JP2006523220A - マルチモードアニオン交換リガンドの製造法 - Google Patents

Abstract

本発明は、マルチモードアニオン交換リガンドの製造方法に関し、この方法は、アミン、カルボニル及びチオールを含む環状の３官能性骨格を準備する段階と、アニオン交換基を提供し及び／又はアミンを保護するように骨格のアミンを適宜誘導体化する段階と及び残基Ｒに結合したアミンを含む試薬の添加によって、誘導体が開環するようにアミノ分解を行い、開環した骨格のカルボニル炭素にアミンを付加する段階とを含む。骨格は、ホモシステインチオラクトンであることが有利である。一実施形態では、この方法は、クロマトグラフィー媒体などの分離媒体が得られるように、開環した骨格をベースマトリックスに固定化する追加の段階を含む。

Description

本発明は、マルチモードアニオン交換リガンドの製造法、並びにベースマトリックスへのかかるリガンドの固定化による分離媒体の製造法に関する。

クロマトグラフィーという用語は、密接に関連した一群の分離法を包含する。他の大半の理化学的分離法と区別されるクロマトグラフィーの特徴は、非混和性の２つの相を接触させ、一方の相を固定相とし、他方を移動相とすることである。移動相に導入された試料混合物は、移動相によって系内を運搬される際に固定相と移動相の間で何度も一連の相互作用（分配）を受ける。相互作用は試料中の成分の理化学的性質の差異を利用する。こうした差異が、固定相を収容したカラム内を移動する移動相の影響下での各成分の移動速度を支配する。分離された成分は、固定相との相互作用の低いものから高いものへと順次流出する。妨害の最も少ない成分が最初に溶出し、最も強く保持された物質が最後に溶出する。分離は、試料成分がカラムから溶出する際に、ある成分の流出速度が隣接する溶質のゾーンと重ならないように十分に遅くなった場合に達成される。

国際公開第９７／２９８２５号（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）には、正荷電アミン窒素から炭素２〜３個分離れたアミノ窒素と酸素の関与する水素結合と荷電による相互作用をもたらす混成モードのアニオン交換体によるクロマトグラフィーが開示されている。このクロマトグラフィーは、結合物質の溶出に比較的高いイオン強度を要するアニオン交換体をこの種のリガンドで得ることができるという知見に基づく。

最近、高塩濃度リガンドと呼ばれるある種のリガンドが開示された。例えば、国際公開第０１／３８２２７号（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））参照。これらのリガンドは混成モードのアニオン交換リガンドとして機能し、しかも高い塩濃度に耐え得るのでサンプルを実質的に希釈する必要性がないため、タンパク質精製などの多くの工業的用途で多大な関心がもたれている。高塩濃度リガンドは、従前の方法に比して必要とされるサンプルの全体積が少なく、かかる用途で必要な装置の総コスト及び作業労力が低減するので、生物工学的な分離での使用に好適である。

混成モードのアニオン交換リガンドを分離に用いるとコスト及び労力が低減されるが、従前の分離法には幾つかの短所があり、その実用性が損なわれている。ほとんどの場合、混成モードのアニオン交換体リガンドの固定化は、リガンドのアミン基によるエポキシド誘導体化ゲルの開環に基づく。この種の求核置換反応は、アミン基のｐＫａだけでなく、その求核性及び立体障害因子にも大きく依存するので、適用できる汎用法がなく、固定化の最適化を個々の事例毎に行わなければならない。さらに、求核性に劣るアミン基の場合、高価なリガンドが大過剰（２当量を超える）必要とされる。もう一つの短所は、反応性の基本的な相違のため、例えば第二級アミンと第三級アミンとの固定化条件の大きな相違を最適化しなければならないことである。

上述の国際公開第０１／３８２２７号のもう一つの短所は、アミン官能基を介して固定化を行うので、第一級アミン基を有する媒体を直接得ることができないことである。

第一級アミン基を得るため、国際公開第０１／３８２７７号では保護基が用いられているが、合成のための時間とコストが増し、また不十分な脱保護のため不均質な媒体を生じるおそれも増す。

媒体で第一級アミンを得るための別の解決策が、ポリアミンの使用で実証される。しかし、かかるポリアミンは複数の部位で結合する可能性があり、同じく均質性に劣る媒体が得られる。

このように、従前提案された方法で、ライブラリの作成又はパラレルフォーマットでの使用に十分な汎用性と信頼性をもつものはない。

混成モードのカチオン交換リガンドの製造に関して知られた同様の問題に対する具体的解決策が、ＰＣＴ／ＳＥ０２／０１６５０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（スウェーデン、ウプサラ））で示唆されているが、この出願は、本願の出願時点では公開されていなかったものである。この国際出願には、三官能性骨格、好ましくはホモシステインチオラクトンが開示されており、カチオン交換リガンドの製造のための出発物質として用いられる。この方法では、多様性に富む様々なリガンドのライブラリーを作成できる。

現在、上述の方法の機能的代替法がないので、分離法に用いるための混成モードのアニオン交換リガンドの改良製造法法に対するニーズが当技術分野で存在する。

最後に、Ｆｅｉｓｔｏｙ及びＤａｎｎａ（“Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ： Ａ Ｎｅｗ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ Ｍｅｒｃｕｒａｔｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”， Ｐａｔｒｉｃｉａ Ｌ． Ｆｅｉｓｔ ａｎｄ Ｋａｔｈｌｅｅｎ Ｊ． Ｄａｎｎａ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０（１５）， ｐ．４２４３−４２４６）は、アミノエチルセルロースをＮ−アセチルホモシステインチオラクトンと混合することを含むスルフヒドリルセルロースの製造法を開示している。
国際公開第９７／２９８２５号パンフレット 国際公開第０１／３８２２７号パンフレット 国際公開第２００３／０２４５８８号パンフレット Ｐ．Ｌ．Ｆｅｉｓｔ ａｎｄ Ｋ．Ｊ．Ｄａｎｎａ，"Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ： Ａ Ｎｅｗ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ Ｍｅｒｃｕｒａｔｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ"， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０（１５），ｐ．４２４３−４２４６

本発明の一つの目的は、マルチモードアニオン交換リガンドの製造法であって、簡単で汎用性のある堅調な方法を提供することである。

本発明の別の目的は、ベースマトリックス容易に固定化できるマルチモードアニオン交換リガンドを提供することである。

したがって、本発明の別の目的は、マルチモードアニオン交換リガンドを含む分離媒体の製造法を提供することである。

本発明の別の目的は、新しい選択性や溶出プロファイルのような新しいクロマトグラフィー特性を示す分離媒体の製造法を提供することである。

本発明の別の目的は、大過剰のリガンドによらずに、信頼性のある制御された方法で固定化マルチモードアニオン交換体リガンドを製造する方法を提供することである。

本発明の別の目的は、同一骨格に基づく多種多様なマルチモードアニオン交換リガンドのライブラリーの作成法であって、特定の用途に向けたリガンドの至適化に使用できる方法を提供することである。

本発明の以上の目的は、上記請求項のいずれか１以上によって達成できる。本発明のその他の目的、利点及び実施形態は、以下の詳細な説明から明らかであろう。

第一の態様では、本発明は、１以上のマルチモードアニオン交換リガンドの製造方法であって、
（ａ）一般式（Ｉ）で定義される１以上の骨格を準備する段階

（式中、Ａ、Ｂ及びＸは互いに独立に炭素原子又はヘテロ原子、例えば酸素、硫黄、窒素及び／又はシリカであり、ｍは０〜４の整数、例えば１〜３、好ましくは１又は２であり、官能基Ｎは窒素であって、いずれかのＸを置換或いはＡ、Ｂ及びＸのいずれかに結合している。）、
（ｂ）任意段階として、上記骨格の環構造を維持しながら、上記骨格の窒素を誘導体化してアニオン交換基を導入及び／又はアミンを保護する段階、及び
（ｃ）残基Ｒに結合したアミンを含む試薬の添加によるアミノ分解によって誘導体の環構造を開環させて、開環した骨格のカルボニル炭素に上記アミンを付加させる段階
を含んでなる方法である。

定義
「分離媒体」という用語は、本明細書では、例えばクロマトグラフィーカラムの充填材として有用な材料、具体的には、ベースマトリックスに１以上のリガンドが結合したものからなる材料に用いる。ベースマトリックスは担体として作用し、リガンドはクロマトグラフィーで目標物質と相互作用する官能基を与える。

「スペーサー」という用語は、ベースマトリックスからリガンドを離隔するための化学物質に用いる。

「リガンド」という用語は、本明細書では、目標物質に結合し得る化学物質をいう。かかる目標物質は、クロマトグラフィーでの単離又は除去が望まれる化合物でもよいし、或いは分析の目標物質でもよい。

「正電荷を有する」及び「正荷電」という用語は、物質が１以上の正電荷及び／又は正味の正電荷を有することを意味する。

「混成モードのアニオン交換リガンド」及び「マルチモードアニオン交換リガンド」という用語は、結合すべき物質と相互作用する２以上の異なる（ただし、協働的な）部位を与え得るリガンドをいう。これらの部位の一方は、リガンドと目標物質を引きつけ合う電荷−電荷相互作用を与える。第二の部位は、通例、電子受容体−供与体相互作用及び／或いは疎水性及び／又は親水性相互作用を与える。電子供与体−受容体相互作用としては、水素結合、π−π、電荷移動、双極子−双極子、誘発双極子などの相互作用が挙げられる。

「高塩濃度」リガンドという用語は、同一条件下で操作される参照イオン交換体に比して高濃度の塩（例えば０．３Ｍ ＮａＣｌ）の存在下でタンパク質と結合し得るリガンドをいう。これは、以下の実施例に記載したフロント分析法を用いて決定できる。

「電子供与体−受容体相互作用」は、非共有電子対を有する電気陰性原子が供与体として作用し、この供与体の電子対の受容体として作用する電子不足原子に結合することを意味する（例えば、Ｋａｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｔｏ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９７３）４２頁参照）。典型的な受容体原子／基は、金属イオン、シアノ、ニトロの窒素などの電子不足原子又は基であり、ヒドロキシ及びカルボキシの−ＯＨ、アミド及びアミンの−ＮＨ−、チオールのＨＳ−などの、電気陰性原子と結合した水素も挙げられる。

「アニオン交換体」とは、除去すべき物質が負電荷を有し、アニオン交換体が正に荷電している（＝アニオン交換条件）ことをいう。

最も好適な実施形態では、式（Ｉ）のＡ、Ｂ及びＸは炭素原子であり、ｍは１である。特定の実施形態では、骨格はホモシステインチオラクトンである。ただし、当業者には自明であろうが、ｍは５〜５００のように４を超える整数でもよく、例えば、リガンドの所望サイズに応じて１０〜２５０、特に５０〜１００とし得る。

本発明の方法の一実施形態では、アミンの誘導体化は、アシル化又はスルホニル化、又はアルキル化とアシル化、又はアルキル化とスルホニル化によって実施され、いかなる荷電基も生成せずに二次相互作用を生じる。この実施形態では、荷電基は段階（ｃ）におけるポリアミン基でのアミノ分解によって導入される。

別の実施形態では、アニオン交換基は段階（ｂ）及び（ｃ）で導入される。

本発明の方法の一実施形態では、段階（ｂ）の誘導体化はアルキル化、還元アミノ化その他所望のアニオン交換基及び／又は保護基を与えるのに適した反応である。例えば、ある具体的実施形態では、段階（ｂ）は、第二級、第三級又は第四級アミンを与えるアルキル化である。この基を選択すれば弱アニオン交換リガンド又は強アニオン交換リガンドを得ることができる。

例えば、強アニオン交換リガンドを得るには、骨格のアミン基を完全にアルキル化して、Ｑ基とも呼ばれる第四級アミンを生成させる。かかる第四級リガンドは、ヌクレオチド及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えばアンチセンス誘導体）の単離に好適に使用される。使用するアルキル化剤は同一でもよいし、同じ窒素原子に異なる基を与えるため異なるものでよい。第三級アミンでも、同様の方法が用いられる。

最終的マルチモードリガンドで第二級及び第一級アミンが望まれる実施形態では、重合を防ぐため好ましくは保護基が用いられる。かかる保護法は当業者に周知であり、常法で簡単に実施できる。別の実施形態では、段階（ｃ）のアミノ分解に過剰のアミンを使用することによって保護段階は不要となる。本発明で製造される第一級アミン官能基を有するリガンドは、高イオン強度の環境下での目標化合物の単離、例えば発酵培地からのタンパク質や核酸などの生体分子の分離に好適に使用される。

一実施形態では、段階（ｂ）で、窒素を誘導体化してＣ（Ｏ）−Ｒ残基（式中のＲは以下で定義する。）を有する基でアミンを保護する。次いでアミノ分解によって環構造を開環すると、Ｃ（Ｏ）基がＣＨ_２に還元され、以下の実施例の「合成経路５」に示す種類のアニオン交換体が得られる。

本発明の方法の一実施形態では、段階（ｃ）のアミノ分解を起こすために添加される試薬は残基Ｒに結合したアミンを含むものであり、Ｒは線状、枝分れ、環状の飽和、不飽和又は芳香族炭化水素基であり、好ましくは炭素原子数が約１〜２０、例えば１〜１０のものである。

具体的には、かかる炭化水素基はヒドロキシ基、ハロゲン、アルコキシ及びアリールオキシ、それらの対応チオ類似体、及び／又はアミノ基を有していてもよい。用途によっては、炭素鎖の１以上の部位にアミノ窒素、エーテル酸素、チオエーテル硫黄などが介在していてもよい。アミドやケトンのようにカルボニル基が存在してもよいし、加水分解に対して同等の安定性を有するその他の基が存在していてもよい。酸素、硫黄及び窒素から選択される多くとも１個の原子が好ましくは同一のｓｐ^３混成炭素原子に結合する。さらに、Ｒは、上述の通り、目標物質がアニオン交換体に結合できるようにする１以上の電子供与体又は受容体原子又は基を与える。Ｒはさらに、最終的リガンドが全体として正に荷電してアニオン交換体として機能することができる全間隔枠を示す限り、荷電基を含んでいてもよい。好適な実施形態ではポリアミンが望ましく、Ｒは１以上のアミンを与える基である。

最終的な分離媒体はイオン交換モードで用いられるので、残基Ｒは所望のマルチモード特性の導入に用いられる。当業者には自明であろうが、最終的なリガンドでは、Ｒは結合に作用する２以上の部分からなるものであればよく、これらの部分の間には適宜スペーサが介在していてもよい。このレベルでは、多種多様なアミンでの開環によってマルチモードアニオン交換リガンドのライブラリを生成することができ、ベースマトリックスへの固定化の準備が整う。

本発明の方法の一実施形態では、誘導体化骨格を与えるため段階（ａ）及び（ｂ）を前もって実施しておく。

好適な実施形態では、本発明の方法は、こうして得られた開環生成物をそのチオール基を介して、反応性基を含むベースマトリックスに固定化する段階（ｄ）をさらに含むが、反応性基は適宜スペーサーを介してベースマトリックスに結合していてもよい。

したがって、特定の実施形態では、本発明の方法はベースマトリックスの反応性基を臭素化する段階をさらに含み、反応性基は炭素−炭素二重結合である（固定化法の概説に関しては、例えば、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａ．Ｋｒｉｓｈｎａ Ｍａｌｌｉａ ａｎｄ Ｐａｕｌ Ｋ．Ｓｍｉｔｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＩＮＣ，１９９２を参照されたい。）。

別の実施形態では、本発明の方法は、ラジカル反応に適した条件下でベースマトリックスの反応性基を活性化する段階をさらに含み、反応性基は炭素−炭素二重結合である。

第二の態様では、本発明は、マルチモードアニオン交換リガンドの製造における出発物質としてのホモシステインチオラクトンの使用に関する。ホモシステインチオラクトンは市販されており（例えばＡｌｄｒｉｃｈ社のカタログ番号Ｈ１，５８０−２ｔ）、ＣＡＳ番号は６０３８−１９−３である。

第三の態様では、本発明は、マルチモードアニオン交換リガンド又はベースマトリックスに複数のマルチモードアニオン交換リガンドが結合した分離媒体であり、当該リガンド又は媒体が上述の方法で製造したものである。分離媒体をクロマトグラフィーに使用する場合、ベースマトリックスは一般にゲルのようなビーズの形態或いはモノリシックな形態である。別の実施形態では、ベースマトリックスは、例えばメンブラン、フィルター、１以上のチップ、表面、キャピラリーなどであってもよい。

一実施形態では、ベースマトリックスは、天然のポリマーから好ましくは多孔質ビーズの形に形成されるが、これは、逆懸濁ゲル化（Ｓ Ｈｊｅｒｔｅｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７９（２），３９３−３９８（１９６４）又は回転ディスク法（例えば、国際公開第８８／０７４１４号（Ｐｒｏｍｅｔｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ）参照））などの常法で当業者が容易に実施し得る。或いは、天然ポリマービーズは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ）などの供給元から市販されている。かかる有用な天然高分子ビーズの商品名としては、例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）やＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）として知られるものがある。

別の実施形態では、ベースマトリックスは、スチレン又はスチレン誘導体、ジビニルベンゼン、アクリルアミド、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、ビニルエステル、ビニルアミドなどの架橋合成ポリマーからなる合成ポリマーから、好ましくは多孔質ビーズの形に作製される。かかるポリマーは常法で容易に合成できる。例えば、“Ｓｔｙｒｅｎｅ ｂａｓｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”（Ｒ Ａｒｓｈａｄｙ：Ｃｈｉｍｉｃａ ｅ Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ ７０（９），７０−７５（１９８８））を参照されたい。或いは、Ｓｏｕｒｃｅ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））などの市販の製品を、本発明によって表面改質することができる。

本発明の第四の態様は、上記定義したような、一般式（Ｉ）によって定義された骨格と、アルキル化剤などの任意選択の誘導体化剤と、上記定義したような残基Ｒに結合した１種又は複数のアミンとを、マルチモードアニオン交換リガンドを製造するための取扱説明面と共に含むキットである。特定の実施形態では、本発明のキットはベースマトリックスをさらに含み、取扱説明書面は、複数のマルチモードアニオン交換リガンドを含んだ分離媒体を製造するためのものである。ベースマトリックスは、上記のいずれかであればよい。

好適な実施形態では、本発明のキットは、高塩濃度リガンドを生成するためのものである。

別の態様では、本発明は、アニオンクロマトグラフィー用クロマトグラフィーカラムに関し、このカラムには、上述の分離媒体が充填されている。カラムは、任意の所望のサイズのものでよく、例えば大量生産や実験室に合わせたもの又は分析を行うのに適切なサイズにすることができる。カラムは、分離媒体及び適宜適切な液体と組合せることもでき、それによって、本発明に包含される第二の種類のキットが提供される。

さらに本発明は、液体から目標物質を分離する方法であって、上記で定義した分離媒体を準備し、媒体を液体に接触させてその表面に目標物質を吸着させることを含む方法を包含する。本発明は、好ましくはクロマトグラフィー法であるが、別の実施形態では、容器内の媒体に液体を適切な時間だけ接触させる、回分法でよい。好適な実施形態では、本発明の方法は、多次元クロマトグラフィーである。本発明の方法は、生体分子など、本明細書に記述されるリガンドへの吸着が可能な、任意の目標分子の単離に有用である。この文脈において、生体分子は、例えばタンパク質、ペプチド、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ウイルス、細胞などである。特定の実施形態では、本発明の方法は、液体からヌクレオチドを分離する方法である。別の実施形態では、本発明の方法は、液体からアンチセンスオリゴヌクレオチドを分離する方法である。上記論じた目標物質を分離するためのクロマトグラフィーの一般原則は、当技術分野で周知であり、当業者なら、本発明の方法を使用する際に必要なパラメータを容易に用いることができる。

別の実施形態では、本発明の方法は、液体中の目標物質を同定するためのものであり、この方法は、分析法に適している。しかし、当業者に容易に理解されるように、本発明は、汚染タンパク質や任意のその他の望ましくない生体分子など、液体から１種又は複数の成分を除去することが望まれる場合に等しく有用である。

図面の詳細な説明
図１は、例示的な骨格としてホモシステインチオラクトンを使用して、本発明でマルチモードアニオン交換リガンドのライブラリを生成するための、基本的方法の概略図（スキーム２）である。使用した例示的な骨格は、ホモシステインチオラクトンであり、３種の異なる誘導体化した骨格が示されている。必要なら、保護段階を、誘導体化の前に含めることができる。Ｒ基に結合したアミンからなる化合物を使用して、環構造を開く段階（ｃ）で、図１では３種の異なる例示的なリガンド構造が得られ、その第一の構造は、弱アニオン交換リガンドであり、第二の構造は、強アニオン交換リガンド、即ちその電荷がすべてのｐＨ値で維持されるリガンドであり、第三の構造は、弱アニオン交換リガンドである。

図２は、本発明で製造することができるマルチモードアニオン交換リガンドの、代替の方法の概略図（スキーム３）である。この場合も、使用した例示的な骨格はホモシステインチオラクトンである。図２に表されるように、弱及び強アニオン交換リガンドを製造することができる。

図３は、本発明で製造することができる、例示的な正荷電基及びポリカチオンリガンドを示す（スキーム４）。この場合も、弱及び強アニオン交換リガンドを本発明で製造できることが示されている。

以下の実施例は、例示を目的としたものにすぎず、特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書のいずれかの箇所で引用した文献の記載内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。

アニオン交換体クロマトグラフィー用の新しい媒体を生成するために、Ｄ，Ｌ−ホモシステインチオラクトンを使用する手順
アニオン交換体リガンドの製造は、例えば、ホモシステインチオラクトンの使用を介して実現することができ、これはいくつかの戦略的合成経路を介して考え出すことができるものである。リガンドのアニオン基は、直接開環誘導体化段階（合成経路１）又は保護、脱保護方法（合成経路２）を介して、ホモシステインチオラクトンのアミン官能基から得ることができる。アニオン基は、開環誘導体段階で、Ｎ−保護チオラクトン又は保護されていないチオラクトンに導入することもでき（合成経路３）、或いは誘導体化ホモシステインチオラクトンにも導入することができる（合成経路４）。アニオン基は、アミド基の還元によって生成することもできる（合成経路５）。Ｎ−保護／脱保護戦略を使用する場合、カップリングは、脱保護の後又は前に行うことができる。すべてのカップリングは、求核置換又はラジカル付加を介して行った。

リガンドの製造
合成経路１
実施例１ａ：
室温のアルゴン中、ベンジルアミン（３．７ｍｌ、３３．９ｍｍｏｌ）を、塩酸Ｄ，Ｌ−ホモシステインチオラクトン（１ｇ、６．５１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４０ｍｌ）撹拌溶液に添加した。４時間後、溶液を蒸発させ、真空乾燥した。残留物をＨＰＬＣ（水／アセトニトリル）で精製して、白色生成物（０．７７ｇ、５２％）を得た。

実施例１ｂ：
室温のアルゴン中、ブチルアミン（１．６ｍｌ、１６．２ｍｍｏｌ）を、塩酸Ｄ，Ｌホモシステインチオラクトン（１ｇ、６．５１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４０ｍｌ）撹拌溶液に添加した。２時間後、溶液を蒸発させ、真空乾燥した。残留物をＨＰＬＣ（水／アセトニトリル）で精製して、白色残留物を得た。

実施例１ｃ：
室温のアルゴン中、２−（トリフルオロメチル）ベンジルアミン（４．５ｍｌ、３２．１ｍｍｏｌ）を、塩酸Ｄ，Ｌホモシステインチオラクトン（０．９９ｇ、６．４７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４０ｍｌ）撹拌溶液に添加した。３時間後、溶液を蒸発させ、真空乾燥した。残留物をＨＰＬＣ（水／アセトニトリル）で精製して、白色固体（０．４８ｇ、２５％）を得た。

合成経路２
実施例２ａ：
ホモシステインチオラクトンのアミン基の保護
塩酸Ｄ，Ｌ−ホモシステインチオラクトン（７．０４ｇ、４５．８２ｍｍｏｌ）、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、８．４０ｍｌ、４８．２２ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン（ＤＣＭ、２００ｍｌ）を、窒素雰囲気中で混合した。反応物を、氷浴中で数分間撹拌し、次いでジカルボン酸ジ−ｔ−ブチル（１０．５３ｇ、４８．２５ｍｍｏｌ）を添加した。０℃で２０分間撹拌した後、反応混合物を室温まで温めた。２０時間後、溶媒を真空除去し、フラッシュクロマトグラフィー（溶出剤ジクロロメタン）にかけた結果、白色固体（５．８８ｇ、５９％）を得た。

保護ホモシステインチオラクトンの開環
上述の生成物（９３３ｍｇ、４．２９ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ ５０ｍｌに溶解し、アルゴンで脱ガスを行った。次いでチオフェン−２−メチルアミン（２．５９ｇ、２２．８８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を４日間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残留物を酢酸エチル（４５ｍｌ）で抽出し、１０％クエン酸水溶液（２×１５ｍｌ）、水（１０ｍｌ）で洗浄した。Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥した後、有機相を蒸発させ、得られた残留物を次の段階で直接使用した。

保護ホモシステインチオラクトンの脱保護
上記得られた残留物を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）４５ｍｌに溶かした溶液に、トリフルオロ酢酸（５ｍｌ）を添加し、アルゴンで脱ガスを行った。

反応物を室温で４時間撹拌した後に、溶媒を蒸発させた。残留物を分取クロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にかけた結果、白色固体（０．７６ｇ、最後の２段階 ７２％）を得た。

合成経路３
実施例３ａ：
室温のアルゴン中、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（１．７７ｍｌ、１６．２６ｍｍｏｌ）を、塩酸Ｄ，Ｌ−ホモシステインチオラクトン（１ｇ、６．５１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４０ｍｌ）撹拌溶液に添加した。４時間後、溶液を蒸発させ、真空乾燥した。残留物を、カップリングに直接使用した。

合成経路４
実施例４ａ：
塩化ベンゾイル（０．８７ｍｌ、７．５ｍｍｏｌ）を５ｍｌのＤＣＭに溶かした溶液を、Ｄ，Ｌ−ホモシステインチオラクトン（１．１５ｇ、７．５ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（２．６ｍｌ、１５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（ＤＣＭ、１５ｍｌ）に溶かした溶液に、０℃で１滴ずつ添加した。混合物を、室温で一晩撹拌した。溶媒を真空蒸発させ、反応残留物を酢酸エチル（３０ｍｌ）で抽出した。有機相を、クエン酸１０％水溶液（ｗ／ｗ、２０ｍｌ）、Ｋ_２ＣＯ_３ １０％水溶液（２０ｍｌ）、水（２０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過した後、溶媒を除去し、白色固体（１．３７ｇ、８３％）を得た。Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（０．６８ｍｌ、６．２５ｍｍｏｌ）を、室温のアルゴン中、上記得られた白色固体（０．５５ｇ、２．４９ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（２０ｍｌ）撹拌溶液に添加した。６時間後、溶液を蒸発させ、真空乾燥した結果、白色粉末が得られ、これをカップリングに直接使用した。

リガンドとアリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦとのカップリング
ゲル１ａの製造：
アリル基の濃度が１６７μｍｏｌ／ｍｌであるＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦ ２．０ｇを、水（５×１０ｍｌ）及びジオキサン（５×１０ｍｌ）で洗浄し、０．５ｍｌのジオキサンが入っているフラスコに添加した。リガンド１ａ（２９２ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）及びＡＩＢＮ（２，２’−アゾイソブチロニトリル）（２０４ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を、１ｍｌのジオキサンに溶解した。溶液に、窒素を１０分間フラッシュし、ゲルに添加し、反応フラスコを７０℃で一晩振盪させた。反応後、ゲルを濾過し、ジオキサン（５×２０ｍｌ）、エタノール（５×２０ｖｏｌ．）及び水（３×２０ｍｌ）で洗浄した。ゲルに対するリガンドの投入量を、以下の手順を使用して、アミン官能基を滴定することによって測定した。ゲル１ｍｌを０．５Ｍ ＨＣｌ溶液で洗浄し、その後、１ｍＭ ＨＣｌ溶液で洗浄した。ゲルをフラスコに移し、水１９ｍｌ及び濃ＨＮＯ_３ ２滴を添加した。滴定を、硝酸銀０．１Ｍ溶液を使用して行った。結果：８５μｍｏｌ／ｍｌゲル。

ゲル１ｂの製造：
リガンド１ｂ（アリル基当たり、リガンド約３当量）を、水（３．５ｍｌ）に溶解し、５０％（ｗ／ｗ）ＮａＯＨ水溶液の添加によってｐＨを８．５に調節した。溶液を、臭素で活性化したアリルＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗゲルに添加し（２ｇ、２３０μｍｏｌ／ｍｌゲル）、その混合物を、振盪板上に６０℃で放置した。１８時間後、ゲルを濾過し、水（２×３０ｍｌ）、エタノール（２×３０ｍｌ）、０．２Ｍ酢酸（２×３０ｍｌ）及び水（２×３０ｍｌ）で洗浄した。アミン基の滴定によって測定したゲルのイオン容量は、１９０μｍｏｌ／ｍｌゲルであることがわかった。

ゲル１ｃの製造：
アリル基の濃度が１６７μｍｏｌ／ｍｌであるＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦ ２．０ｇを、水（５×１０ｍｌ）及びジオキサン（５×１０ｍｌ）で洗浄し、０．５ｍｌのジオキサンが入っているフラスコに添加した。リガンド１ｃ（２４０ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）及びＡＩＢＮ（１９０ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ）を、１ｍｌのジオキサンに溶解した。溶液に、窒素を１０分間フラッシュし、ゲルに添加し、反応フラスコを、７０℃で振盪板上に放置した。１９時間後、ゲルを濾過し、ジオキサン（５×２０ｍｌ）、エタノール（５×２０ｖｏｌ．）及び水（３×２０ｍｌ）で洗浄した。ゲルに対するリガンドの投入量は、アミン官能基の滴定によって測定した結果、１０６μｍｏｌ／ｍｌゲルであった。

ゲル２ａの製造：
アリル基の濃度が２３０μｍｏｌ／ｍｌであるＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦ ２．０ｇを、水（５×１０ｍｌ）及びジオキサン（５×１０ｍｌ）で洗浄し、０．５ｍｌのジオキサンが入っているフラスコに添加した。リガンド２ａ（２９０ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）及びＡＩＢＮ（１９０ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ）を、１ｍｌのジオキサンに溶解した。溶液に、窒素を１０分間フラッシュし、ゲルに添加し、反応フラスコを、７０℃で振盪板上に放置した。１９時間後、ゲルを濾過し、ジオキサン（５×２０ｍｌ）、エタノール（５×２０ｖｏｌ．）及び水（３×２０ｍｌ）で洗浄した。ゲルに対するリガンドの投入量は、アミン官能基の滴定によって測定した結果、１４２μｍｏｌ／ｍｌゲルであった。

ゲル３ａの製造：
リガンド３ａ（アリル基当たり、リガンド約３当量）を水（３．５ｍｌ）に溶解し、５０％（ｗ／ｗ）ＮａＯＨ水溶液の添加によってｐＨを８．５に調節した。溶液を、臭素で活性化したアリルＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗゲルに添加し（２ｇ、２３０μｍｏｌ／ｍｌゲル）、その混合物を、振盪板上に６０℃で放置した。１８時間後、ゲルを濾過し、水（２×３０ｍｌ）、エタノール（２×３０ｍｌ）、０．２Ｍ酢酸（２×３０ｍｌ）及び水（２×３０ｍｌ）で洗浄した。アミン基の滴定によって測定したゲルのイオン容量は、１５６μｍｏｌ／ｍｌゲルであることがわかった。

ゲル４ａの製造：
リガンド４ａ（０．３２ｇ、１．０２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ／水：８０／２０（２．５ｍｌ）に溶解し、５０％（ｗ／ｗ）ＮａＯＨ水溶液の添加によってｐＨを９に調節した。溶液を、臭素で活性化したアリルＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗゲルに添加し（２ｇ、２３０μｍｏｌ／ｍｌゲル）、その混合物を、振盪板上に６０℃で放置した。１８時間後、ゲルを濾過し、水（２×３０ｍｌ）、エタノール（２×３０ｍｌ）、０．２Ｍ酢酸（２×３０ｍｌ）及び水（２×３０ｍｌ）で洗浄した。アミン基の滴定によって測定したゲルのイオン容量は、１３３μｍｏｌ／ｍｌゲルであることがわかった。

ゲルのクロマトグラフィー評価：
・イオン交換体に関する実験参照手順
材料
緩衝液
緩衝液１：２０ｍＭピペラジン＋０．２５ＮａＣｌ ｐＨ６．０
タンパク質溶液：
ＢＳＡ：緩衝液１中、４ｍｇ／ｍＬ
すべての緩衝液及びタンパク質溶液は、使用前に、０．４５μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｅｘ ＨＡフィルターに通して濾過した。

クロマトグラフィーシステム
すべての実験は、Ｕｎｉｃｏｒｎ ３．１ソフトウェアを備えたＡＫＴＡ（商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００クロマトグラフィーシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）を使用して、室温で行った。サンプルを、１５０ｍＬスーパーループを介してカラムに注いだ。全体を通し、１ｍＬ／分（約３００ｃｍ／時）の流量を使用した。１０ｍｍフローセルを使用して、２８０ｎｍで吸光度を測定して、溶出物を連続的にモニタした。

溶出伝導率
プロトタイプのアニオン交換体のそれぞれを、ＨＲ５／５カラム（充填床容積＝１ｍＬ）に充填し、２０カラム体積の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡にした。タンパク質混合物（６ｍｇ／ｍｌコンアルブミン、４ｍｇ／ｍｌラクトアルブミン及び６ｍｇ／ｍｌ大豆トリプシンインヒビター）５０μｌをカラムに注ぎ、１００％の前述の緩衝液及び２Ｍ ＮａＣｌに至る線形勾配（２０カラム体積）で溶出した。流量は、０．３ｍｌ／分（１００ｃｍ／時）に調節した。

フロント分析
プロトタイプのアニオン交換体のそれぞれを、ＨＲ５／５カラム（充填床容積＝１ｍＬ）に充填し、適切なｐＨ及び塩濃度の緩衝液で平衡にした。システムの空隙容量は、非結合条件下、適切なタンパク質溶液をカラムに加えることによって決定した。溶出物のＡ_２８０が、加えられたタンパク質のＡ_２８０の１０％に到達するまでの時間を、このシステムの空隙容量とした（分で表す）。

緩衝液１で平衡にしたカラムに、同じ平衡緩衝液（上記参照）に溶解したサンプルタンパク質を、１ｍＬ／分（即ち約３００ｃｍ／時）の流量で、連続的に供給した（例えば１５０ｍＬスーパーループを介して）。このサンプルは、溶出物のＡ_２８０が、カラムに加えられたサンプルＡ_２８０の１０％のレベルに到達するまで加えた。このように得られたデータに基づいて［即ち充填ゲル床の容積（Ｖｃ）、その空隙容量、カラムに供給されたタンパク質の流量及び濃度］、そこに加えられたタンパク質の濃度の１０％のレベルでの、充填ゲルのブレイクスルー容量（ＱＢ_１０％）を、計算することができる。

ブレイクスルー及び評価
最大吸光度の１０％のレベルでのブレイクスルー（Ｑｂ_１０％）を、以下の関係式を使用して計算した。

Ｑｂ_１０％＝（Ｔ_Ｒ１０％−Ｔ_ＲＤ）×Ｃ／Ｖ_ｃ
式中、Ｔ_Ｒ１０＝最大吸光度の１０％での保持時間（分）、
Ｔ_ＲＤ＝システムの空隙容量（分）、
Ｃ＝供給タンパク質の濃度（４ｍｇ／ｍＬ）及び
Ｖｃ＝カラムの充填床容積（ｍＬ）。

・結果：
以下の表に、ゲル１ａ、１ｂ、１ｃ、２ａ、３ａ及び４ａｎの、タンパク質の混合物（コンアルブミン、ラクトアルブミン及び大豆トリプシンインヒビター）に関する溶出伝導率と、ＢＳＡ（Ｑ１０％）容量を、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢのＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦと比較したものを示す。

例示的な骨格としてホモシステインチオラクトンを使用して、マルチモードアニオン交換リガンドのライブラリを生成する、基本的な方法を示す概略図（スキーム２）である。 本発明で製造することができる、マルチモードアニオン交換リガンドの代替の方法を示す概略図（スキーム３）である。 本発明で製造することができる、正荷電基及びポリカチオンリガンドを示す図である。

Claims (13)

1. １以上のマルチモードアニオン交換リガンドの製造方法であって、
   （ａ）一般式（Ｉ）で定義される１以上の骨格を準備する段階
   （式中、Ａ、Ｂ及びＸは互いに独立に炭素原子又はヘテロ原子、例えば酸素、硫黄、窒素及び／又はシリカであり、ｍは０〜４の整数、例えば１〜３、好ましくは１又は２であり、官能基Ｎは窒素であって、いずれかのＸを置換或いはＡ、Ｂ及びＸのいずれかに結合している。）、
   （ｂ）任意段階として、上記骨格の環構造を維持しながら、上記骨格の窒素を誘導体化してアニオン交換基を導入及び／又はアミンを保護する段階、及び
   （ｃ）残基Ｒに結合したアミンを含む試薬の添加によるアミノ分解によって誘導体の環構造を開環させて、開環した骨格のカルボニル炭素に上記アミンを付加させる段階
   を含んでなる方法。
2. 式（Ｉ）のＡ、Ｂ及びＸが炭素原子であり、ｍが１である、請求項１記載の方法。
3. 前記骨格がホモシステインチオラクトンである、請求項１又は請求項２記載の方法。
4. 段階（ｂ）を含んでいて、前記誘導体化が第二級、第三級又は第四級アミンを与えるアルキル化である、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
5. 段階（ｃ）のアミノ分解を起こすために添加される試薬が、残基Ｒに結合したアミンを含み、Ｒが線状、枝分れ、環状の飽和、不飽和又は芳香族炭化水素基である、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
6. 誘導体化骨格を与えるため段階（ａ）及び（ｂ）を前もって実施しておく、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
7. 得られた開環生成物をそのチオール基を介して、反応性基を含むベースマトリックスに固定化する段階（ｄ）をさらに含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
8. ベースマトリックスの反応性基を臭素化する段階もさらに含んでいて、反応性基が炭素−炭素二重結合である、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
9. ラジカル反応に適した条件下で、ベースマトリックスの反応性基を活性化する段階をさらに含んでいて、反応性基が炭素−炭素二重結合である、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
10. マルチモードアニオン交換リガンドの製造における出発物質としてのホモシステインチオラクトンの使用。
11. マルチモードアニオン交換リガンド又はベースマトリックスに複数のマルチモードアニオン交換リガンドが結合した分離媒体であって、当該リガンド又は媒体が請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法で製造したものである、リガンド又は媒体。
12. 請求項１１記載の分離媒体を充填したアニオンクロマトグラフィー用クロマトグラフィーカラム。
13. 液体から目標物質を分離する方法であって、請求項１１記載の分離媒体を準備し、媒体を液体に接触させてその表面に目標物質を吸着させることを含む方法。