JP4117903B2 - IgG分離媒体および新規プロテインA変異体 - Google Patents
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Description
プロテインAは、動物種に関しては広いIgG−特異性を有するが、特異性はサブクラスによって変化し得る(例えば、ヒトIgG3はプロテインAに結合しない)。プロテインGは、主要な重要な哺乳類種の全てのIgGサブクラスに結合する。プロテインGと比較したプロテインAの利点は、IgGとの結合が弱く、プロテインAからIgGを遊離するために、相対的に緩和な条件が使用できることである。これは、個々のモノクローナル抗体の精製に重要である。
組み換え技術は、異なるドメインの機能に関して、IgG−結合タンパク質の簡単な地図作成を可能にする。プロテインAの場合、天然の形は5つの連続して配列されたIgG−結合ドメイン(E、D、A、BおよびC)、続いてIgGに結合しないX−ドメインを含むことが判明した。新規方法は、IgG−結合フラグメントおよび、1個またはそれ以上のアミノ酸が置換、付加または欠失している変異体の製造を容易にする。特記しない限り、プロテインAという記載は、天然形またはIgG−結合フラグメントおよび天然プロテインAと同じIgG特異性を有するプロテインAの変異体を意味する。システインを含むプロテインAの変異体は、相対的に初期に製造され、挿入されたシステイン残基は基本マトリックスへの結合に使用された。システインをC−末端残基として置かないことが重要であった。システインを、C−末端部で最後から2番目のアミノ酸として有する変異体は、ジスルフィド形成により活性化Thiol Sheparose(登録商標)(Pharmacia Biotech AB,Uppsala,Sweden)に結合し、IgG−分離媒体として研究されている(T.Profy(Repligen);EP284,368およびU.S.5,084,559)。同様の研究がまたFASEB 87、1987年3月29日−4月2日(ポスターN44、Profy,et al)でも提示された。C−末端リンカー配列(C−末端から10個の配列)にシステインを有するプロテインAの3つの変異体(1、2および5ドメイン)で得られた結果は、後に提示された。これらの後の変異体は、またジスルフィド結合形成によりチオプロピルSepharose(登録商標)に共有的に結合した。トレシルクロライドまたはトシルクロライド活性化ゲルへの固定化が、還元的感受性結合基を避ける意図で、別法として示された。等モル関係が、IgG結合キャパシティーと1ドメインおよび2ドメイン変異体のドメインの数の間で判明した。5ドメイン変異体はIgGの2倍モル量以上は決して結合しなかった。天然プロテインAの可溶性形で初期に達成されたものと同等のIgG−キャパシティーが達成された(ある適用において、非−cys−含有変異体が2から3の間のモル結合比を与えるということが後に発見された)。
それと平行して、Genex(U.S.4,977,247(Fahnestock,et al))が、システインがIgG−結合ドメインのC−末端位置に置かれたrProtein G−cysの組み換え変異体を製造している。このプロテインG変異体を基にした分離媒体の製造において、選択は、rProtein G-cysの2官キャパシティー性試薬4−(p−マレイミドフェニル)酪酸N−スルホサクシンイミジルで活性化したアミノヘキシル−アガロース(U.S.4,977,247、請求項1および18欄、22−37行)への共有結合に関してであった。GammaBindG(登録商標)(Pharmacia Biotech AB)は商品として入手可能な、C−末端残基としてシステインを有する固相rProtein G-cys生産物である。生産物は、システイン残基を、4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボン酸N−スルホサクシンイミジルで活性化したアミノヘキシルアガロースと結合させることにより合成する。
我々が気づいている限り、Repligenにより製造されたマトリックス−結合rProtein A-cysは商品として有利であるとされたことはない。理由は、マトリックスへの結合が不安定な構造(−S−S−)によるものであるということであり得るが、理由は我々が知らないファクターによるものでもあり得る。しかしながら、理由がどうであれ、完全に商品として優性である吸着剤は、天然プロテインAまたはシステインを欠く組み換えプロテインAの異なる形を使用している。プロテインGを基本にした商品の市場は、恐らくプロテインAがより有利な結合特性を有するため、これまで本質的に小さかった。
本発明の目的
本発明の目的は、a)プロテインAのIgG−結合特異性;b)天然プロテインAを基本にした他の吸着剤と少なくとも同程度の安定性;c)マトリックス結合rProtein A-cysの既知の変異体と比較して、同じまたは改善されたIgG結合のキャパシティー(先にmol IgG/molプロテインAのcys-変異体の比率として、1、2またはそれ以上のIgG結合ドメインと先に計算された)を有する吸着媒体を提供するという必要性に要約できる。2またはそれ以上のドメインを有する変異体に関して、これはモル比>2であることを意味する。これらの目的の達成は、異なる出発物質からのIgGの洗浄に使用するより有効な方法を可能にする。
本発明
本発明の主態様は、式I:
−B−X−rProtein A-cys I
〔式中、
a.rProtein A-cysはそのアミノ酸配列にシステインを含む組み換え的に製造されたプロテインA;
b.Bは基本マトリックスに結合する橋;および
c.XはrProtein A-cys由来のヘテロ原子NまたはSを含む〕
に従った基で置換された基本マトリックスを含む分離媒体である。
特徴的性質は、Xがチオエーテル硫黄(−S−)および/または2級アミン(−NH−)であることであり、即ち、一つのおよび同じ分離媒体において、Xは、本質的に100%の全てのXがチオエーテル硫黄であるように、50%の選択性で、チオエーテル硫黄または/および2級アミンのいずれかまたは両方であり得る。
全IgG結合キャパシティーとマトリックスのIgGの量の間の最適モル比は、吸着剤のプロテインAに存在するIgG−結合ドメインの数に依存して変化し得る。1ドメイン変異体において、比率は1であり、2ドメイン変異体において比率は≒2である。3、4および5ドメイン変異体に関しては、比率は≒2または好ましくは>2である。最大値は、IgG−結合ドメインの数により決定され、それと共に使用するプロテインA構築物次第である。
本発明のこの態様において、Bは、本質的に、IgGの吸着/脱着に適応する条件下(時間、温度、pH等)で十分な安定性を有する任意のものであり得る。橋−B−の適切な構造の例は、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、炭化水素鎖、アゾ、カルバメート等である。鎖−B−に存在する炭化水素は直鎖、分枝鎖または環状であり得、一般に飽和炭素原子のみを有する(2−10炭素原子、好ましくは2、3または4個の炭素原子で明白な親水性性質を保持する)。橋−B−が基本マトリックスにエーテル構造またはアミド/エステル構造により結合しているのが好ましい。Bが、所望により1個またはそれ以上の酸素/窒素原子で中断され、1個またはそれ以上のアミノまたはヒドロキシ基で置換されていてもよい、直鎖または環状飽和炭化水素鎖を含むことも好ましい。安定性の理由のため、1個および同じ炭素原子が最大1個の酸素または窒素原子と結合している。−B−として無条件に好ましい構造は、rProtein A-cysがマトリックスにエポキシ基またはエピハロ基により結合している時に発生するもの、即ち、その右端(Xに最も近い)に存在するBが構造
−CH2−CHOH−CH2−
であるものである。Xは、リジン中のε−アミノ基またはN−末端アミノ基またはシステイン中のチオール基のいずれが結合しているかに依存して、2級アミンまたはチオエーテルとなる。
前記橋構造は、現在の方法に従って、例えば、エピクロロヒドリン、ビスエポキシド(1,4−ビス(2,3−エポキシプロポキシ)ブタン、4−(マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボン酸N−スルホサクシンイミジル等)のような2機能性試薬の使用により形成できる。適切な基本マトリックスは、それらが多かれ少なかれチオールまたはアミノ基と選択的に反応する基を含むように、このような試薬で活性化し得る。好ましい結合試薬および条件は、1級アミノ基(リシル中のε−アミノおよびN−アミノ末端)と非常に僅かしか反応しない。
rProtein A-cysの適切な形は、天然配列中にシステインで置換されたアミノ酸を有する。あるいは、システインが、末端に融合しているアミノ酸配列(リンカー)に、または天然配列の挿入としてまたはそのIgG−結合部位として存在できる。システインはまた、好ましくはIgG−結合ドメインのN−末端またはC−末端である、ペプチドリンカー中にも含まれ得る。一般に、末端システインは内部システインとするのが好ましい。使用するリンカーの長さは、通常重要ではなく、例えば、1から15アミノ酸残基で変化し得る。全てのシステイン修飾に関して、IgG結合キャパシティーが失われないことが必須である。
rProtein A-cysはまた他の方法でも修飾し得る。例えば、rProtein A-cysは、プロテインAからのIgG−結合ドメインに加えて、1個またはそれ以上のプロテインG由来または他のIgG−結合タンパク質由来のIgG−結合ドメインも含む融合タンパク質であり得る(Guss,et al.,EP262,192参照)。天然ドメインは、変更され得、1回またはそれ以上の回数発生し、また欠失し得る。天然非IgG−結合ドメインは完全にまたは一部欠失し得る。
rProtein A-cysは現法と同様にして製造できる(Profy T,EP294,386;およびLjungquist,et al.,Eur.J.Biochem.186(1989),557-561)。
基本マトリックスは、多くのアミノ基および/またはヒドロキシ基、主に後者を含む親水性ポリマーである。基本マトリックスは通常水性媒体に不溶性である。基本マトリックスは、意図される使用に適した異なる基と架橋し得るおよび/またはそれらを提供し得るデキストラン、セルロース、澱粉、アガロース、プルラン、キシラン等のようなポリサッカライドに由来し得る。合成ポリマーの中で、ヒドロキシアルキルアクリレートまたは対応するメタクリレートのポリマー、ポリビニルアルコール、ビニルヒドロキシアルキルエーテルのポリマー等を特記できる。ポリマーが可溶性である限り、水性媒体に不溶性な支持体、例えばスチレンジビニルベンゼンコポリマーと架橋または吸着または共有結合させて、不溶性にできる。基本マトリックスは、多かれ少なかれ球状および/または多孔性または非孔性であり得る粒子の形でもよい。マトリックスの一つの具体的な形は、ジビニルベンゼン−スチレンコポリマーまたは他の疎水性ポリマー/コポリマーから成る多孔性疎水性粒子であり、その内部および/または外部表面は親水性であり、OH−基を備える。態様の一つの好ましいタイプにおいて、マトリックスは通常水性媒体に不溶性であり、多孔性であり、ポリサッカライドを基本とする。
本発明の他の主要な態様は、分離媒体へのIgGの結合(吸着)に関する。次いで、IgGを前記のように分離媒体と接触させる。吸着は、通常、IgGを製造できる血清または細胞培養物に由来する水性媒体で起こる。適当な条件は、0−35℃、pH6−8、塩濃度0.1−3Mの範囲である(結合するIgGのタイプに依存)。結合IgGの脱着前に、分離媒体を、適当には本質的に吸着緩衝液と同じpHの緩衝液で通常洗浄し、その後脱着を慣用的に、例えば、5より下のpHを有する緩衝液で処置することにより行う。条件は非変性的であるべきである。
C−末端にシステインを有するrProtein A-cysは新規である。
本発明の分離媒体へのIgGの結合は、広い範囲で使用される。溶液からのIgGの捕獲を含む方法、即ち、水性溶液に溶解しているIgGをそこに存在する他の成分から分離するために使用できる。IgGの結合は、クロマトグラフィー中またはバッチ法の方法中の段階の一部であり得る。IgGの結合は、いわゆるイムノアッセイまたは全血または血漿からIgGを除去するための生体外法の一部でもあり得る。使用の主要な領域は(モノクローナル抗体を含む)IgGの精製に見られる。
本発明の非常に好都合な態様は、C−末端システインによるrProtein A-cysの、Anval(登録商標)
のような浸した充填粒子を含むクロマトグラフィー粒子マトリックスへの結合である。このようにして得たクロマトグラフィー支持体は、固定化流動性ベッドにおけるIgGのクロマトグラフィー的分離に非常に有用であることが判明した。”吸着法および分離媒体”に関する我々の同時の特許出願SE9503926−9を参照(引用して包含させる)。拡張/流動化ベッドでのクロマトグラフィーに関しては、WO9218237(Pharmacia Biotech AB)参照。
実験部分
rProtein A-cysの製造
rProtein A-cysはEP284,368の記載またはLjungqvist,et al.,Eur.J.Biochem.186(1989),557-561と同様にして製造した。配列は、最初の18個のアミノ酸(シグナル配列)が欠失し、最後の103アミノ酸がC−末端にシステインを有するヘキサペプチドに置換されている以外、EP284,365の記載と同一であった。
rProtein A-cysの基本マトリックスへの結合
1,4−ビス(2,3−エポキシプロポキシ)ブタン(BPR−ブタン)による活性化。1リットルの排出(drained)Sepharose(登録商標)FF(エピクロロヒドリンと架橋したビーズの形のアガロース、Pharmacia Biotech AB,Uppsala,Sweden)を蒸留水でフィルター漏斗上で洗浄し、300ml蒸留水に溶解した55g NaOHと、35℃で、システムを攪拌しながら温度制御反応器中で混合した。390ml BPR−ブタンを添加した。システムを2時間、35℃で攪拌し、続いて15l水で洗浄した。
rProtein A-cysの結合。活性化ゲルをフィルター漏斗で、3×1リットルの、窒素ガスを飽和させた0.1M Na−リン酸、1mM EDTA、pH8.5で洗浄し、水分を排出させた。次いでゲルを、窒素ガスを飽和させた0.1M Na−リン酸、1mM EDTA、pH8.5に溶解した5.5g rProtein A-cysと混合した。システムを、窒素ガスを通しながら37℃で攪拌した。硫酸ナトリウム(370g)を添加した。システムを2時間、37℃で攪拌した後、ゲルを3l蒸留水で洗浄し、吸引により水抜きした。
脱活性化。水抜きしたゲルを、900ml 0.2M炭酸水素ナトリウム、0.1M NaCl、1mM EDTA、pH10に溶解した100mlチオグリセロールと、システムを攪拌しながら混合した。システムを一晩、37℃で攪拌し、その後ゲルをフィルター漏斗で、0.1Mトリス、0.15M NaCl、pH8および0.05M酢酸で、各サイクル3×1ゲル容量で3サイクル洗浄した。ゲルを最後に水で洗浄した。
ヒトIgGの全キャパシティーの測定
装置:スーパーループを有するFPLC(Pharmacia Biotech AB)
カラム:1ml HR 5/5(Pharmacia Biotech AB)
緩衝液A:10mM リン酸2水素ナトリウム、0.15M 塩化ナトリウム、10mM EDTA、pH7
緩衝液B:0.5M酢酸(約2.7のpHを付与する)
IgG−溶液:緩衝液A中の150mg ヒトIgG(遠心および濾過)
プリンター速度:0.05−0.25cm/分
1.0mlの排出ゲルをカラムに詰め、緩衝液Aで平衡化した。IgG−溶液を流速0.15ml/分で、ゲルがIgG飽和となるまでスーパーループを通して流した。緩衝液Aで同じ流速で洗浄した後、結合IgGを9ml緩衝液Bで、0.30ml/分の流速で溶出した。緩衝液Bでの溶出物を回収し、その容量を測定した(秤量)。1:10に希釈した後、A280を読み取った。IgG−キャパシティーの決定に適応させた式は:溶出容量ml×溶出容量でのA280×7.244=mg排出ゲルのIgG/mlであった。
ヒトIgGの除去キャパシティーQBの測定
カラム:XK16/20(Pharmacia Biotech AB)
緩衝液A:20mM Na−リン酸、pH7.0
緩衝液B:0.1Mグリシン、pH3.0
IgG−溶液:約0.5g IgG/リットル緩衝液A
流速:10ml/分(300cm/h)
プリンター速度:0.02cm/ml
カラム容量:23ml
IgG溶液の輸送は、溶出液で測定しているc/c0(cおよびc0はカラムに通した後および通す前のタンパク質濃度である)が1%に到達した時に妨害された。次いで、吸着IgGを緩衝液Bで溶出し、その容量をmg IgG/ml排出ゲルとして測定した。
最も高い力学的キャパシティーを提供した結合実験の結果および条件は:Na−硫酸1.3M;rProtein A-cysの装填量7.1mg/mlゲル;結合緩衝液pH8.5;結合温度37℃;結合時間2時間;全キャパシティー52.2mg IgG/mlゲル;除去キャパシティーc/c0=1%で31.3mg/mlゲルであった。5−6mg rProtein A-cysを各mlゲルに装填した実験において、大きい相対的力学的キャパシティーが得られた。
他の結合法
rProtein A-cysのエポキシ結合を、N−ヒドロキシサクシンイミド(NHS)に結合した天然プロテインA(システイン欠失)と、4−(N−マレイミドメチル)シクロ−ヘキサン−1−カルボン酸N−スルホサクシンイミジル(Sulfo-SMCC)に結合したProtein A-cysで比較した。天然プロテインとNHSまたはエポキシドとの結合において、rProtein A-cysの結合はチオール基により行われる。rProtein A-cysとエポキシ(BPR)の結合において、結合はアミノ基においてのみ起こる。試薬Sulfo-SMCCの場合、結合はチオール基およびアミノ基の両方について起こり、優性はpHにより測定できる。置換のかなりの程度で、全キャパシティーはNHS、エポキシ、Sulfo-SMCCの順番で増加した。差異は、恐らく末端に位置しない基を経由したアミン結合によるステアリン効果によるものであろう。rProtein GとrProtein G-cysの比較試験もまた下記に報告する。
結果は、非常に良好な全キャパシティーおよび除去キャパシティーが達成され、mol IgG/mol rProtein A-cysのキャパシティーは、cys−含有IgG−結合タンパク質について以前に達成されたものより遥かに優れていることを示した。
ヒトIgGの除去キャパシティー。異なるプロテインAとの比較実験。
方法:プロテインAマトリックス(rProtein A Sepharose(登録商標)Fast Flow)(本発明、エポキシにより固定化);Protein A Sepharose(登録商標)4 Fast Flow(CNBrにより固定化、Pharmacia Biotech AB);PROSEP A(登録商標)(Bioprocessing Ltd.,UK)およびProtein A Hyper D(登録商標)(BioSepra S.A.,France)をXK16/20カラムに、ベッド高10cmまで詰めた。ゲルを20mMリン酸緩衝液、pH7.4で平衡化した。同じ緩衝液にヒトポリクローナルIgG(1mg/ml)を含むサンプルを各ゲルで、190cm/hの直線流動で流した。サンプル輸送を、溶出液中のIgG濃度がサンプル溶液の最初のIgG濃度の10%に到達したら中断した。非結合IgGを洗い流し、結合IgGを0.1Mクエン酸、pH3で溶出した。除去キャパシティーQBを、溶出液中のIgGの量がサンプル中の最初のIgG濃度の5%に到達した時に、ゲルml当たりに結合するIgGの量として計算した。
溶出IgGフランクション中のプロテインAの濃度をELISAで測定した。IgGフラクション中のプロテインAの量をプロテインA/mg IgGとして得る。
結果:
これらの値は、本発明が、その除去キャパシティーが他の商品として入手可能なマトリックスよりも高いプロテインA吸着剤の構築を可能とする。同じマトリックスと比較して、プロテインA放出に関する安定性は、大まかに同じか良好である。
Claims (5)
- 基本マトリックスおよび、システインを含む組み換えプロテインAを提示するマトリックス結合基を含み、該基が式
−B−X−rProtein A-cys
〔式中、rProtein A-cysはそのアミノ酸配列にシステインを含む組み換え的に製造されたプロテインA、Bはエピクロロヒドリン、1,4−ビス(2,3−エポキシプロポキシ)ブタンまたは4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボン酸N−スルホサクシンイミジル(Sulfo-SMCC)の使用により形成される橋、そしてXはrProtein A-cys由来のヘテロ原子Sを含む〕
で表され、Xがチオエーテル硫黄(−S−)であることを特徴とする、分離媒体。 - rProtein A-cysのシステインが末端ペプチドリンカーに含まれることを特徴とする、請求項1に記載の分離媒体。
- ペプチドリンカーがC−末端であることを特徴とする、請求項2に記載の分離媒体。
- システインがrProtein A-cysのC−末端アミノ酸残基であることを特徴とする、請求項1−3のいずれかに記載の分離媒体。
- 基本マトリックスがポリヒドロキシポリマー、好ましくは不溶性ポリサッカライドであることを特徴とする、請求項1−4のいずれかに記載の分離媒体。
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