PT95468B

PT95468B - Processo para a preparacao de um meio contendo ligando para a separacao cromatografica apropriado para isolar moleculas sinteticas ou naturais de uma mistura fluida

Info

Publication number: PT95468B
Application number: PT95468A
Authority: PT
Inventors: Ferdinand Carl Haase
Original assignee: Rohm & Haas
Priority date: 1989-09-29
Filing date: 1990-09-28
Publication date: 1997-07-31
Also published as: DK0423938T3; TR26082A; NO180558C; NO904160L; NZ235480A; JPH03197500A; CA2025487A1; EP0423938A1; PT95468A; AU629692B2; EG19353A; IL95772A0; AU6314390A; ES2062394T3; NO180558B; KR910006320A; IL95772A; ZA907678B; PL287102A1; BR9004848A

Description

Processo para a preparação de um meio contendo ligando para a separação cromatografica apropriado para isolar moléculas sintéticas ou naturais de uma mistura fluida

A presente invenção diz respeito a meios aperfeiçoados contendo ligandos, ao seu processo de preparação e ã sua utilização para a produção de péptidos, proteínas e semelhantes, por separação cromatográfica. De acordo com uma forma de realização preferida, a invenção refere-se a meios que têm permanentemente ligados por intermédio de uma ligação covalente a um substrato sólido inerte, um ligando de polipéptido de avidina sob a forma renaturada dissociada que se liga reversivelmente a certas moléculas (proteínas, péptidos, nucleótidos, oligonucleotidos e semelhantes) e outras moléculas que se ligam â avidina por meio de biotinilação ou por meios das suas estruturas micromoleculares secundãrias/terciãrias.

A produção de certos péptidos e proteínas para utilização em saúde humana, em saúde animal, mercados industrial, alimentar e agrícola, tem sido dificultada pelos elevados custos e escassez, particularmente na ãrea dos cuidados da saúde. Os péptidos e as proteínas para utilização na ãrea da saúde humana são sintetizados naturalmente pelos organismos vivos para satisfazer as suas próprias necessidades e, até recentemente, as únicas fontes destas biomolêculas valiosas eram os animais, plantas, cadáveres, soro e urina. Por exemplo, a insulina porcina ou bovina foi extraída do pâncreas de porcos ou de animais bovinos para utilização por diabéticos e a HGH (hormona de crescimento humana) foi obtida em pequenas quantidades a partir de cadáveres para tratar o nanismo infantil. Estas biomolêculas tem sido usualmente obtidas em muito pequenas quantidades porque só quantidades limitadas são produzidas biologicamente ou são rapidamente degradadas por enzimas presentes nos seus ambientes. Desenvolveram-se duas novas tecnologias que tornam possível a produção de quase um qualquer péptido ou proteína em quantidades relativamente grandes : a síntese química e a síntese biológica.

A via química ê conseguida por síntese em fase sólida (técnica de Merrifield) e síntese de péptidos em fase de solução; esta via ê usualmente limitada a péptidos com menos de vinte resíduos de aminoácidos. A síntese biológica utiliza tecnologias de engenharia genética e de ADN recombinante e a produção de células em culturas de tecidos ou por fermentação microbiana. A via biológica tem sido a única via usada na prática para a produção de pêptidos de maiores pesos moleculares em quantidades relativamente grandes.

Como o interesse destas biomolêculas se baseia no seu comportamento, a purificação das biomolêculas pretendidas torna-se um factor muito importante, especialmente no caso das indústrias de produtos destinados â saúde e de aditivos alimentares, em que o custo da purificação sozinha, correntemente compreendendo múltiplas fases de processo, pode representar mais de metade do custo total da produção das biomolêculas pretendidas.

Na técnica anterior, conhecem-se muitas técnicas para

ligar covalentemente materiais tais como proteínas a substratos sólidos como técnica para separar as espécies ligadas. Por exemplo, a patente de invenção norte-americana U.S.A.-4 732 811 (concedida em 22 de Março de 1988) descreve a utilização de polímeros contendo grupos de poli-aldeído como sendo capazes de ligar compostos que contêm grupos de amina.primária (por exemplo, proteínas, anticorpos e fãrmacos).

Independentemente da via sintética utilizada, a purificação é necessária e a cromatografia em fase líquida tem sido a ferramenta universal utilizada para estas bio-separações. Entre os processos cromatogrãficos disponíveis (permuta de iões, exclusão de tamanhos, fase inversa, interacção hidrofõbica e afinidade), a cromatografia de afinidade tem o potencial de permitir reduzir significativamente o número de operações de purificação necessárias. Sabe-se que colunas de afinidade baseadas em avidina são úteis no isolamento de vãrias biomolêculas Z?D. A. Fuccillo, Biotechniques, ] (6), 494-501 (1985)_7\ Em particular, têm-se utilizado interacções avidina-biotina para o isolamento de proteínas por vias sintéticas biológicas. A avidina ê uma proteína de um elevado peso molecular que se encontra na clara do ovo; a biotina ê uma molécula de baixo peso molecular com um sistema de anel de imidazol-tiofeno fundido que actua como etiqueta para o reconhecimento pela avidina, tendo como resultado a obtenção de um complexo avidina-biotina extremamente estável. Como a via sintética escolhida necessita geralmente do isolamento da bicmolécula pretendida a partir meio de cultura sob concentrações muito pequenas, a afinidade extremamente grande da avidina pela biotina tem sido explorada na concentração cromatogrãfica e no isolamento de moléculas etiquetadas com biotina (biotiniladas) pela utilização de colunas de

afinidade contendo avidina. A especificidade e a afinidade da avidina (forma tetrâmica natural de quatro sub-unidades idênticas) pela biotina ê extremamente elevada e as colunas de cromatografia baseadas neste principio têm sido utilizadas para finalidades analíticas. No entanto, as proteínas e os péptidos que contêm a etiqueta da biotina não podem ser recuperados a partir da coluna com o tetrâmero da avidina sem utilização de condições severas que invariavelmente destroem a biomolêcula que estã a ser isolada. Tentativas para ultrapassar a forte ligação da biotina pela avidina sem perda da elevada especificidade para as moléculas de ligação biotiniladas concentraram-se na utilização de suportes sólidos para estabilizar a forma dissociada de avidina; no entanto, estas colunas não deram resultados satisfatórios para utilização preparativa por causa da presença de diversas classes de sítios de ligação com menores capacidades do que as capacidades da ligação desejáveis, assim como também devido a outras deficiências associadas com as matrizes de suporte sólidas particulares utilizadas /κ. P. Henrikson e col., Analytlcal Blochemlstry, 94, 366-370 (1979)J.

Têm-se utilizado vãrias vias para ligar o agrupamento de avidina a um suporte sólido. Mais vulgarmente, utiliza-se agarose activada com uma forma apropriada para acoplamento covalente dos grupos de amina primaria de avidina como suporte J/a. D. Landman e col., J. Chem. Educ., 53 (9), 591 (1976) _7\ No entanto, estas ligações covalentes não se mostraram satisfatórias devida â instabilidade química e ã lixiviação resultante da avidina a partir do suporte, diminuindo assim a duração operacional da coluna e contaminando também o produto purificado pretendido. Outros inconvenientes importantes destas colunas particulares incluem a absorção não específica de proteínas, a compressibilidade da matriz da co5 /

luna no caso de elevados caudais de liquido tendo como resultado a existência de contrapressão e a diminuição do caudal e a sensibilidade da agarose em relação è degradação microbiana. Além disso, os matérias de agarose não são susceptíveis de limpeza e esterilização fáceis. Utilizaram-se outros suportes com base em poli estireno ou sílica (pedido de patente de invenção japonesa publicado Kokai JP 64-003129 A), mas estes suportes têm o inconveniente de possuir em menores capacidades de ligação do que a agarose e ainda incompatibilidade com certos iões biologicamente importantes

Por estas razões, não hã a necessidade de se dispor de um meio de purificação que permita a separação eficiente e o subsequente isolamento de moléculas biologicamente importantes sob uma forma satisfatória para as necessidades críticas de campos como o dós cuidados de saúde e o dos aditivos alimentares.

A requerente descobriu agora um novo meio de cromatografia por afinidade, um processo aperfeiçoado para a preparação do meio cromatográfico e novas utilizações dos novos meios que permitem aperfeiçoamentos inesperados e surpreendentes no isolamento e na pureza de blomolêculas naturais e sintéticas.

De acordo com a presente invenção, proporciona-se um meio que contêm um ligando para adsorção cromatográfica, o qual compreende um substrato sólido, quimicamente inerte, insolúvel em água e em dissolventes, que tem quimicamente ligado, por intermédio de um grupo de ligação quimicamente estável, não hidrolisãvel, um ligando de polipéptido de avidina sob a forma renaturada dissociada, em que pelo menos uma parte ou toda a avidina, por exemplo, mais do que 50% em peso da avidina, se encontra sob a forma monomérica.

De acordo com a presente invenção, proporciona-se ainda também um processo para a preparação de um meio de afinidade de avidina aperfeiçoado, o qual compreende:

a) a reacção, realizada a um pH próximo da neutralidade, por exemplo a um pH compreendido entre 6,5 e 8,5, de uma quantidade efectiva de um tetrâmero de avidina com grupos funcionais de um substrato quimicamente inerte, sólido, insolúvel em ãgua e em dissolventes, para formar grupos de ligação quimicamente estáveis, não hidrolisãveis, entre o substrato e a avidina, atê se formarem uma a três ligações covalentes, com os grupos funcionais poliméricos, por cada molécula do tetrâmero de avidina;

b) a separação do substrato de contêm avidina e a redução da ligação imino formada com obtenção da correspondente ligação amina;

c) a desnaturação do tetrâmero de avidina para formar avidina monomêrica ligada ao substrato quimicamente estável; e

d) a separação da avidina desnaturada de sub-unidades dissociadas de avidina e a renaturação do substrato contendo avidina por remoção do agente desnaturante para formar o meio de afinidade de avidina, sendo o pH do meio de afinidade de avidina, por exemplo, ajustado atê próximo da neutralidade .

De acordo com a presente invenção, proporciona-se também uma coluna cromatográfica de afinidade, que compreende um recipiente tubular com meios de entrada e de salda nas extremidades opostas do tubo e que contém, alojado dentro do tubo, um meio que contêm um ligando de acordo com a presente invenção.

As expressões adsorção e adsorção cromatográfica uti lizam-se em sentido lato, mas talvez não inteiramente puramente /'

-Ύ' ' Ό técnico, para abranger qualquer forma de ligação estre espécies químicas diferentes de ligação covalente. Assim, a ligação por afinidade ou pelas forças de Van der Waals, embora tecnicamente destinguíveis, pretende-se que sejam ambas incluídas dentro da significação lata do termo adsorção, tal como ê utilizado na presente memória descritiva.

Tal como são utilizadas na presente memória descritiva as expressões quimicamente inerte e insolúvel em ãgua e em dissolvente, quando se referem ao substrato presente no meio de acor do com a presente invenção, significam que o substrato ê quimicamente inerte e insolúvel em ãgua e em dissolvente nas condições de utilização previstas e descritas na presente memória descritiva. De maneira semelhante, tal como ê utilizada na presente memória descritiva, a expressão quimicamente estãvel, quando se refere ao grupo de ligação presente no meio de acordo com a presente invenção, significa que o grupo de ligação é quimicamente estãvel sob as condições de utilização pretendidas referidas na presente memória descritiva.

A presente invenção permite o isolamento de moléculas sintéticas ou naturais e/ou os seus derivados biotinilados por adsorção das referidas moléculas nos novos meios de afinidade que contêm avidina fixada num suporte sólido inerte e a utilização de composições de meios de afinidade que se baseiam em ligações não hidro lisjáveis e quimicamente estáveis de avidina a um substrato polimérico.

Tal como ê utilizado na presente memória descritiva, o termo coluna ê usado no sentido lato para definir um recipiente que contêm meios de adsorção. Tipicamente, nas separações cromatogrãficas, as colunas sao feitas de vidro, sílica, aço inoxidável /- 8 F

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ou semelhantes e têm a forma de tubos ocos (ou de fibras capilares) , muitas vezes enrolados em espiral, ou de tubos cilíndricos compridos que têm, nas extremidades opostas, meios de entrada e de saída. Na crornatografia preparativa ou nas separações industriais, a coluna pode ser um vaso vertical, geralmente cilíndrico, para alojar um leito estacionário de adsorvente. A presente invenção ê apropriada para utilização com qualquer configuração particular da coluna.

As colunas de tetrâmero de avidina da técnica anterior que contêm enzimas/proteínas ligadas têm durações limitadas devido à perda de actividade (resina conspurcada), depois do que toda a resina tem de ser rejeitada devido â ligação irreversível da enzima em questão. No entanto, quando se utilizam colunas que contêm o meio de afinidade de monõmero de avidina de acordo com a presente invenção para imobilizar enzimas, a coluna pode ser regenerada facilmente depois de qualquer perda de actividade da enzima por causa da reversibilidade do complexo monõmero de avidina/enzima.

De acordo com uma forma de realização da presente invenção, proporciona-se um meio acentuadamente útil para isolar moléculas biotiniladas, que compreende um substrato polimêrico reticulado inerte, que tem covalentemente ligado a ele, por intermédio de uma ligação não hidrolisãvel de fórmula -NE^CE^-/ um ligando de polipéptido de avidina sob a forma monomêrica renaturada dissociada. De acordo com uma outra forma de realização, a presente invenção proporciona um processo aperfeiçoado para a preparação de meios de afinidade de avidina, que compreende fazer-se reagir um excesso de avidina com ·υηι substrato: polimêrico contendo grupos funcionais reactivos de . formilo, reduzindo quimicamente as ligações imino de maneira a obte

rem-se ligaçõs amino estáveis e quimicamente se desnaturar e renaturar a avidina ligada de maneira a obter-se a sua forma monomêrica. Ainda uma outra forma de realização da presente invenção refere-se a um processo aperfeiçoado para separar moléculas sintéticas ou naturais de uma mistura de fluidos, tal como um caldo de fermentação ou uma mistura reaccional, que contêm vários subprodutos e impurezas, assim como moléculas, por meio de adsorção e eluição usando os novos meios de acordo com a presente invenção.

A preparação dos meios de afinidade contendo monómero de avidina pelo processo de acordo com a presente invenção baseia-se na ligação da avidina a um substrato compatível, quimicamente inerte, por intermédio de uma ligação quimicamente estável que não se degrada nem dissocia durante os tratamentos químicos e subsequentes necessários para libertar as biomolêculas ligadas. Os substratos sólidos inertes apropriados para os meios aperfeiçoados de acordo com a presente invenção incluem uma ampla gama de sólidos polimêricos (por exemplo, poiimericos orgânicos reticulados) e inorgânicos. ^Preferivelmente, os substratos devem ser muito inertes, porosos e ter a forma de partículas (preferivelmente esféricas) . Um tipo bem conhecido e muito preferido de substrato é constituído por um adsorvente polimérico orgânico reticulado poroso e sob a forma de partículas ou por uma resina de permuta de iões tendo uma estrutura macrorethcular (precipitado). Este tipo de partículas é vulgarmente utilizadonas separações por cromatografia, assim como nas técnicas de purificação industriais. São exemplos ilustrativos destes materiais as resinas de Toyopearl (Toyopearl e uma marca registada de Tosoh, Japão) e a série de polímeros Amberlite XAD (Amberlite e XAD são marcas registadas de Rohm and Haas Co., Estados Unidos da América). Os polímeros e copolímeΖ 10 ros à base de monómeros acrílicos e de estireno e de porosidade muito elevada e grande ãrea superficial constituem a classe mais preferida de substratos (veja-se, por exemplo, a memória descritiva da patente de invenção norte-americana U.S. A-4 382 124).

Dos substratos menos preferidos, podem mencionar-se esferas de vidro, sílica, polímeros de gel e semelhantes.

Os grupos de ligação apropriados utilizados para ligar covalentemente a avidina aos substratos sólidos incluem os que contêm um grupo carbono-azoto ou um grupo enxofre-azoto, por exemplo os grupos -CH₂NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)NH-, -C(O)NHNHC(O)NHe -SO2NH-, em que o agrupamento -NH- do lado direito dos grupos mencionados antes é fornecido pela avidina. Um tipo de ligação muito preferido compreende o grupo imino reduzido de fórmula -NHCH₂-. Os grupos de ligação podem também incluir grupos alquileno cicloalquilo, arilo, aralquileno ou os seus derivados substituídos por carboxilo, hidroxi ou alcoxi, como estruturas distanciadoras entre a cadeia do substrato polimêrico e o sítio de ligaçao real da molécula de avidina. As estruturas representativas incluem os grupos de fórmulas gerais -NH(CH₂)_n~ e -NH(CH₂)_n ^cgH^-, em que o símbolo n representa um número inteiro de 1 a 4, preferivelmente 1 ou 2. A ligação pode envolver qualquer numero dos grupos de amina presentes no polipéptido de avidina, por exemplo, o grupo E-amino de lisina, o grupo imidazol de histidina ou qualquer dos grupo de alfa-amina dos aminoácidos da extremidade N. As equações químcas (1) e (2) seguintes são ilustrativas das reacções químicas que se verificam para formar a ligação entre a avidina e o substrato polimêrico (que, neste caso, contêm grupos formilo):

/^Η /^ΗPolímero -C=0 + Avidina -Ν \

Η

... Η /

—> Polímero -C=N—Avidina + Η₂0 (1)

Η /

Polímero -C=N—Avidina + Agente

H \

Rédutor—^Polímero -C-N—Avidina (2) / \

Η H

Os grupos amino da avidina reagem quimicamente com os grupos funcionais apropriados posicionados no substrato polimêrico citado antes, por exemplo, grupos formilo, que produzem a ligação imino intermediária, -CH=N-, que é subsequentemente tratada com um agente redutor apropriado para originar a ligaçao amina quimicamente estável de fórmula -CE^NH-. Os agentes redutores apropriados incluem tipicamente complexos de metil-hidratos, NaCNBHg, NaBH₄, moléculas de hidrogénio e BHg. Preferivelmente, utilizam-se sais de ciano-boro-hidrogeneto para realizar a redução com obtenção da ligação de amina.

Uma característica importante do meio de afinidade de avidina é a natureza das unidades de avidina ligadas ao suporte inerte. A avidina ocorre na Ntureza sob forma tetramêrica com quatro sub-unidades idênticas, consistindo cada uma em cento e vinte e oito resíduos de aminoâcidos, seis resíduos de manose e três resíduos de glucosamina, para um peso molecular combinado de aproximadamente 68.000. A avidina tetramêrica, mesmo quando ligada a um substrato polimêrico, tal como agarose (um polissacárido), forma complexos extremamente estáveis com moléculas biotiniladas £ constante de dissociação K(d) igual a 10 £J, tornando as enzimas, péptidos e produtos semelhantes biotinilados ligados quase impossíveis de recuperar com elevados rendimentos e graus de pureza devido às reacções quimicamente agressivas que têm de ser utilizadas para separar as moléculas biotiniladas ligadas dos seus com12 /

s *

plexos com os meios de avidina tetramérica. Por consequência, constitui uma característica da presente invenção o facto de uma quantidade predominante: / da„ avidina ligada se encontrar presente sob a sua forma monomêrica, em que a constante de dissociação do complexo de avidina-biotina é consideravelmente maior do que 10 preferivelmente maior do que 10 e, mais preferivel-9 mente ainda, nao menor do que 10 e, mais preferivelmente compre-9 -7 ~ ~ endida entre 10 e 10 . Supoe-se que a combinação unica da ligação quimicamente estável da avidina com o substrato polimêrico, a estrutura química do substrato (interacções hidrofóbicas, ligações em ponte de hidrogénio e semelhantes) e a estrutura física do substrato (porosidade, nível de reticulação e semelhante) são responsáveis pelo estabelecimento dos constrangimentos espaciais a nível molecular que mantêm a avidina ligada na sua forma monomêrica em que a sua grande especificidade para o grupo da biotina se mantêm, enquanto as caracteristicas de facilidade de dissociação do complexo monomérico avidina-biotina tornam o isolamento e a recuperação das moléculas biotiniladas realmente reversível. O processo para a preparação dos novos meios de afinidade contendo avidina monomêrica de acordo com a presente invenção baseia-se na introdução da ligação amina quimicamente estável entre o substrato e a avidina, seguida pelos conhecidos tratamentos de desnaturação e renaturação que originam o meio de afinidade de avidina monomêrica ligada final. A primeira fase do processo inclui a reac ção da avidina (normalmente um excesso) com os grupos funcionais do substrato polimêrico. Os parâmetros que controlam aiextensão com que a avidina.se liga ao substrato nesta fase incluem o tempo, o pH, a temperatura, a concentração dos reagentes (avidina, grupos funcionais do substrato, agente redutor) © a composição do subs13

Λ trato. As temperaturas de realização da reacção são limitadas devido ã sensibilidade .da maior parte das proteínas a temperaturas moderadas; no entanto, a avidina é extremamente insensível â temperatura e pode utilizar-se tipicamente uma temperatura compreendida dentro do intervalo de 5 a 35°C. Como a maior parte das reacções progridem mais lentamente a temperaturas reduzidas, utiliza-se preferivelmente uma temperatura compreendida entre 20 e 25°c para aproveitar a vantagem das velocidades de reacção maiores permitidas pela boa estabilidade da avidina à temperatura. Tempos de reacção menores do que dez horas têm como resultado menores níveis de fixação da avidina, enquanto tempos superiores a quinze horas não aumentam apreciavelmente a fixação da avidina. Podem utilizar-se tempos de reacção de vinte e quatro horas para garantir a absorção máxima da avidina sem se verificarem reacções secundárias prejudiciais.

Pode utilizar-se um intervalo de pH compreendido entre 5 e 10 para realizar a reacção de fixação da avidina. O intervalo de 6,5 a 8 ê o mais apropriado para equilibrar a tendência dos grupos funcionais carregados presentes na proteína para formarem ligações intramoleculares e a necessidade de maximizar a concentra ção de grupos amina não protonizados livres para reagirem com os grupos funcionais do substrato, por exemplo, grupos formilo. Ê preferível um tampão apropriado que mantenha o pH dentro deste intervalo, sendo mais preferível o pH compreendido entre 6,5 e 7,5.

A concentração de avidina (mg/ml de resina) empregada para carregar a proteína no substrato contendo grupos funcionais, por exemplo, grupos funcionais formilo, pode estar compreendida entre 0,5 e 10 mg/ml. Preferem-se concentrações de 2 a 5 mg/ml porque a proporção entre avidina tetramêrica e ligações de amina .* se mantêm de tal maneira que se favoreça a subsequente conversão para avidina monomérica ligada. A concentração de grupos funcionais, por exemplo, grupos formilo, no polímero utilizado como substrato pode variar dentro de uma larga gama : 10 a 100 micromoles de grupos funcionais (por exemplo, -CHO)/ml de resina; preferem-se concentrações de 35 a 70 micromoles/ml, visto que se estabelece um bom equilíbrio relativamente ao número de ligações amina criadas entre o substrato polimérico e a avidina ligada mantendo os constrangimentos espaciais dentro da matriz do polímero de avidina que permitem a transformação fácil da forma monomérica da avidina ligada. A concentração de agente redutor pode variar desde uma concentração equimolar até um excesso molar dêcuplo em relação à concentração do grupo funcional, por exemplo, grupo formilo. Proporções molares (agente redutor/grupo funcional; grupo formilo, por exemplo) superiores a 5 têm como resultado o facto de menos avidina ligada ser transformada na sua forma monomérica; proporções compreendidas entre 1 e 3, que correspondem a cerca de 3 a 10 miligramas de agente redutor/ml (quando se utiliza ciano-boro-hidrogeneto de sódio em relação ao grupo funcional, por exemplo, grupo formilo, concentrações de 55 micromoles/ml, por exemplo) representam um intervalo preferido em relação â conversão da avidina ligada na sua forma monomérica.

A transformação da avidina ligada da sua forma tetramêrica em forma monomérica realiza-se por tratamentos convencionais de desnaturação/renaturação, usando uma larga variedade de reagentes, tais como DMSO (sulfóxido de dimetilo) aquoso, ureia, cloreto de lítio, cloridrato de guanidina. Preferivelmente, pode utilizar-se uma solução de cloridrato de guanidina contendo cerca de 10% em volume/volume de ãcido acético, pH 2, para transformar a avidina

ligada na sua forma monomérica. Desnaturação refere-se à dissocia ção da avidina com obtenção da sua forma monomérica e renaturação refere-se â eliminação do agente desnaturante, estabilização do pH e conservação do ambiente que origina a manutenção da forma monomérica.

isolamento e a purificação de moléculas naturais e sinté ticas utilizando os meios de afinidade de avidina podem realizar-se fazendo contactar uma mistura aquosa ou orgânica contendo as moléculas que se pretendem separar juntamente com outros constituintes indesejáveis com partículas que contêm a composição de acordo com a presente invenção, isto é, avidina monomérica ligada. Podem isolar-se e purificar-se proteínas, péptidos, enzimas, nucleõtidos, oligonucleotidos e as suas correspondentes versões recombinantes ou biotiniladas ou recombinantes biotiniladas e quantificadas para fins analíticos utilizando cromatografia de afinidade com avidina. Além disso, os novos meios de afinidade podem utilizar-se para a lo calização e a separação de antigenes; desenvolvimento de técnicas de ensaio de imunidade; produção, purificação e/ou recuperação de ADN ou de ARN ou de moléculas para ensaio purificadas para estudos de hibridização; purificação ou sequenciamento de informação genética de uma larga variedade de organismos; e outras aplicações que beneficiam da utilização de cromatografia de afinidade com a avidina.

Por consequência, a presente invenção proporciona ainda um processo para isolar moléculas sintéticas ou naturais de uma mistura de fluidos que contém as mesmas em que as moléculas têm afinidade pela avidina ou podem ser biotiniladas para terem afinidade pela avidina ou as suas versões recombinantes que têm afinidade pela avidina ou as versões recombinantes biotiniladas, que compreende fazer passar a mistura de fluidos de maneira a estabelecer contacto íntimo com o meio que contém ligando de acordo

com a presente invenção e eluindo subsequentemente as moléculas sintéticas ou naturais adsorvidas do meio que contêm o ligando.

Os meios de afinidade de avidina podem utilizar-se sob várias formas para realizar as separações referidas antes. Mais vulgarmente, utilizam-se meios sôb a forma de partículas esféricas cujo tamanho varia entre 5 e cerca de 1.000 micrometros. Além disso, o meio pode ser utilizado ou num funcionamento em coluna ou num funcionamento em cargas descontinuas. Por exemplo, no modo de funcionamento em cargas descontínuas, pode tratar-se o caldo de fermentação de proteínas recombinantes com uma quantidade de meio com afinidade por avidina para separar as proteínas segregadas que tenham interesse; o caldo de fermentação tratado pode ser recombinado com outras correntes a serem tratadas (recicladas) para remover o mais possível as moléculas pretendidas. O funcionamento em cargas descontínuas ê particularmente útil para o isolamento à escala preparativa de quantidades relativamente grandes de biomolêculas. Por outro lado, o modo de funcionamento em coluna ê preferivelmente usado para finalidades analíticas e de avaliação preliminar, assim como para as necessidades de pequena escala preparativa .

Uma vez que se tenha isolado a molécula pretendida, isto ê, concentrado no meio de afinidade de avidina, tem de retirar-se do meio e separar-se. Esta operação pode realizar-se por qualquer número de processos convencionais, que são bem conhecidos dos especialistas familiarizados em bio-separações. Entre os processos utilizados para eluir as moléculas pretendidas do meio de afinidade citam-se o tratamento com soluções de ureia, glicina ou ãcido acético; teor variável de sal; tratamento com biotina; variação do pH; e semelhantes.

/¹⁷ f

>As moléculas pretendidas que podem ser isoladas e purificadas por utilização do meios de afinidade de avidina possuem uma de diversas caracteristicas que permitem realizar a separação Uma característica ê a presença do grupo de biotina na molécula a isolar. A D(+)biotina (estrutura I), também conhecida por vitamina H ou coenzima R, tem um peso molecular igual a 244 e reage quimicamente (por meio de reacçoes conhecidas), através do seu grupo carboxilo, com os grupos amina de enzimas, péptidos, protei nas e semelhantes, para se ligar â molécula pretendida através da ligação de amida resultante (Equação II). Outras formas de bio tina, por exemplo, imino-biotina ou ãcido lipóico, podem também auxiliar a separação de biomoléculas.

R

II

C /1

HN NH (Ϊ)

HC—CH

H„C—C--(CH„). CO„H ²\/ \ ⁴²S H

D(+)Biotina, em que o símbolo R representa um ãtomo de oxigénio. Imino-biotina, em que o símbolo R representa NH-HBr:

H

C /\

HN NH lf

C

HN NH (II)

HC—CH + h₂nr— —

H„C C—(CH„),CO„H ² \/\ ^{24 2}S H ^H2^C c— (ch₂) ₄conhr—

A molécula resultante da Equação II estã agora biotini18

lada, isto ê, contém o grupo de biotina. 0 grupo de biotina actua como identificador quando esta molécula ê seguidamente exposta ao meio de afinidade contendo monómero de avidina; a forte complexação da avidina com a biotina provoca que a molécula biotinilada seja adsorvida a partir do meio e assim separada de todas as outras moléculas não biotiniladas presentes na mistura particular Os métodos convencionais (discutidos antes) são então utilizados para remover a molécula biotinilada.

Com o fim de esclarecer mais completamente a natureza da presente invenção e a maneira de a realizar na pratica, descre vem-se os Exemplos seguintes. Estes Exemplos representam apenas algumas das muitas utilizações e composições de acordo com a presente invenção; pretende-se que esses exemplos sejam ilustrativos mas não limitativos. Varias modificações, alternativas e aperfeiçoamentos são evidentes para os especialistas na matéria, sem se verificar o afastamento do espírito e do âmbito da presente inven ção.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Procedimento Geral para a Preparação de Colunas de Afinidade Contendo Avidina

Num filtro de vidro sinterizado, colocou-se resina acrílica (granulometria ; 44 a 88 micrómetros) contendo 55 micromoles de grupos formilo (-CHO)/ml de resina £ Toyopearl®650M (TOSOH) AF-formilo_7 e lavou-se com aproximadamente 10 volumes de solução ζ -¹⁹ ί ’ tampão de fosfato de potássio 100 mM (pH = 7,5). A resina húmida foi então transferida para um balão de polipropileno. Pesou-se avidina purificada (Sigma Chemical Co.) e dissolveu-se em solução de tampão de fosfato 100 mM (pH - 7,5). Mediu-se a concentração final de avidina obtendo-se os valores da absorvância a 282 nm ΖE (1%) = 15,5 em que E ê o coeficiente de extinção e representa a intensidade de absorçãoJ. Adicionou-se avidina (4,0 mg/ml de resina) à resina previamente lavada no balão de polipropileno, agitou-se suavemente a mistura durante dez a quinze minutos e adicionou-se em seguida ciano-boro-hidreto de sódio (7,5 mg/ml de resina) Rolhou-se o balão e colocou-se num agitador horizontal (pequena velocidade) mantido a uma temperatura compreendida entre 23 e 25°C durante vinte e quatro horas. Transferiu-se então a resina modificada para uma coluna e depois lavou-se com tampão de fosfato de potássio 100 mM a pH = 7,5; o eluido foi recuperado e ensaiado relativamente à avidina não ligada (método de absorvância); calculou-se então a quantidade total de avidina ligada à resina por diferença.

A resina carregada com avidina foi então lavada com solução de cloridrato de guanidina 4 M contendo 10% de ãcido acético (volume/volume), pH 2, para dissociar a avidina tetramêrica com obtenção da sua forma monomêrica. Recolheram-se os eluidos e determinou-se a quantidadede'aviâina.retirâdá_/da resina por leituras de absor vância. A resina de afinidade contendo monómeros de avidina foi então empacotada em suspensão em colunas de HPLC (Upchurch Scientific, Inc.) para uso subsequente na purificação de proteínas.

Exemplo 2

Avaliaçao do Rendimento das Colunas de

Afinidade com Monómero de Avidina

Neste exemplo, utiliza-se uma coluna contendo resina de afinidade com avidina monomêrica produzida no Exemplo 1.

Calcula-se a capacidade total da ligação da biotina fazendo a estimativa da quantidade de monómero de avidina imobilizado por mililitro de resina. As afinidades de ligação da biotina e as capacidades foram determinadas usando D-biotina( C). Utilizaram-se extractos brutos de culturas durante vinte e quatro horas de E. coli contendo o plasmídeo ptac 1,3 t, para determinar a capacidade de ligação relativamente a péptidos biotinilados Z*V. L. Murtif e col., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 82, 5617 - 5621 (1985) J e para avaliar a coluna relativamente â purificação de proteínas recombinantes.

As características da resina ensaida são as seguintes :

Capacidade do monómero de avidina (calculado)

Capacidade total de ligação de 14 biotina C

Capacidade de ligação reversível ^^C

Proteína biotinilada reversível (1,3S ) cap e= : 74,9 nmoles/ml, : 58,7 nmoles/ml, : 51,2 nmoles/ml, : 6>8,4 nmoles/ml.

Aproximadamente 78% em peso da avidina imobilizada na /

-'Χ ,r ·’ ι» resina liga biotina e 87% em peso desta ê ligada reversivelmente;

com o péptido 1.3S_o, 91% em peso da avidina demonstrou a capacidade de ligação reversível, indicando a quase completa transformação da avidina na forma monomêrica (ligação reduzida/reversível) .

Exemplos 3 a 6

Diversas Condições Utilizadas para Preparar

Colunas de Afinidade Contendo Avidina

Procedendo de maneira semelhante à que se descreveu no Exemplo 1, preparam-se diferentes colunas de afinidade contendo avidina sob uma variedade de condições e ensaiaram-se relativamente à sua eficácia na ligação de proteínas (procedendo de acordo com o Exemplo 2) . As concentrações estão expressas em relação a ml de resina.

Exemplo 3

Procedendo de acordo com uma maneira de proceder semelhan te â que se descreveu no Exemplo 1, utilizou-se tampão de acetato (pH 5,5), adiciono.u-se avidina na proporção de 2,3 mg/ml e adicionou-se ciano-boro-hidreto de sódio na concentração de 7,5 mg/ml.

As caracteristicas da resina obtida foram as seguintes:

Capacidade do monõmero de avidina (calculado) : 57 nmoles/ml,

Capacidade de ligação da proteína 1.3S^ : 21,5 nmoles/ml.

Exemplo 4

Procedendo de maneira semelhante â que se descreveu no Exemplo 1, utilizou-se tapão de fosfato (pH = 7,5), adicionou-se avidina na concentração de 4,0 mg/ml e adicionou-se ciano-boro-hidreto de sódio na proporção de 7,6 mg/ml. As características da resina obtidas foram as seguintes:

Capacidade do monómero de avidina (calculado) : 75 nmoles/ml,

Capacidade de ligação da proteína 1.3δθ : 64 nmoles/ml.

Exemplo 5

Procedendo de maneira semelhante â que se descreveu no Exemplo 1, utilizou-se tampão de fosfato (pH = 6,5), e adicionou-se avidina a 3,85 mg/ml e adicionou-se ciano-boro-hidreto de sódio a 23,0 mg/ml.

As características da resina obtida são as seguintes:

Capacidade do monómero de avidina (calculado) : 161 nmoles/ml,

Capacidade de ligação da proteína 1.33θ : 115 nmoles/ml.

Exemplo 6

Procedendo de maneira semelhante â que se descreveu no Exemplo 1, utilizou-se um tampão de tris-(hidroximetil)-amino-metano (pH = 7,8), adicionou-se avidina a 3,0 mg/ml e adicionou-se

Ζ /

ciano-boro-hidreto de sódio a 30,0 mg/ml.

As caracteristicas da resina assim obtida foram as seguintes :

Capacidade do monómero de avidina (calculado) : 43 nmoles/ml.

Exemplo 7

Preparação de Amostras de Proteína/Purificação por Cromatografia de Afinidade

A. Subunidade de Biotinilo Recombinante

Proveniente de E. coli

Preparou-se um extracto bruto fazendo passar uma suspensão de células (10 gramas de CSR26 E. coli que expressaram a subunidade 1.3S^) em tampão A / hidrogenocarbonato de amónio 100 mM, sal dissódico de ãcido etilenodiaminotetracêtico 1,0 mM, PMSF (fluoreto de fenil-metil-sulfonilo) 2,0 mM, 0,01% em peso de azida dè sódio e 1,0 mM de DDT (ditiotreitol), pH 8,2 J através de uma prensa francesa ou por Use por meio de ultra-sons. Realizou-se esta maneira de proceder duas vezes e separaram-se os detritos das células por centrifugação. Tratou-se o líquido sobrenadante límpido com sulfato de estreptomicina para eliminar ãcidos nucleicos e, em seguida, fraccionou-se por saturação diferencial com sulfato de amónio. O bolo de proteína resultante da saturação de sulfato de amónio entre 30 e 60% em peso continha as proteínas 1«3S biotiniladas e dissolveu-se em 14 ml de tampão A. Em seguida, dialisou-se esta solução contra tampão B (fosfato de potássio 100 mM, /'

-.:„*** cloreto de sódio 0,15 M, pH 6,8).

B. Subunidade de Biotlnilo de Transcarboxilase de Propionibacterium shermanii

Preparou-se um extracto bruto de transcarboxilase de acor do com a maneira de proceder descrita por H. G. Wood, B. Jacobson, Β. I. Gerwin e D. B. Northrup em Methods Enzymol., 13, 215 - 231 (1969) .

Exemplo 8

Purificação da Subunidade Biotinilada 1.3S^ e Transcarboxilase de Extractos Brutos

Neste Exemplo, o parágrafo A descreve a maneira de proceder geral utilizada; nos parágrafos C e D e no parágrafo B descrevem-se as colunas de cromatografia por afinidade usadas nos parágrafos A, C e D.

A. Método Geral

Utilizou-se a cromatografia em fase líquida de elevado rendimento (HPLC) para caracterizar a qualidade da separação e da recuperação das proteínas e dos péptidos depois de os extractos brutos terem sido submetidos a cromatografia de afinidade. Empregou-se o sistema HPLC Shimadzu, com um detector de comprimento de onda variável (regulado para 220 nm). Empregaram-se opcionalmente outros métodos cromatograficos para caracterizar melhor a purificação dos extractos brutos : HPLC de fase inversa 2? coluna

Synchropak RP-C4, 0,1% em peso de ãcido trifluoroacético (TFA)/ /ãgua e 0,1% em peso do sistema dissolvente TFA/acetonitrilo J⁷; cromatografia por interacção hidrofõbica (HI-HPLC), utilizando uma coluna Progel-TSK Èter 5PW (Supelco, Inc.) com um sistema de dois dissolventes /. sulfato de amónio 2,0 M em tampão de fosfato de potássio 100 mM (pH 6,8) e tampão de fosfato de potássio 100 mM (pH 6,8)J.

As capacidades de ligação das várias colunas de afinidade contendo avidina foram avaliadas equilibrando uma coluna com tampão B (descrito no Exemplo 7) e saturando a coluna por injecções múltiplas de concentrações conhecidas de extractos brutos (descritos no Exemplo 7) . As colunas foram em seguida lavadas extensamente com tampão B atê as absorvâncias dos eluidos a 220 nm terem sido reduzidas para 0,01 de DO (densidade óptica). Em seguida, lavaram-se as colunas com tampão C (tampão de cloridrato de glicina 100 mM, pH 2,0) para eluir as subunidades biotiniladas de 1.3E_qpreviamente ligadas. Utilizou-se o ensaio de SDS-PAGE para verificar a identidade da subunidade.

B. Colunas de Cromatografia por

Afinidade Ensaiadas

Ensaiou-se uma coluna preparada de acordo com a presente invenção (Exemplo 1) designada Avidina-HPLC e uma coluna que representa a tecnologia conhecida, designada Avidina-Agarose (Sigma Chemical Co., subunidade de avidina ligada a 4% em peso de esferas de agarose reticuladas), ao lado uma da outra.

/

C. Rendimento das Colunas (Subunidade 1.3$.

Recombinante Proveniente de E. coli

Determinaram-se os te.ores de biotina e de proteina das fraoções eluídas com tampão C utilizando um meio de afinidade de acordocam a presente invenção (Avidina-HPLC) e uma coluna com meio de afinidade convencional (Avidina-Agarose), empregando os métodos acima mencionados. Os volumes dos leitos empregados foram respectivamente 1,26 e 5,0 ml para as colunas de Avidina-HPLC e Avidina-Agarose; os caudais utilizados foram iguais a 1,0 ml/minuto.

As condições de funcionamento das colunas de afinidade incluiram vários parâmetros importantes. Realizou-se tipicamente a pré-lavagem das colunas antes do seu carregamento; fez-se o equilíbrio com 4 volumes do leito de tampão de fosfato de potássio 100 mM (pH 6,8) contendo cloreto de sódio 150 mM e biotina (1,0 mg/ml), seguido de eluição com um volume igual a dez vezes o volume do leito de tampão C; estas condições foram também utilizadas para regenerar colunas novas ou armazenadas durante um certo tempo

O carregamento da amostra de proteína foi considerado completo quando as lavagens da coluna originaram valores de absorvância menores do que 0,05 OD para a coluna de Avidina-Agarose e de 0,01 OD para a coluna de Avidina-HPLC. A eluição das proteínas ligadas realizou-se com tampão C e as leituras da absorvância foram de novo utilizadas para determinar os pontos finais do processo de eluição. 0 uso repetido da mesma coluna teve como resultado a obtenção de diferenças significativas entre os dois tipos de colunas : compactação do sistema da coluna de Avidina-Agarose e cons tante diminuição da capacidade de ligação ao longo de seis ciclos, /

enquanto na coluna de Avidina-HPLC não se observou nenhuma compactação durante dez a quinze ciclos nem redução da capacidade de ligação.

A capacidade de ligação da coluna de Avidina-HPLC foi quatro vezes maior do que a da coluna de Avidina-Agarose convencional e pode trabalhar seis vezes mais depressa (quarente minutos em comparação com quatro horas por ciclo, depois da pré-lavagem). Não se observou qualquer degradação da capacidade da coluna de Avidina-HPLC durante o tempo de duração destes estudos, enquan to para a resina convencional ela era menor do que 50% da capacidade inicial depois de seis ciclos. O resumo dos resultados que utilizam sub-unidade de biotinilo recombinante proveniente de

E. coli podem encontrar-se no Quadro 8C.

QUADRO 8C

Coluna

Avidina-HPLC

Avidina-Agarose

Capacidade total de
proteina (subunidade 1.3S., nmoles/ml) e	42
Fracção de capacidade como subunidade 1.3S e
biotinilada	0,28
Tempos das operações (minutos)
Pré-lavagem	25
Carregamento/lavagem	15
Eluição	15
Regeneração	10
Capacidade de ligação relativa depois de seis ciclos de regeneração (1,0 = ausência de alteração)	1,0
Estabilidade de armazenagem (ãgua, 25°C)	Estável

0,28

125

120

0,42

Instável** ** - Armazenagem recomendada em tampão de fosfato de sódio mM XpH 6,8), 50% em peso de glicerol, cloreto de sódio 150 mM e 0,02% em peso de azida de sódio a -20°C.

D. Rendimento da Coluna_(Isolamento da Transcarboxilase

Contendo a Subunidade 1.3S_c de P. shermanii)

Tentou-se a purificação da enzima biotinilada, transcarbo xilase, proveniente de extractos brutos de P. shermanii, da mesma maneira que no caso da subunidade 1.3S de E. coli. No entanto,

neste caso, não se recuperou praticamente nenhuma enzima usando a resina convencional conhecida (Avidina-Agarose), enquanto se conseguiu 25 a 50% em peso de enzima pura usando a resina de Avidina-HPLC. 0 Quadro 8D resume as características de rendimento das duas resinas em relação â purificação da enzima de transcarboxilase de P. shermanii.

QUADRO 8D

Coluna:	Avidina-HPLC	Avidina-Agarose
Capacidade total de proteína (subunidade 1.3S_g nmoles/ml)	42	—
Actividade especifica de enzima recuperada (micromoles/minuto/mg de proteína).	8-16**	0

** - 30 micromoles/minuto/mg de proteína são equivalentes a

100% em peso de transcarboxilase pura.

E· Discussão dos Resultados

O Quadro 8C reune os valores da capacidade (subunidade 1.3S_e de E. coli e as vantagens do tempo de funcionamento do meio de afinidade contendo avidina de acordo com a presente invenção.

O Quadro 8D resume o enriquecimento em pureza conseguido durante o isolamento da enzima transcarboxilase (P. shermanii) usando o meio de afinidade contendo avidina de acordo com a presente invenção. Em compensação, o meio de Avidina-Agarose convencional não proporcionou qualquer enriquecimento.

/- ³⁰

Os Exemplos específicos seguintes ilustram variações na sintese dos novos meios contendo ligando de acordo com a presente invenção. Em particular, podem preparar-se cadeias poliméricas acrílicas contendo grupos formilo (-CHO) pela técnica descrita por A. Kanamori e col. em J. Chromatography, 363, 231 - 242 (1986) utilizou-se esta maneira de proceder nos Exemplos 9 e 10 seguintes

Exemplo 9

Preparação de Substrato Contendo Grupo Formilo (CHO) com Base num Polimero de Cadela Acrílica

Resina Toyopearl 650M AF-epóxi (seca, 45 a 90 micrómetros 10,0 gramas), contendo 89 micromoles/grama de grupos epóxido, foi adicionada a uma mistura de 5,0 gramas de dextrose (glicose) e 40 ml de hidróxido de sódio 0,1 M numa proveta de 113,4 gramas (4 onças). Incubou-se o recipiente depois de fechado a 40°C durante vinte e quatro horas num aparelho aquecedor/sacudidor (200 rotações por minuto). A resina resultante foi colocada numa coluna, lavada cuidadosamente com ãgua e transferida para um balão de 113,4 gramas (4 onças). Adicionou-se solução de periodato de sódio (0,1 M, 15 ml) e sacudiu-se a mistura resultante em banho de gelo durante uma hora. As esferas foram lavadas com ãgua num funil de Buchner e, em seguida, incubadas em 25 ml de HCl 0,1 M a 25°C durante trinta minutos num aparelho aquecedor/sacudidor.

As esferas foram finalmente lavadas cuidadosamente com ãgua; a analise do grupo formilo indicou um teor de -CHO igual a 55 micromoles/grama (resina seca).

Exemplo 10

Preparação de Substrato Contendo Grupo Formilo (CHQ) com Base num Polímero de Cadeia Acrilica

Procedendo de acordo com uma maneira de proceder semelhante à que se descreveu no Exemplo 9, misturaram-se 10,0 gramas de resina Toyopearl 65OM Af-epoxi com 100 gramas de solução de hidróxido de sódio 0,1 M contendo 0,020 gramas de boro-hidreto de sódio num balão de 226,8 gramas (8 onças). Incubou-se a mistura a 40°C num aparelho aquecedor/sacudidor (200 rotações por minuto) durante vinte e quatro horas. Colocou-se a resina resultante numa coluna, lavou-se cuidadosamente com ãgua e transferiu-se para um balão de 113,4 gramas (4 onças). Adicionou-se então uma solução de periodato de sódio (0,1 M, 15 ml) e sacudiu-se a mistura resultante em banho de gelo durante uma hora. Lavaram-se as esferas com ãgua num funil de Buchner e depois incubou-se em 25 ml de HCI 0,1 M a 25°C durante trinta minutos num aparelho aquecedor/sacudidor. Finalmente, lavaram-se as esferas cuidadosamente com ãgua; a análise do grupo formilo indicou um teor de -CHO igual a 55 micromoles/grama (resina seca).

Exemplo 11

Preparação de um Substrato Contendo Grupo Formilo (CHO) com Base num Polímero de Cadeia de Estireno

A.

Composição do Copolímero

Preparou-se um copolímero macroporoso contendo grupos de /- 32 clorometilo por polimerização em suspensão de 55% em peso de cloreto de vinil-benzilo (VBC), 36% em peso de divinil-benzeno (DVB), 9% em peso de etil-vinil-benzeno (EVB); como agentes porogénicos, utilizou-se pentanol (40% em volume) e tolueno (20% em volume) (fase diluente). O compolímero obtido como produto continha 8,2% em peso de Cl.

B. Transformação no Polímero que

Contém o Grupo Formilo

Utilizando a maneira de proceder descrita por J. T. Ayres e C. K. Mann em Journal of Polymer Science, Polymer Letters, 3,

505 - 508 (1965) , transformaram-se os grupos clorometilo do copolímero de estireno em grupos formilo (-CHO) por oxidação com sulfóxido de dimetilo (DMSO) . Misturaram-se 10 gramas d-â resina clorometilada (acima descrita) com 14 gramas de hidrogenocarbonato de sódio no seio de 200 ml de DMSO a 155°C durante seis horas. Filtrou-se o produto, lavou-se com DMSO, com ãgua quente e com acetona e secou-se a 100°C sob vazio.

Exemplo 12

Preparação de Substrato Contendo Grupo Formilo com Base em Polímero com Cadeia de Estireno

A. Composição do Copolímero

Procedendo de acordo com uma maneira de proceder semelhante â que se descreveu no Exemplo 11, preparou-se um copolímero

·»» macroporoso com a seguinte composição: 29% em peso de VBC/38% em peso de DVB/9% em peso de EVB/24% em peso de estireno (S), com os mesmos níveis de agentes porogénicos que se referiram no Exemplo

11. 0 copolimero obtido como produto continha 5,4% em peso de Cl.

B. Transformação em Polímero Contendo Grupo Formilo

Procedendo de acordo com uma maneira de proceder semelhante â que se descreveu no Exemplo 11, transformou-se o copolimero clorometilado acima referido no derivado de formilo.

Exemplo 13

Preparação de Substrato Contendo Grupo Fúrmilo (CHO) com Base num Polímero com Cadeia de Estireno

A. Composição do Copolimero

Procedendo de acordo com uma maneira de proceder semelhante ã que se descreveu no Exemplo 11, preparou-se um copolimero macroporoso com a seguinte composição: 15% em peso de VBC/39% em peso de DVB/10% em peso de EVB/36% em peso de S, com os mesmos níveis de agentes porogénicos indicados no Exemplo 11. 0 produto obtido como copolimero continha 2,7% em peso de Cl.

B. Transformação em Polimero Contendo Grupo Formilo

Procedendo de acordo com uma maneira de proceder semelhante à que se descreveu no Exemplo 11, transformou-se o copolimero clorometilado acima descrito num derivado de formilo.

/ / -.

Exemplo 14

Preparação de Substrato Contendo Grupo Formilo (CHO) com Base num Polimero de Cadeia de Estireno

A. Composição do Copolímero

Procedendo de acordo com uma maneira de proceder semelhante à que se descreveu no Exemplo 11, preparou-se um copolímero macroporoso com a seguinte composição: 7% em peso de VBC/40% em peso de DVB/10% em peso de EVB/43% em peso de S, com os mesmos níveis de agentes porogênicos indicados no Exemplo 11. 0 copolímero obtido como produto continha 1,6% em peso de Cl.

B. Transformação em Polimero Contendo Grupo Formilo

Procedendo de acordo com uma maneira de proceder semelhante à que se descreveu no Exemplo 11, transformou-se o copolímero clorometilado referido antes no derivado de formilo.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1.- Processo para a preparação de um meio contendo ligando para adsorção cromatogrãfica, que compreende um substrato sólido quimicamente inerte, insolúvel em ãgua e em dissolventes tendo covalentemente a ele ligado um ligando de polipéptido de avidina através de um grupo de ligação não hidrolisãvel, quimica mente estável, sob a forma renaturada dissociada, em que pelo me nos uma parte ou toda a avidina, por exemplo mais de 50% em peso da avidina, se encontra sob uma forma monomérica, caracterizado pelo facto:

a) de se fazer reagir, a um pH próximo da neutralidade, uma quantidade eficaz de um tetrâmero de avidina com grupos funcionais de um substrato sólido, quimicamente inerte, insolúvel em água e em dissolvente, para formar grupos de ligação qui micamente estáveis, não hidrolisãveis entre o substrato e a avi dina até se formarem 1 a 3 ligações covalentes com os grupos funcionais poliméricos por cada, molécula de tetrâmero de avidina;

b) de se separar o substrato que contém avidina e de se reduzir a. ligação imina assim formada de maneira a obter-se a correspondente ligação amina;

c) de se desnaturar o tetrâmero de avidina para se formar avidina monomérica. ligada ao substrato quimicamente estã vel; e

d) de se separar a avidina desnaturada de subunidades dissociadas de avidina e de se renaturar o substrato que contém a avidina por remoção do agente desnaturante para se formar o' meio de afinidade de avidina.
2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de:

a) o pH da operação a) estar compreendido entre 6,5 e

8,5; e/ou

-37/

- .... ·

b) se ajustar o pH do meio de afinidade de avidina da operação d) de modo a ser próximo da neutralidade.
3. - Processo de acordo.com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o grupo de ligação não hidrolisãvel conter um grupo carbono-azoto, ou um grupo enxofre-azoto, sendo o grupo de ligação não hidrolisãvel escolhido de entre os grupos -CH₂NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)NH-, -C(O)NHNHC(O)NH- e -so₂nh-.
4. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 3, caracterizado pelo facto de o substrato sólido, quimicamente iner te, insolúvel em ãgua e em dissolventes ser um polímero orgânico reticulado.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o substrato sólido, quimicamente inerte, insolúvel em ãgua e em dissolventes ser um adsorvente polimêrico orgânico reticulado poroso ou. uma resina permutadora de iões sob a forma de partículas, por exemplo, um adsorvente polimêrico orgânico reticulado ou. uma resina permutadora de iões sob a forma de partículas e derivado principalmente de um monómero acrílico ou de estireno.
6. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores caracterizado pelo facto de o grupo de afinida-38- de de avidina se encontrar sob a forma de monómero que se liga com biotina para originar um complexo com uma constante de dis_ _ -9 sociaçao nao menor do que 10 molar.
7.- Processo para o isolamento de moléculas sintéticas ou naturais de uma mistura fluida que contém as mesmas, em que as moléculas têm afinidade para.a avidina, ou podem ser biotiui ladas para terem afinidade par.a a avidina, ou as suas versões recombinantes que têm afinidade para a avidina, ou versões recom binantes biotiniladas, caracterizado pelo facto de se fazer passar a mistura fluida em contacto Intimo com um meio que contém um ligando preparado pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6 e, subsequentemente, de se eluirem as moléculas sintéticas ou naturais adsorvidas.do meio que contém o ligando.
8. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracteriza do pelo facto de a mistura fluida ser uma mistura líquida orgâni ca ou aquosa.
9. - Processo de acordo com as reivindicações 7 ou 8, caracterizado pelo facto de as moléculas sintéticas ou naturais consistirem em péptidos, proteínas, enzimas, nucleotidos, oligo nucleotidos ou suas versões recombinantes ou biotiniladas ou re combinantes-biotinilados.
10. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo facto de a mistura fluida, que contém as moléculas sintéticas ou naturais, ser contactada com o meio que contém o ligando contido no interior de uma coluna cromatográfica.
11. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo facto de se separar uma mistura líquida, que compreende moléculas sintéticas ou naturais por cromatografia de afinidade líquida em uma coluna que contém um meio preparado pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6.
12. - Coluna de cromatografia por afinidade, caracterizada pelo facto de compreender um recipiente tubular com meios de entrada e de saída nas extremidades opostas do tubo e que tem, alo jado dentro do tubo, um meio que contém ligando preparado pelo processo de ocordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6.