol/mLを加えた活性化セファロース(登録商標)6FFと反応させた。カップリングはステップ3に従って行った。生じたゲル3a-3はイオン交換容量117.4μmol/mLを示した。このゲルのクロマトグラフによる評価(保持率およびイオン交換容量)を下記表2に示す。
レベル1:
溶液Bを、4mL DCM中の塩化イソバレリル1.24g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1a(一般法)に従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル580μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)4FFをこの混合物へ加えた。ゲル1j-4のイオン交換容量は108.4μmol/mLであった。このゲルのクロマトグラフによる評価(保持率およびイオン交換容量)を下記表2に示す。
580μmol/mLでマトリックスと結合させた後、そのまま濾過して得た溶液を、アリル240μmol/mLを加えた活性化セファロース(登録商標)4FFと反応させた。カップリングはステップ3に従って行った。生じたゲル1j-5はイオン交換容量128.1μmol/mLを示した。このゲルのクロマトグラフによる評価(保持率およびイオン交換容量)を表2に示す。
レベル1:
溶液Bを、4mL DCM中の無水安息香酸2.33g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル580μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)4FFをこの混合物へ加えた。ゲル3a-4のイオン交換容量は1 48.1μmol/mLであった。このゲルのクロマトグラフによる評価(保持率およびイオン交換容量)を表2に示す。
580μmol/mLでマトリックスと結合させた後、そのまま濾過して得た溶液を、アリル240μmol/mLを加えた活性化セファロース(登録商標)4FFと反応させた。カップリングはステップ3に従って行った。生じたゲル3a-5はイオン交換容量144.7μmol/mLを示した。このゲルのクロマトグラフによる評価(保持率およびイオン交換容量)を表2に示す。
材料
緩衝液
バッファー1:20mMリン酸ナトリウム、0.3M NaCl、pH 6.8
バッファー2:20mM酢酸ナトリウム、0.25M NaCl、pH 4.0
バッファー3:20mM酢酸ナトリウム、0.25M NaCl、pH 4.5
バッファー4:20mMリン酸ナトリウム、2M NaCl、pH 6.8
バッファー5:100mMリン酸ナトリウム、pH 7.0(BSAおよびIgGの溶出用)
1. BSA:バッファー2中4mg/mL
2. IgG:バッファー3中4mg/mL
全てのバッファーおよびタンパク質溶液は使用前に0.45μm Millipore Millex HAフィルターで濾過した。
全ての実験は室温にてUnicorn 3.1ソフトウェアを備えたAKTA Explorer 100クロマトグラフィーシステム(Amersham Pharmacia Biotech AB)を用いて実施した。サンプルは150mLのスーパーループを経由してカラムに注入した。全体にわたって1mL/分(約300cm/時)の流速を用いた。10mmフローセルを用い、280nmにて吸光度を測定することで溶出液を継続的にモニタリングした。
各プロトタイプ陽イオン交換体をHR5/5カラム(充填ベッド容量=1mL)に充填し、適当なpHおよび塩濃度のバッファーで平衡化した。システムのボイド容量は、非結合条件下で好適なタンパク質溶液をカラムに適用することで測定した。溶出液のA280が、適用したタンパク質のA280の10%に達するのに要した時間をシステムのボイド容量とした(分で表示)。
吸収極大の10%(Qb10%)レベルでの貫流は以下の関係式を用いて計算した。
Qb10%= (TR10%-TRD) x C / Vc
ここで、TR10% =吸収極大の10%における保持時間(分)
TRD = システムのボイド容量(分)
C = 供給タンパク質の濃度(4mg/mL)
Vc = カラムの充填ベッド容量(mL)
「高塩」陽イオン交換リガンドもそれと結合したタンパク質の回収率に関してスクリーニングするのが好ましい。これは付加的なものであるが、比較的高い吸着容量とそれに適用したタンパク質の高い回収率または量的回収を合わせ持つ、適正な種類のリガンドを選択するために重要な基準である。
Claims (11)
- ベースマトリックスと結合した混合モード陽イオン交換リガンドを含む分離媒体を製造する方法であって、
(a)各々が官能基Fを含み、環状コア構造を示す少なくとも1つのスキャフォールドを準備し、
(b)スキャフォールドの環状構造を保持したまま、残基Rと結合した反応基Zを含む試薬を用いて、該スキャフォールドのF基と該試薬の反応基を反応させることによりスキャフォールドを誘導体化し、
(c)得られた誘導体の環状構造を開環させ、
(d)このようにして得られた開環生成物と、反応基を含むベースマトリックス(所望によりスペーサーを介してベースマトリックスに結合させてもよい)を反応させる
ステップを含み、該スキャフォールドが、環状構造上の隣接した位置に存在する少なくとも2つの官能基(1つはベースマトリックスの反応基と結合させるための硫黄含有基であり、1つはイオン基へと転換可能な基である)を提供し、ステップ(c)において開環が2つの官能基間の結合を切断することによってなされる、方法。 - 式(I)において官能基Fが脱離基、酸または活性化酸、求核基およびC=Cからなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 式(I)においてA、BおよびXが炭素原子であり、mが1であり、Fが−NH2である、請求項2または請求項3に記載の方法。
- ベースマトリックスと結合した混合モード陽イオン交換リガンドを含む分離媒体を製造する方法であって、
(a)環状構造を有する少なくとも1つのスキャフォールド誘導体を準備し、
(b)誘導体の環状構造を開環させ、
(c)このようにして得られた開環生成物と、反応基を含むベースマトリックス(所望によりスペーサーを介してベースマトリックスに結合させてもよい)を反応させる
ステップを含み、該スキャフォールド誘導体が次の一般式(III)で表される、方法。
- Rが、直鎖、分枝状、環状の飽和、不飽和または芳香族炭化水素基である、請求項7に記載の方法。
- 前記スキャフォールド誘導体がホモシステインチオラクトン誘導体である、請求項7または請求項8に記載の方法。
- ステップ(b)とは別にその前に、ベースマトリックスの反応基(該反応基は炭素−炭素二重結合である)を臭素化するステップも含む、請求項1乃至請求項9のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)とは別にその前に、ベースマトリックスの反応基(該反応基は炭素−炭素二重結合である)をラジカル反応に好ましい条件下で活性化するステップも含む、請求項1乃至請求項9のいずれか一項に記載の方法。
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