ES2298423T3

ES2298423T3 - Generacion de medios de intercambio ionico.

Info

Publication number: ES2298423T3
Application number: ES02798880T
Authority: ES
Inventors: Jean-Luc Maloisel; Nicolas Thevenin
Original assignee: GE Healthcare Bio Sciences AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 2001-09-14
Filing date: 2002-09-12
Publication date: 2008-05-16
Anticipated expiration: 2022-09-12
Also published as: AU2002334542B2; CA2460355A1; ATE383906T1; DE60224685T2; SE0103084D0; CN1286554C; JP4188832B2; US20040238446A1; CN1553828A; EP1425092B1; US7067059B2; CA2460355C; JP2005517517A; NZ531094A; EP1425092A1; WO2003024588A1; DE60224685D1

Abstract

Un método para generar un medio de separación que comprende ligandos intercambiadores catiónicos de modo mixto acoplados a una matriz base, método que comprende las etapas de (a) proporcionar al menos una proteína adaptadora, cada una de las cuales comprende una grupo F funcional y exhibe una estructura de núcleo cíclico; (b) derivatizar la(s) proteína(s) adaptadora(s) con un reactivo que comprende un grupo Z reactivo acoplado a un residuo R mediante reacción del grupo F de dicho adaptador con el grupo reactivo de dicho reactivo, mientras que conserva la estructura cíclica del adaptador; (c) abrir la estructura cíclica del derivado resultante; y (d) reactivar el producto abierto así obtenido con una matriz base que comprende un grupo reactivo, que está opcionalmente acoplada a la matriz base vía un espaciador; en el que dicha proteína adaptadora presenta al menos dos funcionalidades, una de las cuales es un grupo que comprende un azufre para acoplar al grupo reactivo de la matrizbase y otra de las cuales es un grupo que puede ser transformado en un grupo iónico, estando dichas funcionalidades presentes en la estructura cíclica en posiciones adyacentes, y en las que en la etapa (c), la apertura es proporcionada para romper el enlace entre dos funcionalidades y en las que la proteína adaptadora está definida por la fórmula general (I) en la que A, B y X independientemente entre sí, son átomos de carbono o cualquier heteroátomo, tales como oxígeno, azufre, nitrógeno y/o silicio, m es cualquier número entero entre 1 y 4, tal como 1-3, preferiblemente 1 ó 2, y el grupo funcional F está representado bien por una X o aparece acoplado a uno cualquiera de A, B y X, opcionalmente vía un adaptador, estando dicho adaptador comprendido de 1-50 átomos.

Description

Generación de medios de intercambio iónico.

Campo técnico

El presente invento se refiere al campo de separación y especialmente a la separación por intercambio iónico usando ligandos de intercambio catiónico en modo mixto. Más específicamente, el invento se refiere a un método de generación de un medio intercambiador catiónico de modo mixto, y también de un kit que comprende materiales de partida esenciales para dicha generación.

Antecedentes

El término cromatografía abarca una familia de métodos de separación íntimamente relacionados. Las características que distinguen la cromatografía de otros muchos métodos químicos y físicos de separación es que dos fases mutuamente inmiscibles son puestas en contacto en la que una fase es estacionaria y la otra móvil. La mezcla muestra, introducida en la fase móvil, experimenta una serie de interacciones (particiones) muchas veces antes de las fases estacionarias y móviles según va siendo llevada a través del sistema por la fase móvil. Las interacciones aprovechan las diferencias en las propiedades físicas o químicas de los componentes en la muestra. Estas diferencias gobiernan la velocidad de migración de los componentes individuales bajo la influencia de una fase móvil que se mueve a través de una columna que contiene la fase estacionaria. Los componentes separados emergen en orden creciente de interacción con la fase estacionaria. El componente menos retardado eluye primero, el material retenido más fuertemente eluye el último. La separación es obtenida cuando un componente es retardado suficientemente para evitar solaparse con la zona de una soluto adyacente según los componentes de muestra eluyen de la columna.

La columna es el corazón del cromatógrafo y proporciona versatilidad en el tipo de instrumento que puede ser obtenido por un único instrumento. Especialmente, grandes esfuerzos son hechos continuamente para diseñar la fase estacionaria óptima para cada propósito específico. Dicha fase estacionaria consta habitualmente de un soporte o matriz base en la que un ligando que comprende grupos funcionales, es decir, grupos de unión ha sido unido. Como se entiende fácilmente, la selección de posibles ligandos es enorme, pero para una visión general se dará a continuación un número de clases diferentes de ligandos.

En adsorción por afinidad, las serín proteasas han sido adsorbidas/desadsorbidas a las/de las matrices a las que la p-aminobenzamidina ha sido unida covalentemente vía el grupo para-amino.

Los intercambiadores aniónicos de modo mixto han sido descritos, por ejemplo en el documento de patente WO 9729825 (Amersham Pharmacia Biotech AB), proporcionando interacciones basadas en cargas y enlaces de hidrógeno que implica oxígeno y nitrógeno amino en distancia de 2-3 carbonos del nitrógeno amino cargado positivamente. La publicación está basada en el descubrimiento de que este tipo de ligandos pueden generar intercambiadores aniónicos que requieren fuerzas iónicas relativamente altas para eluir sustancias unidas.

Los intercambiadores catiónicos en los que hay ligandos de modo mixto que requieren fuerzas iónicas relativamente altas para eluir sustancias unidas han sido sugeridos en el documento de patente WO 9965607 (Amersham Pharmacia Biotech AB). Adicionalmente, el documento de patente WO 9729825 (US 6.090.288) y el documento de patente WO 9965607 describen los ligandos de intercambio catiónico y aniónico, que requieren ambos una fuerza iónica de elución relativamente alta.

El medio de separación de la estructura general M-SP1-L, en la que M es una matriz soporte que puede ser hidrofílica, SP 1 es un espaciador y L comprende un resto homoaromático o heteroaromático mono o bicíclico que puede ser sustituido (un resto homoaromático comprende un anillo aromático formado sólo por átomos de carbono) está descrita en el documento de patente WO 9808603 (Upfront Chromatography). Los sustituyentes son principalmente ácidos. El medio de separación es sugerido por la adsorción de las proteínas, en particular las inmunoglobulinas, por interacciones hidrofóbicas más que por intercambio de iones.

Los documentos de patente WO 9600735, WO 9609116 y la patente norteamericana US 5.652.348 (Burton y otros) también describen medios de separación que están basados en la interacción hidrofóbica. La adsorción y desadsorción son ayudados por el aumento o disminución, respectivamente de la concentración de sal del líquido o por el cambio en la carga del ligando y/o la sustancia a ser adsorbida/desadsorbida mediante el cambio de pH. La estructura susceptible de carga puede ser un grupo amino.

Finalmente, la patente norteamericana US 5.789.578 (Burton y otros) sugiere inmovilizar un ligando que contiene un grupo tiol, tal como el ácido 3-mercaptopropiónico, glutatión etc. mediante adición del grupo tiol sobre el doble enlace carbono-carbono unido a una matriz de soporte.

Sin embargo, una vez que la estructura del ligando deseado ha sido decidida, consideraciones importantes adicionales residirán en la elección de un método adecuado de la preparación de la misma.

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Por ejemplo, recientemente un nuevo tipo de ligandos, indicados como ligandos de elevada salinidad, ha sido descrito, véase por ejemplo el documento de patente WO 0011605 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia). Puesto que estos ligandos pueden funcionar como ligandos de intercambio catiónico en modo mixto, han demostrado ser de gran interés en la mayoría de las aplicaciones industriales, tales como purificación de proteínas, puesto que pueden resistir concentraciones elevadas de salinidad y consecuentemente no requieren ninguna disolución sustancial de la muestra. De esta manera, los ligandos de elevada salinidad son usados ventajosamente para las separaciones, puesto que reducen el volumen total de muestra requerido en comparación con métodos descritos previamente, y por consiguiente reducen el coste total para el equipo así como el esfuerzo de trabajo requerido en dichas aplicaciones.

Sin embargo, aunque los ligandos de intercambio catiónico en modo mixto reducen los costos y el esfuerzo cuando se usan en la separación, los métodos de preparación de los mismos descritos hasta aquí incluyen inconvenientes que los han hecho menos ventajosos en la práctica. En términos generales y para obtener una buena diversidad, la preparación de dicho ligando incluirá cuatro etapas, a saber

(I): Introducción de un grupo reactivo en un soporte cromatográfico y su activación opcional del mismo;

(II): Reacción del soporte modificado resultante con un compuesto tiol que contiene una función ácida.

(III): Activación de las funciones ácidas del soporte sólido con un reactivo adecuado (por ejemplo NHS en presencia de DCC) en un disolvente orgánico.

(IV): Adición de un derivado aminoacídico que comprende un residuo R adecuado para producir un ligando final unido a un soporte.

Un problema con las secuencia de las etapas descritas anteriormente es que dará como resultado un producto que de hecho contiene dos ligandos diferentes, a saber el compuesto de unión tioéter que contiene una función acida, resultante de las conversiones infructuosas en las etapas (iii) o (iv) y el producto final deseado. Un soporte cromatográfico compuesto de una mezcla de tales dos ligandos diferentes puede causar varios problemas cuando se usa en un procedimiento de separación. Por ejemplo, el análisis será difícil, dando como resultado métodos de preparación y uso menos robustos que lo que es generalmente necesitado. Por la misma razón, si el medio es obtenido como una mezcla de dos ligandos, será difícil optimizar la preparación y el uso de dicho soporte cromatográfico para cada aplicación específica. Adicionalmente, dicha mezcla resultará intrínsicamente en una separación menos específica que en un medio mejor definido.

Adicionalmente, otro problema implicado en el método convencional descrito anteriormente es el hecho de que la molécula de soporte cromatográfica más grande estará presente en el procedimiento de la etapa (i). Puesto de otra manera, el procedimiento completo necesitara ser realizado en volúmenes amplios, requiriendo un equipo de gran escala específico y que implica costes sustanciales que son inherentes al trabajo con dicho tipo de equipo.

Otro inconveniente adicional con el método de la técnica anterior descrito anteriormente es el hecho que todas las etapas son realizadas en soporte sólido. El uso del equipo específico ampliamente discutido anteriormente incluirá también desventajas adicionales relativas a un mayor consumo de tiempo y rutinas de lavado complicadas. Esto es especialmente cierto para las etapas (ii) a (iii) y (iii) a (iv), donde se va de un disolvente acuoso a uno orgánico y viceversa.

Puesto que hasta ahora no hay alternativas funcionales al método disponible descrito anteriormente, hay una necesidad dentro de este campo de métodos mejorados para la fabricación de ligandos de intercambio catiónico en modo mixto para el uso en los procedimientos de separación.

Sumario del invento

Consecuentemente, un objetivo del presente invento es el de proporcionar un método que produzca un medio de separación que comprenda ligandos de intercambio catiónico en modo mixto, en el que la composición de los ligandos obtenidos sea fácil de controlar. Este objetivo puede ser alcanzado por el uso como material de partida de un adaptador nuevo o derivado del adaptador como se describe en las reivindicaciones anexas.

Otro objetivo del invento es proporcionar un método de producción de un medio de separación que comprenda ligandos de intercambio catiónico en modo mixto, método que es simplificado y menos costoso que el método descrito anteriormente. Este objetivo puede ser alcanzado por un método en el que el soporte sólido o gel que comprende el reactivo no es introducido en el proceso hasta la última etapa, como se describe en las reivindicaciones anexas, por lo cual los grandes volúmenes de reactivos requeridos anteriormente pueden ser evitados. Este objetivo es alcanzado también por un método que requiere en total menos etapas que el método descrito anteriormente, como se describe en las reivindicaciones anexas.

Un objetivo adicional del invento es el de proporcionar un método para producir un medio de separación que comprende ligandos de intercambio catiónico en modo mixto, cuyo método constituye una alternativa medioambientalmente más aceptable que el método descrito anteriormente. Este objetivo puede ser alcanzado por un método como se describe en las reivindicaciones anexas, método que requiere menos disolvente que los métodos de la técnica anterior. También, la característica discutida anteriormente de que el método según el invento total pueda ser realizado en volúmenes más pequeños contribuirá también a una alternativa medioambientalmente más ventajosa, puesto que volúmenes más pequeños requerirán menos líquidos de lavado y consumirán también menos energía.

Objetivos y ventajas adicionales del presente invento aparecerán en la descripción detallada a continuación.

Definiciones

Los términos "que transportan una carga negativa" y "cargado negativamente" significan que la sustancia transporta una o más cargas negativas y/o tiene una carga neta negativa.

Los términos "ligando de intercambio catiónico en modo mixto" y "ligando de intercambio catiónico multimodal" en el contexto de este invento, se refiere a un ligando que es capaz de proporcionar al menos dos sitios distintos, pero cooperativos, que interactúan con la sustancia a ser unida. Uno de estos sitios da un tipo de interacción carga-carga atractivo entre el ligando y la sustancia de interés. El segundo sitio da típicamente una interacción donante-receptor de electrones y/o interacciones hidrofóbicas y/o hidrofílicas. Las interacciones donante-receptor de electrones incluyen interacciones tales como puentes de hidrógeno, \pi-\pi, transferencia de carga, dipolo-dipolo, dipolo inducido,
etc.

El término "medio" (en plural medios) comprende un ligando, es decir, un grupo de unión unido a una matriz base, es decir, un soporte para el uso en cromatografía. El término como se usa aquí no incluye ningún líquido.

El termino ligando de "elevada salinidad" se refiere a un ligando que es capaz de unir proteínas en presencia de concentraciones relativamente altas de sal (por ejemplo NaCl 0,3 M) relativo a un intercambiador iónico de referencia que es operado en idénticas condiciones. Esto puede ser determinado usando un método de análisis frontal, como se describe a continuación en la parte experimental.

"Las interacciones donante-receptor de electrones" significa que un átomo electronegativo con un par libre de electrones actúa como un donante y se une a un átomo deficiente en electrones que actúa como un receptor para el par de electrones del donante. (Véase por ejemplo Karger y otros, An Introduction into Separation Science, John Wiley Sons (1973) página 42).

Los grupos/átomos receptores típicos son átomos o grupos deficientes en electrones, tales como iones metálicos, grupos ciano, nitrógeno en un grupo nitro, etc. e incluyen un hidrogeno unido a un átomo electronegativo tal como HO- en hidroxi y carboxi, NH- en amidas y aminos, HS- en tiol etc.

Por intercambio catiónico se contempla que la sustancia a ser eliminada lleva una carga positiva y el intercambiador catiónico está cargado negativamente (=condiciones de intercambio catiónico). Para una sustancia anfotérica que está presente en un líquido acuoso esto significa un pH \leq pI + 0,5, preferentemente pH \leq pl.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra un ejemplo de una síntesis tradicional de medio de intercambio catiónico multimodal como se trata en términos generales en la sección anterior "Antecedentes".

La figura 2 muestra una realización del presente invento para la síntesis de medio de intercambio catiónico multimodal usando tiolactona homocisteína como un adaptador.

La figura 3 ilustra el ejemplo de la diversidad potencial de librerías de medios de intercambio catiónico multimodal por medio del adaptador de ejemplo tiolactona homocisteína.

La figura 4 ilustra de forma esquemática el procedimiento general para sintetizar las distintas librerías de los medios del mismo grupo de disoluciones reactivas.

Descripción detallada del invento

Un primer aspecto del presente invento es un método para generar un medio de separación que comprende ligandos de intercambio catiónico en modo mixto unidos a una matriz base, método que comprende las etapas de

(a): proporcionar al menos un adaptador, cada uno de los cuales comprende un grupo funcional F y exhibe una estructura de núcleo cíclico;

(b): derivatización del(los) adaptador(es) con un reactivo que comprende un grupo reactivo unido a un residuo R mediante la reacción del grupo F de dicho adaptador con el grupo reactivo de dicho reactivo, mientras que retiene la estructura cíclica del adaptador;

(c): abrir la estructura cíclica del derivado resultante; y

(d): reacción del producto abierto así obtenido con una matriz base que comprende un grupo reactivo, que está opcionalmente unido a la matriz base vía un separador;

en el que dicho adaptador presenta al menos dos funcionalidades, una de las cuales es un grupo que comprende un sulfuro para unir al grupo reactivo de la matriz base y una de las cuales es un grupo que puede ser transformado en un grupo iónico, dichas funcionalidades están presentes en la estructura cíclica en las posiciones adyacentes, y

en el que en la etapa (c), la apertura es proporcionada por la rotura del enlace entre las dos funcionalidades. La hidrólisis según la etapa (c) puede, por ejemplo, ser realizada mediante la adición de una base o cualquier otro método adecuado. La función del grupo que comprende sulfuro es la de proporcionar un punto de acoplamiento fácil y estable al soporte cromatográfico. Dada la elevada nucleofilia de, por ejemplo, un grupo S-H se obtiene una alta eficacia en la unión vía una sustitución nucleofílica o vía una adición radical.

En una realización, la apertura de la estructura cíclica según la etapa (c) es conseguida mediante hidrólisis, tal como por adición de hidróxido sódico, como se ejemplifica en el apartado A de la parte experimental a continuación. En una realización alternativa, dicha apertura es conseguida por adición de un agente nucleofílico, tal como por adición de un aminoácido o una amina, como se ejemplifica en el apartado B de la parte experimental a continuación. Sin embargo, para abrir la estructura cíclica, cualquier componente que provoque una reacción de sustitución nucleofílica puede ser añadido. El único requerimiento es que el anillo que se abre resulte en un grupo que pueda ser transformado en un grupo único y un grupo tiol, cuyo grupo tiol esté disponible subsiguientemente para unirse a un gel y/o a un separador.

Más específicamente, el adaptador está definido por la formula general (I)

1

en la que A, B y X independientemente de cada uno son átomos de carbono hibridados sp^{2}-ó sp^{3} o cualquier heteroátomo, tal como oxígeno, azufre, nitrógeno y/o silicio. En una realización simple, A, B y X son todos átomos de carbono. m es cualquier número entero entre 1 y 4, tal como 1-3, preferentemente 1 ó 2, y para muchas aplicaciones 1. Como se darán cuenta los expertos en este campo, el número m tendrá un impacto en la longitud del ligando en el medio de separación final. Se decidirá por tanto, dependiendo por ejemplo de los grupos activos seleccionados en los ligandos de intercambio catiónico en modo mixto, de la separación que se pretende conseguir, si se incluye o no un espaciador entre la matriz base y el grupo reactivo sobre ésta, etc. El grupo funcional F es representado bien por una X, es decir, como una parte integral de la estructura cíclica, o aparece unido a cualquiera de A, B y X, posiblemente vía un grupo de unión. Dicho grupo de unión, dependiendo de las propiedades deseadas del medio de separación final, puede estar comprendido entre 1-50, siendo la principal consideración de la cual que no cause ningún efecto secundario no deseado en el método presente para la generación de un medio de separación. Las propiedades deseadas del grupo de unión se corresponden ampliamente a las del espaciador entre la matriz base y el grupo reactivo.

Más específicamente, el espaciador mencionado anteriormente como tal es convencional como en los intercambiadores iónicos tradicionales y puede así comprender grupos hidrocarbonados aromáticos, insaturados, saturados cíclicos, ramificados y lineales (por ejemplo con hasta 1-20, tal como átomos de carbono 1-10). Dichos grupos pueden trasladar grupos hidroxi, halógenos, alcoxi y ariloxi y los análogos tio correspondientes, y/o grupos amino: las cadenas de carbono pueden, en una o más posiciones, ser interrumpidas por nitrógeno amino para ciertas aplicaciones, éteres oxigenados, sulfuros de tioéter, etc. Puede haber también grupos carbonilo, tales como en amidas y cetonas, y otros grupos que tengan una estabilidad comparable frente a la hidrólisis. Al menos un átomo seleccionado de oxígeno, azufre y nitrógeno es preferentemente unido a uno y al mismo átomo de carbono sp^{3}-hibridado. Además, el espaciador puede proporcionar uno o mas átomos receptores o donantes de electrones o grupos que potencian la unión de la sustancia al intercambiador catiónico como se trata anteriormente, por ejemplo por participar en el enlace de hidrógeno, la interacción \pi, las interacciones hidrofóbicas o hidrofílicas etc.

Así, el método según el presente invento comprende menos etapas que el método anterior, y por tanto ahorrará tiempo y consecuentemente costos cuando funcione. Adicionalmente, puesto que la matriz base, que es ventajosamente un gel, no es introducida en el proceso hasta la última etapa, los grandes ahorros pueden hacerse también al limitar la duración de los procedimientos de lavado requeridos anteriormente.

En una realización del método según el presente invento, en la fórmula (I), el grupo funcional F es seleccionado de un grupo que contiene un grupo saliente como se usa convencionalmente en la sustitución nucleofílica, tal como C-Y, donde Y representa por ejemplo Br, Cl, I, o un grupo tosilato o mesilato; un ácido o un grupo activado tal como WC = O, donde W está por ejemplo formado por N-hidrosuccinimida, pentafluorofenol, cloroformiato de isopropilo o para-nitrofenol, un grupo nucleofílico tal como por ejemplo -OH, -SH o -NH_{2}; y un C=C.

En una realización ventajosa del método, en la fórmula (I), A, B y X son átomos de carbono, m es 1 y F es -NH_{2}. En una realización especialmente ventajosa, el adaptador usado es tiolactona homocisteína, que es un producto comercial fácilmente disponible (por ejemplo de Aldrich o de cualquier otro proveedor conocido de los laboratorios químicos).

2

Esta realización es hasta ahora el mejor modo de llevar a cabo el presente invento. En la parte experimental de la presente solicitud, la mezcla racémica del adaptador ha sido usada. Sin embargo, como se darán cuenta los expertos en este campo, para ciertas aplicaciones, será mas ventajoso usar bien la forma D o L, o una mezcla que comprenda las proporciones especificadas de las mismas. La forma más adecuada es fácilmente ensayada en los experimentos rutinarios.

En una realización del método según el invento, el agente derivatizado usado en la etapa (b) es descrito por la fórmula general

(II)-Z-R-

en la que

Z constituye el grupo reactivo cuya función es reaccionar con el grupo funcional F del adaptador. Así, para cada realización, la naturaleza de Z es seleccionada a modo que sea reactiva con el F como se trata anteriormente; y

R puede comprender grupos de hidrocarbonos aromáticos, insaturados, saturados cíclicos, ramificados y lineales (por ejemplo con hasta 1-20, tal como átomos de carbono 1-10). Tales grupos pueden llevar grupos hidroxi, halógenos, alcoxi y ariloxi y los análogos tio correspondientes, y/o grupos amino. Las cadenas carbonadas pueden, en una o más posiciones, ser interrumpidas por nitrógeno amino para ciertas aplicaciones, oxígeno éter, sulfuro de tioéter, etc. Puede haber también grupos carbonilo, tales como en las amidas y cetonas, y otros grupos que tengan la estabilidad comparable frente a la hidrólisis. Al menos un átomo seleccionado de entre oxígeno, azufre y nitrógeno es preferentemente unido a uno y al mismo átomo de carbono sp^{3}-hibridado. Además, R proporcionará uno o más átomos receptores o donantes de electrones o grupos para potenciar la unión de una sustancia con el intercambiador catiónico como se trata anteriormente. R puede también contener grupos cargados siempre y cuando el ligando final presente en una ventana de intervalo completo en el que esté globalmente cargado negativamente y pueda funcionar como un intercambiador catiónico.

Así, puesto que el medio de separación final es útil en el modo de intercambio iónico, el residuo R es usado para introducir las características multimodales del mismo, según se desee. Como los lectores con experiencia en el campo se darán cuenta, el medio final puede comprender ligandos en los que R está comprendida por dos o más partes que son funcionales en enlaces separados por el espaciador discutido anteriormente.

El presente invento también abarca los productos del método según el invento, es decir, ligandos de intercambio catiónico en modo mixto, tal como los ligandos de elevada salinidad. Los ligandos según el invento pueden ser producidos como compuestos mucho más homogéneos que los que resultan de los métodos de la técnica anterior. Los ejemplos específicos abarcados por el invento son como se describen en las tablas en la parte experimental a continuación.

En una realización del método según el presente invento, el método incluye también una etapa de bromación separadamente y antes de la etapa (b) del grupo reactivo de la matriz base, en la que dicho grupo reactivo comprende un doble enlace carbono-carbono. Dicha bromación es bien conocida en este campo.

En una realización alternativa, el presente invento incluye en cambio una etapa de activación separadamente y antes de la etapa (b) del grupo reactivo de la matriz base en condiciones que favorecen una reacción radical, en la que dicho grupo reactivo comprende un doble enlace carbono-carbono. Una reacción radical puede ser iniciada por cualquier método bien conocido, por ejemplo, por adición de agentes químicos que inician una reacción, conocidos como iniciadores radicales, por el uso de la luz, tal como rayos UV, etc. Este tipo de reacciones y las condiciones son por tanto bien conocidos en este campo y han sido tratados ampliamente en la bibliografía.

Sin embargo, como los profesionales con experiencia en la técnica se darán cuenta, el único criterio que limita el grupo reactivo presente en la matriz base es que debe ser capaz de reaccionar en una extensión suficiente con uno de los extremos que resultan de la apertura de la estructura de anillo del adaptador. Adicionalmente, no debería ser tampoco reactivo con el resto de los derivados del adaptador abiertos para no destruir ninguna estructura que sea necesaria en el medio de separación final. Consecuentemente, la elección de una de las funcionalidades del adaptador y la elección del grupo reactivo presente en la matriz base deberían ser hechas de modo que puedan reaccionar entre sí. También, incluso si no es la realización más simple, se entiende también que los grupos reactivos en la matriz base pueden ser idénticos o diferentes.

Respecto a la matriz base, está basada en material orgánico o inorgánico, o una combinación de los mismos, tal como un materiales combinados de un modo eficaz (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia). La matriz base es preferentemente hidrofílica y en forma de un polímero, que es insoluble y más o menos expansible en agua. Los polímeros hidrofóbicos que han sido derivatizados para convertirse en hidrofílicos están incluidos en esta definición. Los polímeros adecuados son polímeros polihidroxi, por ejemplo, basados en polisacáridos, tales como agarosa, dextrosa, celulosa, almidón, pululan, etc. y polímeros completamente sintéticos, tales como amidas poliacrílicas, amidas polimetacrílicas, poli (hidroxialquilvinil éteres), poli (hidroxialquilacrilatos) y polimetacrilatos (por ejemplo, poliglucidil metacrilato), polivinilalcoholes y polímeros basados en estirenos y divinilbencenos, y copolímeros en los que dos o más de los monómeros que corresponden a los polímeros mencionados anteriormente son incluidos. Los polímeros, que son solubles en agua, pueden ser derivatizados para convertirse en insolubles, por ejemplo mediante reticulación y por acoplamiento a un cuerpo insoluble por vía de adsorción o unión covalente. Los grupos hidrofílicos pueden ser introducidos en los polímeros hidrofóbicos (por ejemplo en copolímeros de monovinil y divinilbencenos) mediante polimerización de los grupos que exhiben monómeros que pueden ser convertidos en OH, o mediante hidrofilización del polímero final, por ejemplo mediante adsorción de compuestos adecuados, tales como polímeros hidrofílicos. Los materiales inorgánicos adecuados para ser usados en las matrices base son sílice, óxido de zirconio, grafito, óxido de tántalo, etc. La matriz puede ser derivatizada homogéneamente por el ligando de intercambio catiónico o sólo parcialmente en un modo especialmente diseñado.

Las matrices preferidas carecen de grupos que son inestables frente a la hidrólisis, tales como el silano, éster, grupos amido y grupos que presentan silicio como tal. Esto aplica en particular con respecto a grupos que están en contacto directo con los líquidos usados. La matriz puede ser porosa o no porosa. Esto significa que la matriz puede ser completamente o parcialmente permeable (porosa) o completamente impermeable a la sustancia a ser eliminada (no porosa). La matriz puede estar alternativamente en forma de partículas irregulares o esféricas con tamaños en el intervalo de 1-1000 \mum, preferentemente entre 5-50 \mum para aplicaciones de alto rendimiento y 50-300 \mum para propósitos preparativos. Una forma interesante de matrices tiene densidades más altas o más bajas que el líquido. Este tipo de matrices es especialmente aplicable en operaciones a amplia escala para cromatografía de lecho fluidizado o expandido así como para diferentes procedimientos de aspecto por lote, por ejemplo en tanques agitados. Los procedimientos de lecho fluidizado o expandido son escritos en el documento de patente WO 9218237 (Amersham Pharmacia Biotech AB) y en el WO 9200799 (Kem-En-Tek). El término matriz hidrofílica significa que la superficie accesible de la matriz es hidrofílica en el sentido que los líquidos acuosos son capaces de penetrar la matriz. Las superficies típicamente accesibles en una matriz base hidrofílica exponen una pluralidad de grupos polares que comprenden por ejemplo átomos de oxígeno y/o nitrógeno. Los ejemplos de dichos grupos polares son hidroxilo, amino, carboxilo, éster, éter o alquilos menores (tales como (-CH_{2}CH_{2}O-)_{n}H donde n es un número entero).

Un segundo aspecto del presente invento es un método de generación de un medio de separación que comprende ligandos de intercambio catiónico en modo mixto unidos a una matriz base, cuyo método comprende las etapas de

(a): proporcionar al menos un derivado del adaptador que tiene una estructura cíclica;

(b): abrir la estructura cíclica del derivado; y

(c): acoplar el producto abierto así obtenido con una matriz base que comprende un grupo reactivo, que está opcionalmente unido a la matriz base vía un espaciador;

en el que dicho derivado de adaptador puede ser definido por la fórmula general (III)

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4

en la que A, B y X independientemente entre sí son carbonos hibridados sp^{2} o sp^{3} o cualquier heteroátomo, tal como oxígeno, azufre, nitrógeno y/o silicio, y m es cualquier número entero entre 1 y 4, tal como 1-3, preferentemente 1 ó 2, dichas funcionalidades están presentes en la estructura cíclica en posiciones adyacentes, y en las que en la etapa (c), la apertura es proporcionada por la ruptura del enlace entre las dos posiciones adyacentes dichas, y en las que un Z-R esta unido a cualquiera de A, B y X, preferentemente a B.

La etapa (b) puede ser realizada como se discute anteriormente en relación al primer aspecto del invento.

Como los expertos en este campo se dan cuenta, este aspecto corresponde al primer aspecto del invento, excepto en que un producto de partida es un derivado del adaptador fácilmente fabricado. Así, el segundo aspecto es una alternativa simplificada del primer aspecto, y es especialmente ventajoso en casos en los que la naturaleza del adaptador y del agente derivatizado pueden dar como resultado un producto fácilmente almacenado. Está previsto que en algunos casos, dicho derivado pueda estar comercialmente disponible o producido de una vez para ser almacenado y usado más tarde. Detalles adicionales respecto a la naturaleza y las propiedades del derivado del adaptador usado en este aspecto pueden ser encontrados anteriormente en relación con el adaptador y el agente de derivatización, respectivamente.

El nivel de los ligandos de intercambio catiónico en los intercambiadores catiónicos según el invento es seleccionado habitualmente en el intervalo de 0,001-4 mmol/ml de matriz, tal como 0,002-0,5 mmol/ml matriz, con preferencia para 0,005-0,3 mmol/ml matriz. Los intervalos posibles y preferidos están entre otros determinados por el tipo de matriz, ligando, sustancia a ser eliminada, etc. Así, el nivel de ligandos de intercambio catiónico está habitualmente dentro del rango de 0,01-0,3 con preferencia para 0,06-0,2 mmol/ml para las matrices basadas en agarosa. Para las matrices basadas en dextrano el intervalo es típicamente de 0,01-0,6 mmol/ml de matriz con un subintervalo de 0,01-0,2 mmol/ml de matriz. En ciertas variantes, por ejemplo cuando R es un grupo aromático, el nivel de los ligandos en modo mixto es con frecuencia la mitad inferior de estos intervalos. En estas variantes del invento los niveles del ligando de intercambio catiónico son por tanto más pequeños que 0,150 mmoles por ml de matriz y/o más pequeños que 1 mmol por gramo del peso seco de la matriz. La expresión "mmol por ml de matriz" se refiere a matrices sedimentadas completamente saturadas con agua. El intervalo de capacidad se refiere a la capacidad de la matriz en forma desprotonada para valorar la función del ácido. Incluye una posible contribución también de los grupos cargados negativamente distintos del grupo iónico principal en el ligando, por ejemplo, en el espaciador o el residuo R.

El medio de separación producido según el presente invento puede ser usado por métodos convencionales bien conocidos por los expertos de la técnica, tales como en el intercambio catiónico y especialmente en el intercambiador catiónico en modo mixto. Actualmente, el uso más ventajoso de un medio de separación generado según el método del invento es como ligandos de elevada salinidad. Sin embargo, el medio de separación actual funciona con tan buena capacidad como los medios conocidos anteriormente en los procedimientos de intercambio catiónico tradicionales en condiciones normales, con condiciones que pueden ser definidas por funcionar por debajo de 10 ms. Los medios de separación generados según el método del presente invento también funcionaran satisfactoriamente en el intervalo entre las condiciones normales mencionadas anteriormente y las condiciones de elevada salinidad, como se trata a continuación.

Así, un medio de separación generado según el presente invento puede ser usado ventajosamente como un intercambiador catiónico que absorbe la sustancia particular a fuerzas iónicas altas relativamente, conocidas como un ligando de elevada salinidad. Dicho intercambiador catiónico debería ser capaz de:

(a): unir la sustancia de interés en un líquido de referencia acuoso a una fuerza iónica correspondiente a NaCL 0,25 M, y

(b): permitir una capacidad de penetración máxima a través de su capacidad en un punto a un intervalo de pH de 2-12 para la sustancia \geq 200%, tales como \geq 300% ó \geq 500% ó \geq 1000% de la fractura a través de la capacidad de la sustancia para un intercambiador catiónico convencional.

El termino "capacidad de penetración" es un término bien conocido dentro de este campo y los métodos para la calculación del mismo son bien conocidos y también descritos a continuación en la parte experimental de la aplicación. Primeramente estas cifras de porcentaje se aplican a las medidas hechas durante las condiciones del intercambiador catiónico.

Más especialmente, durante la adsorción una muestra líquida que contiene una sustancia cargada positivamente es puesta en contacto con el intercambiador catiónico en condiciones que conducen a la unión de la sustancia con el ligando vía intercambio catiónico. El pH es seleccionado de modo que la sustancia esté, al menos parcialmente, cargada positivamente y al menos una parte de los ligandos de intercambio catiónico estén cargados negativamente. En las variantes preferidas, los intercambiadores catiónicos débiles (por ejemplo donde el grupo aniónico es -COO^{-}) son usados con pH del líquido tamponado a pKa \pm 2, tal como \pm 1, unidades de pH. El valor pKa del intercambiador catiónico es tomado como el punto de inflexión cuando el intercambiador catiónico es valorado con NaOH. La fuerza iónica (medida como concentración de sal o conductividad) está típicamente por debajo de la fuerza iónica de elución para la combinación particular del intercambiador catiónico, sustancias a ser enlazadas, temperatura y pH, composición disolvente, etc. Uno de los beneficios de usar los intercambiadores aniónicos multimodales es que será luego posible ejecutar la adsorción/unión también a fuerzas iónicas elevadas comparadas con los intercambiadores catiónicos convencionales. Al unir el intercambiador catiónico a la sustancia a ser eliminada, la adsorción puede ser llevada a cabo a una fuerza iónica que es mayor que cuando se usa el intercambiador iónico de referencia (medida al mismo pH y por otro lado en las mismas condiciones). Dependiendo de las capacidades de penetración del intercambiador catiónico \geq 200%, tal como \geq 300% ó \geq 500% e incluso \geq 1000% de la capacidad de penetración obtenida con el intercambiador catiónico de referencia puede ser completada.

La fuerza iónica exacta para ser usada durante la unión dependerá del ligando usado, de su densidad en la matriz, de la sustancia a ser unida y de su concentración, etc. Las fuerzas iónicas útiles se corresponden con frecuencia con las concentraciones de NaCl (agua pura) \geq 0,1 M, tal como \geq 0,3 M o incluso \geq 0,5 M.

En la desadsorción, los procedimientos que son bien conocidos en la técnica son usados convenientemente, tales como un aumento de la concentración de sal (fuerza iónica) por encima de la fuerza iónica de elución mínima requerida para la desadsorcion; una disminución del pH para reducir la carga negativa de los ligandos; un aumento del pH para disminuir la carga positiva en la sustancia; y/o mediante la inclusión de un ligando análogo o un agente(por ejemplo un aditivo disolvente) que reduce la polaridad de los líquidos acuosos usados. Los cambios son relativos al líquido acuoso que contiene la sustancia.

La desadsorción en condiciones de intercambio catiónico significa que el líquido usado para la desadsorcion proporciona condiciones (por ejemplo pH) tales que al menos una porción de la sustancia a ser desadsorbida está cargada positivamente, y la fuerza iónica está fijada a un valor por encima de la fuerza iónica de elución mínima para estas condiciones. Para los compuestos anfotéricos, las primeras opciones mencionadas implican pH \geq pI tal como pH \geq pI + 0,5.

La desadsorción puede también ser llevada a cabo en condiciones (por ejemplo de pH) en las que la sustancia a ser desadsorbida tiene una carga neta cero o menor y/o esencialmente todos los ligandos de intercambio catiónico están descargados.

En los procedimientos cromatográficos y/o en lotes la matriz con la sustancia a ser desadsorbida está presente en una columna u otro recipiente adecuado en contacto con el líquido de absorción. Las condiciones proporcionadas por el líquido son luego cambiadas como se describe anteriormente hasta que la sustancia deseada es liberada y eluida de la matriz. Para los procesos de desabsorción llevados a cabo en condiciones de intercambio catiónico la fuerza iónica es típicamente aumentada comparada con la absorción y corresponde con frecuencia al menos a NaCl 0,6 M. Los valores actuales dependen de los diversos factores discutidos anteriormente.

El cambio en las condiciones tratadas anteriormente puede ser completado en una o más etapas (gradiente por etapas) o continuamente (gradiente continuo). Las diversas variables del líquido en contacto con la matriz pueden ser cambiadas una por una o en combinación.

Las sales típicas útiles para cambiar la fuerza iónica son seleccionadas entre el amonio soluble o las sales metálicas de los fosfatos, sulfatos, etc, en particular las sales de metal alcalinos y/o metal alcalino-térreos. Las mismas sales pueden también ser usadas en las etapas de adsorción, pero luego con frecuencia a concentraciones menores.

Los componentes de tampón típicos útiles en los procedimientos de intercambio catiónico pueden ser seleccionados entre los pares ácido/base en los que la parte básica es aniónica. Los ejemplos ilustrativos son carboxilatos/ácidos carboxílicos (por ejemplo acetato/ácido acético), fosfatos, etc. Un aumento en el pH en la etapa de desadsorcion o etapas anteriores reducirá la carga positiva de la sustancia a ser desadsorbida, ayuda a la desadsorción y así también reduce la fuerza iónica necesaria para liberar la sustancia de la matriz. Dependiendo del pKa del ligando usado y del pI de la sustancia, una disminución en el pH puede conducir a la liberación o unión de la sustancia desde/a la matriz de intercambio catiónico.

La desadsorción puede también ser asistida por ajuste de la polaridad del líquido de desadsorción, comparado con el líquido de adsorción. Esto puede ser logrado mediante la inclusión de un disolvente orgánicos miscible en agua y/o menos hidrofílico en el líquido de desadsorción. Ejemplos de dichos disolventes son acetona, metanol, etanol, propanol, butanol, sulfóxido de dimetilo, dimetil formamida, acrilonitrilo etc. Una disminución en la polaridad del líquido de desadsorción es probable que asista en la desadsorción y así también reducir la fuerza iónica necesaria para liberar el compuesto de la matriz. La desadsorción puede también ser asistida mediante la inclusión de una estructura soluble análoga (ligando análogo) del ligando de intercambio catiónico en el líquido de desadsorción. La concentración suficiente de tal análogo es al menos mayor que su concentración en el líquido de adsorción.

Descripción detallada de los dibujos

La figura 1 muestra un ejemplo de una síntesis tradicional de los medios de intercambio catiónico multimodales como se trata en términos generales en la sección anterior "Antecedentes". Parece a partir de las figuras cómo el gel, que es el soporte sólido en los casos en que la síntesis de los ligandos tiene lugar, deber estar presente.

La figura 2 muestra una realización del presente invento para la síntesis de los medios de intercambio catiónico multimodal que usan homocisteína tiolactona como un adaptador. En principio, el método según el invento está compuesto de dos etapas, como se compara con la cuarta etapa del procedimiento de la técnica anterior, y la parte gel del ligando necesita solamente ser incluida en la última etapa.

La figura 3 ilustra la diversidad potencial de las librerías de los medios de intercambio catiónico multimodal vía la homocisteína tiolactona del adaptador ejemplar. El número de residuos R posibles es extenso y se trata con más detalle anteriormente, mientras que los ejemplos específicos serán descritos a continuación en la parte experimental.

La figura 4 ilustra de una manera esquemática el procedimiento general para sintetizar las diferentes bibliotecas de los medios del mismo grupo de las disoluciones reactivas. Dicho método puede ser usado con una variación de prácticamente cualquier propiedad tal como el tamaño de las partículas, de la porosidad, la rigidez o condiciones de unión, tal como el pH, el tiempo, la temperatura, etc.

A continuación, el presente invento es ilustrado por medio de ejemplos. Sin embargo, debe entenderse que los ejemplos presentes son proporcionados solamente para propósitos ilustrativos y no deben ser interpretadas para limitar el presente invento como se define en las reivindicaciones anexas. Todas las referencias dadas a continuación y en otro lugar en la presente aplicación son por la presente incluidas mediante referencia.

Parte experimental Procedimiento general usando DL homocisteína tiolactona para generas medios nuevos: A. Tiolactona abierta mediante hidrólisis

Esquema 1

Esquema sintético general

5

Procedimiento general

Etapa 1

Etapa 1a

Una disolución A de DL-homocisteína tiolactona Ia y diisopropil etil amina (DIPEA) en diclorometano (DCM) fue enfriada por debajo de 0ºC. Una disolución B que contiene un cloruro de acilo o un cloruro de sulfonilo o un anhídrido o un ácido activado en DCM fue enfriado por debajo de 0ºC, y añadida gota a gota a la disolución A mantenida entre 0 y 5ºC. La mezcla fue agitada durante toda la noche a temperatura ambiente.

Etapa 1b

Una disolución A de DL-homocisteína tiolactona Ia y di isopropilamina (DIPEA) en diclorometano (DCM) fue enfriada por debajo de 0ºC. Una disolución de cloruro de iodoacetilo en DCM fue añadida gota a gota a la disolución A mantenida entre 0 y 5ºC. La mezcla fue agitada durante toda la noche a temperatura ambiente. Una disolución B que contiene un tiol en DCM fue luego añadida gota a gota a la mezcla de la reacción y la agitación se mantuvo durante otras 17 h.

Etapa 2

El disolvente fue eliminado al vacío de la mezcla generada a partir de la Etapa 1a o Etapa 1b. A 0ºC una disolución de hidróxido sódico 5N fue añadida lentamente a la mezcla en bruto y fue luego agitada durante 2 horas a temperatura ambiente.

Etapa 3

La Sepharose® 6FF Bromada (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia) obtenida siguiendo el procedimiento bien conocido fue mezclada con la disolución alcalina de la Etapa 2 y calentada hasta 50ºC durante toda la noche. Después de la reacción, el gel (1 volumen) fue filtrado y lavado con agua (2 x 15 vol.), etanol (2 x 15 vol.), ácido acético 0,2 M (2 x 15 vol.) y agua (2 x 15 vol.).La capacidad iónica de los geles fue luego medida por valoración del ácido (Chauhan V.S. y otros, Tetrahedron, 44 (8), 2359-2366, 1988 (activación del ácido)). Las evaluaciones cromatográficas (retención y capacidad) de estos geles son mostradas en la Tabla 1A a continuación.

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Ejemplos Generación de medios de separación según el invento usando grupos R-Z diferentes

Ejemplos 1-4

Los siguientes ejemplos fueron realizados usando D,L homocisteína tiolactona Ia como un adaptador y la reacción química descrita (cf. Esquema 1 anterior). Después de la formación del enlace amida o sulfonamida mediante reacción de homocisteína tiolactona Ia con cloruros de acilos, cloruros de sulfonilos, anhídridos o ácidos activados, la apertura del enlace tiolactona fue llevada a cabo con hidrólisis básica y el compuesto resultante fue luego unido a una Sepharose® 6FF activada o Sepharose® 4FF (ambos de Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia).

Todas las disoluciones A fueron preparadas recientemente, pero es posible reutilizar la mezcla de la disolución generada a partir de la filtración después de la reacción de unión (en la Etapa 3) y hacerla luego reaccionar con otro gel. En los siguientes ejemplos el filtrado de la primera reacción (gel con una carga alilo de 411 \mumol/mL) fue además usado con un gel con una carga alilo de 250 \mumol/mL según la Etapa 1a, 2 y 3. En la Tabla 1A los resultados del gel con una carga alilo de 411 \mumol/mL son indicados por a) mientras los resultados de una carga alilo de 250 \mumol/mL son indicados con b), y los resultados con una carga alilo de 230 \mumol/mL son indicados con c).

Para los ejemplos 1 a 4 la disolución A fue preparada según la Etapa 1A con 1,58 g de DL homocisteína tiolactona, HCl (10,3 mmol) y 3,58 mL de disopropil etil amina (DIPEA) (20,6 mmol) en 6 mL de DCM.

Ejemplo 1

Cloruros de acilo

1a. La disolución B fue preparada con 2,37 g (10,3 mmol) de cloruro de 3,4,5-trimetoxi benzoílo en 4 mL de DCM y según la Etapa 1a, añadida a la disolución A. Tras la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 6 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. Según la Etapa 3, 5 mL de Sepharose® 6FF bromada (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia) con una carga alilo de 411 \mumol/mL de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 1a fue 232,6 \mumol/mL.

1b. La disolución B fue preparada con 1,80 g (10,3 mmol) de cloruro de 4-clorobenzoílo en 4 mL de DCM y según la Etapa 1a, añadida a la disolución A. Siguiendo la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 6 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. Según la Etapa 3, 5 mL de Sepharose® bromada 6FF con una carga alilo de 411 \mumol/mL de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 1b fue 251,1 \mumol/mL.

1c. La disolución B fue preparada con 2,15 g (10,3 mmol) de cloruro de 2,4-diclorobenzoílo en 4 mL de DCM y según la Etapa 1a, añadida a la disolución A. Siguiendo la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 6 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. Según la Etapa 3, 5 mL de Sepharose® 6FF bromada con una carga alilo de 411 \mumol/mL de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 1c fue 253,3 \mumol/mL.

1d. La disolución B fue preparada con 2,14 g (10,3 mmol) de cloruro de 3-(trifluorometil)benzoílo en 4 mL de DCM y según la Etapa 1a, añadida a la disolución A. Siguiendo la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 6 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. Según la Etapa 3, 5 mL de Sepharose® 6FF bromada con una carga alilo de 411 \mumol/mL de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 1d fue 239,9 \mumol/mL.

1e. La disolución B fue preparada con 2,14 g (10,3 mmol) de cloruro de 4-(trifluorometil)benzoílo en 4 mL de DCM y según la Etapa 1a, añadida a la disolución A. Siguiendo la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 6 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. Según la Etapa 3, 5 mL de Sepharose® 6FF bromada con una carga alilo de 411 \mumol/mL de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 1e fue 247,1 \mumol/mL.

1f. La disolución B fue preparada con 1,83 g (10,3 mmol) de cloruro de nicotinol en 4 mL de DCM y según la Etapa 1a, añadida a la disolución A. Siguiendo la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 6 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. Según la Etapa 3, 5 mL de Sepharose® 6FF bromada con una carga alilo de 411 \mumol/mL de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 1f fue 253,3 \mumol/mL.

1g. La disolución B fue preparada con 1,65 g (10,3 mmol) de cloruro de acetil 2-tiofeno en 4 mL de DCM y según la Etapa 1a, añadida a la disolución A. Siguiendo la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 6 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. Según la Etapa 3, 5 mL de Sepharose® 6FF bromada con una carga alilo de 411 \mumol/mL de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 1g fue 261,5 \mumol/mL.

1h. La disolución B fue preparada con 1,10 g (10,3 mmol) de cloruro de butirilo en 4 mL de DCM y según la Etapa 1a, añadida a la disolución A. Siguiendo la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 6 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. Según la Etapa 3, 5 mL de Sepharose® 6FF bromada con una carga alilo de 411 \mumol/mL de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 1h fue 260,6 \mumol/mL.

1i. La disolución B fue preparada con 1,67 g (10,3 mmol) de cloruro de octanoilo en 4 mL de DCM y según la Etapa 1a, añadida a la disolución A. Siguiendo la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 6 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. Según la Etapa 3, 5 mL de Sepharose® 6FF bromada con una carga alilo de 411 \mumol/mL de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 1i fue 233,6 \mumol/mL.

1j. La disolución B fue preparada con 1,24 g (10,3 mmol) de cloruro de isovalerilo en 4 mL de DCM y según la Etapa 1a, añadida a la disolución A. Siguiendo la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 6 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. Según la Etapa 3, 5 mL de Sepharose® 6FF bromada con una carga alilo de 411 \mumol/mL de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 1j fue 232,4 \mumol/mL.

1k. La disolución B fue preparada con 1,57 g (10,3 mmol) de cloruro de acetilo (metoxietoxi-2)-2 en 4 mL de DCM y según la Etapa 1a, añadida a la disolución A. Siguiendo la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 6 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. Según la Etapa 3, 5 mL de Sepharose® 6FF bromada con una carga alilo de 411 \mumol/mL de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 1k fue 234,0 \mumol/mL.

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Ejemplo 2

Cloruros de sulfonilo

2a. La disolución B fue preparada con 1,96 g (10,3 mmol) de cloruro de tolueno 4-sulfonilo en 4 mL de DCM y según la Etapa 1a, añadida a la disolución A. Siguiendo la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 6 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. Según la Etapa 3, 5 mL de Sepharose® 6FF bromada con una carga alilo de 411 \mumol/mL de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 2a fue 199,0 \mumol/mL.

2b. La disolución B fue preparada con 2,43 g (10,3 mmol) de 2,5-cloruro dimetoxibencenosulfonilo en 4 mL de DCM y según la Etapa 1a, añadida a la disolución A. Siguiendo la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 6 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. Según la Etapa 3, 5 mL de Sepharose® 6FF bromada con una carga alilo de 411 \mumol/mL de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 2b fue 182,6 \mumol/mL.

2c. La disolución B fue preparada con 2,40 g (10,3 mmol) de cloruro de 4-acetamidobencenosulfonilo en 4 mL de DCM y según la Etapa 1a, añadida a la disolución A. Siguiendo la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 6 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. Según la Etapa 3, 5 mL de Sepharose® 6FF bromada con una carga alilo de 411 \mumol/mL de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 2c fue 159,7 \mumol/mL.

2d. La disolución B fue preparada con 2,25 g (10,3 mmol) de cloruro de 2,4,6-trimetilbencenosulfonilo en 4 mL de DCM y según la Etapa 1a, añadida a la disolución A. Siguiendo la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 6 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. Según la Etapa 3, 5 mL de Sepharose® 6FF bromada con una carga alilo de 411 \mumol/mL de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 2d fue 176,5 \mumol/mL.

2e. La disolución B fue preparada con 1,18 g (10,3 mmol) de cloruro de metanosulfonilo en 4 mL de DCM y según la Etapa 1a, añadida a la disolución A. Siguiendo la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 6 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. Según la Etapa 3, 5 mL de Sepharose® 6FF bromada con una carga alilo de 411 \mumol/mL de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 2e fue 163,2 \mumol/mL.

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Ejemplo 3

Anhídridos

3a. La disolución B fue preparada con 2,33 g (10,3 mmol) de anhídrido benzoico en 4 mL de DCM y según la Etapa 1a, añadida a la disolución A. Siguiendo la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 6 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. Según la Etapa 3, 5 mL de Sepharose® 6FF bromada con una carga alilo de 411 \mumol/mL de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 3a fue 255,1 \mumol/mL.

3b. La disolución B fue preparada con 1,34 g (10,3 mmol) de anhídrido propiónico en 4 mL de DCM y según la Etapa 1a, añadida a la disolución A. Siguiendo la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 6 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. Según la Etapa 3, 5 mL de Sepharose® 6FF bromada con una carga alilo de 411 \mumol/mL de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 3b fue 238,3 \mumol/mL.

Ejemplo 4

Ácidos activados

4a. El ácido activado fue preparado recientemente a partir del ácido carboxílico como sigue: una disolución de 1,84 g (10,3 mmol) de ácido hipúrico y 1,13 mL de N-metilmorfolino en 20 ml de tetrahidrofurano (THF) fue enfriada por debajo de -8ºC antes de añadir lentamente 1,33 mL de isobutilcloroformiato en 5 mL de THF. Esta mezcla fue agitada 2h a 0ºC y a temperatura ambiente durante toda la noche antes de la evaporación del disolvente. La disolución B fue preparada disolviendo el material en bruto en 4 mL de DCM y añadiéndolo a la disolución A según la Etapa 1a. Siguiendo la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 6 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. Según la Etapa 3, 5 mL de Sepharose® 6FF bromada con una carga alilo de 411 \mumol/mL de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 4a fue 182,4 \mumol/mL.

Ejemplo 5 Cloruro de yodoactilo y tioles

Los siguientes ejemplos fueron realizados usando D,L homocisteína tiolactona Ia como adaptador y la reacción química descrita (cf Esquema 1 anterior). La formación de la amida fue hecha mediante la reacción de homocisteína tiolactona Ia con cloruros de yodoacetilo. Un tiol fue introducido en el ligando resultante mediante sustitución nucleofílico del halógeno restante. La apertura del enlace tiolactona fue llevada a cabo mediante hidrólisis básica y el compuesto resultante fue además unido a una Sepharose® 6FF o Sepharose® 4FF activadas.

Para todos los 5 ejemplos, la disolución A fue preparada según la Etapa 1b con 0,35 g de DL homocisteína tiolactona, HCl (2,3 mmol) y 0,841 \muL de diisopropil etil amina (DIPEA) (4,8 mmol) en 4 mL de DCM. A la mezcla de la reacción enfriada, se añadieron 0,52 g de cloruro de yodoacetilo (2,5 mmol) en 2 mL de DCM.

5a. La disolución B fue preparada con 284 \mul (2,3 mmol) de bencil mercaptano en 1 mL de DCM y según la Etapa 1b, añadida a la disolución A. Siguiendo la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 5 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. Según la Etapa 3, 4 mL de Sepharose® 6FF bromada con una carga alilo de 230 \mumol/mL de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 5a fue 118,2 \mumol/mL.

5b. La disolución B fue preparada con 243 \mul (2,3 mmol) de furfuril mercaptano en 1 mL de DCM y según la Etapa 1b, añadida a la disolución A. Siguiendo la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 5 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. Según la Etapa 3, 4 mL de Sepharose® 6FF bromada con una carga alilo de 230 \mumol/mL de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 5b fue 114,1 \mumol/mL.

5c. La disolución B fue preparada con 373 mg (2,3 mmol) de ácido 4-mercaptobenzoico en 1 mL de DCM y según la Etapa 1b, añadida a la disolución A. Siguiendo la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 5 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. Según la Etapa 3, 4 mL de Sepharose® 6FF bromada con una carga alilo de 230 \mumol/mL de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 5c fue 184,8 \mumol/mL.

5d. La disolución B fue preparada con 251 \mul (2,3 mmol) de 2-metil 1-propanotiol en 1 mL de DCM y según la Etapa 1b, añadida a la disolución A. Siguiendo la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 5 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. Según la Etapa 3, 4 mL de Sepharose® 6FF bromada con una carga alilo de 230 \mumol/mL de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 5d fue 155,0 \mumol/mL.

5e. La disolución B fue preparada con 205 \mul (2,3 mmol) de 2,2,2-trifluoro etanotiol en 1 mL de DCM y según la Etapa 1b, añadida a la disolución A. Siguiendo la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 5 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. Según la Etapa 3, 4 mL de Sepharose® 6FF bromada con una carga alilo de 230 \mumol/mL de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 5e fue
125,4 \mumol/mL.

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TABLA 1A

6

TABLA 1A (continuación)

7

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B. Tiolactona abierta mediante un agente nucleófilo I. Aminoácido

Esquema 2

Tiolactona abierta mediante un aminoácido

8

Ejemplo 6 Cloruro de benzoilo y fenil serina

El siguiente ejemplo fue realizado usando D,L homocisteína tiolactona Ia como proteína adaptadora y la reacción química descrita (cf. Esquema 2 anterior). Tras la formación de la amida unida mediante reacción con homocisteína tiolactona Ia con un cloruro de acilo, la apertura del anillo de tiolactona fue realizada con un derivado aminoacídico y el compuesto resultante fue adicionalmente acoplado a una sefarosa Sepharose® activada.

En la tabla 1B a continuación los resultados a partir del gel con una carga alilo de 230 \mumol/ml son indicados con c).

Una disolución A de 1,58 g de DL-homocisteína tiolactona, HCl (10,3 mmoles) y 3,58 ml de diisopropiletil amina (DIPEA)(20,6 mmoles) en 6 ml de DCM fue preparada y enfriada a 0ºC. Otra disolución fue preparada con 1,45 g (10,3 mmoles) de cloruro de benzoilo en 4 ml de DCM y añadida gota a gota a la disolución A. Tras 17 horas de agitación a temperatura ambiente el disolvente fue eliminado. A la mezcla en bruto, 50 ml de THF y 1,8 ml (10,3 mmoles) de DIPEA y 3,52 g (20,6 mmoles) de hidrato de DL-fenilserina fueron añadidos. La reacción fue calentada a 50ºC durante toda la noche. El disolvente fue eliminado al vacío y 50 ml de una disolución de carbonato potásico al 10% en agua fue añadida. La fase acuosa fue lavada con acetato de etilo (EtOAc) (3x15 ml), acidificada con ácido cítrico y extraída con EtOAc (3 x 15 ml). La fase orgánica fue secada con sulfato sódico y concentrada al vacío.

6 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fueron añadidos al material en bruto. 5 ml de Sepharose® 6FF bromada con una carga alilo de 230 \mumol/ml de gel fue añadido a la mezcla alcalina y calentada a 50ºC durante toda la noche. Tras la reacción, el gel (1 volumen) fue filtrado y lavado con agua (2 x 15 vol.), etanol (2 x 15 vol.), ácido acético 0,2 M (2 x 15 vol.) y agua (2 x15 vol.). La capacidad iónica de los geles fue luego medida mediante valoración del ácido. Las evaluaciones cromatográficas de estos geles son mostradas en la Tabla 1B a continuación. La capacidad iónica del gel 6 fue 148,3 \mumol/ml.

2. Amina

Esquema 3

Tiolactona abierta mediante una amina

9

Ejemplo 7 Anhídrido succínico y anilina

El siguiente ejemplo fue realizado usando D,L homocisteína tiolactona Ia como proteína adaptadora y la reacción química descrita (cf. Esquema 3 anterior). Tras la formación de la amida unida mediante reacción de la homocisteína tiolactona Ia con un anhídrido, la apertura del anillo de tiolactona fue realizado con una amina y el compuesto resultante se unió además a una Sepharose® activada.

En la Tabla 1B a continuación los resultados del gel con una carga alilo de 230 \mumol/ml son indicados con c).

Una disolución de 1,58 g de DL-homocisteína tiolactona, HCl (10,3 mmoles) y 3,58 ml de diisopropil etil amina (DIPEA) (20,6 mmoles) en 50 ml de metanol fue preparada y enfriada a 0ºC. 0,93g (9,3 mmoles) de anhídrido succínico fue añadido en pequeñas porciones a la tiolactona. Tras 17 h de agitación a temperatura ambiente el disolvente fue eliminado.

A la mezcla en bruto, 20 ml de THF y 1,3 ml (15,3 mmoles) de fueron añadidos. La reacción se hizo circular con reflujo a lo largo de toda la noche. El disolvente fue eliminado al vacío y 50 ml de una disolución de carbonato potásico al 10% en agua fue añadida. La fase acuosa fue lavada con acetato de etilo (EtOAc) (3 x 15 ml), acidificada con ácido cítrico y extraída con EtOAc (3 x 15 ml). La fase orgánica fue secada con sulfato sódico y concentrada al vacío.

6 ml de una disolución de hidróxido sódico 5 N fue añadida a la mezcla alcalina y calentada hasta 50ºC durante toda la noche.

Tras la reacción el gel (1 volumen) fue filtrado y lavado con agua (2 x 15 vol.), etanol (2 x 15 vol.), ácido acético 0,2 M (2 x 15 vol.) y agua (2 x 15 vol.). la capacidad iónica de los geles fue entonces medida mediante valoración del ácido. Las evaluaciones cromatográficas de estos geles son mostradas en la Tabla 1B a continuación.

La capacidad iónica del gel 7 fue 155,1 \mumol/ml.

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TABLA 1B

10

Ejemplos 8-11

Optimización de la matriz

Una mezcla de reacción puede ser usada varias veces para reaccionar con diferentes matrices, y/o para una misma matriz diferentes niveles de carga de alilo.

Ejemplo 8

Nivel 1:

El gel 1j fue preparado como se describe anteriormente. La disolución B fue preparada con 1,24 g (10,3 mmoles) de cloruro de isovalerilo en 4 ml de DCM y según la Etapa 1a, añadida a la disolución A. Tras la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 6 ml de una disolución de hidróxido sódico 5 N fue añadida al material en bruto. De acuerdo con la Etapa 3, 5 ml de Sepharose® 6FF bromada con una carga alilo de 411 \mumol/ml de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 1j fue 232,4 \mumol/ml. Las evaluaciones cromatográficas (retención y capacidad) de este gel son mostradas en la tabla 2.

Nivel 2:

La disolución resultante de la filtración directamente tras el acoplamiento a la matriz a 411 \mumol/ml (nivel 1) fue hecha reaccionar con una Sepharose® 6FF activada con una carga alilo de 250 \mumol/ml. El acoplamiento fue hecho de acuerdo con la Etapa 3. El gel 1j-2 generado presenta una capacidad iónica de 162,8 \mumol/ml. Las evaluaciones cromatográficas (retención y capacidad) de este gel son mostradas en la tabla 2.

Nivel 3:

La disolución resultante de la filtración directamente después del acoplamiento a la matriz a 250 \mumol/ml (nivel 2) fue hecha reaccionar con una Sepharose® 6FF activada con una carga alilo de 138 \mumol/ml. El acoplamiento fue hecho según la etapa 3. El gel 1j-3 generado presenta una capacidad iónica de 104,2 \mumol/ml. Las evaluaciones cromatográficas (retención y capacidad) de este gel son mostradas en la tabla 2 a continuación.

Ejemplo 9

Nivel 1:

El gel 3a fue preparado como se describe en la parte A: la disolución B fue preparada con 2,33 g (10,3 mmoles) de anhídrido benzoico en 4 ml de DCM y según la Etapa 1a, añadido a la disolución A. Tras la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 6 ml de una disolución de hidróxido sódico 5 N fue añadida al material en bruto. Según la Etapa 3, 5 ml de Sepharose® 6FF bromado con una carga alilo de 411 \mumol/ml de gel fue añadido a la mezcla. La capacidad iónica del gel 3a fue 255,1 \mumol/ml. Las evaluaciones cromatográficas (retención y capacidad) de este gel son mostradas en la tabla 2.

Nivel 2:

La disolución resultante de la filtración directamente después del acoplamiento a la matriz a 411 \mumol/ml fue hecha reaccionar con una Sepharose®6FF activada con una carga alilo de 250 \mumol/ml. El acoplamiento fue hecho según la Etapa 3. El gel 3a-2 generado presenta una capacidad iónica de 196,0 \mumol/ml. Las evaluaciones cromatográficas (retención y capacidad) de este gel son mostradas en la tabla 2.

Nivel 3:

La disolución resultante a partir de la filtración directamente tras el acoplamiento a la matriz a 250 \mumol/ml fue hecha reaccionar con una Sepharose® 6FF activada con una carga alilo de 138 \mumol/ml. El acoplamiento fue hecho según la etapa 3. El gel 3a-3 generado presenta una capacidad iónica de 117,4 \mumol/ml. Las evaluaciones cromatográficas (retención y capacidad) de este gel son mostradas en la tabla 2.

Ejemplo 10

Nivel 1:

La disolución B fue preparada con 1,24 g (10,3 mmoles) de cloruro de isovalerilo en 4 ml de DCM y según la Etapa 1a (procedimientos generales), añadida a la disolución A. Tras la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 6 ml de una disolución de hidróxico sódico 5 N fue añadida al material en crudo. Según la Etapa 3, 5 ml de Sepharose® 4FF bromada con una carga alilo de 580 \mumol/ml de gel fueron añadidos a la mezcla. La capacidad iónica del gel 1j-4 fue 108,4 \mumol/ml. Las evaluaciones cromatográficas (retención y capacidad) de este gel son mostradas en la tabla 2.

Nivel 2:

La disolución resultante de la filtración directamente después del acoplamiento a la matriz a 580 \mumol/ml fue hecha reaccionar con una Sepharose® 4FF activada con una carga alilo de 240 \mumol/ml. El acoplamiento fue hecho según la Etapa 3. El gel 1j-5 generado presenta una capacidad iónica de 128,1 \mumol/ml. Las evaluaciones cromatográficas (retención y capacidad) de este gel son mostradas en la tabla 2.

Ejemplo 11

Nivel 1:

La disolución B fue preparada con 2,33 g (10,3 mmoles) de anhídrido benzoico en 4 ml de DCM y según la Etapa 1a, añadida a la disolución A. Tras la Etapa 2 el disolvente fue eliminado y 6 ml de una disolución de hidróxido sódico 5N fue añadido al material en crudo. Según la etapa 3, 5 ml de Sepharose® 4FF bromada con una carga alilo de 580 \mumol/ml de gel fue añadida a la mezcla. La capacidad iónica del gel 3a-4 fue 148,1 \mumol/ml. Las evaluaciones cromatográficas (retención y capacidad) de este gel son mostradas en la tabla 2.

Nivel 2:

La disolución resultante a partir de la filtración directamente tras el acoplamiento a la matriz a 580 \mumol/ml ml fue hecha reaccionar con una Sepharose® 4FF activada con una carga alilo de 240 \mumol/ml. El acoplamiento fue hecho según la Etapa 3. El gel 3a-5 generado presenta una capacidad iónica de 144,7 \mumol/ml. Las evaluaciones cromatográficas (retención y capacidad) de este gel son mostradas en la tabla 2.

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TABLA 2

11

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Ejemplos 12-14

Procedimientos de referencia experimental para intercambiadores iónicos Materiales Disoluciones tampón

Tampón 1: fosfato sódico 20 mM, NaCl 0,3 M, pH 6,8

Tampón 2: acetato sódico 20 mM, NaCl 0,25 M, pH 4,0

Tampón 3: acetato sódico 20 mM, NaCl 0,25 M, pH 4,5

Tampón 4: fosfato sódico 20 mM, NaCl 2 M, pH 6,8

Tampón 5: fosfato sódico 100 mM, pH 7,0 (para elución de BSA e IgG)

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Disoluciones proteicas

1.: BSA: 4 mg/ml en Tampón

2.: IgG: 4 mg/ml en Tampón 3

Todos los tampones y disoluciones proteicas fueron filtrados a través de filtros Millipore Millex HA de 0,45 \mum antes de su uso.

Sistema cromatográfico

Todos los experimentos fueron realizados a temperatura ambiente usando un sistema de cromatografía AKTA Explorer 100 (Amersham Pharmacia Biotech AB) equipado con un software Unicorn 3.1. Las muestras fueron aplicadas a las columnas via una superloop de 150 ml. Un caudal de 1 ml/min (aprox 300 cm/h) fue usada a lo largo de todo el proceso. Los eflujos fueron monitorizados de modo continuo mediante medidas de absorbancia a 280 nm usando una celda de flujo de 10 mm.

Ejemplo 12

Análisis frontal, ligando de "elevada salinidad"

Cada intercambiador catiónico prototipo fue empaquetado en columnas HR5/5 (volumen del lecho empaquetado = 1 ml) y equilibrado con un tampón de pH y concentración salina apropiados. El volumen muerto del sistema fue determinado aplicando una disolución de una proteína adecuada a la columna en condiciones de no unión. El tiempo que lleva para la A_{280} del eflujo para alcanzar 10% del A_{280} de la proteína aplicada es tomado como el volumen muerto del sistema (expresado en minutos).

A una columna equilibrada con un tampón apropiado (Tampón 1, 2 ó 3) se alimentó de modo contínuo (por ejemplo vía un superloop de 150 ml) la proteína muestra disuelta en el tampón de equilibrio apropiado (véase anteriormente) a un caudal de 1 ml/min (es decir aprox. 300 cm/h). la aplicación de la muestra fue continuada hasta que la A_{280}del efluente alcanzó un nivel de 10% del A_{280} de la muestra aplicada a la columna. En base a los datos así obtenidos [es decir el volumen del lecho del gel empaquetado (Vc), su volumen inicial, caudal y concentración de la proteína alimentada a la columna, la capacidad de permeabilidad del gel empaquetado a un nivel de 10% de la concentración de la proteína aplicada a ella (QB _{10%}) puede ser calculada.

Ejemplo 13

Permeabilidad y evaluación

La permeabilidad a un nivel de 10% del máximo de absorbancia (Qb_{10%}) fue calculada usando la siguiente relación:

Qb_{10%} \approx (T_{R10%} -T_{RD}) x C/V_{c}

en la que:

T_{R10%} = tiempo de retención (min) a 10% del máximo de absorbancia

T_{RD} = volumen muerto del sistema (en minutos),

C = concentración de la proteína alimentada (4 mg/ml) y,

V_{c}= volumen de lecho empaquetado (ml) de la columna

Ejemplo 14

Recuperación de las proteínas unidas a ligandos de intercambio catiónico de "elevada salinidad"

Ligandos de intercambio catiónico de "elevada salinidad" serán preferiblemente también cribados con respecto a la recuperación de las proteínas unidas sobre ellas. Esto es un criterio adicional e importante para elegir los tipos adecuados de ligandos que combinan relativamente capacidades de elevada absorción con recuperaciones elevadas o cuantitativas de proteínas aplicadas a las mismas.

Claims

1. Un método para generar un medio de separación que comprende ligandos intercambiadores catiónicos de modo mixto acoplados a una matriz base, método que comprende las etapas de

(a) proporcionar al menos una proteína adaptadora, cada una de las cuales comprende una grupo F funcional y exhibe una estructura de núcleo cíclico;

(b) derivatizar la(s) proteína(s) adaptadora(s) con un reactivo que comprende un grupo Z reactivo acoplado a un residuo R mediante reacción del grupo F de dicho adaptador con el grupo reactivo de dicho reactivo, mientras que conserva la estructura cíclica del adaptador;

(c) abrir la estructura cíclica del derivado resultante; y

(d) reactivar el producto abierto así obtenido con una matriz base que comprende un grupo reactivo, que está opcionalmente acoplada a la matriz base vía un espaciador; en el que dicha proteína adaptadora presenta al menos dos funcionalidades, una de las cuales es un grupo que comprende un azufre para acoplar al grupo reactivo de la matriz base y otra de las cuales es un grupo que puede ser transformado en un grupo iónico, estando dichas funcionalidades presentes en la estructura cíclica en posiciones adyacentes, y en las que en la etapa (c), la apertura es proporcionada para romper el enlace entre dos funcionalidades y en las que la proteína adaptadora está definida por la fórmula general (I)

13

en la que A, B y X independientemente entre sí, son átomos de carbono o cualquier heteroátomo, tales como oxígeno, azufre, nitrógeno y/o silicio, m es cualquier número entero entre 1 y 4, tal como 1-3, preferiblemente 1 ó 2, y el grupo funcional F está representado bien por una X o aparece acoplado a uno cualquiera de A, B y X, opcionalmente vía un adaptador, estando dicho adaptador comprendido de 1-50 átomos.

2. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que en la fórmula (I), el grupo F funcional es seleccionado de entre un grupo que contiene un grupo saliente tal como se usa convencionalmente en sustituciones nucleofílicas, tal como C-Y en el que Y representa por ejemplo Br, Cl, I, mesilato, o un grupo tosilato; un ácido o un ácido activado tal como WC=O, en el que W está por ejemplo formado a partir de N-hidroxisuccinimida, pentafluorofenol, para-nitrofenol o isopropil cloroformiato; un grupo nucleofílico tal como por ejemplo -OH, -SH Ó NH2; y un C=C.

3. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que en la fórmula (I), A, B, y X son átomos de carbono, m es 1 y F es -NH_{2}.

4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que en la fórmula (I), la proteína adaptadora es homocisteína tiolactona:

14

5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el agente de derivatización usado en la etapa (b) puede ser descrito mediante la fórmula general

(II)-Z-R-

en la que

Z es un grupo que es capaz de reaccionar con el grupo funcional F de la proteína adaptadora; y

R es un grupo lineal, ramificado, saturado cíclico, hidrocarbonato insaturado y aromático, que comprende preferiblemente alrededor de 1-20, tal como 1-10 átomos de carbono.

6. Un método para generar un medio de separación que comprende ligandos intercambiadores catiónicos en modo mixto acoplados a una matriz base, método que comprende las etapas de

(a) proporcionar al menos un derivado de la proteína adaptadora que tiene una estructura cíclica;

(b) abrir la estructura cíclica del derivado; y

(c) hacer reaccionar el producto abierto así obtenido con una matriz base que comprende un grupo reactivo, que está opcionalmente acoplado a la matriz base ví a un espaciador; en el que dicho derivado de la proteína adaptadora está definido por la fórmula general (III)

16

en la que A, B y X independientemente entre sí son átomos de carbono o cualquier heteroátomo, tales como oxígeno, azufre, nitrógeno, y/o sílicio, y m es un número entre 1 y 4, tal como 1-3, preferiblemente 1 ó 2, estando dichas funcionalidades presentes en la estructura cíclica en posiciones adyacentes, y en las que en la etapa (c), la apertura se proporciona mediante la ruptura del enlace entre dichas dos posiciones adyacentes, y en la que un Z-R está acoplado a uno cualquiera de A, B y X.

7. Un método según la reivindicación 6, en el que R es un grupo lineal, ramificado, cíclico saturado, hidrocarbono insaturado y aromático, que comprende preferiblemente alrededor de 1-20, tal como átomos de carbono de 1-10.

8. Un método según la reivindicación 6 ó 7, en el que el derivado de la proteína adaptadora es un derivado de homocisteína tiolactona.

9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que también incluye una etapa de bromación separada y antes de la etapa (b) del grupo reactivo de la matriz base, en el que dicho grupo reactivo es un doble enlace carbono-carbono.

10. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que también incluyen una etapa de activación y separadamente y antes de la etapa (b) del grupo reactivo de la matriz base en condiciones que favorecen la reacción del radical, en el que dicho grupo reactivo es un doble enlace carbono-carbono.