ES2249820T3 - Procedimiento de adsorcion/separacion. - Google Patents

Procedimiento de adsorcion/separacion.

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ES2249820T3
ES2249820T3 ES98903331T ES98903331T ES2249820T3 ES 2249820 T3 ES2249820 T3 ES 2249820T3 ES 98903331 T ES98903331 T ES 98903331T ES 98903331 T ES98903331 T ES 98903331T ES 2249820 T3 ES2249820 T3 ES 2249820T3
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Hasse Hansson
Lennart Kagedal
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Abstract

Un método para la adsorción de un sustancia a partir de una muestra líquida en un lecho fluidizado o suspensión agitada, en el que las perlas usadas comprenden una matriz básica y ligandos de afinidad, caracterizado en que los ligandos están unidos adecuadamente a la matriz básica mediante prolongadores que proporcionan las superficies de las perlas con una capa polimérica flexible.

Description

Un método de adsorción/separación.
La invención se refiere a un proceso para la separación de una sustancia por adsorción a lechos no compactados que contienen perlas que muestran estructuras (ligandos) con afinidad por la sustancia. Los lechos no compactados pueden generarse expandiendo/fluidizando perlas sedimentadas por un flujo de fluido ascendente y descendente, dependiendo la dirección de flujo de la densidad de las perlas usadas. Una muestra líquida que contiene la sustancia a adsorber se introduce en el flujo después de la expansión. Se genera un lecho no compactado menos eficaz agitando perlas suspendibles con la ayuda de un flujo turbulento y agitando mecánicamente.
Seleccionando la población de perlas que incluye perlas variadas en tamaño y/o densidades y usando esta población en un lecho expandido, es posible obtener un lecho supuestamente clasificado en el que las perlas más grandes y las perlas con densidades más altas se localizan por debajo de las perlas más pequeñas y las perlas con densidades más bajas. La mezcla acumulada en este tipo de lechos llega a ser baja y se han llamado lechos expandidos estables (a veces lechos fluidizados estables). Un modo alternativo para estabilizar un lecho fluidizado es incorporar partículas de carga magnéticas en las perlas y aplicar un campo magnético durante la fluidización. La estabilización por un campo magnético es un ejemplo de que pueden conseguirse lechos expandidos estables sin usar perlas que cubren cierto intervalo de tamaño/densidad. La adsorción en lechos fluidizados estables tendrá lugar durante el flujo del lecho como en un proceso cromatográfico en un lecho compactado. La cantidad de placas teóricas será elevada. En el caso de que el lecho no compactado se genere por un flujo turbulento o por agitación, la mezcla acumulada será alta y la adsorción tendrá lugar en un modo discontinuo. Para un estudio corto, reciente del campo, véase la parte introductoria de Thömmes et al., Biotechnol. Bioengin. 48 (1995) 367-374.
La mezcla acumulada en un lecho a menudo se mide como dispersión axial ("cantidad de dispersión en el recipiente"), véase Levenspiel, "Chemical Reaction Engineering" 2a Edición, John Wiley & Sons (1972). Para lechos expandidos estables, la dispersión en el recipiente será preferiblemente <75x10^{-3}, más preferiblemente <20x10^{-3}, que corresponde a >5, más preferiblemente >30 placas teóricas. Para la mezcla acumulada total, la cantidad de placas 
\hbox{será 1.}
La expansión/fluidización del lecho normalmente se hace en una columna que tiene puesto en cada uno de sus extremos una estructura de red que cubre el área de sección transversal de la columna, o algún otro dispositivo perforado que no generará turbulencia en el flujo. Véase, por ejemplo, el documento WO-A-9218237 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia). Se ha atribuido el efecto similar para un sistema que utiliza un flujo de entrada agitado (documento WO-A-9200799; Kem-En-Tek/Upfront Chromatography A/S). También pueden se factibles otros distribuidores.
Después de la adsorción, puede realizarse la elución directamente desde el lecho expandido. Como alternativa, el lecho puede dejarse asentar y eluirse el material adsorbido desde el lecho con la ayuda de un flujo fluido a menudo introducido en una dirección opuesta a aquella en la que el lecho se expandió.
A menudo el fluido es acuoso (por ejemplo, tampones disueltos en agua), pero también pueden usarse otros líquidos.
Publicaciones anteriores
Pharmacia Biotech AB (Uppsala, Suecia) comercializa Streamline® que en su primera versión utilizaba perlas porosas de agarosa con partículas de cuarzo como material de carga (documento WO-A-9218237, Pharmacia Biotech AB). En la última versión, las partículas de cuarzo se remplazaron por cargas de densidades mayores que el cuarzo (documento PCT/SE96/01431, presentado con prioridad del 7 de noviembre de 1995, Pharmacia Biotech AB). Otro suministrador principal es Bioprocessing Ltd. (Durham, Inglaterra) cuyas perlas de vidrio porosas (Prosep®) pueden usarse para cromatografía en lechos expandidos (Beyzavi et al, Genetic Engineering News, 1 de marzo de 1994 17)). Otro suministrador más es Sepracor.
El documento US-A-4.976.865 (Sanchez, et al, CNRS) contiene lechos fluidizados y el uso de columnas segmentadas para mimetizar la adsorción multi-etapas que tiene lugar en lechos compactados así como en los expandidos estabilizados. Las perlas usadas en la parte experimental son partículas de vidrio (Spherosil) que se han recubierto.
El documento WO-A-9200799 (Kem-En-Tek; Upfront Chromatography) describe una gran cantidad de cargas y materiales poliméricos que pueden combinarse para producir perlas pretendidas para adsorción en lechos fluidizados. Cada perla contiene dos o más partículas de carga.
El documento WO-A-8603136 (Graves and Burns; University Patents Inc) describe perlas que contienen partículas de carga magnéticas y su uso en lechos fluidizados estabilizados por un campo magnético aplicado de manera externa. Véase también Burns et al., Biotechnol. Bioengin. 27 (1985) 137-145; y Lochmüller et al., J. Chem. Tech. Biotechnol. 40 (1987) 33-40.
En cromatografía en lechos compactados se ha sugerido anteriormente el uso de perlas porosas, los poros de las cuales se han cargado completa o parcialmente con geles hidrófilos que llevan ligandos de afinidad, tales como grupos de intercambio iónico. Un ejemplo es Macrosob-K que es kieselguhr macroporoso que se ha cargado con agarosa que a su vez se ha derivatizado para mostrar grupos de intercambio iónico DEAE o CM (Macrosorb-KAX.DEAE y Macrosorb-KAX.CM, respectivamente (documento GB-A-1.586.364, Miles)). Este último tipo de materiales también se ha aplicado en cromatografía de lecho fluidizado (Bite et al., En: Verrall et al., Separations for Biotechnology (1987), Elles Horwood Ltd, Capítulo 13, 193-199.
Lochmüller et al., Sep. Sci. Techn. 22(11) (1987) 2111-2125 describe un estudio comparativo de adsorciones en un lecho compactado, un lecho fluidizado en el estado quiescente y un lecho estabilizado magnéticamente. Las perlas usadas se fabrican de Amberlite XAD, que se ha recubierto de manera adsortiva con un polímero sintético después de lo cual se ha unido un ligando de afinidad para la sustancia a adsorber a un extremo terminal del polímero. Las partículas magnéticas están presentes en el recubrimiento.
Problemas relacionados con sistema de lecho fluidizado anterior
En el caso de procesos de adsorción en lechos expandidos y/o fluidizados, hay un deseo expresado de tener la productividad más alta posible. Las variables importantes que deben tenerse en cuenta para conseguir esto es usar perlas con la capacidad de avance más alta posible para la sustancia a adsorber y también aumentar el caudal. Sin embargo, aumentar el caudal conduce a una capacidad de avance disminuida y también un riesgo aumentado de elutriación de las perlas. Un modo de solucionar el problema de elutriación es aumentar la densidad de las perlas incluyendo materiales de carga en ellas. Sin embargo, el material de carga como norma tendrán un efecto perjudicial en la capacidad de avance, siendo el tamaño de este efecto dependiente de diversos factores tales como caudal, el tamaño de poro de las perlas, la estructura que se une a la sustancia a adsorber, la sustancia a adsorber, etc.
Un modo de aumentar la capacidad de avance de las matrices de carga en forma de perlas se ha presentado recientemente en la Solicitud de Patente Internacional PCT/SE96/01431 (Pharmacia Biotech AB), el contenido de la cual se incorpora por la presente como referencia. Véase a continuación.
Objetivos de la invención
Un primer objetivo es mejorar los rendimientos totales en los procesos de absorción en lechos fluidizados.
Un segundo objetivo es mejorar la productividad para los procesos de adsorción en lechos fluidizados.
La invención
Ahora se ha descubierto que los problemas mencionados anteriormente se pueden resolver utilizando perlas en las que la estructura/ligando de afinidad está unido a la matriz básica de las perlas mediante un prolongador que proporciona una capa polimérica flexible.
El efecto positivo provocado por un prolongador se cree que reside en el hecho de que proporcionará las superficies internas (superficies de poro) y/o superficies externas de las perlas con una capa polimérica flexible que es permeable a macromoléculas y otras moléculas a las que se les permite pasar el lecho. Esto provocará un aumento en el volumen de interacción eficaz así como en la disponibilidad estérica de las estructuras/ligandos de afinidad para la sustancia a adsorber. Esto a su vez aumentará la velocidad de transferencia de masa así como la capacidad disponible total.
Por consiguiente, el primer aspecto de la invención es un método de separación en un lecho fluidizado o en una suspensión agitada como se ha descrito anteriormente. El rasgo característico es que la estructura de afinidad utilizada está unida a la matriz básica mediante un prolongador. Preferentemente la unión es covalente, lo que significa que en el modo preferido no hay enlace no covalente entre la estructura de afinidad y la matriz básica.
El prolongador
Los prolongadores adecuados deben ser hidrófilos y contener una pluralidad de grupos seleccionados, por ejemplo, entre hidroxi, carboxi, amino, óxido de etileno repetitivo (-CH_{2}CH_{2}O-), amido etc. El prolongador puede estar en forma de un polímero tal como un homo- o un copolímero. Los prolongadores poliméricos hidrófilos pueden ser de origen sintético, es decir, con un esqueleto sintético, o de origen biológico, es decir, un biopolímero con un esqueleto de origen natural. Los polímeros sintéticos típicos son polivinil alcoholes, poliacril- y polimetacrilamidas, polivinil éteres etc. Los biopolímeros típicos son polisacáridos, tales como almidón, celulosa, dextrano, agarosa. Los prolongadores poliméricos preferidos a menudo son solubles en agua en su estado libre, es decir, cuando no están unidos a la matriz básica. Los polímeros insolubles en agua o polímeros de baja hidrofilicidad original pueden volverse más hidrófilos introduciendo grupos hidrófilos en ellos. En particular se cree que los supuestos polihidroxi polímeros y otros polímeros que carecen de estructura polipeptídica son preferidos.
La longitud (tamaño) del prolongador óptimo dependerá de varios factores, tales como cantidad de puntos de unión a la matriz básica de las perlas, tipo de prolongador, la estructura y tamaño del ligando de afinidad así como la cantidad de los mismos por molécula prolongadora, grado de entrecruzamiento, etc. La flexibilidad de la capa formada por el prolongador se aumentará por una disminución en la cantidad de puntos de unión a la matriz básica por molécula prolongadora y/o en el grado de entrecruzamiento del prolongador. Los prolongadores que posibilitan la unión de un punto, por ejemplo en una unidad monomérica terminal, pueden ser pequeños. Para prolongadores poliméricos para los que la unión y/o entrecruzamiento es posible en varias unidades monoméricas, se cree que se prefieren prolongadores más largos. Para el tipo de polímeros mencionado anteriormente, por ejemplo, se cree que los polímeros más adecuados deben contener al menos 30 unidades monoméricas, que para polisacáridos de tipo dextrano indica un Pm > 5000 Da.
Para controlar la flexibilidad del prolongador, a menudo es ventajoso activar primero la matriz básica y después unir el prolongador a la matriz por reacción con los grupos activados introducidos. Los reactivos de activación típicos son bifuncionales en el sentido en que son capaces de reaccionar dos veces con grupos funcionales electrófilos. Los ejemplos ilustrativos son epihalohidrinas, bisepóxidos, CNBr, etc. Otros reactivos bifuncionales requieren una reacción de activación intermediaria, por ejemplo, alil glicidil éter y estiril glicidil éter. Para los últimos reactivos, la primera reacción tiene lugar en el grupo oxirano después de lo cual la activación se provoca por la adición de halógeno (X_{2}, OH u otros compuestos que proporcionan halógeno positivo) al doble enlace carbono-carbono. Los reactivos bifuncionales a menudo dan lugar a enlaces estables entre el prolongador y la matriz básica, que en los casos preferidos contiene una cadena de hidrocarburo lineal o ramificada que está interrumpida por uno o más átomos de oxígeno (estructuras éter) o nitrógenos amino y opcionalmente también está sustituida con uno o más grupos hidroxi o amino. Los reactivos bifuncionales preferidos deben dar lugar a enlaces que sean estables frente a hidrólisis en el intervalo de pH usado en cromatografía líquida, es decir, en la mayoría de los casos pH 3-12. Esto a menudo significa que el enlace de estar desprovisto de grupos éster y grupos de estabilidad hidrolítica similar o menor, por ejemplo, los enlaces deben tener como mucho un átomo de oxígeno o de nitrógeno unido a uno y al mismo átomo de carbono. Típicamente, el enlace tiene una longitud que es menor de 30 átomos.
Si se utiliza apropiadamente, el reactivo bifuncional usado para unir el prolongador a la matriz básica no provocará o provocará una cantidad muy baja de entrecruzamientos intra- e intermoleculares en el prolongador.
Estructuras/ligandos de afinidad
Las propiedades de afinidad pueden estar inherentes en la estructura del prolongador o pueden introducirse por acoplamiento químico de las estructuras/grupos de ligando apropiados (ligandos de afinidad) al prolongador. Esto significa que el prolongador a menudo está sustituido con uno, en el caso preferido dos o más, ligandos/grupos que tienen afinidad por la sustancia/sustancias que se pretenden adsorber. Los ligandos/grupos de afinidad típicos
son:
1. Grupos cargados positivamente (grupos de amina primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria).
2. Grupos cargados negativamente (por ejemplo, carboxi, ácido fosfónico, ácido sulfónico, etc.).
3. Grupos anfotéricos.
4. Grupos que tienen una afinidad específica (por ejemplo, grupos de bio-afinidad), tal como entre la proteína de unión a IgG (Proteína A, G, L, etc.) e IgG, lectina y carbohidratos, antígeno/hapteno y anticuerpo, (estrep) avidina y biotina.
5. Ácidos nucleicos/oligonucleótidos complementarios.
6. Grupos que muestran sistemas electrónicos \pi.
7. Grupos quelato.
8. Grupos hidrófobos, etc.
Con la ayuda de estos ligandos/estructuras de afinidad, el método de la invención puede realizarse como cromatografía de afinidad, tal como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad bioespecífica, cromatografía de interacción hidrófoba, "cromatografía en fase inversa", cromatografía con quelato, cromatografía covalente, etc. o correspondiente a adsorciones de modo discontinuo.
El ligando puede introducirse antes o después de haber unido el prolongador a la superficie de la matriz básica. Un modo de hacer esto contempla hacer reaccionar el grupo apropiado del prolongador, tal como carboxi, amino, hidroxi, etc., con un reactivo bifuncional adecuado, tal como CNBr, bisepóxido o epihalohidrina correspondiente, alil glicidil éter, etc., para introducir la reactividad deseada que a su vez se hace reaccionar con un compuesto que introducirá la afinidad de interés. En caso de que el compuesto muestre un grupo reactivo con un grupo en el prolongador no se necesita derivatización adicional del prolongador. Las condiciones y reactivos deben seleccionarse para minimizar el entrecruzamiento del prolongador.
La introducción del ligando de afinidad a menudo contempla insertar un enlazador entre el ligando y el prolongador. Dichos enlazadores a menudo son hidrófilos en el sentido en que contienen una cadena de hidrocarburo lineal, ramificada o cíclica que puede estar interrumpida por átomos de oxígeno (éter) y/o nitrógeno (amino) y/o sustituida con grupos hidroxi y/o amino. Las exigencias del enlazador principalmente son las mismas que en la unión puente del prolongador a la matriz básica. Véase anteriormente.
El mal efecto obtenido con proteína A nativa puede explicarse en términos de proporciones óptimas entre el tamaño del prolongador y la estructura/grupo de afinidad. Compárese que la Proteína A nativa es mucho mayor que el prolongador usado en la parte experimental (Ejemplo 11) (dextrano Pm 10.000 Da). Esto apunta al hecho de que se cree que con el presente conocimiento se conseguirán los mayores efectos con la invención para grupos de afinidad más pequeños que los encontrados normalmente entre los grupos 1, 2, 3, 6, 7 y 8 como se ha definido anteriormente. A modo de sugerencia la proporción entre los Pm para la estructura de afinidad y el prolongador desnudo debe ser menos de 1, tal como menos de 0,1.
Matrices básicas
La matriz básica de las perlas puede ser de naturaleza orgánica o inorgánica como se conoce para perlas usadas en cromatografía con perlas fluidizadas y compactadas. Puede ser porosa o no porosa. A menudo es un polímero, tal como vidrio, un polímero sintético o un biopolímero. La matriz básica puede ser un polímero hidrófobo, por ejemplo, un copolímero de estireno-divinil benceno, que se ha hidrofilizado en las superficies interna y/o externa recubriéndolas con el polímero hidrófilo apropiado (a menudo un polímero que muestra grupos hidroxi y/o amino) o por otros medios, por ejemplo, se oxida para introducir grupos hidrófilos del tipo dado anteriormente. Como alternativa, la matriz básica puede ser un polímero hidrófilo insoluble en agua, por ejemplo, agarosa, celulosa, dextrano, almidón, etc., que se ha entrecruzado para dar la porosidad y estabilidad deseadas, si es necesario. Hasta la fecha de prioridad, la agarosa era el polímero de elección, preferiblemente en forma entrecruzada. Para un análisis adicional acerca de la selección de polímeros en matrices básicas, véase el documento WO-A-9200799 (Kem-En-Tek A/S/Upfront Chromatography A/S), el documento WO-A-9218237 (Pharmacia Biotech AB), el documento PCT/SE96/01431 (Pharmacia Biotech AB) y el documento WO-A-8603136 (Graves & Burns, University Patents Inc).
Densidad de perlas y materiales de carga
Para la fluidización ascendente, la densidad de las perlas finales (densidad media, estado húmedo) debe ser superior que la densidad del fluido en el que se van a usar las perlas, es decir, para fluidos acuosos > 1 g/cm^{3}, por ejemplo \geq 1,1 g/cm^{3}, tal como \geq 1,2 g/cm^{3} (medido en el tampón usado para mantener el lecho en un estado fluidizado). Para una fluidización descendente, se aplica lo opuesto, es decir, la densidad de las perlas finales (densidad media, estado húmedo) debe ser inferior que la densidad del fluido en el que se van a usar las perlas, es decir, para fluidos acuosos > 1 g/cm^{3}. Para una suspensión agitada, la densidad de las perlas es menor crítica.
Las perlas usadas en el método de la invención pueden comprender o no comprender material de carga para dar a las perlas la densidad apropiada para el uso pretendido. El material de carga puede ser magnético o no magnético.
Algunos materiales de matriz de perlas, tales como perlas de vidrio porosas y otros materiales inorgánicos porosos, pueden tener por sí mismos la densidad apropiada en el estado húmedo y por lo tanto no necesitan contener una carga para controlar la densidad.
Los polímeros orgánicos, por otro lado, a menudo tienen una densidad cercana a las densidades de los fluidos usados en los procesos de adsorción contemplados. En este caso a menudo es muy ventajoso incorporar partículas de carga conocidas en la técnica para adsorciones en lecho fluido, véase el documento WO-A-9200799 (Kem-En-Tek A/S/Upfront Chromatography A/S), documento WO-A-9218237 (Pharmacia Biotech AB) y documento PCT/SE96/
01431 (Pharmacia Biotech AB). Se introduce una, preferiblemente dos o más partículas por perla. Dependiendo de la dirección del flujo para la fluidización (descendente o ascendente), la carga debe tener una densidad inferior o superior, respectivamente, que el fluido a usar. Para fluidos acuosos esto significa < 1 g/cm^{3} (descendente) o > 1 g/cm^{3} (ascendente). Las cargas típicas son partículas de vidrio, cuarzo y sílice, metales, sales metálicas, aleaciones metálicas, etc. Véase adicionalmente el documento WO-A-920799 (Kem-En-Tek A/S/Upfront Chromatography A/S) y documento WO-A-9218237 (Pharmacia Biotech AB). Para caudales > 300-400 cm/h (dirección ascendente), la densidad de la carga debe ser \geq 3 g/cm^{3}, siendo los materiales de carga preferidos metales pesados.
El tamaño de partícula del material de carga normalmente está en el intervalo de 1-200 \mum, con la condición de que siempre sea menor que el de las perlas. Para materiales de carga a usar en perlas porosas y que tienen densidades \geq 3 g/cm^{3}, los tamaños de partícula típicos son 1-70 \mum, con preferencia de un intervalo de 15-50 \mum.
Para perlas porosas, la forma geométrica de las partículas de carga es importante. Las formas preferidas incluyen esferas, elipsoides, gotitas, formas de fideo, formas de alubia y agregados/aglomerados de estas formas de partículas. Se da una preferencia particular a formas redondeadas continuas. Véase adicionalmente el documento PCT/SE96/01431 (Pharmacia Biotech AB). Esto llega a ser particularmente importante en el caso de que los tamaños de poro permitan la penetración de la sustancia o sustancias a adsorber.
El contenido en carga de las perlas se determina por factores tales como la densidad y capacidad deseadas de las perlas finales, caudales a usar, tipo y densidad del material de carga, ligando, sustancia a adsorber, etc. Los contenidos en carga óptimos típicos se encuentran en el intervalo de 1-100% (p/p, perlas húmedas).
Tamaño de perla
La población de perlas usada en cada aplicación particular puede ser monodispersa o contiene perlas que cubren un cierto intervalo de tamaño con una cierta distribución de tamaño de perla y tamaño de perla medio. Los tamaños de perla medios e intervalos de tamaño adecuados típicamente se encuentran en el intervalo de 10-1.000 \mum, con preferencia por un intervalo de 50-700 \mum. En muchos casos de lechos fluidizados (lechos expandidos), el límite inferior se determina por el hecho de que las perlas no deben ser capaces de escapar a través de la salida o entrada del recipiente usado para la fluidización. Otros factores que influyen en la elección de los tamaños de perla incluyen la capacidad deseada, el ligando de interés, la sustancia o sustancias específicas a adsorber de la muestra, etc.
La proporción entre el área superficial total de las perlas (superficies interna más externa) y el volumen de perla total es altamente significativa para la capacidad de avance. Áreas de superficie de contacto relativas más grandes (perlas pequeñas) conducen una capacidad de avance más alta. La capacidad total, por otro lado, solo se ve ligeramente afectada.
Para lechos expandidos estabilizados por un flujo distribuido de manera uniforme a través del área de sección transversal del lecho, las distribuciones de tamaño de perla típicas son de tal modo que el 95% de las perlas coinciden en un intervalo cuya anchura es 0,1 a 10 veces el diámetro medio de la perla, preferiblemente 0,3 a 3 veces el diámetro medio de la perla. La distribución del tamaño de partícula exacto a seleccionar dependerá de factores tales como caudal, diámetro medio de la perla, densidad de las perlas, densidad del fluido etc. Una distribución de tamaño de partícula demasiado amplia dará como resultado un riesgo aumentado de elutriación y/o sedimentación de proporciones grandes de perlas. La distribución de tamaño puede ser asimétrica, por ejemplo, la proporción de perlas en la parte inferior de un intervalo puede ser mayor que la proporción en la parte superior. Aunque es menos preferido con la presente tecnología de producción, una alternativa futura a la distribución de tamaño en esta aplicación particular es tener una distribución en las densidades de las perlas usadas. También pueden usarse poblaciones de perlas en las que tanto el tamaño como la densidad de las perlas individuales varían.
Para lechos fluidizados estabilizados de manera magnética o lechos fluidizados turbulentos y suspensiones agitadas, las exigencias de distribución de tamaño y/o densidad en la población de perlas usada es menos crítica. En estos casos también pueden usarse poblaciones de perlas monodispersas.
Porosidad de las perlas
Se prefiere que las perlas finales sean porosas con poros abiertos que permiten que la sustancia a adsorber penetre en el interior de las perlas. La porosidad óptima puede determinarse a partir del tamaño de la sustancia o sustancias a adsorber. Parece como si el prolongador de algún modo desconocido facilitara el transporte de sustancias en las perlas. Por lo tanto se cree que el intervalo para valores Kav aceptables es más amplio que para perlas sin prolongadores es decir, 0,1-0,95 en comparación con 0,40-0,95 sin prolongadores. Para un definición de Kav véase L. Hagel en "Protein Purification, Principles, High Resolución, and Applications", J-C Janson and L Rydén (Eds), VCH Publishers Inc. Nueva York, 1989, página 99.
Muestras a aplicar
Las muestras a aplicar en el método de la invención pueden ser del mismo tipo que las aplicadas anteriormente en procesos cromatográficos en lechos compactados y no compactados, o en procesos de adsorción discontinuos en lechos fluidizados turbulentos y suspensiones agitadas.
Las perlas de la invención y métodos pueden aplicarse al tratamiento de sobrenadantes/medios de cultivo procesados y no procesados de fermentadores y otros recipientes de cultivo celular, suero, plasma, bebidas, etc.
La sustancia o la muestra adsorbida se procesan adicionalmente.
La invención funcionará para la separación de compuestos de diversos pesos moleculares y tipos. Los ejemplos son macromoléculas, por ejemplo, con pesos moleculares \geq 5.000 Dalton, tales como polisacáridos, proteínas/polipéptidos y ácidos nucleicos y polímeros sintéticos solubles en agua. También pueden adsorberse sustancias con peso molecular \leq 5.000 Dalton de acuerdo con la invención. Normalmente no hay límite superior en peso molecular, aunque el proceso está normalmente limitado a la adsorción/separación de compuestos que tiene un peso molecular por debajo de 1.000.000.
Aspectos variados de la fabricación de perlas
La fabricación de las perlas de matriz básica, la introducción de grupos de unión, la adición de carga, etc., se realizan de un modo conocido, asegurando que las perlas serán apropiadas para los propósitos de adsorción de acuerdo con lo anterior. Las perlas se criban, cuando es necesario, para obtener una fracción de tamaño adecuado.
La siguiente parte experimental describe la fabricación de la población de perlas más preferida en la presentación de prioridad de esta solicitud.
Parte experimental Síntesis Ejemplo 1
Preparación de una solución de dextrano. Se añadieron 53,6 kg de dextrano (T40 Pm 40.000 Pharmacia Biotech AB) a 60 l de agua destilada en un reactor discontinuo mientras se agitaba durante 20 h a 20ºC.
Activación con epóxido de la matriz básica. La matriz básica (perlas, 125-315 \mum) se preparó de acuerdo con el ejemplo 1 en el documento WO-A-9218237 (Pharmacia Biotech AB). Se añadieron 3,2 l de NaOH al 50% a un reactor que contenía una solución de 20 l de matriz básica y 9,1 l de agua destilada mientras se agitaba. La mezcla se enfrió hasta 25ºC. Se bombearon 4,68 l de epiclorhidrina (ECH) en el reactor durante aproximadamente 45 min. La reacción se dejó continuar durante 2 h a 25ºC. La mezcla de reacción después se neutralizó con ácido acético (pH=6-7) y la matriz básica activada se lavó con agua destilada. El análisis mostró 16,8 \mumol de grupos epóxido/ml de gel.
Acoplamiento de dextrano. Se añadieron 27,9 l de la solución de dextrano mientras se agitaba en un reactor que contenía una solución de 20 l de matriz básica activada con epóxido y 3,4 l de agua destilada. La mezcla se agitó durante 1 h. Después se añadieron 3,2 l de NaOH (50%) y 34,6 g de NaBH_{4} y la reacción se permitió continuar durante una noche (aprox. 18 h). La mezcla después se neutralizó con ácido acético (pH=6-7) y la matriz se lavó con agua destilada. El contenido en dextrano de la matriz después de la reacción fue 22,0 mg/ml de gel.
Ejemplo 2
Preparación de solución de dextrano. De manera análoga al Ejemplo 1. 56,3 kg de dextrano y 60 l de agua destilada.
Activación con epóxido de la matriz básica. De manera análoga al Ejemplo 1. 4,0 l de NaOH al 50%, 25 l de gel y 11,4 l de agua destilada. El análisis mostró 22,0 \mumol de grupos epóxido/ml de gel.
Acoplamiento de dextrano. De manera análoga al Ejemplo 1. 39,3 l de solución de dextrano, 25 l de gel activado con epóxido, 1,5 l de agua destilada, 4,0 l de NaOH al 50% y 45,5 g de NaBH_{4}. El contenido en dextrano de la matriz básica después de la reacción fue 29,0 mg/ml de gel.
Ejemplo 3
Introducción de grupos aminometilo cuaternario (grupos Q) (intercambiador aniónico). Se añadieron 250 ml de cloruro de glicidiltrimetil amonio (G-MAC, 70%) con agitación a una solución que contenía 250 ml de la matriz del Ejemplo 1 y 25 ml de agua destilada. La mezcla se calentó hasta 30ºC y se añadieron 7,3 ml de NaOH (50%) y 0,5 g de NaBH_{4}. La reacción se dejó continuar durante 18 h a 30ºC. La mezcla después se neutralizó con ácido acético (pH=6-7) y la matriz resultante se lavó con agua destilada, NaCl 2 M y con agua destilada una vez más. La capacidad de iones cloruro del producto fue 0,21 mmol Cl^{-}/ml de gel.
Ejemplo 4
Introducción de grupos aminometilo cuaternario (grupos Q) (intercambiador aniónico). De manera análoga al ejemplo 3. 325 ml de G-MAC, 250 ml de gel del Ejemplo 1, 25 ml de agua destilada, 11,6 ml de NaOH (50%) y 0,5 g de NaBH_{4}. La capacidad de iones cloruro del producto fue 0,26 mmol Cl^{-}/ml de gel.
Ejemplo 5
Introducción de grupos aminometilo cuaternario (grupos Q) (intercambiador aniónico). De manera análoga al Ejemplo 3. 250 ml de G-MAC, 250 ml de gel del Ejemplo 2, 25 ml de agua destilada, 7,3 ml de NaOH (50%) y 0,5 g de NaBH_{4}. La capacidad de iones cloruro del producto fue 0,24 mmol Cl^{-}/ml de gel.
Ejemplo 6
Introducción de grupos aminometilo cuaternario (grupos Q) (intercambiador aniónico). De manera análoga al Ejemplo 3. 325 ml de G-MAC, 250 ml de gel del Ejemplo 2, 25 ml de agua destilada, 11,6 ml de NaOH al 50% y 0,5 g de NaBH_{4}. La capacidad de iones cloruro del producto fue 0,33 mmol Cl^{-}/ml de gel.
Ejemplo 7
Alilación. Se añadieron 55 g de NaOH, 0,9 de NaBH_{4} y 32 g de Na_{2}SO_{4} con agitación a un reactor que contenía 250 ml de la matriz básica con prolongador preparada en el Ejemplo 1 y 100 ml de agua destilada. La mezcla se calentó hasta 45ºC. Después de 1 h, se añadieron 115 ml de alilglicidil éter (AGE,>99%). La reacción se permitió continuar durante 18 h a 45ºC. La mezcla después se neutralizó con ácido acético (pH=6-7) y la matriz se lavó con agua destilada, etanol y agua destilada otra vez. El análisis mostró 0,19 mmol de grupos alilo/ml de gel.
Introducción de grupos sulfopropilo (SP) (intercambiador catiónico). Se añadieron 44 g de Na_{2}S_{2}O_{5} con agitación a un reactor que contenía una mezcla de 250 ml de la matriz alilada y 76 ml de agua destilada. Después se añadió NaOH (50%) hasta que el pH llegó a ser 6,5. Se burbujeó aire a través de la mezcla de reacción usando un tubo de dispersión de gas. La reacción se mantuvo durante 18 horas a 20ºC, y el gel después se lavó con agua destilada. La capacidad de H^{+} del producto fue 0,19 mmol H^{+}/ml de gel.
Ejemplo 8
Alilación. De manera análoga al Ejemplo 7. 250 ml de matriz de agarosa-dextrano del Ejemplo 1, 100 ml de agua destilada, 65 g de NaOH, 0,9 g de NaBH_{4}, 32 g de Na_{2}SO_{4} y 135 ml de AGE. El análisis mostró 0,23 mmol de grupos alilo/ml de gel.
Introducción de grupos sulfopropilo (SP) (intercambiador catiónico). De manera análoga al Ejemplo 7. 250 ml de gel alilado, 76 ml de agua destilada y 44 g de Na_{2}S_{2}O_{5}. La capacidad de H^{+} del producto fue 0,24 mmol H^{+}/ml de gel.
Ejemplo 9
Alilación. De manera análoga al Ejemplo 7. 250 ml de matriz de agarosa-dextrano del Ejemplo 2, 100 ml de agua destilada, 55 g de NaOH, 0,9 g de NaBH_{4}, 32 g de Na_{2}SO_{4} y 115 ml de AGE se hicieron reaccionar como se da en el Ejemplo 7. El análisis mostró 0,19 mmol de grupos alilo/ml de gel.
Introducción de grupos sulfopropilo (SP) (intercambiador catiónico). De manera análoga al Ejemplo 7. 250 ml de gel alilado, 76 ml de agua destilada y 44 g de Na_{2}S_{2}O_{5}. La capacidad de H^{+} del producto fue 0,19 mmol H^{+}/ml de gel.
Ejemplo 10
Alilación. De manera análoga al Ejemplo 7. 250 ml de matriz de agarosa-dextrano del Ejemplo 2, 100 ml de agua destilada, 55 g de NaOH, 0,9 g de NaBH_{4}, 24 g de Na_{2}SO_{4} y 135 ml de AGE. El análisis mostró 0,23 mmol de grupos alilo/ml de gel.
Introducción de grupos sulfopropilo (SP) (intercambiador catiónico). De manera Análoga al ejemplo 7. 250 ml de gel alilado, 76 ml de agua destilada y 44 g de Na_{2}S_{2}O_{5}. La capacidad de H^{+} del producto fue 0,24 mmol H^{+}/ml de gel.
Ejemplo 11
La matriz básica se preparó como en el documento PCT/SE96/01431 comenzando con dos concentraciones de agarosa (3% y 4%, respectivamente).
Material de carga. Anval 600® (Anval, Torshalla, Suecia) es una aleación de cromo-níquel que tiene la composición química (% en peso) C 0,02%, Si 0,41%, Mn 0,31%, P 0,007%, S 0,001%, Cr 15,5%, Ni 75,0%, Cu 0,02% y Fe 8,68%. La aleación tiene una densidad de 8,4 g/cm^{3}. La calidad usada comprendía perlas con un diámetro de 16-44 \mum.
Mezcla de agarosa (4%). Se cargaron 900 ml de agua destilada a un reactor separado y 36 g se añadieron de agarosa con agitación. La mezcla se calentó hasta 95ºC hasta que la agarosa se hubo disuelto (aproximadamente una hora). Se añadieron después 378 g de Anval® a la mezcla que se agitó durante quince minutos, después de lo cual la temperatura se bajó hasta 70ºC.
Emulsionado. Se cargaron 1050 ml de tolueno a un reactor de emulsión y se añadieron 49,5 g de etil celulosa en un "chorro fino" con agitación. La mezcla se calentó en un baño de agua hasta 60ºC hasta que toda la etil celulosa se hubo disuelto (aproximadamente dos horas) La velocidad del agitador en el reactor de emulsión se ajustó a 130 r.p.m. después de lo cual se transfirió la solución de agarosa (70ºC). El proceso de emulsión se interrumpió cuando el 95% (volumen) de las perlas tuvo un diámetro <200 \mum (gel convencional) que dio una proporción alta de perlas con un diámetro de 80-160 \mum. Después se paró el calentamiento del baño de agua y la temperatura del baño se bajó de 60 a 30ºC en aproximadamente siete horas.
Tratamiento. Las perlas se lavaron por agitación y después se decantaron (3x) con 3 l de etanol al 99,5%. El lavado de las perlas se continuó en filtros nutsch con 4 x 2 l de etanol con auto-vaciado. Las perlas finalmente se transfirieron a agua destilada, mediante agitación y decantado.
Entrecruzamiento. Se cargaron 100 ml de suspensión de gel al 75% y 34 g de sulfato sódico al reactor y se agitó durante dos horas, después de lo cual la temperatura se elevó hasta 50ºC. Después se añadieron 1 ml de solución NaOH al 45% y 0,1 g de borohidruro sódico. Se añadieron 7 ml (10,5 g) de solución NaOH al 45% y 7,5 ml de epiclorhidrina al mismo tiempo con la ayuda de una bomba y durante un periodo de seis a ocho horas. La reacción se dejó continuar durante una noche mientras se agitaba el sistema (durante aproximadamente dieciséis horas) a 50ºC. Después de que se completara la reacción, el gel se suspendió (se lavó) con 7 x 150 ml de agua, después de lo cual el gel se acidificó con ácido acético al 60% hasta pH 5-6 y se cribó en húmedo (80-160 \mum).
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Ejemplo 11A
Acoplamiento directo de la Proteína A nativa a la matriz básica. Se lavaron 30 ml de la matriz básica (de agarosa al 3%) con agua destilada, se mezclaron con 3,67 g de NaOH disueltos en 18 ml de agua destilada mientras se agitaba, y la temperatura se ajustó hasta 24ºC. Después de algunos minutos, se añadieron 7,2 ml de epiclorhidrina mientras se agitaba vigorosamente la mezcla. Después de dos horas, el gel se lavó en un filtro de vidrio con 300 ml de agua destilada. El gel lavado después se mezcló con ácido 6-aminocaprónico (6-ACS; 30 ml de solución 6-ACS1 M, NaCl 1 M pH 11,5) y la mezcla se agitó durante 17-24 horas y después se lavó finalmente con 200 ml de NaCl 0,5 M. El gel después se lavó otra vez, ahora con 2 x 30 ml de acetona, después de lo cual el gel se mezcló con 15 ml de acetona y se activó con 559 mg de NHS y 1007 mg de diciclohexilcarbodiimida mientras se agitaba el sistema. Después de 4-17 horas a 31ºC, el gel se lavó con 2 x 30 ml de acetona + 450 ml de isopropanol y se enfrió con 210 ml de HCl 1 mM enfriado con hielo. El gel activado resultante se mezcló con 30 ml de solución que contenía Proteína A nativa (Pharmacia Biotech AB) (Proteína A disuelta en NaHCO_{3} 0,2 M, NaCl 1 M pH 8), y se agitó a temperatura ambiente durante dos horas, y después se lavó con tampón Tris pH 8, y tampón acetato pH 3, y finalmente con agua destilada.
Ejemplo 11B
Acoplamiento directo de la Proteína A nativa a la matriz básica. Como en el Ejemplo 11A pero la matriz básica se había obtenido de agarosa al 4%.
Ejemplo 11C
Acoplamiento de la Proteína A nativa mediante un prolongador
Alilación. 400 ml de agua destilada, 48 g de NaOH y 0,15 g de NaBH_{4} (solución A). Se lavaron 50 ml de la matriz básica (agarosa al 3%) con 200 ml de agua destilada y 380 ml de solución A. Se añadieron 50 ml de la matriz básica y 20 ml de solución A a un reactor. La mezcla se calentó hasta 45ºC. Se añadieron 60 ml de AGE a la mezcla. La reacción se dejó continuar durante 18 h a 45ºC. La mezcla después se neutralizó con ácido acético y la matriz se lavó con agua destilada, etanol y agua destilada.
Bromación. Se añadieron 2 g de acetato sódico a una solución de 50 ml de gel alilado y 200 ml de agua destilada. Después de 15 min de agitación, se añadieron 20 ml de Br_{2}/H_{2}O a la solución y la reacción se realizó durante 15 min. Después se añadió formiato sódico para destruir el exceso de bromo. El gel después se lavó con agua destilada.
Acoplamiento de dextrano. La solución de dextrano se preparó en un reactor discontinuo añadiendo 15 g de dextrano (Pm 10.000 (Pharmacia Biotech AB)) a 75 ml de agua destilada mientras se agitaba durante 18 h a 40ºC (solución de dextrano). Después se añadieron 50 ml del gel bromado, 5 g de NaOH y 0,15 g de NaBH_{4} al reactor que contenía la solución de dextrano (40ºC) y la reacción se dejó proceder durante una noche (aprox. 18 h) a 40ºC. La mezcla después se neutralizó con ácido acético (pH=6-7) y la matriz se lavó con agua destilada.
Acoplamiento de la Proteína A nativa. De manera análoga al Ejemplo 11A.
Ejemplo 11D
Preparación de solución de dextrano. Se preparó una solución de dextrano en un reactor discontinuo añadiendo 50 g de dextrano (Pm 10.000 Pharmacia Biotech AB) a 125 ml de agua destilada mientras se agitaba durante 18 h a 20ºC.
Activación con epóxido de la matriz básica. Se añadieron 3,2 g de NaOH y 0,9 g de NaBH_{4} con agitación a un reactor que contenía una solución de 250 ml de la matriz básica y 150 ml de agua destilada. La mezcla se calentó hasta 30ºC. Se añadieron 60 ml de ECH a la solución. La reacción se dejó continuar durante 2 horas a 30ºC. La mezcla después se neutralizó con ácido acético (pH=6-7) y la matriz se lavó con agua destilada.
Acoplamiento de dextrano. Se añadieron 100 ml del gel activado con epóxido, 12 g de NaOH y 0,4 g de NaBH_{4} a un reactor que contenía la solución de dextrano (30ºC.). La reacción se permitió continuar durante una noche (aprox. 18 h) a 30ºC. La mezcla después se neutralizó con ácido acético (pH=6-7) y la matriz se lavó con agua destilada.
Acoplamiento de la Proteína A nativa. De manera análoga al Ejemplo 11A.
Métodos de análisis
Los contenidos en epóxido de diversos geles se determinaron en un Radiometer VIT 90 Titrator con HCl 0,1 M, pH fijo de punto final pH 7.
Los contenidos en alilo de diversos geles se determinaron en un Mettler DL40GP Memo Titrator con AgNO_{3} 
\hbox{0,1 M.}
Los contenidos en dextrano de diversos geles se determinaron calculando la diferencia entre el peso seco del dextrano acoplado y los geles activados con epoxi. El peso seco se determinó después de un secado de 18 h en un horno a 105ºC y se expresó como mg de dextrano por ml de gel.
\global\parskip0.990000\baselineskip
La capacidad de iones cloruro se determinó en un Mettler DL40GP Memo Titrator con AgNO_{3} 0,1 M.
La capacidad de H^{+} se analizó en un Radiometer VIT 90 Titrator con HCl 0,1 M, pH fijo de punto final pH 7.
\vskip1.000000\baselineskip
Capacidad de avance Q_{B} (C/C_{O}=0,1) para BSA (albúmina de suero bovino) a 400 cm/h, lecho expandido. Equipamiento
Columna: STREAMLINE 25 (Pharmacia Biotech AB)
Tampón A: Tris/HCl 50 mM, pH 7,5
Tampón B: Tris/HCl 50 mM, NaCl 2 M, pH 7,5
Proteína: BSA (InterGen Company, EEUU)
Flujo: 400 cm/h
Procedimiento
La capacidad de avance Q_{B} se determinó en una columna STREAMLINE®25 (cargada con gel sedimentado a una altura de 15 cm) a un caudal lineal de 400 cm/h. La proteína se disolvió en aproximadamente 2 mg/ml de tampón A y la concentración se midió usando a espectrómetro a A_{280}.
La columna se evitó inicialmente y el flujo se suministró directamente al monitor de UV, en el que se midió un valor de absorbancia a 280 nm de solución no adsorbida (C_{O}), después de lo cual se dejó pasar el flujo junto con la muestra a través de la columna. Cuando la absorbancia del flujo a través de la columna (280 nm) fue el 10% de la absorbancia C_{O}, se interrumpió el ensayo, se lavó el gel y se eluyó la BSA unida al gel con tampón B. El eluido se recogió y se determinó su contenido en BSA, que a su vez dio la cantidad de BSA adsorbida por ml de gel (la capacidad de avance (Q_{B}) para C/C_{O}=0,1).
\vskip1.000000\baselineskip
Capacidad de avance Q_{B} (C/C_{O}=0,1) para ovoalbúmina a 400 cm/h, lecho expandido. Equipamiento
Columna: STREAMLINE 25 (Pharmacia Biotech AB)
Tampón A: Tris/HCl 50 mM, pH 7,5
Tampón B: Tris/HCl 50 mM, NaCl 2 M, pH 7,5
Proteína: ovoalbúmina (Sigma A-5503)
Flujo: 400 cm/h
Procedimiento
De manera análoga al procedimiento para BSA.
\vskip1.000000\baselineskip
Capacidad de avance Q_{B} (C/C_{O}=0,1) para lisozima a 400 cm/h, lecho expandido. Equipamiento
Columna: STREAMLINE 25 (Pharmacia Biotech AB)
Tampón A: glicina 50 mM pH 9,0
Tampón B: glicina 50 mM, NaCl 2 M, pH 7,5
Proteína: lisozima (Sigma L-6876)
Flujo: 400 cm/h
Procedimiento
De manera análoga al procedimiento para BSA.
\vskip1.000000\baselineskip
Capacidad de avance Q_{B} (C/C_{O}=0,1) para hIgG a 400 cm/h, lecho expandido. Equipamiento
Columna: STREAMLINE 25 (Pharmacia Biotech AB)
Tampón A: acetato sódico 50 mM, pH 5,0
Tampón B: acetato sódico 50 mM, NaCl 2 M, pH 7,5
Proteína: hIgG (Pharmacia & Upjohn)
Flujo: 400 cm/h
Procedimiento
De manera análoga al procedimiento para BSA.
Los resultados de los ejemplos 3-10 están comparados con gel convencional para lecho expandido (STREAM-
LINE®DEAE y STREAMLINEE®SP, Pharmacia Biotech AB) y se presentan en la tabla 1 y 2.
TABLA 1 Capacidad de avance Q_{B} (C/C_{O}=0,1) para BSA y Ovoalbúmina a 400 cm/h, lecho expandido
Nº Ejemplo Contenido en dextrano Capacidad de Cl^{-} Q_{B} mg Q_{B} mg
mg dextrano/ml gel mmol Cl^{-}/ml gel BSA/ml gel Ovoalbúmina/ml gel
STREAMLINE DEAE 0 0,13-0,21 39 38
Ejemplo 3 22 0,21 163 153
Ejemplo 4 22 0,26 144 168
Ejemplo 5 29 0,24 145 129
Ejemplo 6 29 0,33 144 121
TABLA 2 Capacidad de avance Q_{B} (C/C_{O}=0,1) para lisozima y hIgG a 400 cm/h, lecho expandido
Nº Ejemplo Contenido en dextrano Capacidad de Cl^{-} Q_{B} mg Q_{B} mg
mg dextrano/ml gel mmol Cl^{-}/ml gel lisozima/ml gel hIgG/ml gel
STREAMLINE DEAE 0 0,17-0,24 78^{1)} 12
Ejemplo 7 22 0,19 215 70
Ejemplo 8 22 0,24 215 39
Ejemplo 9 29 0,19 222 73
Ejemplo 10 29 0,24 198 58
^{1)} La capacidad de avance Q_{B} (C/C_{O}=0,1) es 120 mg de lisozima/ml de gel.
Conclusión
Se puede observar de las tablas 1 y 2 que el principio de la invención puede dar resultado en matrices con una capacidad de avance Q_{3} de más de tras veces superior que los geles convencionales usados en cromatografía de lecho expandido.
Para matrices con proteína A nativa los experimentos preliminares mostraron un efecto que fue nulo o sólo mínimo con respecto al aumento en la capacidad de avance (lecho compactado) por el uso de un prolongador. Esto puede depender del hecho de que el prolongador usado (dextrano Pm 10.000 Da) era mucho más pequeño que la estructura de afinidad como tal (proteína A, Pm aproximadamente 40.000 Da). Resultados no presentados.

Claims (15)

1. Un método para la adsorción de un sustancia a partir de una muestra líquida en un lecho fluidizado o suspensión agitada, en el que las perlas usadas comprenden una matriz básica y ligandos de afinidad, caracterizado en que los ligandos están unidos adecuadamente a la matriz básica mediante prolongadores que proporcionan las superficies de las perlas con una capa polimérica flexible.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado en que los prolongadores comprenden al menos 30 unidades monoméricas.
3. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizado en que las perlas contienen partículas de carga.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado en que el lecho es un lecho expandido.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado en que el lecho es un lecho expandido estabilizado.
6. El método de acuerdo con las reivindicación 4, caracterizado en que el lecho es un lecho expandido turbulento.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado en que la adsorción tiene lugar en una suspensión agitada.
8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado en que el prolongador es un polímero y cada prolongador lleva dos o más estructuras con afinidad por la sustancia a adsorber.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado en que el polímero es de estructura no polipeptídica.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado en que, si están presentes, los entrecruzamientos intra- e intermoleculares en el prolongador derivan del entrecruzamiento del prolongador antes de la unión del mismo a la matriz básica.
11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado en que las perlas son porosas.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 7-11, caracterizado en que el lecho es un lecho fluidizado estabilizado por un flujo de fluido distribuido uniformemente a los largo del área de sección transversal del lecho.
13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado en que los ligandos de afinidad se seleccionan entre:
a. Grupos cargados positivamente (grupos de amina primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria),
b. Grupos cargados negativamente (por ejemplo, carboxi, ácido fosfónico, ácido sulfónico, etc.),
c. Grupos anfotéricos,
d. Grupos que tienen una afinidad específica (por ejemplo, grupos de bio-afinidad), tal como entre la proteína de unión a IgG (Proteína A, G, L, etc.) e IgG, lectina y carbohidratos, antígeno/hapteno y anticuerpo, (estrep) avidina y biotina,
e. Ácidos nucleicos/oligonucleótidos complementarios,
f. Grupos que muestran sistemas electrónicos \pi,
g. Grupos quelato, y
h. Grupos hidrófobos.
14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado en que los ligandos de afinidad se seleccionan entre grupos catiónicos o aniónicos.
15. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizado en que la muestra líquida se obtiene de un fermentador.
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