ITMI952582A1

ITMI952582A1 - Peptidi antigenici migliorati

Info

Publication number: ITMI952582A1
Application number: IT95MI002582A
Authority: IT
Inventors: Giorgio Fassina; Antonio Verdoliva; Menotti Ruvo
Original assignee: Tecnogen Scpa
Priority date: 1995-12-11
Filing date: 1995-12-11
Publication date: 1997-06-11
Also published as: DK0779297T3; EP0779297B1; DE69613086D1; ITMI952582A0; ATE201697T1; US6222011B1; ES2158235T3; IT1277057B1; DE69613086T2; US5932692A; EP0779297A1

Abstract

Peptide antigenico migliorato in cui la sequenza amminoacidica è modificata rimpiazzando uno o più amminoacidi con glicina.(Fig. 7).

Description

DESCRIZIONE

dell'invenzione industriale dal titolo:

Peptidi antigenici migliorati

La presente invenzione riguarda peptidi antigenici migliorati, i metodi per prepararli ed il loro uso.

E' noto che gli anticorpi riconoscono proteine di rilevanza diagnostica associando epitopi proteici specifici, costituiti in genere da sequenze amminoacidiche aventi da 5 a 20 residui amminoacidici .

In diversi casi, sono stati utilizzati peptidi sintetici corrispondenti ad epitopi proteici per la preparazione di kit diagnostici utili per la identificazione e/o la determinazione quantitativa di anticorpi associati alle più diverse patologie. L'identificazione di epitopi proteici di rilevanza diagnostica viene generalmente condotta producendo, mediante sintesi chimica, peptidi corrispondenti a diverse porzioni della proteina in esame e valutandone le caratteristiche antigeniche con un gruppo di sieri o altri fluidi biologici che contengono l'anticorpo corrispondente .

Spesso, la struttura di tali epitopi proteici è complessa e la loro sintesi è molto costosa.

Peraltro, modifiche chimiche nei peptidi identificati come epitopi possono condurre, in modo generalmente non prevedibile, ad alterazioni delle caratteristiche di riconoscimento anticorpale (antigenicità) e, comunque, non sono attualmente disponibili metodiche di larga applicabilità che consentano di migliorare, semplificandola, la natura chimica del peptide antigenico senza alterarne le caratteristiche di antigenicità.

E' quindi ancora molto sentita l'esigenza di un miglioramento alla struttura di un peptide antigenico che consenta di produrlo a più basso costo, che lo renda maggiormente resistente all'azione delle protessi, più stabile chimicamente, e/o che ne riduca le interazioni aspecifiche con altri anticorpi (antigenigità crociata), senza alterarne le caratteristiche di antigenicità .

Questi vantaggi si ripercuoterebbero anche, in modo evidente, sulla produzione di kit diagnostici, sulla utilizzazione di detti peptidi antigenici come ligandi specifici nella produzione di anticorpi di interesse diagnostico o terapeutico e sulla produzione di vaccini sintetici.

Ora è stato sorprendentemente trovato che questi obiettivi vengono raggiunti sostituendo, con un residuo di glicina, uno o più amminoacidi presenti in posizione pari o, rispettivamente, dispari della catena di un peptide antigenico.

Costituisce, quindi, un primo oggetto della presente invenzione un peptide antigenico migliorato, caratterizzato dal fatto che la sua sequenza aitiminoad dica, sia normale che invertita in direzione opposta, è modificata rimpiazzando uno o più amminoacidi con glieina e che, quando è rimpiazzato più di un amminoacido, tutti gli amminoacidi rimpiazzati sono in posizione pari o, rispettivamente, dispari e dal fatto che, in detto peptide antigenico migliorato, gli amminoacidi possono avere sia configurazione L che D.

Un secondo oggetto della presente invenzione è costituito da un metodo per migliorare un peptide antigenico di cui si conosca la sequenza amminoacidica, caratterizzato dal fatto che si rimpiazza almeno un amminoacido della sua sequenza amminoacidica, con glieina e che, quando si rimpiazza più di un amminoacido, tutti gli amminoacidi rimpiazzati sono in posizione pari o, rispettivamente, dispari e dal fatto che, in detto peptide antigenico migliorato, gli amminoacidi possono avere sia configurazione L che D.

Per comodità di esposizione, il peptide antigenico di cui è nota la sequenza amminoacidica in cui, sia essa normale o invertita in direzione opposta, si rimpiazza almeno un amminoacido con glieina verrà indicato, qui di seguito, come "peptide antigenico originario".

I "peptidi antigenici originari" utilizzati in diagnostica per la preparazione di kit utilizzati nella determinazione di specifici anticorpi nel siero e/o altri fluidi biologici sono molto numerosi. Ad esempio, per la diagnosi di infezioni da HIV 1 o 2 vengono utilizzati peptidi corrispondenti alla regione 586-610 della proteina env del virus HIV mentre per la diagnosi di infezioni da virus dell'epatite C (HCV) vengono utilizzati, nei kit diagnostici, vari peptidi, di lunghezza variabile, corrispondenti alle regioni E1, NS4 e NS5.

Una lista di riferimenti bibliografici pubblicati sul Chemical Abstracts in relazione a peptidi antigenici (ossia di peptidi antigenici originari) che possono essere migliorati secondo la presente invenzione è riportata nell'allegata Tabella.

Un terzo oggetto della presente invenzione è costituito da un kit per diagnosi, caratterizzato dal fatto di contenere almeno un peptide antigenico migliorato come indicato più sopra.

Un quarto oggetto della presente invenzione è costituito dalla produzione di anticorpi mono o policlonali capaci di riconoscere un "peptide antigenico originario", caratterizzato dal fatto che si immunizza un adatto animale con un corrispondete peptide antigenico migliorato secondo la presente invenzione, si preleva dall'animale, dopo un predeterminato periodo di tempo, sangue o altri adatti tessuti e si isola l'anticorpo desiderato mediante tecniche convenzionali quali la cromatografia e la precipitazione. Come noto al tecnico del ramo, il sangue viene prelevato quando sì vogliono ottenere anticorpi policlonali mentre altri adatti tessuti, quali la milza, vengono prelevati quando si vogliono ottenere anticorpi monoclonali.

Un quinto oggetto della presente invenzione è costituito da un vaccino, caratterizzato dal fatto di comprendere almeno un peptide antigenico migliorato come indicato più sopra.

Un sesto oggetto della presente invenzione è costituito da un metodo per purificare un anticorpo con la tecnica dei ligandi, caratterizzato dal fatto che il ligando è un peptide antigenico migliorato come indicato più sopra.

La scelta di quali amminoacidi rimpiazzare in posizione pari o dispari nella sequenza amminoacidica del peptide antigenico dipende da fattori ben noti al tecnico del ramo quali il costo, la resa di accoppiamento con l'amminoacido che lo precede e quello che lo segue, la difficoltà di proteggere e deproteggere le funzioni reattive, la sensibilità agli agenti chimici ed agli enzimi del legame con l'amminoacido che lo precede e quello che lo segue, e simili.

Tipici esempi di amminoacidi che si preferirà rimpiazzare con glieina sono: cisteina, arginina, asparagina, acido aspartico, acido glutammico, glutammina, istidina, lisina, aerina, tirosina, treonina e triptofano.

I peptidi antigenici migliorati della presente invenzione possono essere facilmente preparati secondo tecniche convenzionali nella chimica dei peptidi che prevedono adatte protezioni di amminoacidi, accoppiamenti di amminoacidi protetti e sblocchi dei gruppi protettori.

Preferibilmente, essi vengono preparati secondo la tecnica della sintesi in fase solida che comprende le seguenti fasi:

- accoppiamento, mediante adatti reagenti, del primo amminoacido, protetto da adatti gruppi sia al gruppo amminico che alle eventuali funzioni reattive in catena laterale, a partire dall'estremità C-terminale, su un adatto supporto per sintesi in fase solida;

- rimozione del gruppo protettore al gruppo amminico con adatti reagenti ;

- accoppiamento del secondo amminoacido, a partire dall'estremità C-terminale, protetto al gruppo amminico ed alle eventuali funzioni reattive in catena laterale;

- rimozione del gruppo protettore al gruppo amminico e ripetizione delle fasi di accoppiamento e rimozione finché non è stato completato l'accoppiamento di tutti i rimanenti amminoacidi costituenti l'intera catena peptidica fino all'ultimo amminoacido N-terminale;

- rimozione di tutti i rimanenti gruppi protettori dal peptide antigenico assemblato e distacco del peptide dalla resina.

Queste tecniche sono ampiamente descritte in letteratura e sono ben note al tecnico medio del ramo. Vedasi, ad esempio, Atherton & Sheppard, 1989, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, UK.

In generale, l'uso a scopo diagnostico dei composti della presente invenzione nei processi di determinazione di anticorpi comprende la formazione di complessi con anticorpi diretti verso il "peptide antigenico originario".

Tipicamente, questa tecnica comprende:

1) immobilizzazione di almeno un peptide antigenico migliorato della presente invenzione su micropiastre in plastica per determinazione ELISA, oppure su particelle utilizzabili a fini diagnostici, sia direttamente, sia in forma di coniugati ad altre molecole;

2) incubazione di un campione contenente l'anticorpo di interesse con il peptide antigenico migliorato immobilizzato;

3) lavaggio del complesso peptide antigenico migliorato immobilizzato/anticorpo; e

4} rivelazione dell 'anticorpo adsorbito mediante un adatto reagente .

Queste tecniche sono ampiamente descritte in letteratura e sono ben note al tecnico medio del ramo. Vedasi, ad esempio, "Immunochemistry in Practice", Johnstone & Thorpe, (1987) Blackwell, Oxford, UK.

Preferibilmente, la fase 1 viene condotta con micropiastre in materiale plastico quale ad esempio PVC, dotate di 96 pozzetti che vengono riempiti con soluzioni di bicarbonato di sodio 0.1 M, pH 9, contenenti quantità variabili (da 0 a 50 microgrammi) di un peptide antigenico migliorato della presente invenzione, previa coniugazione ad albumina da siero bovino. Dopo 24 ore d'incubazione, la soluzione viene rimossa, le micropiastre vengono lavate con tampone fosfato (pH 7,3) ed i pozzetti vengono riempiti con una soluzione al -3% di albumina bovina per eliminare i siti di interazione aspecifica.

Nella fase 2, le micropiastre vengono lavate con tampone fosfato (pH 7,3) ed i relativi pozzetti vengono riempiti con campioni biologici contenenti gli anticorpi da determinare. Le micropiastre vengono poi incubate a 20-37°C per altre 4-18 ore.

Il lavaggio (fase 3) viene preferibilmente eseguito con tampone fosfato (pH 7,3).

Infine la fase 4 viene condotta aggiungendo una soluzione di un anticorpo anti-anticorpo da determinare (per esempio un anticorpo di coniglio anti immunoglobuline umane) coniugato all'enzima perossidasi. Dopo 2 ore di incubazione le micropiastre vengono nuovamente lavate accuratamente con tampone fosfato (pH 7,3). Viene quindi aggiunta una soluzione di o-fenilendiamina e si registra la formazione di colore con un adatto lettore di micropiastre .

Tipicamente, la preparazione di un anticorpo contro un peptide antigenico migliorato capace di riconoscere il corrispondente "peptide antigenico originario" comprende:

1) immunizzazione di un adatto animale, quale coniglio, pecora, capra, ratto, topo o simili, con almeno un adatto peptide antigenico migliorato secondo la presente invenzione, eventualmente coniugato ad una proteina carrier quali, ad esempio, albumina ed emocianina, utilizzando adatti adiuvanti;

2) prelievo di sangue dall'animale dopo un predeterminato periodo di tempo e separazione della frazione serica;

3) purificazione dell'anticorpo mediante tecniche convenzionali, quali, ad esempio, cromatografia o precipitazione.

Anche queste tecniche sono ampiamente descritte in letteratura e note al tecnico medio del ramo.

Tipicamente la purificazione di un anticorpo diretto verso un peptide antigenico comprende le seguenti fasi:

1) immobilizzazione del peptide antigenico migliorato su un adatto supporto per cromatografia di affinità;

2) impaccamento della resina cosi ottenuta in una adatta colonna cromatograf ica;

3) equilibrazione della colonna con un tampone capace di favorire la formazione del legame immunoglobulina/ antigene;

4} caricamento della colonna con un fluido contenente almeno una immunoglobulina capace di riconoscere il "peptide antigenico originario" ;

5 ) lavaggio della colonna con almeno un liquido capace di eluire le impurezze senza però interferire con il legame immunoglobulina/ antigene migliorato; ed

6) eluizione della immunoglobulina precedentemente adsorbita dalla colonna mediante un adatto eluente dissociante.

Le fasi da 1) a 6) vengono facilmente realizzate mediante tecniche convenzionali ben note al tecnico del ramo.

Queste ed altre caratteristiche della presente invenzione risulteranno più evidenti dagli esempi che seguono e dalle figure allegate in cui:

- la Figura 1 è una vista laterale della struttura di un peptide antigenico migliorato secondo la presente invenzione di formula NH2-Ala-Gly-Leu-Gly-Ala-Gly-COOH, indicato come (-G)P15, corrispondente al peptide antigenico originario P15 in cui tutti gli amminoacidi in posizione pari sono stati rimpiazzati con glicine;

- la Fig. 2 è una vista laterale della struttura del peptide antigenico originario P15 di formula NH2-Ala-Asp-Leu-Asp-Ala-Arg-COOH;

- la Fig. 3 è una vista laterale della struttura di un peptide antigenico migliorato secondo la presente invenzione di formula NH2-Gly-Asp-Gly-Asp-Gly-Arg-COOH, indicato come (+G)P15, corrispondente al peptide antigenico originario P15 in cui tutti gli amminoacidi in posizione dispari sono stati rimpiazzati con glieina;

- la Fig. 4 è una vista frontale del peptide di Fig 1;

- la Fig. 5 è una vista frontale del peptide di Fig 2;

- la Fig. 6 è una vista frontale del peptide di Fig 3;

- la Fig. 7 mostra l'interazione tra anticorpi prodotti contro il peptide antigenico originario P15 ed il peptide P15, peptidi antigenici migliorati della presente invenzione (+G)P15 e (-G)P15, ed un peptide scorrelato di controllo;

- la Fig. 8 mostra come l'interazione tra anticorpi anti peptide originario P15 e peptide P15 sia inibibile in presenza di peptidi antigenici migliorati (-G)P15 e (+G)P15 e del peptide P15 stesso ma non in presenza di un peptide scorrelato di controllo.

Le Figg. 1-6 indicano che il peptide migliorato (-G)P5 mantiene tutte le catene laterali disposte inferiormente allo scheletro centrale del peptide antigenico originario P15. A sua volta il peptide migliorato (+G)P5 mantiene tutte le catene laterali disposte superiormente allo scheletro centrale del peptidé antigenico originario P15.

Esempio 1

Preparazione di peptidi antigenici migliorati e determinazione delle loro proprietà antiqeniche

Sono stati prodotti anticorpi policlonali immunizzando dei conigli con il peptide antigenico originario P15 (NH2-Ala-Asp-Leu-Asp-Ala-Arg-COOH) coniugato ad albumina di siero bovino.

Inoltre, sono stati prodotti i corrispondenti peptidi antigenici migliorati.

Un primo peptide antigenico migliorato è stato ottenuto sostituendo residui in posizione pari con glieina. E' stato così ottenuto il peptide di sequenza NH2-Ala-Gly-Leu-Gly-Ala-Gly-COOH, indicato qui di seguito con la sigla (-G)P15.

Un secondo peptide antigenico migliorato è stato ottenuto sostituendo residui in posizione dispari con glicina. E' stato così ottenendo il peptide di sequenza NH2-Gly-Asp-Gly-Asp-Gly-Arg-COOH, indicato qui di seguito con la sigla (+)GP15.

Per-la sintesi dei composti P15, (+)GP15, e <-G)P15 è stato utilizzato un sintetizzatore automatico della Applied Biosystems della Perkin Elmer (Foster City, California, USA) - modello 431-A, software version 1.1- seguendo la procedura consigliata dal costruttore e che si basa su metodiche riportate in letteratura (Atherton & Sheppard, 1989, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, UK).

La sintesi è stata condotta partendo da resina per sintesi peptidica acido labile prederivatizzata con Glieina (Novabiochem Cat No. 04-12-2800; 0.1 mmoli) per la sintesi del peptide (-G)P15, e Arginina (Novabiochem Cat No. 04-12-2850; 0.1 mmoli) per la sintesi dei peptidi antigenici P15 e (+G)P15 (resina cloro tritìi cloridrica) protetti al gruppo amminico N-terminale dal gruppo Fmoc che, nel primo ciclo di sintesi, è stato deprotetto mediante trattamento con 3,0 mi di piperidina al 20 % in N-metilpirrolidone (ABI Cat No. 400629) per 14 minuti, a temperatura ambiente sotto agitazione.

La resina deprotetta è stata poi lavata 5 volte con 2,5 mi di N-metil-pirrolidone (Merck Cat. No. 806072) per 9 minuti sotto agitazione, a temperatura ambiente.

Nel frattempo il residuo amminoacidico in posizione 2 al C-terminale (1 mmole) è stato preattivato mediante incubazione con 1 mi di HOBt 1 M sciolto in N-metil-pirrolidone (ABI Cat. No.

400662) e 1 mi di dicicloesilcarbodiimide 1 M in N-metilpirrolidone (ABI Cat. No. 400663).

L 'amminoacido attivato e stato incubato con la resina per 51 minuti sotto agitazione costante. La resina è stata poi lavata con N-metil-pirrolidone (4 lavaggi di 0.5 minuti con 2 mi). A questo punto la resina è stata sottoposta ad un secondo ciclo di deprotezione con piperidina e di accoppiamento dell1amminoacido successivo.

Questa procedura è stata ripetuta in maniera sequenziale per tutti i residui amminoacidici compresi nelle sequenze riportate più sopra. In particolare, sono stati usati i seguenti derivati amminoacidici: Fmoc-Asp(tBu) (Novabiochem Cat. No. 04-12-1013), Fmoc-Ala (Novabiochem Cat. No. 04-12-1006) ; Fmoc-Leu (Novabiochem Cat. No. 04-12-1025).

Dopo aver completato la sintesi e dopo aver rimosso il gruppo Fmoc N-terminale mediante trattamento con piperidina, la resina è stata lavata con metanolo, diclorometano, ancora con metanolo, e seccata accuratamente sotto vuoto per 12 ore. Successivamente, il materiale peptidico è stato rimosso dalla resina incubando 100 mg di resina con 5 mi di una miscela costituita da acido trifluoroacetico (Fierce cat No. 28901)/fenolo (Carlo Erba Cat. No. 451285)/acqua (Merck Cat. No.

15333 )/etanditiolo (Aldrich Cat No. E 360-0)/tioanisolo (Aldrich Cat. No. T 2,800-2) 84:4:3:3:3 per 2 ore a temperatura ambiente sotto agitazione. La resina è stata poi filtrata su filtro in vetro sinterizzato. Il filtrato è stato ridotto di volume a pochi mi mediante evaporazione sotto vuoto ed il liquido residuo è stato poi trattato con 50 mi di etere etilico freddo.

Il materiale peptidico così precipitato è stato separato mediante centrifugazione ed il centrifugato e stato risospeso in 25 mi di acqua/acetonitrile/acido trifluoroacetico 50:50:0,1, congelato e liofilizzato.

Infine, il liofilo è stato purificato da contaminanti mediante cromatografia ad alte prestazioni (HPLC) utilizzando una colonna Lichrospher RP-8 (25 x 1 era I.D.) (Merck Cat. No. 150153), equilibrata ad un flusso di 3 ml/min con acqua/acetonitrile/acido trifluoroacetico 95/5/0,1, ed eluendo con un gradiente lineare di acetonitrile variante dal 5% all'80% in 55 minuti.

Il materiale corrispondente al picco principale è stato raccolto, congelato e liofilizzato.

I peptidi antigenici così ottenuti sono stati coniugati ad albumina bovina di siero tramite glutaraldeide mediante metodiche note ( "Immunochemistry in Practice", Johnstone & Thorpe, (1987) Blackwell, Oxford, UK ), dializzati contro tampone fosfato 0,1 M acido acetico, e liofilizzati.

Micropiastre per determinazioni ELISA (Falcon Cat No. 3912) sono state trattate con i peptidi coniugati a BSA in concentrazione da 0 a 50 μg/ml in tampone sodio bicarbonato pH 9,0 per 12 ore a 4°C. Le piastre sono state lavate con un tampone sodio fosfato 150 mM, pH 7,2 (PBS) e poi, ad ogni pozzetto delle micropiastre, sono stati aggiunti 200 ul di una soluzione di PBS contenente il 3 % di albumina bovina di siero (BSA, Sigma Cat. No. A-4503 ).

Dopo un'ora, le piastre sono state ancora lavate per 4 volte con PBS ed ogni pozzetto è stato riempito con soluzioni (100 pi) contenenti anticorpi di coniglio anti peptide P15, in concentrazioni variabili da 0 a 20 pg/ml. Dopo un'incubazione di 2 ore, le piastre sono state lavate nuovamente con FBS 8 volte e, successivamente, ad ogni pozzetto, sono stati aggiunti 100 pi di una soluzione di immunoglobuline di capra anti immunoglobuline di coniglio derivatizzate con perossidasi (Sigma Cat. No. A-6154) diluita 1:100 con FBS contenente 3% BSA. Dopo un'ora le piastre sono state nuovamente lavate con PBS. Poi, ogni pozzetto è stato riempito con 100 pi di una soluzione 1 mg/ml di o-fenilendiamina (Sigma P 6912) in sodio citrato 0,1 M, ed acqua ossigenata 5 mM.

Dopo circa 30 minuti, la reazione di sviluppo è stata bloccata mediante l'aggiunta di 25 pi di acido solforico 4,5 M. L'assorbenza a 450 nm di ogni pozzetto è stata determinata mediante un lettore di piastre (Merck , Mod. MIOS). I risultati sono illustrati in Fig. 7.

Le specificità dell*interazioni osservate sono state determinate mediante studi di inibizione, incubando l'anticorpo diretto verso il peptide P15 con i peptidi P15, (-G)P15 e (+G)P15 a concentrazioni variabili.

Come riportato in Fig. 7, le immunoglobuline si associano ai peptidi antigenici P15, (-G)P15, (+G)P15 immobilizzati su piastra in maniera dose dipendente e con circa la stessa intensità. L'interazione risulta inibibile in presenza di tutti i peptidi P15, (-G)PIS, (+G)P15 in soluzione in maniera dose dipendente ed in maniera specifica perché i peptidi di controllo (BSA, o un peptide scorrelato) non risultano in grado di inibire l'interazione (Fig. 8).

Caratteristiche di riconoscimento simili sono state dimostrate dai peptidi antigenici migliorati secondo la presente invenzione (-G)P15 e (+G)P15 prodotti utilizzando amminoacidi nella configurazione D, come pure da peptidi antigenici migliorati secondo la presente invenzione ottenuti invertendo la sequenza in direzione opposta. Difatti, i peptidi NH2-Gly-Ala-Gly-Leu-Gly-Ala-COOH, corrispondente al peptide (-G)P15 con sequenza invertita, e NH2-Arg-Gly-Asp-Gly-Asp-Gly-COOH, corrispondente al peptide (+G )P15 con sequenza invertita, entrambi sia in configurazione L sia in configurazione D, hanno dimostrato caratteristiche funzionali simili.

Esempio 2

Purificazione di anticorpi anti P15 su colonne preparate immobilizzando (-G)P15 e (+G)P15

I peptidi antigenici migliorati secondo la presente invenzione (-G)P15 e (+G)P15 (5 mg) sono stati sciolti separatamente in 5 mi di tampone sodio bicarbonato 0,1 M, pH 9,0, e poi aggiunti rispettivamente a 1,2 g di resina Eupergit C30 N (Sigma Cat. No. O 9879 ), supporto per cromatografia di affinità preattivato con gruppi epossidici per l'accoppiamento diretto di peptidi e proteine.

La sospensione è stata posta in agitazione per 24 ore e l'entità dell'accoppiamento è stata monitorata mediante prelievi della miscela di reazione a tempi diversi e successiva analisi mediante RP-HPLC. In entrambi i casi, dopo 24 ore, risultava legato covalentemente al supporto circa l '85 % del peptide iniziale.

Le resine derivatizzate sono state lavate con 50 mi di TRIS 1 M, pH 9,0, e poi impaccate su colonne in vetro delle dimensioni di 100 x 6,6 mm I.D.. Per le procedure di purificazione, le colonne sono state equilibrate con un tampone TRIS 50 mM pH 7,0, ad un flusso di 1 ml/min, monitorando l'eluente a 280 nm. Nelle due colonne, è stato poi applicato 1 mi di siero grezzo di coniglio contenente anticorpi anti peptide P15 e, dopo l'eluizione del. materiale non trattenuto al volume morto delle colonne, l'eluente è stato cambiato in acido acetico 0,1 M.

Il materiale desorbito da tale trattamento è stato raccolto ed analizzato mediante analisi elettroforetica su gel di poliacrilammide. In entrambi i casi, le colonne si sono dimostrate capaci di purificare efficientemente gli anticorpi anti-P15 presenti nel siero.

Caratteristiche di riconoscimento simili sono state dimostrate da peptidi antigenici migliorati secondo la presente invenzione (-G)P15 e (+G)P15 prodotti utilizzando amminoacidi nella configurazione D, come pure da peptidi antigenici migliorati secondo la presente invenzione ottenuti invertendo la sequenza in direzione opposta. Difatti, entrambi i peptidi NH2-Gly-Ala-Gly-Leu-Gly-Ala-COOH, corrispondente al peptide (-G)P15 con sequenza invertita, e NH2-Arg-Gly-Asp-Gly-Asp-Gly-COOH, corrispondente al peptide (+G)P15 con sequenza invertita, hanno dimostrato caratteristiche funzionali simili, sia in configurazione L che in configurazione D.

Esempio 3

Produzione di anticorpi contro (-G)PIS e (+G)P15 nel coniglio I coniugati a BSA dei peptidi antigenici migliorati secondo la presente invenzione (-G)P15 e <+G)P15, preparati come descritto più sopra, sono stati usati per immunizzare conigli albini New Zealand mediante iniezioni intradermiche nella zona plantare. Dopo circa 4 settimane è stato effettuato un secondo richiamo con gli stessi peptidi antigenici migliorati e dopo circa 2 mesi sono stati prelevati campioni di sangue per la separazione della frazione serica.

Utilizzando le metodiche ELISA descritte più sopra ed utilizzando micropiastre per determinazioni ELISA derivatizzate con il peptide P15, si è visto che i sieri ottenuti dalle due immunizzazioni erano in grado di riconoscere il peptide P15 con affinità e selettività comparabili a quelle dimostrate dall 'antisiero prodotto contro il peptide P15 originario.

Caratteristiche di riconoscimento simili sono state dimostrate dai peptidi antigenici migliorati secondo la presente invenzione (-G)P15 e (+G)P15 prodotti utilizzando amminoacidi nella configurazione D, come pure da peptidi ottenuti invertendo la sequenza in direzione opposta.

Difatti, entrambi i peptidi NH2-Gly-Ala-Gly-Leu-Gly-Ala-COOH, corrispondente al peptide (-G)P15 con sequenza invertita, ed NH2-Arg-Gly-Asp-Gly-Asp-Gly-COOH, corrispondente al peptide (+G)P15 con sequenza invertita, hanno dimostrato caratteristiche funzionali simili sia in configurazione L che in configurazione D.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Un peptide antigenico migliorato, caratterizzato dal fatto che la sua sequenza amminoacidica, sia normale che invertita in direzione opposta, è modificata rimpiazzando uno o più amminoacidi con glieina e che, quando è rimpiazzato più di un amminoacido, tutti gli amminoacidi rimpiazzati sono in posizione pari o, rispettivamente, dispari e dal fatto che, in detto peptide antigenico migliorato, gli amminoacidi possono avere sia configurazione L che D.
2. Un metodo per migliorare un peptide antigenico di cui si conosca la sequenza amminoacidica, caratterizzato dal fatto che si rimpiazza almeno un amminoacido della sua sequenza amminoacidica, con glieina e che, quando si rimpiazza più di un amminoacido, tutti gli amminoacidi rimpiazzati sono in posizione pari o, rispettivamente, dispari e dal fatto che, in detto peptide antigenico migliorato, gli amminoacidi possono avere sia configurazione L che D.
3. Un kit per diagnosi, caratterizzato dal fatto di contenere almeno un peptide antigenico migliorato secondo la rivendicazione 1.
4. Un metodo per la produzione di anticorpi mono e policlonali capaci di riconoscere un "peptide antigenico originario" ,. caratterizzato dal fatto che si immunizza un adatto animale con un corrispondente peptide antigenico migliorato secondo la rivendicazione 1, si preleva, dopo un predeterminato periodo di tempo, sangue o altri adatti tessuti dall'animale e si isola l 'anticorpo desiderato mediante tecniche convenzionali.
5. Un vaccino, caratterizzato dal fatto di comprendere almeno un peptide antigenico migliorato secondo la rivendicazione 1.
6. Un metodo per purificare un anticorpo con la tecnica dei ligandi, caratterizzato dal fatto che il ligando è un peptide antigenico migliorato secondo la rivendicazione 1.