SE529145C2 - Aktiverad fast stödfas och metod - Google Patents

Description

ILO lS 20 25 529 145 2 ï_ff1ffl_<>ë.i_l_i§.eäi_f_1s___§§¿.129l innehåller amino-, tiol- eller fenolgrupper, pà ytan av en fast stödfas utförs behändigt genom N- hydroxisuccinimidkoppling eller genom direkt öppning av en epoxid som är immobiliserad på stödfasens yta (sä som en gel) under vattenhaltiga betingelser i närvaro av natriumhydroxid.

Sådana metoder kan framgångsrikt användas för produktionen av kromatografimedia sä som affinitetsmatriser, där en làg substitutionsgrad krävs (karaktäristiskt s 20 umol/ml gel). I fallet med jonbytesmedia behövs en högre substitutionsgrad, lämpligen 18-150 umol/ml. I detta fall är en av de föredragna metoderna baserad pà aktivering genom bromering av immobiliserade allylgrupper (se Schema 1).

Schema l @_° /\/ i I^° 0 wfnfii /Nam @“_°ïH/\o/\ Användningen av brom är riskfylld och i produktion är användningen av en speciell reaktor som är avsedd för denna typ av reaktion ofta nödvändig. Vidare, medan kopplingsproceduren via bromering är effektiv och huvudsakligen ger glycerolderivat som sidoprodukt, kan oönskade sidoprodukter fràn processen observeras inklusive spår av oreagerade allylgrupper, tillsammans med nâgra få procent bromatomer pá den fasta stödfasen.

Således finns det fortfarande ett behov av förbättrade metoder för syntesen av aktiverade stödfasmaterial lämpliga för 10 15 20 25 30 35 529 145 ast sättningen av" lisaider. .iår _a_f_í_i__r_1__i tietfir., Qshl jonbyteskromatografi. Sundberg, L. et al., (J. Chromatography, (1974), 20, 87-98) beskriver användningen av bis~oxiraner för introduktionen av reaktiva oxirangrupper på agarosgeler genom reaktion av agaros med 1,4-butandiol-diglycidyleter i vattenlösning av natriumhydroxid innehållande natriumborhydrid. Metoden uppfyllde den dubbla funktionen att bilda en brygga mellan gelsträngarna genom tvärbindning och att tillhandahålla funktionalitet för efterföljande fastsättning av liganden till matrisen. Matsumoto, I. (1975), êâ, 1091-98) beskriver bland annat framställningen av epoxiaktiverade Sepharose 4B-pärlor med et al., (J. Biochem., epiklorhydrin, följt av derivatisering av den aktiverade Sepharosen till amino- och karboxiagaros. Dessa metoder är effektiva i fall där en substitutionsgrad under 50 umol/ml gel krävs, men är olämplig för separationsmedia med högre substitutionsgrader.

Hjertén, S., et al., (J. Chromatography, (1986), âäí, 203-210) beskriver en metod för framställningen av agarosderivat genom att först koppla 7-glycidoxipropyl-trimetoxisilan i ett vattenhaltigt medium till agaros via trimetoxigrupperna, följt av fastsättning av (till exempel) alkoholer i aceton- eller dioxanlösning i närvaro av bortrifluorid-dietyleterat som katalysator. Katalysatorn är emellertid korrosiv och kräver speciella försiktighetsåtgärder vid hantering. Vidare är separationsmedia framställda enligt denna metod efter immobilisering av en ligand, instabila under basiska betingelser (pH>10), pà grund av närvaron av silanenheten.

Detta är inte kompatibelt med den praktiska användningen av dessa media i processen rening av biomolekyler där förfaranden med rening in situ med användning av högt pH (>12) används rutinmässigt.

En svårighet som kan uppstå när man utför nukleofil substitution i heterogena reaktionssystem är att reaktanterna kanske inte blandas effektivt. I sådana nukleofila substitutionsreaktioner är substratet ofta olösligt i vatten 10 15 20 25 3D 35 529 145 eller _ai1si;:a_.p_9_lë;a_lšësninssmsdsli .medatafinslileo ilenuusfita år sne ._ anjon som är löslig i vatten men inte i det organiska lösningsmedlet eller substratet. Når tvà reaktanter bringas samman är deras koncentrationer i samma fas följaktligen för låga för lämpliga reaktionshastigheter. Ett sätt att komma förbi detta är att använda ett lösningsmedel som kommer att lösa båda species. Ett annat sätt är att använda ett tvàfassystem med en fasöverföringskatalysator. Den föreliggande uppfinningen tillhandahåller en alternativ metod för immobilisering av ligander och aktivering av material till fasta stödfaser med epoxigrupper, vilken metod utnyttjar betingelser med fasöverföringskatalysator. I denna metod används en katalysator för att ”bära” nukleofilen från vattenfasen in till den organiska fasen och därigenom medge introduktionen av epoxigrupper och specifika ligander på stödfasmaterialet med en hög substitutionsgrad. Vidare undviker metoden manipulationer med brom och eliminerar samtidigt oönskade sidoprodukter resulterande från ofullständig reaktion så som noterats ovan. Den föreliggande metoden är med fördel användbar pà alla immobiliseringsmetoder där ett högt epoxidinnehàll eller hög ligandsubstitution krävs i separationsmatrisen och är i synnerhet lämplig för immobiliseringen av nukleofila ligander för användning i en stor mängd kromatografiska separationsförfaranden, så som hydrofob interaktionskromatografi (HIC), omvänd fas- V kromatografi (RPC) och multi-modal jonbyteskromatografi.

I en första aspekt av den föreliggande uppfinningen tillhandahålls således en metod för att framställa en separationsmatris, metoden innefattar att tillsammans reagera: a) en matris innefattande formeln: M--A--H vari: M är en fast stödfas; A är en atom eller grupp vald från -O-, -S- och -NR1-, där RI väljs fràn H och Cl - C4 alkyl; och b) en förening med formeln: 10 15 20 25 30 529 145 vari: X väljs från kloro, bromo, jodo, Cl - Cl alkoxi, mesyl, tosyl och gruppen: /°\ f* Hzc-cí vari R* väljs från H, cl - c., alkyl, -cooR3 och aryl; där R* väljs från H och Cl - Cl alkyl; P är H, eller en ligand vald frän Cl - Culalkyl, Cl - Cw alkenyl, Cl - Cw karboxylsyraester, Cl - Cm alkoxi, Cl - Cm alkenyloxi, Cl - Cm karboxialkyl, substituerad amino, kvartär ammonium, Cl - Cw monoeter eller polyeter innehàllande från 1 till 6 syreatomer, aryl, aryloxi, heteroaryl och aralkyloxi; eller P väljs från gruppen: O o / \ -cH-_cH2 --L-Hc-cH2 och , där L är en sammanlänkande grupp och är en grenad eller ogrenad kedja av kovalent bundna atomer innehållande frän 1 - 20 linjära atomer valda från gruppen bestående av kol-, och svavelatomer; och r är 0 eller l; syre- kännetecknad av att sagda metod utförs i närvaro av en fasöverföringskatalysator.

Den föreliggande uppfinningen avser därför en metod för modifieringen av ett material till en fast stödfas för användning i ett separationsmedium, pà sagda stödfasmaterial år fastsatt åtminstone en och företrädesvis ett flertal nukleofila grupper. Uttrycket ”separationsmedium” används hâri för ett material som är användbart, till exempel, som packning i en kromatografikolonn, och mer specifikt bestär av en eller flera ligander kopplade till en basmatris. Sàledes fungerar basmatrisen som en bärare, medan liganderna tillhandahåller funktionaliteter som interagerar med màlsubstanser i kromatografiska separationsförfaranden. Reaktion av sagda nukleofila grupper utförs under fasöverföringsbetingelser med en reaktant innefattande ett elektrofilt kolcentrum. Lämpligen 10 15 20 25 30 35 529 145 innehåller §tödfasmaterialet,_eller är derivatiserat så att _ det innehåller, åtminstone en och företrädesvis ett flertal av grupperna -OH, -SH och/eller -NHR1, där R* väljs från väte och Cjl-CÅ; , den fasta stödfasen innehåller, eller är derivatiserad så att företrädesvis väte. Företrädesvis är A -O-, sà att den innehåller, ett flertal hydroxylgrupper kovalent bundna till stödfasen.

Lâmpligen utförs metoden enligt den första aspekten inom pH- omràdet mellan pH 7 och pH 14. Företrâdesvis utförs reaktionen under basiska betingelser i ett pH område mellan 9 och 13 i ett lämpligt lösningsmedel, till exempel etylacetat, bensen, toluen, kloroform, dikloretan, hexan eller dietyleter. Ett föredraget lösningsmedel för att utföra metoden enligt den föreliggande uppfinningen är toluen. Reaktionen kan utföras vid en temperatur som kan variera mellan O °C och temperaturen för àterloppskokning för det valda lösningsmedlet, i mellan 30 minuter och 10 timmar. Företrädesvis utförs reaktionen vid en temperatur inom området från ungefär 20 °C till ungefär 35 °C och från 1 till 4 timmar.

Lämpligen kan separationsmatrisen enligt den första aspekten eventuellt inkludera en motjon, vilken kan vara positiv eller negativ för att balansera matrisens formella laddning (eller laddningar). Motjonens natur är inte av betydelse för uppfinningen och kan vara en av många kända joner, så som NHJQ K*, Na*, trifluoracetat (F3C-CO{), perklorat (C10{), sulfonat (SO{), fosfat (POf', Cl", Br' eller IÜ I en utföringsform enligt den första aspekten tillhandahålls en metod för kovalent fastsättning av en ligand pà en fast stödfas. I denna utföringsform reageras lämpligen en matris innefattande formeln: M--A--H vari M och A är definierade tidigare häri, i närvaro av en fasöverföringskatalysator med en förening med formeln: x-(cfipr-P I 10 15 20 25 30 35 529 145 vari-. ràn_.l<_l_9r9s.s_rb.r9:n_ o /\/W H2c-~c\ vari R2 väljs från H, -COOR3 och aryl; där R3 väljs fràn H och Cl - C4 alkyl; P är en ligand vald från C; - Cm alkyl, Cl - Cm alkenylf Ci “ Cw karboxylsyraester, Cl - Cm alkoxi, C1 - Cm alkenyloxi, Cl - CN karboxialkyl, substituerad amino, kvartär ammonium, C1 - CW monoeter eller polyeter innehållande from l till 6 syreatomer, aryl, aryloxi, heteroaryl och aralkyloxi; och r är 0 eller 1.

Uttrycket "ligand” används häri i sin konventionella betydelse för en kemisk enhet innefattande en funktionell grupp som kan interagera med, och binda till en målsubstans. Sådana málsubstanser kan antingen vara en förening som det är önskvärt att isolera eller avlägsna genom kromatografi, eller alternativt en analytisk màlsubstans. Exempel pä ligandgrupper inkluderar positivt laddade grupper (anjonbytande ligander); negativt laddade grupper (katjonbytande ligander); lipid- och kolvätesolubiliserande grupper sä som alkyl-, aryl- och aralkylgrupper, och immobiliserade metalljoner, till exempel Cu(II), Ni(II), Fe(II) och Fe(III) polyhistidintaggade molekyler). (för bindning till Föredragna ligandgrupper P kan väljas från gruppen bestående av C1 - Cm alkyl, perfluoro C1 - Cw alkyl, Cl - Cm karboxylsyraester, Cl - Cm alkoxi, C1 - Cm karboxialkyl, Cl - Cm alkenyloxi, trimetoxisilylmetyl, fenyl, perfluorofenyl, fenoxi eventuellt substituerad med halogen, Cl - Cm alkoxi och fenyl, bensyloxi, l-naftyloxi, 2-furylmetyloxi och tri-Cl - C4 alkylammonium.

I en andra utföringsform reageras en matris innefattande formeln: M--A--H vari M och A är definierade tidigare häri, i närvaro av en fasöverföringskatalysator med en förening med formeln: 10 15 20 25 30 529 145 vari X väljs från kloro, bromo, jodo och gruppen: o 2 H C/ \C/R 2“"\ vari R? väljs från H, -COOR3 och aryl; där R3 väljs från H och C1 - C4 alkyl; och P väljs från gruppen: O -cH--cH2 I /Fk -L-Hc-CHZ och , där L är definierad tidigare hâri och r är O eller l. Denna utföringsform tillhandahåller därför en effektiv metod för kovalent fastsättning av en epoxigrupp pà ett material för fast stödfas, och aktiverar därigenom stödfasen. Stödfasen kan derivatiseras ytterligare genom reaktion med en eller flera ligander som har nukleofila funktionella grupper fastsatta pà sig. Metoden enligt den föreliggande uppfinningen medger därför derivatisering av en fast stödfasmatris antingen direkt med en ligand eller med en reaktiv epoxifunktionalitet, i vilket fall ytterligare reaktion med en nukleofil ligand är möjlig.

I en föredragen utföringsform är X gruppen: O /\/R2 H2c-c\ där R2 är väte; P är gruppen: o / \ -L-Hc-CHZ I L är definierad tidigare häri; och r är O eller 1.

Lämpligen kan "alkyl-", "alkoxi-“, "alkenyl-" och "alkenyloxigrupper" enligt den föreliggande uppfinningen innehålla grenade eller ogrenade kedjor av kolatomer. Sådana alkyl-, alkoxi~, alkenyl- och alkenyloxigrupper kan vara osubstituerade eller substituerade med en eller flera av grupperna ~COOH, -SO3H, -OH, -SH (och deras skyddade former, så 10 15 20 25 30 .i §s>m_§§§e1:___9çhletar) , 529 145 9 :Nilla subat. i_tuerad_ amino. kyëlgtër ammonium, trimetoxisilyl och halogen. Lämpligen väljs substituerad amino och kvartär ammonium från -NR?Rb respektive -N*RÜf?F, där Ra, Rb och RF väljs oberoende av varandra från väte, Cl - C4 alkyl, fenyl och bensyl. I sammanhanget med den föreliggande uppfinningen ska det förstås att grupperna ~COOH och -SO;H kommer att inkludera grupperna -C00' respektive -S03] eftersom de är de joniserade formerna av de respektive syrorna.

Uttrycket "aryl“ avses representera en aromatisk substituent innehållande en eller två fuserade aromatiska ringar innehållande 6 till 10 kolatomer, lämpligen fenyl eller naftyl. Arylgruppen kan eventuellt och oberoende vara substituerad med en eller flera substituenter, till exempel - SO3H, -NH2, kvartår ammonium, -OH, halogen, karbonyl inklusive aldehyd och keton, raka eller grenade alkylkedjegrupper innehållande l till 10 kolatomer, cykloalkyl, fenyl och Cl - Cm alkoxi, till exempel metoxi-, etoxi-, propoxi- och n- butoxi-_ Uttrycket “heteroaryl“ avses representera ett mono-, bi- eller tricycliskt aromatiskt ringsystem valt från kolatomer och innehållande åtminstone en och inte mer än 4 heteroatomer vilka kan väljas från N, O, och S. Heteroarylgruppen kan eventuellt och oberoende vara substituerad med en eller flera substituenter, till exempel -SOfi¶, -NH2, kvartär ammonium, halogen, raka eller grenade alkylkedjegrupper innehållande 1 till 10 kolatomer, cykloalkyl, fenyl och Cl - Cm alkoxi, till exempel metoxi-, etoxi-, propoxi- och n-butoxi-. Exempel pà lämpliga heteroaryl-ringsystem med möjliga fastsättningspunkter visas i tabell 1.

Tabell 1 10 15 20 25 529 145 _ .

I I (ID 00 N 'i N N N N > V. go Nf N N \\ (I) Alternativt kan heteroaryl vara ett residuum av en purin- eller pyrimidinbas vald fràn adenin, guanin, hypoxantin, xantin, tymin, uracil och cytosin och deras derivat.

Aralkyl är en Cl till CG alkylgrupp substituerad med en aryl- eller heteroaryl-grupp. Exempel inkluderar bensyl-, fenyletyl- och fenylpropylgrupper.

Uttrycket "aralkyloxi" avses representera en Cl - CS alkoxigrupp substituerad med en aryl- eller heteroarylgrupp så som definierats tidigare häri.

Halogen- och halogrupper väljs från fluoro, kloro, bromo och jodo.

Länkande grupp L är lämpligen en grenad eller ogrenad kedja av kovalent bundna atomer innehållande l - 20 linjära atomer valda från gruppen bestående av kol-, kväve-, syre- och svavelatomer. Lämpliga länkar väljs fràn gruppen bestående av alkylkedjor innehållande fràn 1 till 20 kolatomer vilka eventuellt kan innehålla från 1 till 8 syre- eller svavelatomer så som mono(tio)eter- eller poly(tio)eterlänkar.

L kan eventuellt innehålla en eller flera ringstrukturer inlagda i atomkedjan, till exempel cyklohexylen- och fenylenenheter. Grenade länkgrupper kan också tillhandahållas sä att en eller flera epoxigrupper fastsatta pà kol- eller 529 145 ll .líïëyeeëgfïæeä kedj ex; fiaklusiewrfßxswqçwhelëaflf låmpl,i9_a_ ššâ; fastsàttningen av en eller flera ytterligare ligander därpå.

Exempel på lämpliga sammanlänkande grupper (L) ViSaS i tabell 2.

Tabell 2 ~ (CHz) 4- ; -CH2- (CFQ) g-CHZ- ; "cH2_O"CH2°' .7 -cHg-O- (cHg) 2-'O-CH2- -cHz-o- (CHZ) 4-o-cH2- ; -CHZ-o- (CHZ) s-o-cHz- 'CH2'Û-(CH2)2-Ö-(CH2)2-O-(CH2)2'0“CH2“ -cH2-o-cH2ß<:>-<:H2-o-c+z2- -cH2-o-cH2 cHz-o-cflz- CHZ u I CF O v» /O cHs-cšH CH O ; OCh cHz- / -cH2-o N \ G3-<ï7 O u I f' 529 12 145 _ Bättre;rëéesviërxcälis, íràrn 10 15 20 .

I cHz ; och 0/ I -CHQ- -CHz-CH-CHz-O-CHz- där n är ett heltal från 1 till 6 och m är ett heltal från 1 till 4. I en speciell utföringsform är L -CH¿-O-(CHflnfO~CHr' och n är 2, 3 eller 4.

I en speciell utföringsform enligt uppfinningen väljs X väljs från kloro, bromo och jodo; P är aryl eller heteroaryl och r är l.

I en ytterligare utföringsform väljs X från kloro, bromo och jodo; P är gruppen: O -cH-cl-az och r är 1.

I en ytterligare utföringsform är X gruppen: O I? Hzc/-šc/ \\ vari R2 väljs fràn H och -COOR3, där R? väljs fràn H och Cl - C4 alkyl; P väljs fràn Cl - C4 alkyl eventuellt substituerad med fluor, aryl eventuellt substituerad med fluor, och etenyl; och r är 0. Fluorosubstituerade alkyl- eller arylgrupper är företrädesvis perfluoro Cl - C4 alkyl, till exempel trifluorometyl-, och perfluorofenylgrupper. 10 15 20 25 30 35 529 145 13 ___I,-__§_I_1_..;f_§3ä?_l..i9_êrs._ lßëišsäriaaëšgrrztä:_>§__.s:i129§:4_:._ i c , O Hzc/-šci P väljs fràn Cl - Cm alkyl, Cl - Cm alkenyl, C1 - Cm alkoxi, Cl - C10 alkenyloxi, tri-Cl -C4 alkylammonium, aryl, aryloxi, heteroaryl och aralkyloxi; och r är 1. Speciellt föredragna grupper P väljs från fenoxi, bensyloxi, propoxi, prop-2- enyloxi, trimetylammonium, butyloxi, hexyloxi och oktyloxi.

I ett alternativt förfarande kan materialet till den fasta stödfasen derivatiseras med en ligand i en tvåstegsprocess vari, i ett första steg, stödfasen aktiveras genom fastsättning av en epoxifunktion på stödfasen. I processens andra steg reageras stödfasmaterialets aktiverade epoxigrupper vidare med en ligand. Lämpligen bildar liganden en komponent av ett bindande par sä att stödfasen kan användas som ett jonbytande medium, eller separationsmedium för hydrofob interaktionskromatografi (HIC), omvänd fas-kromatografi (RPC), eller affinitetskromatografi. Liganden ska innehålla, eller derivatiseras sä att den innehåller, åtminstone en funktionell grupp lämplig för reaktion med en epoxigrupp som är närvarande pá materialet till den fasta stödfasen, och därigenom bilda en kovalent bindning med stödfasen. Det ska förstås att vilka molekyler som helst som uppvisar en bindningsaffinitet för varandra kan användas som ligander i metoden enligt den föreliggande uppfinningen, så att det derivatiserade matrismaterialet kan användas för att binda till den komplementära medlemmen i bindningsparet.

Materialet till den fasta stödfasen, M, som används i separationsmatrisen i den föreliggande uppfinningen, kan vara av något lämpligt material och kan vara en porös eller en icke-porös stödfas. Företrädesvis är materialet till den fasta stödfasen en stödfaspartikel eller -pärla. I en utföringsform utgörs stödfasen av ett tvàrbundet kolhydratmaterial, så som agaros, agar, cellulosa, dextran, kitosan, konjac, karragenan, gellan, alginat etc. Stödfasen kan enkelt framställas enligt 10 15 20 25 30 35 529 145 14 V standardmetpder, så som en omvänd suspensionsgelering (S Hjertén: Biochim. Biophys. Acta., (1964), Z2(2), 393'393)- Alternativt är stödfasen en kommersiellt tillgänglig produkt, så som Sephadexnleller Sepharosem FF (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sverige). I en utföringsform av den föreliggande matrisen är således stödfasen en tvârbunden_polysackarid. I en specifik utföringsform är polysackariden agaros. Sådana kolhydratmaterial varpå hydroxylgrupper är fastsatta kan användas i metoden enligt uppfinningen. Alternativt kan den fasta stödfasen derivatiseras enligt metoder som kommer att vara väl kända för fackmannen.

I en alternativ utföringsform utgörs stödfas till den föreliggande separationsmatrisen av tvârbundna syntetiska polymerer, så som styren eller styrenderivat, divinylbensen, akrylamider, akrylatestrar, metakrylatestrar, vinylestrar, vinylamider, eller kan vara ett oorganiskt material så som glas eller silika. Företràdesvis väljs polymeren från gruppen bestående av polystyren, polypropylen, polyvinyltoluen, polyakrylamid, polyakrylonitril och polykarbonat. Stödfaser av sådana polymerer framställs enkelt enligt standardmetoder, se t.ex. ”Styren based polymer supports developed by suspension polymerization” (1988), 1Q(9), 70-75). Alternativt kan en kommersiellt tillgänglig (Arshady, R., Chimica e L'Industria, produkt så som Source” (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sverige) ytmodifieras enligt uppfinningen. Emellertid modifieras, i denna utföringsform, företrädesvis stödfasens yta för att öka dess hydrofilicitet, vanligen genom att överföra merparten av de exponerade resterande dubbelbindningarna till hydroxylgrupper.

I ytterligare utföringsformer kan den fasta stödfasen till exempel vara ett membran, ett filter, ett eller flera chips, ytor, kapillärer etc.

De fasta stödfaserna som innehåller hydroxylgrupper kan derivatiseras med epiklorhydrin och liknande eller bis- eller trisepoxidinnehàllande derivat för att generera i _ enegsiuaktsiyeigeiiets.etëdieserhisirilkei; enligt metoden enligt denna __ 10 15 20 25 30 35 529 145 15 föreliggande uppfinningen, utförs genom att använda ett tvàfassystem i närvaro av en fasöverföringskatalysator. I ett karaktäristiskt förfarande förtvättas ett stödfasmaterial, så som en gel, i en andel av det lösningsmedel i vilket aktiveringssteget ska utföras. En sörja av gelen i det organiska lösningsmedlet bringas sedan i kontakt med en NaOH innehållande fasöverföringskatalysatorn_ Lämpliga vattenlösning av 50 % fasöverföringskatalysatorer kan väljas från gruppen bestående av kvartära ammoniumsalter, till exempel ett tetra Cl-Cs alkylammoniumsalt, fosfoniumsalter och kronetrar, till exempel, dicyklohexano-18-kron-6,1,4,7,10,l3- pentaoxocyklopentadekan, eller l,4,7,10,l3,16- hexacyklooktadekan. Efter nägra få minuter sätts det epoxiinnehållande aktiveringsreagenset till blandningen som lämnas att reagera vid den önskade temperaturen under en given tid. Den epoxiaktiverade sörjan erhålls efter tvätt, lämpligen med vatten, etanol och slutligen med vatten. I speciellt föredragna utföringsformer utförs fasöverföringsreaktionen i toluen i närvaro av tetrabutylammoniumvätesulfat vid 25 °C i 4 timmar. Förfarandet kan med fördel upprepas för att generera en högre aktiveringsgrad hos stödfasen.

Den aktiverade stödfasen kan derivatiseras vidare med en nukleofil ligand under konventionella betingelser, se till exempel PCT-ansökan nr. WO 2003/24588 (Maloisel, J-L och Thevenin, N.). Som är väl känt kan nukleofila grupper så som tiol eller amin enkelt reageras med en epoximodifierad stödfas, medan svagare nukleofiler så som hydroxi och alkoxi reagerar långsammare. Se till exempel, Edwards, J.O och Pearson, R.G., J. Amer.Chem.Soc., (1962), §í, 16.

Genom att använda ett sådant tväfasigt reaktionssystem är det möjligt att undgå nackdelar i de konventionella metoderna vilka utförs direkt i ett vattenhaltigt medium under basiska betingelser, utan fasöverföringsreagens, eftersom, på grund av tävlande partiell hydrolys, de resulterar i låga 10 15 20 25 30 35 529 145 16 ___aktiveringsnivàer vilket endast gär att komma%undan_g§§9@"§E§H använda ett stort överskott av aktiveringsreagens.

Metoden enligt uppfinningen kan också användas för den direkta immobiliseringen av en epoxigruppinnehàllande ligand, med förbehållet att det organiska reaktionslösningsmedlet förmànligen kan väljas sä att det passar lösligheten hos liganden som ska immobiliseras. Således är den föreliggande metoden synnerligen användbar för ligander med dàlig löslighet i vatten, men med god löslighet i hydrofoba organiska lösningsmedel och där en hög grad av ligandsubstitution är önskvärd i den slutliga fasta stödfasen.

I en andra aspekt tillhandahåller uppfinningen en stödfaspartikel eller -pärla framställd enligt metoderna beskrivna hàri.

Uppfinningen illustreras vidare genom referens till de följande exemplen.

Exempel 1. Aktivering av Sepharosem med epiklorhydrin 1.1 Sepharosem 6 FF (50 ml) tvättades på ett glasfilter med etanol (4 x 50 ml) och toluen (4 x 50 ml). Toluen (20 ml) tillsattes och den bildade sörjan sattes till en 50% vattenlösning av NaOH (50 ml) innehållande 2 g tetrabutylammoniumvätesulfat. Efter 2 minuter tillsattes epiklorhydrin (25 ml) och blandningen rördes försiktigt vid 25 °C i 3 timmar. Efter tvätt med kallt vatten (3 x 50 ml), etanol (3 x 50 ml) och vatten (3 x 50 ml), uppskattades gelens epoxideringsnivà (IA) genom titrering efter koppling av merkaptopropionsyra, till att vara åtminstone 257 pmol epoxid/ml gel. 1.2 Upprepad aktivering: Epoxiaktiverad Sepharosem 6 FF erhällen så som beskrivs i Exempel 1.1 tvättades på ett 529 145 17 ., _,__,__3l꧚i.l§§š med 32611101 (få X 50 mlLPCh *20111611 (4 i? 50 El)- Toluen (20 ml) tillsattes och den bildade sörjan sattes till en 50 % vattenlösning av NaOH (50 ml) innehållande 2 g tetrabutylammoniumvätesulfat. Efter 2 minuter tillsattes s epiklorhydrin (25 ml) och blandningen rördes försiktigt vid 25 °C i 3 timmar. Efter tvätt med kallt vatten (3 x 50 ml), etanol (3 x 50 ml) och vatten (3 x 50 ml) uppskattades gelens epoxideringsnivà (lB) genom titrering efter koppling av trietylamin, till att vara åtminstone 305 pmol epoxid/ml gel. 10 2. Aktivering av Sepharosem med bispropoxibutan Sepharosem 6 FF (50 ml) tvättades på ett glasfilter med etanol (4 x 50 ml) och toluen (4 x 50 ml). Toluen (20 ml) tillsattes is och den bildade sörjan sattes till en 50 % vattenlösning av NaOH (50 ml) innehållande 2 g tetrabutylammoniumvåtesulfat.

Efter 2 minuter tillsattes bispropoxibutan (25 ml) och blandningen rördes försiktigt vid 25 °C i 17 timmar. Efter tvätt med kallt vatten (3 x 50 ml), etanol (3 x 50 ml) och 20 vatten (3 x 50 ml) uppskattades gelens epoxideringsnivà (lC) genom titrering efter koppling av trietylamin, till att vara åtminstone 149 umol epoxid/ml gel. 3. Aktivering av Sepharosem med triglycidylglycerol »w o OfOQï/CK/AO ßño Owfowwo 25 OH --_---:--> Sepharosem 6 FF (50 ml) tvättades på ett glasfilter med etanol (4 x 50 ml) och toluen (4 x 50 ml). Toluen (20 ml) tillsattes ao och den bildade sörjan sattes till en 50 % vattenlösning av NaOH (50 ml) innehållande 2 g tetrabutylammoniumvätesulfat.

Efter 2 minuter tillsattes triglycidylglycerol (13 ml) och blandningen rördes försiktigt vid 25 °C i 3 timmar. Efter tvätt med kallt vatten (3 x 50 ml), etanol (3 x 50 ml) och vatten (3 10 15 20 25 30 529 145 18 ._ 25-59 .._f_r1_l_,_>__ uszp§šsatte<í@§_._sz_ titrering efter koppling av trietylamin, till att vara åtminstone 78 pmol epoxid/ml gel. 4. Immobilisering av en ligand på den epoxiaktiverade stödfasen I. o/\(\o/ï/\ \ on OH 4.1 Immobilisering av trimetylamin Epoxiaktiverad Sepharosem (frán exempel 1B) (6 ml) blandades med en 65 % vattenlösning av trimetylammoniumklorid (4 ml). pH Hos reaktionsblandningen justerades till 11,8 med användning av 50 % vattenlösning av NaOH och blandningen rördes vid 50 °C över natt. Gelen tvättades med vatten (8 x 6 ml). Titrering av gelen gav en jonkapacitet på 305 pmol amin/ml gel. 4.2 Immobilisering av merkaptopropionsyra En 50 % vattenlösning av merkaptopropionsyra (10 ml) och 50 % vattenlösning av NaOH (10 ml) sattes till epoxiaktiverad Sepharose” (fràn exempel 1B) (6 ml). Blandningen rördes vid 50 °C över natt. Gelen tvättades med vatten (8 x 6 ml). av gelen gav en jonkapacitet pà 206 pmol syra/ml gel.

Titrering 5. Immobilisering av en epoxidinnehàllande ligand pà en fast stödfas: 5.1 Immobilisering av fenylglycidyleter pá Sepharosem 6 FF 10 529 145 19 OH Sepharosem 6 FF (50 ml) tvättades pà ett glasfilter med etanol (4 x 50 ml) och toluen (4 x 50 ml). Toluen (20 ml) tillsattes och den bildade sörjan sattes till en 50% vattenlösning av NaOH (50 ml) innehållande 1 g tetrabutylammoniumvätesulfat.

Efter 2 minuter tillsattes fenylglycidyleter (25 ml) och blandningen rördes försiktigt vid 25 °C i 6 timmar. Efter tvätt med kallt vatten (5 x 50 ml), etanol (5 x 50 ml) och vatten (5 x 50 ml) bestämdes substitutionsgraden av fenylgrupper med HR- MAS NMR till att vara 156 pmol fenyl/ml gel.

Claims (1)

1. 0 1.5 20 25 30 529 145 20 l. En metod för att framställa en separationsmatris, sagda metod innefattar att tillsammans reagera: a) en matris innefattande formeln: M--A--H vari: M är en fast stödfas; A är en atom eller group vald fràn -O-, -S- och -NR1-, där R1 väljs fràn H och Cl - C4 alkyl; och b) en förening med formeln: vari: X väljs från kloro, bromo, jodo, Cl - Cl alkoxi, mesyl, tosyl och gruppen: O /\/W we-al vari R2 väljs fràn H, Cl - C4 alkyl, -COOR3 och aryl; där R3 väljs från H och Cl - C4 alkyl; P är H, eller är en ligand vald fràn Cl - Cm alkyl, Cl - Ca alkenyl, Cl - CW karboxylsyraester, Cl - Cm alkoxi, Cl - Cw alkenyloxi, Cl - Cm karboxialkyl, substituerad amino, kvartär ammonium, Cl - Cm monoeter eller polyeter innehållande från 1 till 6 syreatomer, aryl, aryloxi, heteroaryl och aralkyloxi; eller P väljs fràn gruppen: O o / \ -cH-CHZ --L-HC--CH2 och , där L är en sammanlänkande grupp och år en grenad eller ogrenad kedja av kovalent bundna atomer innehållande l - 20 linjära atomer valda från gruppen bestående av kol-, syre- och svavelatomer; och r är 0 eller 1; kännetecknad av att sagda metod utförs i närvaro av en fasöverföringskatalysator_ 2. Metoden enligt patentkrav 1, vari: X väljs fràn kloro, bromo, jodo och gruppen: 10 15 20 25 30 529 145 2l O .W 7rX:>R¿ vari R2 väljs från H, -COOR3 och aryl; där R3 väljs från H och Cl " G4 alkyl; P är en ligand vald från Cl - Cm alkyl, Cl - Cm alkenyl, C1 “ Cm karboxylsyraester, Cl - Cw alkoxi, Cl - Cm alkenyloxi, C1 - Cm karboxialkyl, substituerad amino, kvartär ammonium, Cl - CW ' monoeter eller polyeter innehållande från l till 6 syreatomer, aryl, aryloxi, heteroaryl och aralkyloxi; och r är O eller 1. 3. Metoden enligt patentkrav 1 eller patentkrav 2, vari X väljs från kloro, bromo och jodo; P är aryl eller heteroaryl och r är 1. 4. Metoden enligt patentkrav 1 eller patentkrav 2, vari X är gruppen: O /\/W vari R2 väljs från H och -COOR3, där R3 väljs från H och Cl - C4 alkyl; P väljs från Cl - Cl alkyl eventuellt substituerad med fluoro, aryl eventuellt substituerad med fluoro och etenyl; och r är O. 5. Metoden enligt patentkrav 1 eller patentkrav 2, vari X är gruppen: H /°\ / Hg?--C\\ . P väljs frän Cl - CN alkyl, Cl - Cm alkenyl, Cl - Cm alkoxi, Cl - Cw alkenyloxi, tri-Cl - Cl alkylammonium, aryl, aryloxi, heteroaryl och aralkyloxi; och r är 1. 6. Metoden enligt patentkrav 5, vari P väljs från fenoxi, bensyloxi, propoxi, prop-2-enyloxi, trimetylammonium, butyloxi, hexyloxi och oktyloxi. 10 15 20 __\Metod_e__11_,enliqt__ Datentkrêyili . _ , 529 145 22 X väljs från kloro, bromo, jodo och gruppen: vari R2 väljs från H, -COOR3 och aryl; där R3 väljs från H OCh C1 - C4 alkyl; och P väljs från gruppen: O O / \ _L-Hc-cH2 OCh I där L är definierad tidigare häri och r är 0 eller 1. 8. Metoden enligt patentkrav 7, vari X är gruppen: O / \ f* H¿>--C\\ där R” är väte; P är gruppen: /o\ -L-Hc-craz _ I L är definierad så som i patentkrav 1; och r är 0 eller 1. 9. Metoden enligt patentkrav 7, vari: X väljs från kloro, bromo och jodo; P är gruppen: / \ --cH--c|-|2 och r är 1. 10. Metoden enligt patentkrav 7 eller patentkrav 8, vari L väljs fràn: -cH2-o--(c|-|2)n-o-cH2- n I -CHZ-o-CHZ CHZ-o-CHZ- ; och 10 15 20 25 30 529 145 . 23 --CH2-O-CH2-CH-CH2_O-CH2- där n är ett heltal från 1 till 6 och m är ett heltal från 1 till 4. 11. Metoden enligt patentkrav 7 eller patentkrav 8, vari L är gruppen: -CH2-O-(CH2)n-O-CH2- och n är 2, 3 eller 4. 12. Metoden enligt något av patentkrav 1 till 11, vari A är ~ O-. 13. Metoden enligt något av patentkrav 1 till 12, vari M är en stödfaspartikel eller -pärla. 14. Metoden enligt något av patentkrav 1 till 13, vari M är ett poröst fast ämne. 15. Metoden enligt något av patentkrav 1 till 13, vari M är ett icke poröst fast ämne. 16. Metoden enligt nàgot av patentkrav 1 till 15, vari M innefattar ett tvärbundet kolhydratmaterial. 17. Metoden enligt patentkrav 16, vari M väljs från gruppen bestående av agaros, agar, cellulosa, dextran, chitosan, konjac, karragenan, gellan och alginat. 18. Metoden enligt patentkrav 17, vari M är agaros. 19. Metoden enligt nàgot av patentkrav 1 till 15, vari M är en syntetisk polymer. 10 15 20 529 145 _ 24 _ _ 2.9 ,,,____1Y_1_<ët_°.,<å§:_1_ .sënl_..i_ai;__nëi=_êzl.tls_r_ay ___1._9,__>__Y<¿:i_,M _.l==_i.,lëa§__š:ânla:upp§n__ __ _ i bestående av polystyren, polypropylen, polyvinyltoluen, polyakrylamid, polyakrylonitril, polykarbonat. 21. Metoden enligt något av patentkrav 1 till 13, vari M väljs från glas eller silika. 22. Metoden enligt något av patentkrav 1 till 21, vari fasöverföringskatalysatorn väljs från gruppen bestående av kvartära ammoniumsalter, fosfoniumsalter och kronetrar. 23. Metoden enligt något av patentkrav 1 till 21, vari fasöverföringskatalysatorn är ett tetra C; - Ca alkylammoniumsalt. 24. Metoden enligt patentkrav 23, vari fasöverföringskatalysatorn är tetrabutylammoniumvätesulfat. 25. Metoden enligt något av patentkrav 1 till 24, vari reaktionen utförs under basiska betingelser i ett pH-område mellan 9 och 13. 26. En stödfaspartikel eller -pärla framställd enligt metoden i patentkrav

1.