ES2273407T3

ES2273407T3 - Procedimiento para introducir una funcionalidad.

Info

Publication number: ES2273407T3
Application number: ES98908406T
Authority: ES
Inventors: Jan Bergstrom; Rolf Berglund; Lennart Soderberg
Original assignee: GE Healthcare Bio Sciences AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 1997-03-04
Filing date: 1998-03-04
Publication date: 2007-05-01
Anticipated expiration: 2018-03-04
Also published as: AU6644198A; WO1998039364A1; DE69836126D1; EP0966488A1; SE9700768D0; US6426315B1; JP4368424B2; EP0966488B1; JP2001516376A; ATE342284T1; DE69836126T2

Abstract

PROCEDIMIENTO PARA LA INTRODUCCION, EN CAPAS DE UNA MATRIZ POROSA, QUE COMPRENDE LOS GRUPOS A, DE UNA FUNCIONALIDAD UTILIZANDO UN REACTIVO I, INTRODUCIENDO LA FUNCIONALIDAD MEDIANTE UNA REACCION CON LOS GRUPOS A. LA INVENCION SE CARACTERIZA PORQUE LA MATRIZ SE PONE EN CONTACTO CON UNA DEFICIENCIA FUNCIONAL DE REACTIVO I Y PORQUE LAS CONDICIONES Y EL REACTIVO I SE ELIGEN DE MODO QUE LA REACCION ENTRE EL REACTIVO I Y LOS GRUPOS A SEA MAS RAPIDA QUE LA DIFUSION DEL REACTIVO I EN LA MATRIZ.

Description

Procedimiento para introducir una funcionalidad.

Campo técnico y uso de la invención

La invención se refiere a un procedimiento para preparar matrices porosas multifuncionales. En la actualidad, el uso principal de las matrices inventivas es la separación de uno o más componentes de una mezcla de componentes disueltos o dispersados en un líquido. Las matrices también pueden ser usadas como fases sólidas para: a) la síntesis de oligopéptidos y oligonucleótidos; b) los métodos de análisis y determinación que utilizan reacciones de afinidad, etc. Hay también otros usos.

Las separaciones corrientes implican que un líquido que contiene el(los) componente(s) es puesto en contacto con una matriz, en la que el(los) componente(s) a separar es/son escindido(s) hacia la matriz y es/son separado(s) de este modo de los componentes restantes, que son escindidos hacia la matriz de manera diferente, incluyendo no escindidos en absoluto.

Por la expresión "escindidos hacia la matriz" se quiere decir que un componente se une o se adsorbe de otra manera sobre/dentro de la matriz.

Por componentes se quiere decir sustancias individuales/estructuras complejas que incluyen células enteras y partes de las mismas.

Fundamentos técnicos-síntesis de matrices de separación y problemas asociados.

Para obtener componentes con una pureza suficientemente alta, a menudo se deben usar en etapas separadas varias matrices de separación con diferente función. Esto ha llevado a ideas de crear matrices multifuncionales, que darían una reducción en el número de etapas de separación. Véase, p.ej., la solicitud de patente de los autores de la invención "Matrices para separación y método de separación que explota dichas matrices", que ha sido presentada al mismo tiempo que esta solicitud. Los autores de la invención describen allí matrices que implican dos o más capas distintas que son diferentes con respecto a las características de separación.

La síntesis de matrices con características de separación dadas ha implicado a menudo hacer reaccionar una matriz base, que exhibe grupos funcionales A, con un reactivo I, el cual, mediante la reacción con los grupos A, da a la matriz una funcionalidad nueva. A ha sido a menudo hidroxi, amino (primario, secundario y terciario), tiol, carboxi (-COOH/-COO-), alquenilo, tal como alilo, halógeno, etc. y las formas correspondientes activadas (reactivas). Dado que los grupos A están localizados usualmente por toda la matriz, las técnicas conocidas anteriores han implicado que las funcionalidades introducidas han tenido una localización similar por todas las matrices. Por una funcionalidad introducida se quiere decir bien un grupo reactivo o bien un grupo que contribuye a las características de separación de la matriz. Los grupos reactivos introducidos se han utilizado entonces para crear grupos, que contribuyen a las características de separación de la matriz u otras características que se desean utilizar en forma vinculada a la matriz.

El documento US-A-3.959.251 se refiere a una cuenta de agar o agarosa reticulada químicamente, que cumple las exigencias de los tamices moleculares mejor que los productos conocidos anteriormente. La reticulación se obtiene, p.ej., por contacto con un epóxido en un ambiente libre de oxígeno, e incluye una reducción durante la reticulación. La reticulación obtenida estará distribuida uniformemente dentro del gel.

El documento EP-A-O 203 049 se refiere a geles rígidos de polisacáridos, y más específicamente a un método de aumento controlado de la longitud de la reticulación. Esto se consigue mediante el uso de un reactivo monofuncional que contiene un grupo enmascarado en un método de reticulación, en el que dicho reactivo reaccionará en primer lugar como monómero y no actuará como reticulador hasta después de su activación. Como anteriormente, la reticulación obtenida estará distribuida uniformemente.

Según las técnicas anteriores, no ha sido posible introducir en matrices porosas funcionalidades en capas. Hay una necesidad de nuevos métodos.

Objeto de la invención

El principal objeto de la invención es hacer posible la preparación de matrices porosas, que en su parte interior exhiben capas con diferentes funciones, para matrices de separación, usualmente capas con diferentes funciones separadoras (capas de separación).

La invención

La invención es un método para introducir una funcionalidad en una matriz porosa según la metodología mencionada en los Fundamentos Técnicos. La invención introduce una funcionalidad deseada en una o más capas bien definidas en la matriz. La invención se caracteriza porque

a): la cantidad de reactivo I, con el que se pone en contacto la matriz, es deficiente comparada con los grupos A que existen antes de la reacción con el reactivo I, y

b): el reactivo I y las condiciones de reacción se seleccionan para que la reacción entre el reactivo I y el grupo A sea rápida comparada con el transporte del reactivo I en la matriz (la reacción con el grupo A es rápida comparada con la difusión del reactivo I en la matriz).

Por deficiencia se quiere decir que la cantidad de reactivo no es suficiente para una reacción con todos los grupos A en la matriz. Una capa interna de la matriz permanecerá sin reaccionar al mismo tiempo que una capa con una nueva funcionalidad es introducida por el reactivo I. Cuando se calcula la deficiencia, se debe tener en cuenta que el reactivo I puede ser mermado en reacciones secundarias, mediante vaporización, etc.

Por reacción rápida entre el grupo A y el reactivo I se entiende también que el reactivo I es adsorbido localmente a un grupo A en una reacción físico-química rápida. En este caso, el reactivo I puede ser estabilizado en la matriz por adición de uno o más reaccionantes adicionales que promueven la unión local a la matriz.

El grupo A acorde con la invención se selecciona entre hidroxi, amino, carboxi (-COOH/-COO-), mercapto y dobles enlaces carbono-carbono.

El reactivo I puede ser cualquier compuesto que se una más rápidamente a la matriz de lo que se está difundiendo a través de la matriz, a condición de que introduzca la función pretendida. La relación entre la velocidad de difusión y la velocidad de reacción con A puede ser optimizada por la selección apropiada del reactivo I, teniendo en cuenta que la funcionalización de capas es promovida incrementando la reactividad del reactivo I por el grupo A, y también incrementando el tamaño del reactivo I. La reactividad está influenciada a menudo por el disolvente, el pH, la temperatura. Las condiciones adecuadas se seleccionan según la práctica convencional para cada reactivo y el tipo de reacción que se va a realizar. Los disolventes orgánicos polares y no polares, así como disolventes orgánicos de polaridad intermedia y mezclas de los mismos unos con otros, y donde sea apropiado también con agua, pueden ser a menudo más adecuados para el procedimiento de la invención que el agua pura.

El reactivo I puede ser un compuesto que introduce la funcionalidad deseada, a condición de que las condiciones apropiadas para que esto ocurra se cumplan (reacción rápida con los grupos comparada con el transporte en la matriz). Para la síntesis de matrices de separación, en este caso la reacción del reactivo I con A introduce la característica separadora en una capa predeterminada.

El reactivo I también puede ser el llamado reactivo de activación. Estos se utilizan usualmente para introducir grupos reactivos que son necesarios para una funcionalización adicional y el uso de la matriz según la parte introductoria. Los reactivos de activación pueden ser electrófilos, nucleófilos, basados en radicales libres, etc.

En la fecha de prioridad los autores de la invención han trabajado principalmente con el reactivo I en forma de reactivos electrófilos. Son ejemplos X_{2} ó XOH (donde X es un halógeno tal como cloro, bromo, yodo) o cualquier otro reactivo de halogenación que libere fácilmente un halógeno cargado positivamente o sin carga. La mayoría de los reactivos de halogenación, especialmente X_{2} o XOH, dan una reacción instantánea con los dobles enlaces carbono-carbono. Los dobles enlaces carbono-carbono pueden dar como resultado dihaluros vecinos o halohidrinas como grupos reactivos, los cuales se convierten fácilmente en grupos epoxi reactivos.

Usualmente, los grupos reactivos como tales no contribuyen con ninguna característica de separación útil. Por tanto, a menudo se hacen reaccionar adicionalmente con un compuesto B, que introduce la característica de separación deseada en la capa que ha sido activada según la invención. Más adelante se dan características de separación particulares, que pueden ser introducidas por el uso de un compuesto B, bajo el título "Características de separación introducidas". El compuesto B se puede seleccionar para introducir grupos reactivos que a su vez se pueden utilizar para introducir características de separación mediante la reacción con un compuesto C. Teóricamente, puede ser posible usar secuencias de reacción más largas. A condición de que pueda disponerse que los compuestos B, C, etc. se difundan más despacio de lo que reaccionan con grupos introducidos previamente, la invención también se puede aplicar a cada una de las reacciones entre el compuesto B, C, etc. y grupos reactivos introducidos previamente.

Si se requiere, puede ser adecuado introducir grupos protectores que pueden ser retirados más tarde. Por ejemplo, si un reactivo (reactivo I, compuesto B, C, etc.) es para ser transportado a través de una capa en la que hay grupos que destruyen el reactivo.

El grado de reticulación, la densidad o la porosidad de la matriz es una clase especial de funcionalidad. Puede ser cambiada capa a capa sin añadir un compuesto B. Para la combinación doble enlace carbono-carbono, como grupo A, y X_{2} ó XOH como reactivo I, la reticulación se puede conseguir en la capa activada según la invención mediante un simple cambio de pH después de la activación (realmente una adición de OH^{-} (= compuesto B)). Alternativamente, en algunos casos la activación se puede conseguir a un pH que posibilite la reticulación.

Se obtiene usualmente una capa superficial hidrófila, si el compuesto B es agua, OH^{-} o algún otro nucleófilo de bajo peso molecular e hidrófilo, que puede reaccionar con un grupo reactivo introducido. Si se desea, los grupos A restantes en la parte

\hbox{interior de la matriz pueden ser
utilizados después para una funcionalización,  p.ej., según la
invención.}

Después de que se ha introducido una característica de separación en una capa, se pueden introducir capas con otras características de separación. Por ejemplo, mediante una activación renovada de la matriz seguido de una reacción con un compuesto B' que introduce características de separación distintas a las obtenidas con el compuesto B. Las capas adicionales no tienen que ser introducidas necesariamente según el procedimiento de la invención. También en este caso puede haber una necesidad de introducir grupos protectores.

Matrices base que se pueden usar en el procedimiento de la invención

Las matrices base adecuadas están a menudo en la forma de partículas. Deben ser insolubles pero humedecibles y a menudo también hinchables en el medio líquido en el que se van a usar. Sus superficies interior y exterior pueden ser cualesquiera, desde hidrófilas a hidrófobas. Se consiguen características hidrófilas si las matrices, en su superficie interior y exterior, exhiben grupos hidrófilos tales como hidroxi (-OH), amino (-NH_{2}), carboxi (-COOH/-COO-), amido (-CONH_{2}), grupos repetitivos -OCH_{2}CH_{2}- y -OCH_{2}CH_{2}CH_{2}-, -OCH_{2}CH_{2}(CH_{3})-. Se pueden conseguir características hidrófobas si están presentes, de manera correspondiente, grupos hidrófobos, p.ej., grupos hidrocarbonados que contienen 2 o más átomos de carbono. Para una hidrofilicidad/hidrofobocidad intermedia, la superficie de la matriz exhibe a menudo grupos de ambos tipos.

Las matrices se construyen típicamente de polímeros orgánicos o inorgánicos, que pueden ser de origen sintético o biológico. Especialmente, se pueden mencionar los llamados biopolímeros.

Son matrices orgánicas hidrófilas bien conocidas unos polímeros que exhiben varios grupos hidrófilos de los tipos mencionados anteriormente. Son polímeros hidrófilos conocidos los llamados polímeros y poliamidas polihidroxilados, principalmente polímeros que son insolubles en medios acuosos, y basados por ejemplo en poli(alcohol vinílico), poli(metacrilatos de hidroxialquilo) y los correspondientes acrilatos, amidas poliacrílicas y polimetacrílicas (p.ej. amidas trisacrílicas y amidas trismetacrílicas (tris= (HOCH_{2}CH_{2})_{3}CNH_{3}), polisacáridos tales como agarosa, dextrano, almidón, pululano y celulosa, opcionalmente reticulados para hacerles adecuados como matrices de
separación.

Son matrices orgánicas hidrófobas bien conocidas las formas porosas de polímeros de estireno-divinilbenceno, poli(metacrilatos de alquilo), polímeros de hidrocarburos perfluorados (PFC).

Las variantes inorgánicas de las matrices de separación pueden estar basadas en formas porosas de vidrio, zeolitas, gel de sílice, materiales compuestos, óxido de zirconio.

Se le puede dar la hidrofilicidad/hidrofobicidad deseada a las matrices hidrófilas, las matrices hidrófobas, las matrices inorgánicas, mediante una hidrofilización/hidrofobización.

Las matrices más preferidas en la fecha de prioridad se basaron en

a): agarosa en la forma de cuentas opcionalmente reticuladas y opcionalmente también derivatizadas con dextrano en los poros, p.ej., los grados comercializados bajo los nombres de Sepharose® y Superdex®, respectivamente,

b): dextrano reticulado en la forma de cuentas, p.ej., los grados comercializados bajo el nombre de Sephadex®,

c): celulosa, p.ej., los grados comercializados bajo el nombre de Sephacel®,

d): partículas porosas reticuladas de poliacrilamida derivatizada con dextrano en los poros, p.ej., Sephacryl®, y

e): partículas porosas monodispersadas y polidispersadas, entre otros, de un material sustancialmente hidrófobo, p.ej., un polímero de estireno-divinilbenceno, que han sido hidrofilizadas, p.ej. los grados comercializados bajo los nombres de Monobeads® y Source®.

Estas marcas registradas corresponden a productos de Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia.

La densidad de las matrices puede ser más alta, más baja o la misma que el medio líquido en el que se usarán (densidad para la matriz saturada con el medio líquido). Las matrices en forma de partículas pueden contener agentes de carga que determinan su densidad. Véanse, p.ej., los documentos WO-A-9200799 (Kem-En-Tek/Upfront Chromatography) y WO 9118237 (Pharmacia Biotech AB).

Los requerimientos con respecto a la porosidad (límite de exclusión) de las matrices de separación están determinados principalmente por el peso en moles y la forma de los compuestos que se van a separar. Para la invención, es importante también que la porosidad permita el transporte dentro de la matriz del reactivo I y a menudo también del compuesto B.

\newpage

Los límites de exclusión interesantes están, de manera general, en el intervalo de 0,3-10^{5} nm (3-10^{6} \ring{A}). Dentro del campo técnico del solicitante, y el futuro poseedor de la patente, puede ser especialmente ventajoso con límites de exclusión que sean al menos 1 nm (10 \ring{A}).

Característica de separación introducida

Las características de separación de la matriz están a menudo determinadas por los grupos que lleva. Los grupos comunes en este contexto son:

1.: grupos de intercambio iónico

2.: grupos de bioafinidad

3.: grupos hidrófobos

4.: grupos que se pueden utilizar para cromatografía covalente

5.: grupos que contienen azufre, p.ej. para la llamada interacción tiofílica

6.: quelatos o grupos quelantes,

7.: grupos con sistemas aromáticos que dan lugar a la llamada interacción \pi-\pi con diferentes compuestos

8.: grupos que dan enlaces de hidrógeno

9.: grupos reticuladores

10.: grupos hidrófilos

11.: grupos poliméricos.

En el contexto de la invención, se dispone a menudo que el compuesto B ó B' o las correspondientes entidades en reacciones posteriores exhiban cualquiera de los grupos 1-11. Estos grupos también pueden ser creados como consecuencia de la reacción entre el compuesto B y grupos reactivos que son introducidos en una capa según la invención en una etapa anterior. Esto último es especialmente cierto para los grupos más pequeños del tipo 1 o cualquiera de los tipos 3-9. En algunos casos, los grupos también pueden ser introducidos directamente con el reactivo I.

Los grupos de intercambio iónico pueden ser de intercambio aniónico, tales como el grupo amonio primario, secundario, terciario o cuaternario, el grupo sulfonio, etc., o de intercambio catiónico, tales como carboxilato (-COO-),
fosfonato o fosfato (-PO_{3}^{2-} y -OPO_{3}^{2-}, respectivamente), sulfonato o sulfato (-SO_{3}^{-} y -OSO_{3}^{-} respectiva- mente) etc. En los grupos -COO-, -PO_{3}^{2-}, -OPO_{3}^{2-}, -SO_{3}^{-} y -OSO_{3}^{-} la valencia libre se une directamente a un átomo de carbono.

Unos grupos de bioafinidad bien conocidos son los miembros simples de los pares a) antígeno/hapteno y anticuerpo (incluyendo el fragmento de unión al antígeno o hapteno del mismo), b) ácido nucleico y su homólogo complementario, c) lectina y una estructura de carbohidrato, d) proteína que se une a IgG y proteína que exhibe la parte de IgG que se une a tal proteína, e) sistemas de afinidad basados en sentido y antisentido, etc. Los grupos de bioafinidad también incluyen grupos que se originan a partir de moléculas orgánicas preparadas sintéticamente y que "imitan" la afinidad por la afinidad bioespecífica natural, los llamados "miméticos".

Los grupos hidrófobos son a menudo grupos hidrocarbonados que contienen pocos o ningún átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre. Los ejemplos típicos de grupos hidrófobos son los grupos hidrocarbonados saturados, insaturados o aromáticos lineales, ramificados y cíclicos.

Entre los grupos que se pueden utilizar para la cromatografía covalente se pueden mencionar los grupos disulfuro, principalmente grupos disulfuro reactivos (-S-S-R^{1}) y grupos tiol (-SH) libres. Un ejemplo de R^{1} es el 2-piridilo. Para ejemplos adicionales de R^{1}, véase p.ej. la patente de EE.UU. 4.647.655 (Pharmacia AB).

Entre los grupos que contienen azufre que se pueden utilizar para la interacción tiofílica se pueden mencionar grupos que son esencialmente hidrófobos pero en los que hay una o más estructuras de tioéter. Véase p.ej. el documento WO-A-9533557, de Oscarsson y Porath; el documento EP-A-165912, de Porath; y el documento EP-A-168363, de Porath.

Se han utilizado anteriormente grupos que se unen mediante hidrógeno (Belew, Berglund, Bergström, Söderberg, documento SE 9600590-5 (= WO 97 29825).

Este tipo de grupo exhibe a menudo un grupo amonio (primario, secundario o terciario) de intercambio aniónico débil, con un grupo hidroxi a una distancia de 2 ó 3 átomos de carbono del nitrógeno del amonio.

Los grupos reticuladores se pueden introducir directamente mediante el uso del reactivo I. Véase más arriba. Alternativamente, se puede utilizar un compuesto B, que es capaz de unirse a dos o más grupos reactivos simultáneamente.

Los grupos hidrófilos acordes con la invención son principalmente hidroxi simple e hidroxialquilo inferior con uno o más grupos hidroxilo, o grupos que contienen los grupos repetitivos -CH_{2}CH_{2}O-. Los grupos son a menudo de bajo peso molecular, p.ej. de menos que 25 átomos de carbono.

Los grupos poliméricos con o sin ligandos pueden dar características de filtración en gel. Los polímeros pueden ser reticulados.

Los grupos adecuados se acoplan típicamente a la matriz mediante un puente, que puede ser de estructura variada, según las técnicas conocidas. La estructura de puente puede ser polimérica, p.ej. un polímero hidrófilo o hidrófobo, que tiene uno o más de los grupos 1-11 según los anteriores en cada puente. Los nombres comunes de los puentes han sido "tentáculo", "extensor", "pelusa", "conector", "espaciador", etc. Los puentes hidrófobos son adecuados principalmente para medios líquidos hidrófobos, y tienen a menudo mejor disponibilidad y capacidad para los grupos introducidos 1-11. Lo correspondiente es cierto para puentes hidrófilos en combinación con medios líquidos hidrófilos. Los ejemplos de puentes poliméricos hidrófilos son polisacáridos, tales como dextrano, y otros polímeros polihidroxilados solubles en agua.

Aspectos adicionales de la invención

Un aspecto de la invención son las matrices que se pueden preparar según la invención. Estas matrices contienen una o más capas que tienen diferente funcionalidad. El grado de sustitución para al menos un ligando de los grupos 1-11 en una capa es a menudo diferente del grado de sustitución para el mismo ligando en otra capa. En muchas realizaciones de las matrices de la invención, el grado de sustitución de un ligando en la capa superficial es cero o cercano a cero, mientras que al mismo tiempo el mismo ligando está presente en una capa interior. También lo contrario puede ser cierto.

Un aspecto adicional de la invención es el uso de las matrices para separación, según la parte introductoria.

La separación, dependiendo de la elección de la matriz y los grupos introducidos (véase más arriba), puede ser designada como cromatografía de afinidad o como cromatografía basada en el tamaño y la forma de los compuestos que se van a separar (filtración en gel), o como procedimientos por lotes correspondientes. Se puede utilizar lecho relleno, así como lecho fluidizado/expandido y estabilizado. Los ejemplos de cromatografía de afinidad son cromatografía de intercambio iónico (intercambio aniónico, intercambio catiónico), cromatografía de bioafinidad, cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), cromatografía covalente, cromatografía tiofílica, cromatografía basada en quelatos, cromatografía basada en la interacción \pi-\pi. En principio, las condiciones y protocolos se eligen de acuerdo con el conocimiento previo para el tipo respectivo de procedimiento de separación.

La separación se puede realizar a partir de mezclas que contienen componentes similares o muy diferentes, desde moléculas simples pequeñas hasta componentes individuales que están unidos de manera compleja unos a otros, tal como en agregados de partículas, complejos de bioafinidad, células animales y vegetales y partes de las mismas, microorganismos y partes de los mismos. Son sustancias interesantes, entre otros, los ácidos nucleicos, incluyendo los oligo-nucleótidos, las proteínas, incluyendo los péptidos, los lípidos y otros compuestos orgánicos e
inorgánicos.

La separación puede implicar que el componente de interés: a) sea escindido hacia la matriz a la vez que las sustancias no deseadas permanecen en el medio líquido, ó b) permanezcan en el medio líquido a la vez que las sustancias no deseadas sean escindidas hacia la matriz.

La invención será presentada ahora con varios ejemplos no limitantes. La invención está definida en las reivindicaciones de patente adjuntas, que constituyen una parte de la memoria descriptiva.

Parte experimental

Ejemplo 1

Preparación del intercambiador iónico Q Sepharose 4 Fast Flow con un bloqueo en la capa exterior de la cuenta

A. Preparación de agarosa alilada reticulada en forma de partículas (Sepharose 4 Fast Flow alilada). La Sepharose 4 Fast Flow fue de Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia. La matriz consiste en agarosa reticulada, tamaño medio de partícula 90 \mum, preparada por una reacción entre epiclorhidrina y agarosa en presencia de NaOH según Porath et al (J. Chromatog. 60 (1971) 167-77 y documento US-A-3.959.251). La alilación se consigue haciendo reaccionar la partícula acabada con éter alilglicidílico, con NaOH como base, hasta un nivel de alilo (CH_{2}=CHCH_{2}OCH_{2}- CHOHCH_{2}-) de 0,26 mmol/ml de gel.

B. Disolución de dextrano con un peso molecular medio ponderal de 500.000. El Dextrano T500 está disponible comercialmente en Amersham Pharmacia Biotech AB, y consiste en dextrano en bruto, hidrolizado y fraccionado, de Leuconostoc mesenteroides. Se disuelven 12,8 g de Dextrano T500 en 39,0 ml de agua destilada en un matraz de tres cuellos de 250 ml, con agitación lenta.

C. Bromación parcial de agarosa alilada reticulada. Se añaden 30 ml de agarosa alilada escurrida, preparada según la etapa A, 30 ml de agua destilada y 0,64 g de NaOAc anhidro a un recipiente de reacción de 100 ml. Posteriormente se lleva a cabo la bromación mediante la carga de 0,25 ml de bromo con agitación vigorosa. En el cálculo de la cantidad de bromo, se ha tenido en cuenta que una parte del bromo volátil se evaporará. La reacción continúa durante unos minutos hasta que la mezcla es puramente blanca. Después de la bromación, el gel se lava en un filtro de vidrio con agua destilada.

D. Acoplamiento de Dextrano T500. El gel de la etapa C es secado por aspiración y transferido al recipiente de reacción que contiene el Dextrano T500 disuelto de la etapa B, con agitación cuidadosa. Se deja equilibrar la mezcla durante 1 hora. Posteriormente, la reacción es iniciada por la adición de 2,98 g de NaOH y 0,12 g de NaBH_{4} disuelto en 27,2 ml de H_{2}O destilada. La temperatura se fija en 35ºC y se deja continuar la reacción durante la noche (p.ej., 16 h) con agitación cuidadosa. Se detiene la agitación y la mezcla de reacción se filtra en un filtro de vidrio. Después de que la mayor parte del Dextrano T500 ha sido retirado por lavado con agua destilada, se realiza la neutralización con unos pocos ml de HOAc concentrado añadidos directamente en el embudo filtrador hasta pH < 7, preferiblemente 5-6, y después el gel se lava de nuevo con agua destilada. Después del acoplamiento, el nivel de alilo remanente fue 0,19 mmol/ml.

E. Bromación de los grupos alilo remanentes. Se añaden con agitación vigorosa 20 ml de agarosa alilada escurrida, modificada con una capa de Dextrano T500 en la parte exterior de las cuentas, preparada según la etapa D, 4,53 ml de agua destilada y 0,8 g de NaOAc anhidro y 0,4 ml de bromo a un matraz de tres cuellos de 100 ml. La agitación continúa hasta que la coloración amarilla/ exceso de bromo es eliminada.

F. Introducción de los grupos de intercambio iónico mediante los grupos alilo remanentes. La introducción de grupos amino cuaternarios de intercambio aniónico (CH_{3})_{3}N^{+}CH_{2}-CHOHCH_{2}- es continuada directamente en el mismo matraz de tres cuellos que en E. Se cargan 9,9 g de cloruro de trimetilamonio (TMAC) al 65% en el matraz. Se agita durante 10 minutos y después se cargan 3,0 g de NaOH disueltos en 3,0 g de agua destilada. Con la carga de esta disolución de NaOH al 50%, la mezcla se vuelve amarilla clara. Inmediatamente después de esto, se cargan a la misma 0,06 g de NaBH_{4}. La temperatura se fija en 24ºC y se inicia la agitación. La reacción continúa durante la noche (p.ej. 16 h). La reacción es detenida por neutralización directamente en el matraz hasta pH < 7 con unos pocos ml de HOAc concentrado, preferiblemente hasta pH 5-6, y después el gel se lava repetidamente con agua destilada y con unos pocos volúmenes de gel de NaCl 1,0 M. Finalmente, el gel se lava de nuevo repetidamente con agua destilada. La capacidad de intercambio iónico fue determinada por valoración de cloruro de plata hasta 0,132 mmol/ml.

G. Evaluación microscópica del Intercambiador Iónico Q Sepharose 4 Fast Flow con un bloqueo en la capa exterior de la cuenta. Todas las evaluaciones microscópicas se realizaron en un microscopio con ajuste variable de contraste de fases, a un aumento de 200. La matriz de partida Sepharose 4 Fast Flow del ejemplo 1 y el Intercambiador Iónico Q Sepharose 4 Fast Flow acabado con un bloqueo del ejemplo 1 fueron teñidas con hematoxilina para su comparación. En el último caso, se pudo ver claramente el bloqueo en la capa exterior de las cuentas en la foto microscópica tomada. Para poder observar ópticamente que las cuentas bloqueadas son operativas, el Intercambiador Iónico bloqueado Q Sepharose 4 Fast Flow acabado fue incubado durante unos minutos con CO-hemoglobina bovina a pH 8,2; tampón Tris-HCl 0,020 M. El exceso de CO-hemoglobina fue eliminado por lavado con el mismo tampón. Las cuentas fueron observadas entonces en un microscopio sin ninguna tinción adicional previa. En la foto microscópica, se pudo ver la CO-hemoglobina roja en la parte interna de las cuentas, pero no se vió nada de la CO-hemoglobina en la capa de bloqueo de Dextrano T500 de las cuentas.

Ejemplo 2

Preparación del intercambiador iónico Q Sepharose 6 Fast Flow con un bloqueo en la capa exterior de la cuenta

A. Preparación de agarosa alilada reticulada en forma de partículas (Sepharose 6 Fast Flow alilada). La Sepharose 6 Fast Flow fue de Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia. La matriz consiste en agarosa reticulada, tamaño medio de partícula 90 \mum, preparada por una reacción de epiclorhidrina y agarosa en presencia de NaOH según Porath et al (J. Chromatog. 60 (1971) 167-77 y documento US-A-3.959.251). La alilación se realiza de tal manera que la partícula acabada se hace reaccionar con éter alilglicidílico, con NaOH como base, hasta un nivel de alilo (CH_{2}=CHCH_{2}OCH_{2}- CHOHCH_{2}-) de 0,27 mmol/ml de gel.

B. Disolución de dextrano con un peso molecular medio ponderal de 500.000. El Dextrano T500 está disponible comercialmente en Amersham Pharmacia Biotech AB, y consiste en dextrano en bruto, hidrolizado y fraccionado, de Leuconostoc mesenteroides. Se disuelven 57,7 g de Dextrano T500 en 157 ml de agua destilada en un matraz de tres cuellos de 500 ml, con agitación lenta.

C. Bromación parcial de agarosa alilada reticulada. Se añaden 90 ml de agarosa alilada escurrida, preparada según la etapa A, 90 ml de agua destilada y 1,92 g de NaOAc anhidro a un matraz de tres cuellos de 500 ml. Posteriormente se lleva a cabo la bromación mediante la carga de 0,69 ml de bromo con agitación vigorosa. En el cálculo de la cantidad de bromo, se ha tenido en cuenta que una parte del bromo volátil se evaporará. La reacción continúa durante unos minutos hasta que la mezcla es puramente blanca. Después de la bromación, el gel se lava en un filtro de vidrio con agua destilada.

D. Acoplamiento de Dextrano T500. El gel de la etapa C es secado por aspiración y transferido al recipiente de reacción que contiene el Dextrano T500 disuelto de la etapa B, con agitación cuidadosa. Se deja equilibrar la mezcla durante 1 hora. Posteriormente, la reacción es iniciada por la adición de 10,39 g de NaOH y 0,36 g de NaBH_{4} disuelto en 41,6 ml de H_{2}O destilada. La temperatura se fija en 35ºC y se deja continuar la reacción durante la noche (p.ej., 16 h) con agitación cuidadosa. Se detiene la agitación y la mezcla de reacción se filtra en un filtro de vidrio. Después de la eliminación por lavado de la mayor parte del Dextrano T500 con agua destilada, se realiza la neutralización con unos pocos ml de HOAc concentrado directamente en el embudo filtrador hasta pH < 7, preferiblemente 5-6, y después el gel se lava otra vez con agua destilada. Después del acoplamiento, el nivel de alilo remanente fue 0,18 mmol/ml.

E. Bromación de los grupos alilo remanentes. Se añaden con agitación vigorosa 40 ml de agarosa alilada escurrida, modificada con una capa de Dextrano T500 en la parte exterior de las cuentas, preparada según la etapa D, 9,06 ml de agua destilada y 1,6 g de NaOAc anhidro y 1,0 ml de bromo a un matraz de tres cuellos de 250 ml. La agitación continúa hasta que la coloración amarilla/exceso de bromo es eliminada.

F. Introducción de los grupos de intercambio iónico mediante los grupos alilo remanentes. La introducción de grupos amino cuaternarios de intercambio aniónico (CH_{3})_{3}N^{+}CH_{2}-CHOHCH_{2}- es continuada directamente en el mismo matraz de tres cuellos que en E. Se cargan 19,9 g de cloruro de trimetilamonio (TMAC) al 65% en el matraz. Se agita durante 10 minutos y después se cargan 6,0 g de NaOH disueltos en 6,0 g de agua destilada. Con la carga de esta disolución de NaOH al 50%, la mezcla se vuelve amarilla clara. Inmediatamente después de esto, se cargan 0,12 g de NaBH_{4}. La temperatura se fija en 24ºC y la velocidad de agitación en 130 RPM, y la reacción continúa durante la noche (p.ej. 16 h). La reacción es detenida por neutralización directamente en el matraz hasta pH < 7 con unos pocos ml de HOAc concentrado, preferiblemente hasta pH 5-6, y después el gel se lava repetidamente con agua destilada y con unos pocos volúmenes de gel de NaCl 1,0 M. Finalmente, el gel se lava de nuevo repetidamente con agua destilada. La capacidad de intercambio iónico fue determinada por valoración de cloruro de plata hasta 0,142 mmol/ml.

G. Evaluación cromatográfica de Dextrano T500 Q Sepharose 6 FF. El efecto de la capa exterior de dextrano fue ensayado por cromatografía utilizando carreras en gradiente sobre columnas HR5/5 (Amersham Pharmacia Biotech AB) rellenas con aproximadamente 1 ml de intercambiador iónico. Se usaron como muestras una proteína tiroglobulina grande de 660 kD y una \alpha-lactoalbúmina pequeña de 14,4 kD a pH 8,2, en el cual ambas están cargadas negativamente. La Figura 1 muestra la separación de ambas proteínas en una carrera en gradiente sobre un intercambiador aniónico fuerte convencional, Q-Sepharose HP, sin restricción basada en tamaño de la disponibilidad para los ligandos Q cargados positivamente. Aquí la \alpha-lactoalbúmina (pico 1) se eluye antes que la tiroglobulina (pico 2). La Figura 2 muestra el resultado de una carrera en gradiente con tiroglobulina en el intercambiador iónico Dextrano T500 Q Sepharose 6 FF según este ejemplo. Esta proteína grande migra a través de toda la columna sin ser adsorbida. La \alpha-lactoalbúmina, más pequeña, que se hizo correr de una manera similar, es adsorbida y eluida en el gradiente (pico 2). Véase la Figura 3.

Ejemplo 3

Síntesis de intercambiador cat-aniónico mediante el uso de activación de capas

A. Síntesis. 5 ml de Sepharose HP alilada, con un nivel de alilo de aproximadamente 0,2 mmol/ml, preparada de manera análoga al procedimiento de los ejemplos 1 y 2 haciendo reaccionar Sepharose HP con éter alilglicidílico en agua con hidróxido sódico como base, se suspendieron en 20 ml de agua destilada en un recipiente de reacción de vidrio y fueron bromados con agitación vigorosa con 0,3 milimoles de bromo elemental. El gel parcialmente bromado se hizo reaccionar después con 25 ml de disolución de hidróxido sódico 0,1 M saturado con sulfito sódico. La reacción tuvo lugar a 40ºC durante una noche. La reacción fue detenida por neutralización con ácido acético y posterior lavado en un embudo filtrador de vidrio con aproximadamente 100 ml de agua destilada. Los grupos alílicos remanentes en la matriz parcialmente funcionalizada fueron bromados en 20 ml de agua destilada con un exceso de bromo mediante una carga gota a gota de bromo elemental, hasta que se obtuvo una coloración amarilla remanente de la suspensión del gel. La matriz parcialmente funcionalizada y bromada fue lavada después en un embudo filtrador de vidrio con agua destilada y cargada en 25 ml de una disolución de bis-(3-aminopropil)amina al 50%. La reacción tuvo lugar a temperatura ambiente con agitación durante una noche. La reacción fue detenida por neutralización con ácido clorhídrico al 50% y un lavado posterior en un embudo filtrador de vidrio con aproximadamente 100 ml de agua destilada.

B. Evaluación cromatográfica del intercambiador cat-aniónico con capa. Se introdujo aproximadamente 1 ml del intercambiador cat-aniónico preparado según la especificación anterior en una columna HR5/5 (Amersham Pharmacia Biotech AB), fue conectado a un sistema de FPLC (Cromatografía Líquida Rápida de Proteínas) y equilibrado con un tampón de pH 6,0. Las muestras de proteínas fueron adsorbidas y eluidas después mediante el uso de un gradiente salino también a pH 6,0.

Muestra A. Se hizo correr lisozima, una proteína que está cargada positivamente a pH 6,0, según lo anterior. Véase el cromatograma en la figura 4, que muestra que la lisozima puede unirse a los ligandos sulfonato negativos de la matriz y eluirse después.

Muestra B. Transferrina, ovoalbúmina y \beta-lactoglobulina, proteínas que están cargadas negativamente a pH 6,0, se hicieron correr según lo anterior. Véase el cromatograma de la figura 5, que muestra que la transferrina, la ovoalbúmina y la \beta-lactoglobulina pueden unirse a los ligandos amina cargados positivamente de la matriz y eluirse después.

El resultado de los ensayos de cromatografía A y B muestra que hay regiones/capas en las partículas que sólo contienen grupos cargados positivamente y regiones/capas con sólo grupos cargados negativamente.

Figuras

Figura 1. Cromatograma de la carrera de la mezcla de muestra de 50 \mul que contiene 0,5 mg/ml de \alpha-lactoalbúmina (pico 1) y 0,5 mg/ml de tiroglobulina (pico 2) en una columna HR5/5 (Amersham Pharmacia Biotech) que contiene Q Sepharose HP, altura de lecho 5,9 cm.

Tampón A: Tris-HCl 20 mM, pH 8,2.

Tampón B: Tris-HCl 20 mM + NaCl 0,5 M

Caudal: 1 ml/min

Figura 2. Cromatograma de la carrera de la muestra de 200 \mul que contiene 0,25 mg/ml de \alpha-lactoalbúmina en una columna HR5/5 (Amersham Pharmacia Biotech) que contiene Dextrano T500 Q Sepharose 6 FF, según el ejemplo 2, altura de lecho 6,5 cm.

Tampón A: Tris-HCl 20 mM, NaCl 50 mM, pH 8,2.

Tampón B: Tris-HCl 20 mM + NaCl 1 M

Caudal: 0,2 ml/min

Figura 3. Cromatograma de la carrera de una muestra de 200 \mul que contiene 1 mg/ml de tiroglobulina en una columna HR5/5 (Amersham Pharmacia Biotech) que contiene Dextrano T500 Q Sepharose 6 FF, según el ejemplo 2, altura de lecho 6,5 cm.

Tampón A: Tris-HCl 20 mM, NaCl 50 mM, pH 8,2.

Tampón B: Tris-HCl 20 mM + NaCl 1 M

Caudal: 0,2 ml/min

Figura 4. Cromatograma de la carrera de una muestra de 50 \mul que contiene 1 mg/ml de lisozima en una columna HR5/5 (Amersham Pharmacia Biotech) que contiene un intercambiador cat-aniónico según el ejemplo 3, altura de lecho 4,2 cm.

Tampón A: piperazina-HCl 20 mM, pH 6,0.

Tampón B: piperazina-HCl 20 mM + NaCl 1 M

Caudal: 0,5 ml/min

Figura 5. Cromatograma de la carrera de una muestra de 50 \mul que contiene 0,1 mg/ ml de transferrina (pico 1), 0,2 mg/ml de ovoalbúmina (picos 2 y 3) y 0,2 mg/ml de \beta-lactoglobulina (pico 4) en un intercambiador cat-aniónico según el ejemplo 3, altura de lecho 4,2 cm.

Tampón A: piperazina-HCl 20 mM, pH 6,0.

Tampón B: piperazina-HCl 20 mM + NaCl 1 M

Caudal: 0,5 ml/min

Claims

1. Un procedimiento para producir matrices porosas introduciendo una funcionalidad en una matriz porosa que exhibe grupos A, funcionalidad que es introducida por la reacción de un reactivo I con dichos grupos A, caracterizado porque la matriz se pone en contacto con el reactivo I en una cantidad que es deficiente comparada con los grupos A para producir matrices que en su interior exhiben una o más capas con diferentes funciones, en el que dichos grupos A se seleccionan del grupo que consiste en hidroxi, amino, carboxi (-COOH, -COO-), mercapto, y dobles enlaces carbono-carbono, y en el que el reactivo I es cualquier compuesto que puede unirse más rápidamente a la matriz de lo que se está difundiendo a través de la matriz.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque A es un doble enlace carbono-carbono y porque el reactivo I es un reactivo de halogenación.

3. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque el reactivo I es X_{2} ó XOH, en el que X es un halógeno seleccionado entre cloro, bromo y yodo.

4. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la funcionalidad que se está introduciendo es un grupo reactivo que en una etapa posterior se hace reaccionar con un compuesto B que introduce una característica de separación deseada a la matriz.

5. Un procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque el compuesto B introduce una o más características de separación basadas en afinidad y/o filtración en gel.

6. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la matriz es hidrófila y exhibe grupos hidrófilos en sus superficies interior y exterior.

7. Un procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque la matriz exhibe grupos hidroxilo en sus superficies interior y exterior.

8. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque la matriz está construida de un polímero polihidroxilado.

9. Un procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque la matriz está construida de un polisacárido.

10. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque la reacción de los grupos A y el reactivo I se realiza en un medio acuoso.

11. Uso de una matriz preparada según cualquiera de las reivindicaciones 1-10 para la captura de un componente de una mezcla de componentes.

12. El uso según la reivindicación 11, caracterizado porque la separación implica cromatografía.