JP2001510397A - 吸着／分離方法および吸着／分離の媒体 - Google Patents

吸着／分離方法および吸着／分離の媒体

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Abstract

(57)【要約】 流動ビーズまたは攪拌懸濁で液体試料から物質を吸着する方法であり、使用するビーズに基礎マトリクスを含み、構造はエクステンダーを介して基礎マトリクスに共有結合することを特徴とする、物質に親和性を有する構造を示す。基礎マトリクスに組込まれた充填物およびエクステンダーを含むビーズのビーズ集団も記載している。

Description

【発明の詳細な説明】 吸着／分離方法および吸着／分離の媒体 技術分野および従来技術 本発明の技術分野の総論 本発明は、物質に親和性のある構造(リガンド)を示すビーズを含む非パック床 への吸着による、物質の分離方法に関与する。非パック床は、流体の上下流(そ の流れの方向は使用するビーズの密度に依存する)により沈積ビーズを伸展(expa nding)／流動化することによって生じ得る。吸着する物質を含む液体試料は、伸 展の後、流れに導入される。効果の小さい非パック床は、乱流を用いることによ りまたは攪拌器により懸濁ビーズを攪拌することにより得られる。 様々な大きさおよび／または密度のビーズを含む、ビーズ集団を選択し、伸展 床でこの集団を用いることにより、大きなビーズおよび高密度のビーズがより小 さなビーズおよびより小さな密度のビーズの下に位置する、いわゆる分級床(cla ssified bed)が得られる。これらのタイプの床のバックミキシングは低くなり、 それらは安定伸展床(expanded bed)と呼ばれている(安定流動床ともいう)。流動 床を安定化する他の方法は、磁性充填粒子をビーズに組込み、流動化の間、磁場 を適用する。磁場による安定化は、安定伸展床を粒度／密度が一定範囲で異なる ビーズを用いずに形成し得る１つの例である。安定流動床での吸着は、パックし た床によるクロマトグラフ法のようにプラグフローの間に行なわれ得る。理論段 数は、高くなる。非パック床が、乱流により、または攪拌により得られる場合、 バックミキシングは高くなり、吸着はバッチ型式で成される。手短に、最近 367-374の導入部参照。 床のバックミキシングは、しばしば軸向分散(axial dispersion)(“容器分散 数(vessel dispersion number)”)として測定される。Levenspiel，”Chemical Reaction Engineering”2nd Edition，John Wiley & Sons(1972)参照。安定伸展 ビーズについて、容器分散数は、好ましくは<75x10-3、更に好ましくは<20x10- 3 であり、それは>5、更に好ましくは>30の理論段数に相当する。完全なバックミ キシングでは、段数は、1となる。 床の伸展／流動化は、通常、各カラムの端にカラムの断面部分を覆うネット構 造または流れに乱流を生じさせない、穴の開いた他の幾つかの装置を供したカラ ムで実施される。例えばWO-A-9218237(Pharmacia Biotech AB，Uppsala Sweden) 。同様の実施が、攪拌した導入流を用いるシステムにも要求される(WO-A-920079 9;Kem-En-Tek/Upfront Chromatography A/S)。他の業者のものも利用できる。 吸着の後、溶出は伸展床から直接的に実行できる。別法として、床を静止させ 、吸着された物質は、床を伸展したときとはしばしば逆方向で導入される液体の 流れによって溶出されてもよい。 流体はしばしば水溶液(例えば水に溶解した緩衝液)であるが、他の流体も使用 し得る。 背景技術 Pharmacia Biotech AB(Uppsala，Sweden)はStreamline(商標登録)を市販して おり、その最初のバージョンは充填物質として石英粒子を伴うアガロースの多孔 性ビーズを用いている(WO-A-9218237，Pharmacia Biotech AB)。最近のバージョ ンにおいて、石英粒子は、石英よりも高い密度の充填物に置換されている(Pharm acia Biotech ABによって1995年11月7日付け優先権を伴って出願されたPCT/SE96 /01431)。他の主な供給者はBioprocessing Ltd.(Durham，England)であり、その 多孔質ガラスビーズ(Prosep(商標登録))は伸展床のクロマトグラフィーに用い得 る(Beyzavi et al.，Genetic Engineering News，March 1，1994 17)。更に他の 供給者はSepracorである。 US-A-4,976,865(Sanchez，et al.，CNRS)により、パックした伸展床および安 定伸展床において成される多段階吸着を模倣するセグメント化カラムの使用が教 示される。実験部において使用されたビーズは被覆されたガラス粒子(Spherosil )である。 WO-A-9200799(Kem-En-Tek;Upfront Chromatography)により、多数の充填物お よびポリマー物質が開示され、それらは流動床の吸着を目的とするビーズを生産 するために組合され得る。それぞれのビーズには2つまたはそれ以上の充填粒子 を含む。 WO-A-8603136(Graves and Burns;University Patents Inc)により、磁性充填 粒子を含むビーズ、および外部からの磁場の適用により安定させた流動床の使用 が開示されている。またBurns et al.，Biotechnol．Bioengin．27（1985）137- 40参照。 パックした床のクロマトグラフィーにおいて、早くから、孔が全体的にまたは 部分的に、イオン交換基のような、親和性リガンドを有する親水性ゲルで満たさ れている多孔性ビーズの使用が提唱されている。1つの例はMacrosob-Kであり、 それは大多孔性(macroporous)珪藻土であり、アガロースで充填し、そしてDEAE またはCMイオン交換基を提示するように修飾されている(それぞれ、Macrosorb-K AX．DEAE and Macrosorb-KAX．CM(GB-A-1,586,364，Miles))。この最近のタイプ の物質は、流動床クロマトグラフィーにも適用されている(Bite et al.，In:Ver rall et al.，Separations for Biotechnology(1987),Elles Horwood Ltd，Chap ter 13，193-199)。 された床、静穏状態での流動床および磁性安定床上の吸着の比較研究を開示する 。使用するビーズはAmberlite XAD製であり、それは、合成ポリマーで吸着的に 被覆し、その後、吸着する物質に親和性のあるリガンドをポリマーの一端に連結 している。磁性粒子は被覆内に位置する。 初期の流動床システムに関する問題 伸展および／または流動床における吸着方法の場合、最大級の生産性を得ると いう明示された要請がある。これを達成するために考慮すべき重要な条件は、吸 着する物質に対する最大級の漏出容量を有するビーズを使用すること、および流 速を増加することである。しかしながら、流速の増加により、漏出容量が減少し 、またビーズの流出のリスクが増加する。流出問題を解決する一つの方法は、充 填 物質を含ませることによってビーズの密度を高くすることである。しかしながら 、概して充填物質は、漏出容量に不利益な効果となり、この効果は流速、ビーズ の孔の大きさ、吸着する物質に結合する構造、吸着する物質等のような様々な因 子に依存する。 ビーズ型の充填物質の漏出容量を増加させる1つの方法は、近年、国際特許出 願PCT/SE96/01431に記載されている(Pharmacia Biotech AB)(その記載は、ここ で引用によりこの明細書の一部に加える)。以下参照。 本発明の目的 第1の目的は、流動床の吸着工程で全体的な収量を改善すること。 第2の目的は、流動床の吸着工程の生産性を改善すること。 第3の目的は、流動床の漏出容量を改善する充填マトリクスを提供すること。 本発明の詳細な説明 我々は、今、親和性構造／リガンドがエクステンダーを介しビーズの基礎マト リクスに結合しているビーズを用いることにより上記問題を解決することを実現 した。 エクステンダーによる明確な効果は、それにより、床を通過する高分子および 他の分子が浸透できる可曲性ポリマー層を有するビーズの内側表面(孔表面)およ び／または外側表面を提供するという事実に帰すると考えられる。これによって 、吸着する物質に対する親和性構造／リガンドの有効相互作用容積、および立体 的利用性が増加する。そしてこれによって、物質移動速度および全容積利用性(t otal capacity available)を増加する。 それゆえ、本発明の最初の観点は、上記のような、流動床または攪拌懸濁によ る分離方法である。その特徴は、用いる親和性構造がエクステンダーを介して基 礎マトリクスに結合していることである。好ましくは、この結合は共有結合であ り、それは、好ましい態様において、親和性構造と基礎マトリクスの間には非共 有結合が存在しないことを意味する。 エクステンダー 適当なエクステンダーは親水性であり、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、ア ミノ、反復性エチレンオキシド(-CH2CH2O-)、アミド等から選択される複数の基 を含む。エクステンダーは、ホモ-またはコポリマーのようなポリマー型であっ てもよい。親水性ポリマーのエクステンダーは、合成由来、すなわち合成骨格ま たは生物的由来、すなわち天然性骨格を有するバイオポリマーであってもよい。 典型的な合成ポリマーは、ポリビニルアルコール、ポリアクリル-およびポリメ タクリルアミド、ポリビニルエーテル等である。典型的なバイオポリマーは、澱 粉、セルロース、デキストラン、アガロースのようなポリサッカライドである。 好ましいポリマー性エクステンダーは、しばしば遊離状態、すなわち、基礎マト リクスに結合していないとき、多くの場合、水可溶性である。水不溶性ポリマー 、または元来は低い親水性のポリマーは、親水性基を導入することにより更に親 水性となし得る。特に、ポリペプチド構造を欠く、いわゆるポリヒドロキシポリ マーおよび他のポリマーが好ましいと考えられる。 最適なエクステンダーの長さ(大きさ)は、ビーズの基礎マトリクスへの結合点 の数、エクステンダーの型、親和性リガンドの構造および大きさ、ならびにエク ステンダー分子あたりのそれらの数、架橋度等のような幾つかの因子に依存する 。エクステンダーにより形成する層の可曲性(flexibility)は、エクステンダー 分子あたりの基礎マトリクスへの結合点の数、および／またはエクステンダーの 架橋度の減少に対応して増加する。例えば、モノマー単位の端に1点結合が可能 なエクステンダーは小さくなり得る。結合および／または架橋が、幾つかのモノ マー単位に可能なポリマー性エクステンダーにとって、より大きなエクステンダ ーが好ましいと考えられる。上記型のポリマーとして、例えば、最も適当なポリ マーは、少なくとも30モノマー単位を含み、デキストランのようなポリサッカラ イドではMw>5000Daとなるものである。 エクステンダーの可曲性を制御するには、最初に基礎マトリクスを活性化し、 そして導入した活性化基との反応によりマトリクスにエクステンダーを結合させ ることが、しばしば有利である。典型的な活性化試薬は、求電子機能性基で2回 反応し得るという意味で、二官能性である。例示すると、エピハロヒドリン (epihalohydrin)、ビスエポキシド(bisepoxide)、CNBr等がある。他の二官能性 試薬は中間的活性化反応を必要とし、例えばアリルグリシジルエーテルおよびス チリルグリシジルエーテルがある。後者の試薬では、最初の反応がオキシラン(o xirane)基で起こり、その後、活性化はハロゲン(陽性ハロゲンを提供するX2、OH または他の化合物)の炭素-炭素二重結合への付加により起こる。二官能性試薬は 、しばしばエクステンダーと基礎マトリクス間に安定した架橋を生じ、それは、 好ましい場合では、1つもしくはそれ以上の酸素原子(エーテル構造)またはアミ ノ窒素を中途に介在させ、また所望により1つまたはそれ以上のヒドロキシまた はアミノ基で置換される、直鎖状、分枝状炭化水素鎖を含んでいる。好ましい二 官能性試薬により、液体クロマトグラフィーに用いるpH領域における、すなわち 多くの場合pH3-12における加水分解に対し安定な架橋を生じる。これは、しばし ば、架橋にはエステル基および加水分解安定の低い基かそれと同等の基が全くな いこと、例えば架橋は、殆どの場合、1個だけの炭素原子に結合する1つの酸素ま たは窒素原子を有することを意味する。典型的には、架橋は30原子未満の長さで ある。 もし適当に使用したならば、基礎マトリクスとエクステンダーの結合に使用す る二官能性試薬は、エクステンダーに分子内または分子間架橋を全く形成しない か、僅かに形成するだけである。 親和性構造／リガンド 親和性は、エクステンダーの構造には固有のものであるか、適当なリガンド構 造／基(親和性リガンド)とエクステンダーの化学的カップリングにより導入され 得る。これは、エクステンダーは、しばしば吸着させようとする物質／物質群に 親和性のある、1つ、好ましい場合は2つまたはそれ以上のリガンド／基で置換さ れることを意味する。典型的な親和性リガンド／基は以下のものである： １．陽性荷電基(1級、2級、3級または4級アミン基) ２．陰性荷電基(例えば、カルボキシル基、リン酸、硫酸等) ３．両向性基 ４．IgG-結合タンパク質とIgG、レクチンと炭水化物、抗原／ハプテンと抗体、 (Strep)アビジンとビオチンのような、特異的親和性を有する基(例えば、生物親 和性基) ５．相補性核酸／オリゴヌクレオチド ６．π-電子システムを有する基 ７．キレート基 ８．疎水性基など これら親和性リガンド／構造を用いることにより、本発明方法は、イオン交換 クロマトグラフィー、生物特異的親和性クロマトグラフィー、疎水性相互作用ク ロマトグラフィー、“逆相クロマトグラフィー”、キレートクロマトグラフィー 、共有結合クロマトグラフィー等のような親和性クロマトグラフィー、または相 当するバッチ型吸着として実施され得る。 リガンドは、エクステンダーを基礎マトリクス表面に結合させる前か、後に導 入され得る。これを行う1つの方法は、カルボキシ、アミノ、ヒドロキシ等のよ うなエクステンダーの適当な基を、CNBr、ビスエポキシドまたは相当するエピハ ロヒドリン、アリルグリシジルエーテル等のような適当な二官能性試薬と反応さ せ、次いで所望の親和性を導入する化合物と反応させて所望の反応性を導入する ことが行なわれる。エクステンダーの基と反応する基を有する化合物の場合、特 別のエクステンダー誘導体化は必要ではない。条件および試薬は、エクステンダ ーの架橋を最小限にするように選択すべきである。 親和性リガンドの導入には、しばしばリガンドとエクステンダーの間にリンカ ーを挿入することが考えられる。そのようなリンカーは、しばしば、酸素(エー テル)および／もしくは窒素(アミノ)原子を中途に介在させ、ならびに／または ヒドロキシおよび／もしくはアミノ基で置換され得る、直鎖状、分枝状または環 状炭化水素鎖が含まれるという意味においては親水性である。リンカーの条件は 、多くの場合、基礎マトリクスにエクステンダーを結合させる架橋の場合と同じ である。上記参照。 天然のプロテインAから得られる乏しい効果は、エクステンダーの大きさと親 和性構造／基との最適な割合によって説明され得る。天然のプロテインAは、実 験部(実施例11)(デキストランMw10,000Da)で使用するエクステンダーよりも遥か に大きい。これはまた、今日の知識と合わせて、本発明の大きな効果は通常上記 のような基１、２、３、６、７および８に見られる、より小さな親和性基で達成 すると考えられているという事実を指し示す。親和性構造とネイキッドエクステ ンダーの分子量の比は、1未満、例えば0.1未満である。 基礎マトリクス ビーズの基礎マトリクスは、流動化および充填ビーズのクロマトグラフィーに 使用するビーズとして既知の有機的または無機的性質のものである。それは多孔 性でもよいし、非多孔性でもよい。それはしばしば、ガラス、合成ポリマーまた はバイオポリマーのようなポリマーである。基礎マトリクスは、疎水性ポリマー であってもよく、例えばスチレンジビニルベンゼンコポリマーであり、それは適 当な親水性ポリマー(しばしばヒドロキシおよび／またはアミノ基を有するポリ マー)で被覆することにより、または例えば酸化して上記の型の親水性基を導入 するのような他の方法により、内側および／または外側表面を親水性化する。他 に、基礎マトリクスは、水-不溶性親水性ポリマーであってもよく、例えばアガ ロース、セルロース、デキストラン、澱粉等であり、必要ならば架橋させて、所 望の多孔性および安定性を付与する。優先日では、アガロースが好ましくは架橋 型において選択のポリマーであった。さらに基礎マトリクスのポリマーの選択に ついての考察は、WO-A-9200799(Kem-En-Tek A/S/Upfront Chromatography A/S) 、WO-A-9218237(Pharmacia Biotech AB)、PCT/SE96/01431(Pharmacia Biotech A B)およびWO-A-8603136(Graves & Burns,University Patents Inc)参照。 ビーズの密度および充填物質 上向きの流動化のためには、最終ビーズ密度(平均密度、濡れ状態)は、ビーズ が使用される流体の密度より高く、すなわち水溶液の場合>1g/cm3、例えば 液中で測定した)である。下向きの流動化のためには、逆になり、すなわち最終 ビーズ密度(平均密度、濡れ状態)は、ビーズが使用される流体の密度よりも低く 、すなわち水溶液の場合>1g/cm3である。攪拌懸濁の場合は、ビーズ密度はそれ 程 重要ではない。 本発明方法で使用するビーズは、意図された使用に適切な密度のビーズを得る ために充填物質が含まれてもよいし、含まれていなくてもよい。充填物質は、磁 性物質であってもよいし、非磁性物質であってもよい。 多孔質ガラスビーズおよび他の多孔性無機物質などの、ある種のビーズマトリ クス物質は、それ自身濡れ状態で適当な密度を有し、それゆえ密度を制御する充 填物を含む必要はない。 一方、有機ポリマーは、意図された吸着工程において使用する流体密度にしば しば近い密度となる。この場合、流動床吸着のために、当分野で既知の充填粒子 を加えることはしばしば大きな利点となる。WO-A-9200799(Kem-En-Tek A/S/Upfr ont Chromatography A/S)、WO-A-9218237(Pharmacia Biotech AB)およびPCT/SE9 6/01431(Pharmacia Biotech AB)参照。1つ、好ましくは2つまたはそれ以上の粒 子がビーズあたりに添加される。流動化の流れの方向に依存して(上向きまたは 下向き)、充填物は使用する流体よりも、それぞれ低い密度となるか、高い密度 となる。水流動化の場合、これは<1g/cm3(下向き)または>1g/cm3(上向き)を意味 する。典型的な充填物は、ガラス、石英およびシリカ、金属、金属塩、金属合金 等の粒子である。さらにWO-A-920799(Kem-En-Tek A/S/Upfront Chromatography A/S)およびWO-A-9218237(Pharmacia Biotech AB)参照。流速 好ましい充填物質は重金属である。 充填物質の粒子サイズは通常1-200μmの範囲内であるが常にビーズより小さく 型的な粒子サイズは、1-70μmであり、好ましくは15-50μmの範囲である。 多孔性ビーズの場合、充填粒子の幾何学的形態が重要である。好ましい形態に は、球、楕円、小滴、麺形、マメ形およびこれらの形態の粒子の凝集体(aggrega tes/agglomerate)が含まれる。特に好ましいのは連続曲面形態(continuously ro unded shape)である。さらにPCT/SE96/01431(Pharmacia Biotech AB)参照。これ は、孔の大きさが吸着されるべき物質が浸透し得るようにする場合に特に重要と なる。 ビーズの充填物含量は、最終的なビーズの所望の密度および容量、使用される べき流速、充填物質の型および密度、リガンド、吸着されるべき物質等のような 因子により決定される。典型的には、最適な充填物含量は、1-100％(w/w、濡れ ビーズ)の範囲である。 ビーズサイズ 個々の適用で使用するビーズの集団は、単分散であってもよく、また、あるビ ーズサイズ分布および平均ビーズサイズを有し、あるサイズ範囲にあるビーズを 含む。適当な平均ビーズサイズおよびサイズ範囲は、典型的には10-1,000μmの 範囲以内であり、好ましくは50-700μmの範囲である。多くの流動床(伸展床)の 場合、ビーズは流動化に使用する容器の排出口または導入口を通って漏れ出ては ならないという事実によって、下限が決定される。ビーズサイズの選択に影響す る他の因子には、所望の容量、使用するリガンド、試料に含まれ、吸着されるべ き特定の物質または物質群等を含む。 ビーズの全表面積(内側＋外側表面)と全ビーズ容積との比は、漏出容量に非常 に重要である。より大きな相対的接触表面積(小さいビーズ)により、より高い漏 出容量をもたらす。一方、全容量は殆ど影響を受けない。 床の断面全体に均一な流れによって安定化された伸展床では、典型的なビーズ サイズ分布は、その巾が平均ビーズ直径の0.1から10倍であり、好ましくは平均 ビーズ直径の0.3から3倍である範囲内に95％のビーズが相当するような分布であ る。選択されるべき正確な粒子サイズ分布は、流速、平均ビーズ直径、ビーズ密 度、流体密度等のような因子に依存する。粒子サイズの分布が広くなりすぎると 、大きな集団のビーズの流出および／または沈積のリスクが増加する結果となる 。サイズ分布は、非対照的であってもよく、例えば範囲の低い部分のビーズの集 団は、高い部分の集団よりも大きくてもよい。現在の生産技術ではあまり好まし くないけれども、この特別の適用において、将来のサイズ分布は、使用するビー ズの密度の分布となる。個々のビーズのサイズおよび密度の両方が変化するビー ズ集団がまた、使用し得る。 磁性安定化流動床または乱流流動床および攪拌懸濁に対して、使用するビーズ 集団内のサイズおよび／または密度分布に対する要求はそれ程重要でない。これ らの場合もまた、単分散ビーズ集団が使用され得る。 ビーズの多孔性 最終的なビーズは、物質をビーズ内部に浸透し吸着し得る開孔を有する、多孔 性であることが好ましい。最適な多孔性は、吸着する物質または物質群のサイズ により決定され得る。エクステンダーが、ある種の未知の方法でビーズ内の物質 搬送を促進しているように思われる。それゆえ、許容できるKav値の範囲はエク ステンダーのないビーズよりも広くなり、すなわちエクステンダーのない0.40-0 .95と比べて、0.1-0.95となる。Kavの定義については、L．Hagel in”Protein P urification，Principles，High Resolution，and Applications”，J-C Janson 適用する試料 本発明の方法において適用する試料は、バックおよび非パック床のクロマトグ ラフィー法に、または乱流流動床および攪拌懸濁のバッチ吸着法に以前から適用 されているものと同じタイプのものであってもよい。本発明ビーズおよび方法は 、発酵槽および他の細胞培養容器からの処理および非処理の上清／培養培地、血 清、血漿、飲料等の処置に適用され得る。 吸着する物質または試料の何れであっても、さらに処理し得る。 本発明は、様々な分子量およびタイプの化合物の分離に機能する。例として高 分子があり、例えばポリサッカライド、タンパク質／ポリペプチドおよび核酸、 分子量1,000,000未満の化合物の吸着／分離に限られるけれども、通常分子量に 上限はない。 ビーズ製造のその他の観点 ビーズは前述の吸着目的に適当となることが保証されなければならないが、基 礎マトリクスビーズの製造、結合基の導入、充填物の添加等は、既知の方法で実 施される。ビーズは、適当なサイズのフラクションを得るために、必要であれば 、篩過される。 本発明の第2の観点 本発明の第2の観点は、上記の充填物質(ビーズフラクション)を含むビーズの 集団であり、それは、前述の伸展／流動床上で実施される吸着／分離方法、特に クロマトグラフィー法において、マトリクスとしての使用に適当である。本発明 のこの観点はまた、流動化のために流れる液体の導入および排出開口部を有する カラムに設置される、上記の安定な伸展床の型の集団を含む。この第2の観点に は、例えば前活性化型の親和性基を欠くビーズ集団を含む。上記考察のように、 集団内のビーズは、あるサイズおよび／または密度範囲を有し、またはこれらの 特徴について均質となり得る(単分散)。 以下の実験部分では、この出願の優先日における最も好ましいビーズ集団の製 造を開示する。 実験部 合成実施例1 デキストラン溶液の調製 デキストラン53.6kg(T40 Mw40,000 Pharmacia Biotech AB)を、攪拌しながら バッチリアクター内の蒸留水60Lに添加し、20℃、20時間攪拌した。 基礎マトリクスのエポキシド活性化 基礎マトリクス(ビーズ、125-315μm)をWO-A-9218237の実施例1の通りに調製 した。50％ NaOH 3.2Lを、攪拌しながら基礎マトリクス20Lおよび蒸留水9.1Lを 含むリアクターに添加した。混合物を25℃に冷却した。エピクロロヒドリン(ECH )4.68Lを約45分間でリアクターにポンプで送入した。反応は25℃で2時間実施し た。次いで反応混合物を酢酸(pH=6-7)で中和し、活性化基礎マトリクスを蒸留水 で洗浄した。分析すると、ゲル1mlあたり16.8μmolのエポキシド基を持って いた。 デキストランカップリング デキストラン溶液27.9Lを、攪拌しながら、エポキシド活性化基礎マトリクス2 0Lおよび蒸留水3.4Lを含むリアクターに添加した。混合物を1時間攪拌した。次 いでNaOH(50％)3.2LおよびNaBH434.6gを添加し、一夜反応させた(約18時間)。次 いで混合物を酢酸(pH=6-7)で中和し、マトリクスを蒸留水で洗浄した。反応後の マトリクスのデキストラン含量はゲル1mlあたり22.0mgであった。実施例2 デキストラン溶液の調製 実施例1と同様に、デキストラン56.3kgおよび蒸留水60Lで行った。 基礎マトリクスのエポキシド活性化 実施例1と同様に、50％ NaOH 4.0L、ゲル25Lおよび蒸留水11.4Lで行った。分 析すると、ゲル1mlあたり22.0μmolのエポキシド基を持っていた。 デキストランカップリング 実施例1と同様に、デキストラン溶液39.3L、エポキシド活性化ゲル25L、蒸留 水1.5L、50％ NaOH 4.0LおよびNaBH445.5gで行った。反応後の基礎マトリクスの デキストラン含量はゲル1mlあたり29.0mgであった。実施例3 4級アミノメチル基(Q-基)(陰イオン交換体)の導入 グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド250ml(G-MAC 70％)を、攪拌しな がら、実施例1のマトリクス250mlおよび蒸留水25mlを含む溶液に添加した。混合 物を30℃に加熱し、NaOH(50％)7.3mlおよびNaBH40.5gを添加した。反応は30℃で 18時間続けた。次いで混合物を酢酸(pH=6-7)で中和し、得られたマトリクスを蒸 留水、2M NaClで洗浄し、そして蒸留水で1回以上洗浄した。生成物の塩素イオン 容量はゲル1mlあたり0.21mmol Cl-であった。実施例4 4級アミノメチル基(Q-基)(陰イオン交換体)の導入 実施例3と同様に、G-MAC325ml、実施例1のゲル250ml、蒸留水25ml、NaOH(50％ )11.6mlおよびNaBH4 0.5gで行った。生成物の塩素イオン容量はゲル1mlあたり0. 26mmol Cl-であった。実施例5 4級アミノメチル基(Q-基)(陰イオン交換体)の導入 実施例3と同様に、G-MAC250ml、実施例2のゲル250ml、蒸留水25ml、NaOH(50％ )7.3mlおよびNaBH4 0.5gで行った。生成物の塩素イオン容量はゲル1mlあたり0.2 4mmol Cl-であった。実施例6 4級アミノメチル基(Q-基)(陰イオン交換体)の導入 実施例3と同様に、G-MAC325ml、実施例2のゲル250ml、蒸留水25ml、NaOH(50％ )11.6mlおよびNaBH4 0.5gで行った。生成物の塩素イオン容量はゲル1mlあたり0. 33mmol Cl-であった。実施例7 アリル化 NaOH55g、NaBH4 0.9gおよびNa2SO4 32gを、攪拌しながら、実施例1で調製した エクステンダーを有する基礎マトリクス250mlおよび蒸留水100mlを含むリアクタ ーに添加した。混合物を45℃に加熱した。1時間後、アリルグリシジルエーテル( AGE、>99％)を添加した。反応は45℃で18時間続けた。次いで混合物を酢酸(pH=6 -7)で中和し、蒸留水、エタノールで洗浄し、再度蒸留水で洗浄した。分析する と、ゲル1mlあたり0.19mmolアリル基を示した。 スルホプロピル(SP)基(陽イオン交換体)の導入 Na2S2O544gを、攪拌しながら、アリル化マトリクス250mlおよび蒸留水76mlの 混合物を含むリアクターに添加した。次いでNaOH(50％)をpH6.5となるまで添加 した。ガス分散チューブを用い反応混合物中に空気を送気した。反応は20℃で18 時間続け、次いでゲルを蒸留水で洗浄した。生成物のH+容量はゲル1mlあたり0.1 9mmol H+であった。実施例8 アリル化 実施例7と同様に、実施例1のアガロースーデキストランマトリクス250mL蒸留 水100ml、NaOH65g、NaBH4 0.9g、Na2SO4 32gおよびAGE135mlで行った。分析する と、ゲル1mlあたり0.23mmolアリル基を示した。 スルホプロピル(SP)基(陽イオン交換体)の導入 実施例7と同様に、アリル化ゲル250ml、蒸留水76mlおよびNa2S2O544gで行った 。生成物のH+容量はゲル1mlあたり0.24mmol H+であった。実施例9 アリル化 実施例7と同様に、実施例2のアガロース-デキストランマトリクス250ml、蒸留 水100ml、NaOH 55g、NaBH4 0.9g、Na2SO4 32gおよびAGE 115mlを実施例7の通り に反応した。分析すると、ゲル1mlあたり0.19mmolアリル基を示した。 スルホプロピル(SP)基(陽イオン交換体)の導入 実施例7と同様に、アリル化ゲル250ml、蒸留水76mlおよびNa2S2O5 44gで行っ た。生成物のH+容量はゲル1mlあたり0.19mmol H+であった。実施例10 アリル化 実施例7と同様に、実施例2のアガロース-デキストランマトリクス250ml、蒸留 水100ml、NaOH 55g、NaBH4 0.9g、Na2S04 24gおよびAGE 135mlで行った。分析す ると、ゲル1mlあたり0.23mmolアリル基を示した。 スルホプロピル(SP)基(陽イオン交換体)の導入 実施例7と同様に、アリル化ゲ ル250ml、蒸留水76mlおよびNa2S2O5 44gで行った。生成物のH+容量はゲル1mlあ たり0.24mmol H+であった。実施例11 基礎マトリクスは、PCT/SE96/01431のとおりに、2つのアガロース濃度(それぞ れ3％および4％)を用いて調製した。 充填物質 Mn 0.31％、P 0.007％、S 0.001％、Cr 15.5％、Ni 75.0％、Cu 0.02％およびFe 8.68％の化学組成((重量)%)を有するクロムニッケル合金である。この合金は密 度8.4g/cm3であった。使用した素材は直径16-44μmのビーズからなるものであっ た。 アガロース混合物(4％) 蒸留水900mlを別のリアクターに満たし、アガロース36gを攪拌しながら添加し た。混合物を、アガロースが溶解するまで(約1時間)、95℃で加熱した。次いでA nval(商標登録)378gを、15分間攪拌した混合物に添加し、その後温度を70℃に下 げた。 乳化 トルエン1050mlを乳化リアクターに満たし、エチルセルロース49.5を、攪拌し ながら“ファイン・ジェット”で添加した。混合物を、エチルセルロースが完全 に溶解するまで(約2時間)、水浴で60℃に加熱した。乳化リアクターの攪拌速度 を130rpmに調節し、その後アガロースの溶液(70℃)を移した。乳化工程は、95％ (体積)のビーズが直径<200μm(標準ゲル)となったときに(直径80-160μmのビー ズの割合が高い)中止した。そして水浴の加熱を止め、水浴の温度を約7時間で60 から30℃に下げた。 後処理 ビーズを攪拌により洗浄し、その後99.5％エタノール3Lでデカントした(3x)。 ビーズの洗浄は、ヌッチェ・ロート上でエタノール4x2Lを自然流下させて続行し た。ビーズは最終的に、攪拌とデカンティングを行ないながら蒸留水に移した。 架橋 75％ゲルスラリー100mlおよび硫酸ナトリウム34gをリアクターに加え、2時間 攪拌し、その後、温度を50℃に上げた。次いで45％NaOH溶液1mlおよび水素化ホ ウ素ナトリウム0.1gを添加した。45％NaOH溶液7ml(10.5g)およびエピクロロヒド リン7.5mlを6から8時間にわたりポンプを用いて同時に添加した。反応は50℃で 全体を攪拌しながら一夜続けた(約16時間)。反応の終了後、ゲルを水7x150mlで スラリー化し(洗浄し)、その後ゲルを60％酢酸でpH5-6に酸性化し、湿式ふるい( wet-sieve)にかけた(80-160μm)。実施例11A 天然プロテインAと基礎マトリクスの直接カップリング 基礎マトリクス(3％アガロースより)30mlを蒸留水で洗浄し、攪拌しながら蒸 留水18mlに溶解したNaOH3.67gと混合し、温度を24℃に調節した。数分後、エピ クロロヒドリン7.2mlを激しく攪拌しながら混合物に添加した。2時間後、ゲルを ガラスフィルター上で蒸留水300mlで洗浄した。次いで洗浄したゲルを6-アミノ カプロン酸(6-ACS;1M 6-ACS、1M NaCl pH11.5溶液30ml)と混合し、混合物を17-2 4時間攪拌し、次いで最終的に0.5M NaCl200mlで洗浄した。次いでゲルを再び、 今度はアセトン2x30mlで洗浄し、その後、全体を攪拌しながら、ゲルをアセトン 15mlと混合し、NHS559mgおよびジシクロヘキシルカルボジイミド1007mgで活性化 した。31℃で4-17時間後、ゲルをアセトン2x30ml＋イソプロパノール450mlで洗 浄し、氷冷1mM HCl 210mlで冷却する。得られた活性化ゲルを、天然のプロテイ ンA(Pharmacia Biotech AB)(0.2M NaHCO3、1M NaCl pH8に溶解したプロテインA) を含む溶液30mlと混合し、室温で2時間攪拌し、次いでトリスバッファーpH8で洗 浄し、酢酸バッファーpH3で洗浄し、最後に蒸留水で洗浄した。実施例11B 天然プロテインAと基礎マトリクスの直接カップリング 4％アガロースから得られた基礎マトリクスを用いる以外、実施例11Aの通りに 行った。実施例11C エクステンダーによるプロテインAのカップリング アリル化 蒸留水400ml、NaOH 48gおよびNaBH4 0.15g(溶液A)。基礎マトリクス50ml(アガ ロース3％)を蒸留水200mlおよび溶液A380mlで洗浄した。基礎マトリクス50mlお よび溶液A20mlをリアクターに添加した。混合物を45℃に加熱した。AGE 60mlを 混合物に添加した。反応は18時間45℃で行った。次いで混合物を酢酸で中和し、 マトリクスを蒸留水、エタノールで洗浄し、そして蒸留水で洗浄した。 臭素化 酢酸ナトリウム2gをアリル化ゲル50mlおよび蒸留水200mlの溶液に添加した。 攪拌して15分後、Br2/H2O 20mlを溶液に添加し、15分間反応を行った。そしてギ 酸ナトリウム(sodium formiate)を添加し、過剰の臭素を失活させた。次いでゲ ルを蒸留水で洗浄した。 デキストランカップリング デキストラン溶液を、デキストラン(Mw 10,000(Phrmacia Biotech AB))15gを 蒸留水75mlに40℃で18時間攪拌しながら添加することにより、バッチリアクター で調製した(デキストラン溶液)。次いで臭素化ゲル50ml、NaOH 5gおよびNaBH40. 15gを、テキストラン溶液(40℃)を含むリアクターに添加し、反応は40℃で一夜( 約18時間)行なった。次いで混合物を酢酸(pH=6-7)で中和し、マトリクスを蒸留 水で洗浄した。 天然タンパク質Aのカップリング 実施例11Aと同様に行った。実施例11b デキストラン溶液の調製 デキストラン溶液を、デキストラン(Mw 10,000 Pharmacia Biotech AB)50gを 蒸留水125mlに20℃で18時間攪拌しながら添加することにより、バッチリアクタ ーで調製した。 基礎マトリクスのエポキシド活性化 NaOH 3.2gおよびNaBH4 0.9gを、攪拌しながら、基礎マトリクス250mlおよび蒸 留水150mlの溶液を含むリアクターに添加した。混合物を30℃に加熱した。ECH 6 0mlを溶液に添加した。反応は30℃で2時間行なった。次いで混合物を酢酸(pH=6- 7)で中和し、マトリクスを蒸留水で洗浄した。 デキストランカップリング エポキシド活性化ゲル100ml、NaOH 12gおよびNaBH4 0.4gを、デキストラン溶 液(30℃)を含むリアクターに添加した。反応は30℃で一夜(約18時間)行なった。 次いで混合物を酢酸(pH=6-7)で中和し、マトリクスを蒸留水で洗浄した。天然の タンパク質Aのカップリング 実施例11Aと同様に行った。 分析の方法 ゲルのエポキシの含量は、0.1M HCl、pH-stat終点pH7のRadiometer VIT 90 Ti tratorで測定した。 ゲルのアリル含量は、0.1M AgNO3のMettler DL40GP Memo Titratorで測定した 。 ゲルのデキストラン含量は、デキストランカップリングゲルの乾燥重量とエポ キシ活性化ゲルの乾燥重量の差を計算することにより測定した。乾燥重量は、10 5℃のオーブンで18時間乾燥した後、測定し、ゲルmlあたりのゲルmgで表した。 塩素イオン容量は、0.1M AgNO3のMettler DL40GP Memo Titratorで測定した。 H+容量は、0.1M HCl、pH-stat終点pH7のRadiometer VIT 90 Titratorで分析し た。 400cm/h、伸展床におけるBSA(ウシ血清アルブミン)の漏出容量QB(C/Co=0.1)器具 ： カラム：STREAMLINE 25（Pharmacia BiotechAB） バッファーA：50mM Tris/HCl，pH7.5 バッファーB：50mM Tris/HCl，2M NaCl，pH7.5 タンパク質：BSA(InterGen Company，USA) 流速：400cm/h方法 ： 漏出容量QBは、STREAMLINE 25(商標登録)カラム(高さ15cmの沈積カラムで満た した)で、400cm/hの直線状の流速で測定した。タンパク質はバッファーAに、約2 mg/mlで溶解し、濃度はA280の分光光度計を用い、測定した。 カラムは、最初は迂回させ、そしてUVモニターに流れ(280nm吸収では非吸収溶 液である)を向けて測定し(C0)、その後、試料と共にカラムに流し通過させる。 カラムを通る流れの吸収が吸収C0の10％であるとき、試験を中断、ゲルを洗浄し 、ゲルに結合しているBSAをバッファーBで溶出した。溶出液を回収し、そのBSA 含量を測定すると、ゲルmlあたりの吸収BSA量が得られた(C/C0=0.1の漏出容量(QB ))。 400cm/h、伸展床における卵白アルブミンの漏出容量QB(C/C0=0.1)器具 ： カラム：STREAMLINE 25(Pharmacia Biotech AB) バッファーA：50mM Tris/HCl，pH7.5 バッファーB：50mM Tris/HCl，2M NaCl，pH7.5 タンパク質：卵白アルブミン(Sigma A-5503) 流速：400cm/h方法 ： BSAでの方法と同様に行なった。 400cm/h、伸展床におけるリゾチームの漏出容量QB(C/C0=0.1)器具 ： カラム：STREAMLINE 25（Pharmacia Biotech AB） バッファーA：50mMグリシン，pH9.0 バッファーB：50mMグリシン，2M NaCl，pH7.5 タンパク質:リゾチーム(Sigma L-6876) 流速：400cm/h方法 ： BSAでの方法と同様に行なった。 400cm/h、伸展床におけるhIgGの漏出容量QB(C/C0=0.1)器具 ： カラム：STREAMLINE 25（Pharmacia Biotech AB） バッファーA：50mM酢酸ナトリウム，pH5.0 バッファーB：50mM酢酸ナトリウム，2M NaCl，pH7.5 タンパク質：hIgG(Pharmacia & Upjohn) 流速：400cm/h方法 ： BSAでの方法と同様に行なった。 実施例3-10の結果を伸展床の標準ゲルで比較し(STREAMLINE(商標登録)DEAEお よびSTREAMLINE SP，Pharmacia Biotech AB)、表1および2に示す。 表1．400cm/h、伸展床におけるBSAおよび卵白アルブミンの漏出容量QB(C/C0=0.1 ) 表2．400cm/h、伸展床におけるリゾチームおよびhIgGの漏出容量QB(C/C0=0.1) 1)漏出容量QB(C/C0=1.0)は、120mg lysozyme/ml of gelである。結論 表1および2から、本発明原理により伸展床クロマトグラフィーに使用する通常 のゲルよりも3倍高い漏出容量QBを有するマトリクスが得られ得ることが分る。 天然のタンパク質Aを有するマトリクスのための、最初の実験は、エクステン ダーの使用による漏出容量の(パック床)の増加に関し、価値がなく、重要ではな い効果を示した。これは、使用するエクステンダーがタンパク質A(Mw 10,000Da) のような親和性構造よりも遥かに小さかったという事実による。結果は示さなか った。
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年５月１２日（１９９９．５．１２） 【補正内容】 請求の範囲 １．構造がエクステンダーを介して基礎マトリクスと共有結合することを特徴と する、使用するビーズに基礎マトリクスを含み、物質に親和性のある構造を示す 、流動床または攪拌懸濁による液体試料から物質を吸着する方法。 ２．ビーズに充填粒子を含むこと特徴とする、請求項1記載の方法。 ３．床が伸展床であることを特徴とする、請求項1-2の何れか記載の方法。 ４．床が安定伸展床(stabilized expanded bed)であることを特徴とする、請求 項3記載の方法。 ５．床が乱流伸展床(turbulent expanded bed)であることを特徴とする、請求項 3記載の方法。 ６．吸着が攪拌懸濁中で起きることを特徴とする、請求項1-2の何れか記載方法 。 ７．エクステンダーがポリマーであり、各エクステンダーは吸着する物質に親和 性を有する2つまたはそれ以上の構造を有することを特徴とする、請求項1-6の何 れか記載の方法。 ８．ポリマーが非ポリペプチド構造であることを特徴とする、請求項1-7の何れ か記載の方法。 ９．もし存在するならば、エクステンダーにおける分子内または分子間架橋が、 それが基礎マトリクスに結合する以前の、エクステンダーの架橋に由来すること を特徴とする、請求項1-8の何れか記載の方法。 １０．ビーズが多孔性であることを特徴とする、請求項1-9の何れか記載の方法 。 １１．床が、床の断面全体に均一な流れによって安定化された流動床であること を特徴とする、請求項1-4および6-10の何れか記載の方法。 １２．親和性構造が、 ａ．陽性荷電基(1級、2級、3級または4級アミン基) ｂ．陰性荷電基(例えば、カルボキシル基、リン酸、硫酸等) ｃ．両向性基 ｄ．IgG-結合タンパク質(タンパク質A、G、Lなど)とIgG、レクチンと炭水化物、 抗原／ハプテンと抗体、(strep)アビジンとビオチンのような、特異的親和性を 有する基(例えば、生物親和性基) ｅ．相補性核酸／オリゴヌクレオチド ｆ．π-電子システムを有する基 ｇ．キレート基 ｈ．疎水性基 から選択されることを特徴とする、請求項1-11の何れか記載の方法。 １３．親和性構造が、陽イオンまたは陰イオン基から選択されることを特徴とす る、請求項1-12の何れか記載の方法。 １４．液体試料が発酵槽から得られることを特徴とする、請求項1-13の何れか記 載の方法。 １５．ビーズに、基礎マトリクスに組込まれた充填物、および共有結合する親和 性構造を有することを特徴とするエクステンダーを含む、ビーズ集団 １６．エクステンダーがポリマーであり、各エクステンダーが2つまたはそれ以 上の親和性構造を有することを特徴とする、請求項15記載のビーズ集団。 １７．エクステンダーが非ポリペプチド構造のポリマーであることを特徴とする 、請求項15-16の何れか記載のビーズ集団。 １８．もし存在するならば、エクステンダーにおける分子内または分子間架橋が 、それが基礎マトリクスに結合する以前の、エクステンダーの架橋に由来するこ とを特徴とする、請求項15-18の何れかに記載のビーズ集団。 １９．ビーズが多孔性であることを特徴とする、請求項15-18の何れか記載のビ ーズ集団。 ２０．親和性構造が、 ａ．陽性荷電基(1級、2級、3級または4級アミン基) ｂ．陰性荷電基(例えば、カルボキシル基、リン酸、硫酸等) ｃ．両向性基 ｄ．IgG-結合タンパク質(タンパク質A、G、Lなど)とIgG、レクチンと炭水化物、 抗原／ハプテンと抗体、(strep)アビジンとビオチンのような、特異的親和性を 有する基(例えば、生物親和性基) ｅ．相補性核酸／オリゴヌクレオチド ｆ．π-電子システムを有する基 ｇ．キレート基 ｈ．疎水性基 から選択されることを特徴とする、請求項15-19の何れか記載ビーズ集団。 ２１．親和性構造が、陽イオンまたは陰イオン基から選択されることを特徴とす る、請求項15-20の何れか記載のビーズ集団。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．構造がエクステンダーを介して基礎マトリクスと共有結合することを特徴と する、使用するビーズに基礎マトリクスを含み、物質に親和性のある構造を示す 、流動床または攪拌懸濁による液体試料から物質を吸着する方法。 ２．ビーズに充填粒子を含むこと特徴とする、請求項1記載の方法。 ３．床が伸展床であることを特徴とする、請求項1-2の何れか記載の方法。 ４．床が安定伸展床(stabilized expanded bed)であることを特徴とする、請求 項3記載の方法。 ５．床が乱流伸展床(turbulent expanded bed)であることを特徴とする、請求項 3記載の方法。 ６．吸着が攪拌懸濁中で起きることを特徴とする、請求項1-2の何れか記載方法 。 ７．エクステンダーがポリマーであり、各エクステンダーは吸着する物質に親和 性を有する2つまたはそれ以上の構造を有することを特徴とする、請求項1-6の何 れか記載の方法。 ８．ポリマーが非ポリペプチド構造であることを特徴とする、請求項1-7の何れ か記載の方法。 ９．もし存在するならば、エクステンダーにおける分子内または分子間架橋が、 それが基礎マトリクスに結合する以前の、エクステンダーの架橋に由来すること を特徴とする、請求項1-8の何れか記載の方法。 １０．ビーズが多孔性であることを特徴とする、請求項1-9の何れか記載の方法 。 １１．床が、床の断面全体に均一な流れによって安定化された流動床であること を特徴とする、請求項1-4および6-10の何れか記載の方法。 １２．親和性構造が、 ａ．陽性荷電基(1級、2級、3級または4級アミン基) ｂ．陰性荷電基(例えば、カルボキシル基、リン酸、硫酸等) ｃ．両向性基 ｄ．IgG-結合タンパク質(タンパク質A、G、Lなど)とIgG、レクチンと炭水化物、 抗原／ハプテンと抗体、(strep)アビジンとビオチンのような、特異的親和性を 有する基(例えば、生物親和性基) ｅ．相補性核酸／オリゴヌクレオチド ｆ．π-電子システムを有する基 ｇ．キレート基 ｈ．疎水性基 から選択されることを特徴とする、請求項1-11の何れか記載の方法。 １３．親和性構造が、陽イオンまたは陰イオン基から選択されることを特徴とす る、請求項1-12の何れか記載の方法。 １４．液体試料が発酵槽から得られることを特徴とする、請求項1-13の何れか記 載の方法。 １５．ビーズに、基礎マトリクスに組込まれた充填物およびエクステンダーを含 む、ビーズ集団 １６．エクステンダーが、共有結合する親和性構造を有することを特徴とする、 請求項15記載のビーズ集団。 １７．エクステンダーがポリマーであり、各エクステンダーが2つまたはそれ以 上の親和性構造を有することを特徴とする、請求項16記載のビーズ集団。 １８．エクステンダーが非ポリペプチド構造のポリマーであることを特徴とする 、請求項15-17の何れか記載のビーズ集団。 １９．もし存在するならば、エクステンダーにおける分子内または分子間架橋が 、それが基礎マトリクスに結合する以前の、エクステンダーの架橋に由来するこ とを特徴とする、請求項15-18の何れかに記載のビーズ集団。 ２０．ビーズが多孔性であることを特徴とする、請求項15-19の何れか記載のビ ーズ集団。 ２１．親和性構造が、 ａ．陽性荷電基(1級、2級、3級または4級アミン基) ｂ．陰性荷電基(例えば、カルボキシル基、リン酸、硫酸等) ｃ．両向性基 ｄ．IgG-結合タンパク質(タンパク質A、G、Lなど)とIgG、レクチンと炭水化物、 抗原／ハプテンと抗体、(strep)アビジンとビオチンのような、特異的親和性を 有する基(例えば、生物親和性基) ｅ．相補性核酸／オリゴヌクレオチド ｆ．π-電子システムを有する基 ｇ．キレート基 ｈ．疎水性基 から選択されることを特徴とする、請求項15-20の何れか記載ビーズ集団。 ２２．親和性構造が、陽イオンまたは陰イオン基から選択されることを特徴とす る、請求項15-21の何れか記載のビーズ集団。
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