ITMI951328A1 - Peptidi multimerici - Google Patents
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Abstract
Il composto di formula: (FORMULA I) dove G, K ed R hanno i significati indicati nella descrizione,è capace di legarsi non covalentemente alla porzione costante delle immunoglobuline.Vengono inoltre descritti il procedimento per preparare il composto di formula (I) e l'uso di detto composto sia in campo biotecnologico che analitico.
Description
DESCRIZIONE
dell'invenzione industriale dal titolo:
"Peptidi multimerici"
La presente invenzione riguarda nuovi peptidi multimerici capaci di legarsi non covalentemente alla porzione costante delle immunoglobuline, il procedimento per prepararli ed il loro uso sia in campo bi otecno Logi co che analitico.
Le immunoglobuline rivestono notevole importanza sia nel settore diagnostico che nel settore terapeutico. Nel primo caso trovano infatti ampio impiego come reagenti utili nella identificazione e quantificazione analitica di composti presenti in fluidi biologici. Nel secondo caso, invece, vengono usati come agenti in grado di legarsi a molecole biologiche coinvolte in processi fisiologici di importanza terapeutica. Data La loro importanza, ne consegue che anche La loro produzione e, soprattutto, la loro purificazione, riveste una particolare rilevanza industriale.
Le immunoglobuline possono essere ottenute da sieri animali o dalla coltivazione di adatte linee cellulari.
La loro purificazione viene condotta mediante tecniche cromatografiche classiche quali, ad esempio, scambio ionico o gel filtrazione o, preferibilmente, cromatografia di affinità su colonne preparate immobilizzando la Proteina A. Questa proteina, est ratta dallo Staffilococcus aureus, è infatti capace di Legarsi specificamente alla porzione costante delle immunoglobuline (Siodahl, J. Eur. J. Biochem. 78471-490 (1977)).
L'applicazione su vasta scala della Proteina A presenta tuttavia molti limiti perché la sua origine estrattiva richiede un'accurata eliminazione di contaminanti capaci di pregiudicare La qualità del prodotto purificato mediante detta proteina. Inoltre, la Proteina A non è motto stabile in condizioni denaturanti o in presenza di agenti usati per La rimozione di contaminanti biologici come virus o frammenti di acidi nucleici. Per di più, i costi di produzione della Proteina A sono motto elevati, limitandone le applicazioni per purificazioni su larga scala.
E' quindi ancora molto sentita L'esigenza di un composto di sintesi, e quindi privo di contaminanti di origine biologica, che sia capace di legarsi non covalentemente alla porzione costante delle immunoglobuline e che abbia un costo sensibilmente inferiore a quello della Proteina A.
Ora è stato trovato che queste caratteristiche sono possedute dal composto di formula:
X ' ed X", uguali o diversi fra loro, sono H o un composto scelto dal gruppo dei composti comunemente usati nella chimica dei peptidi per proteggere l'ossidrile,
Y è H o un composto scelto dal gruppo dei composti comunemente usati nella chimica dei peptidi per proteggere il gruppo funzionale guanidinico dell'arginina.
Costituisce quindi un primo oggetto della presente invenzione un composto di formula (I) in cui G, K ed lì hanno i suddetti significati.
Preferibilmente, G (glicine), K (lisina) ed R (-Tyr-Thr-Arg-NH) hanno configurazione L.
In letteratura sono descritti numerosi gruppi adatti per proteggere l'ossidrile durante la sintesi di peptidi (G.A. Grant, Synthetic peptides: a user's guide Freeman, N.Y.
Tipi c i esempi di X sono: ter.butiLe (tBu) (G. La Joie, A. Crivici, J.G. Adamson, "Synthesis" 571-572 (1990)) o il gruppo benzile (Yoj'ima "Tetrahedron, 44, 805-819 (1988).
Anche i gruppi adatti per proteggere il gruppo guanidinico dell ’arginina durante la sintesi di peptidi sono ampiamente noti in letteratura (G.A. Grant, Synthetic peptides: a user's guide, freeman, N.Y., 1992).
Tipici esempi di Y sono: 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonile (Pmc) e 4-metossi-2,3,6-trimetiLbenzene (Mtr) (Ramage & Green, "Tetrahedron Letters, 28, 2287 (1987); Fuijino et al. "Chem. Pharm. Bull., 29, 2825, (1981)).
I Composti di formula (I) possono essere facilmente preparati secondo tecniche convenzionali nella chimica dei peptidi. Preferibilmente, essi vengono preparati secondo la tecnica della sintesi in fase solida.
Costituisce quindi un secondo oggetto della presente invenzione un metodo di sintesi che comprende le seguenti fasi: a) accoppiamento di un residuo di glieina ad un supporto acidolabile per sintesi peptidica in fase solida,
b) successivo accoppiamento di un residuo di lisina attivabile nei suoi gruppi funzionali alfa ed epsilon amminici;
c) ulteriore accoppiamento di un residuo di lisina attivabile nei suoi gruppi funzionali alfa ed epsilon amminici;
d) accoppiamento sequenziale di residui di tirosina protetta al gruppo ossidrilico, treonina protetta aL gruppo ossidrilico ed arginine protetta al gruppo guanidirvico;
e) sblocco del peptide dalla resina in maniera da ottenere il peptide in forma protetta; e
f) quando Lo si desidera, sblocco delle funzioni ossidriliche e/o guanidiniche del peptide.
Le suddette fasi vengono realizzate secondo tecniche convenzionali.
Un terzo oggetto della presente invenzione è costituito dall'uso di un Composto di formula (I) per formare complessi con almeno una immunoglobulina nei processi di separazione e di determinazione qualitativa e quantitativa di detta immunoglobulina o di una miscela di immunogluiine.
Esempi di immunogLobuline capaci di formare complessi, legandosi non covalentemente ai Composti di formula (I), sono: Le IgG di topo, di coniglio, di ratto e di capra, e le IgA umane Un tipico esempio di metodo per separare e purificare un1immunogLobuLina comprende:
(i) L'immobilizzazione su un supporto per cromatografia di affinità di un composto capace di legarsi non covalentemente ad almeno una immunoglobulina,
(ii) l'impaccamento della resina cosi ottenuta in una colonna cromatografica,
(iii) l'equilibrazione della colonna con un tampone capace di favorire la formazione del Legame immunoglobulina/composto immobilizzato,
(iv) il caricamento della colonna con un fluido contenente almeno una immunoglobulina,
(v) il lavaggio della colonna con almeno un Liquido capace di eluire le impurezze senza però interferire sul legame immunoglobulina/composto immobilizzato,
(vi) l'eluizione della immunoglobulina precedentemente adsorbita dalLa colonna mediante un eluente dissociante,
ed è caratterizzato dal fatto che:
il composto capace di legarsi non covalentemente ad almeno una immunoglobulina è un Composto di formula (I) in cui G, K ed R hanno i significati indicati più sopra.
Le fasi da (i) a (vi) vengono realizzate secondo tecniche convenzionali.
Preferibilmente, il supporto per cromatografia di affinità è del tipo preattivato con gruppi epossidici per l'accoppiamento diretto di peptidi e proteine. Tipici esempi di adatti supporti sono La resina Protein-Pak deLla ditta Waters (USA) e la resina Eupergit C30 N della Rohm SiHaas (Germania).
La fase (i) viene preferibilmente condotta in presenza di una soluzione tampone basica, il cui pH è preferibilmente compreso fra 8,5 e 9,0, e non contiene funzioni amminiche libere od altri gruppi nucleofili.
La fase (iii) viene preferibilmente condotta con una soluzione tampone neutra quale, ad esempio, una soluzione di fosfato di sodio 50 mM, pH 7.
La fase (v) viene preferibilmente condotta utilizzando una soluzione tampone neutra e a bassa forza ionica quale, ad esempio, una soluzione di fosfato di sodio 50 mM, pH 7, od una soluzione di acetato di ammonio 100 mM, pH 5,7.
Esempi di eluenti dissocianti adatti per realizzare la fase (vi) sono le soluzioni acquose acide o basiche. Tipici esempi di dette soluzioni sono le soluzioni acquose di acido acetico a pH 2,5 e di bicarbonato di sodio a pH 9.
Questa tecnica di separazione e purificazione di immunoglobuline è ampiamente descritta in letteratura (S . R. Narayanan "Preparative affinity chromatography of proteins" J. of Chromatography, 658, 237-258, (1994); C.R. Lowe "Laboratory Technique in Biochemistry and Molecular Biology", Work and Burdon, voi.
7, parte 2, Elsevier, N. Holland, Amsterdam; Ey et al. Immunochemi st ry 15, 429 (1978)
Un tipico esempio di metodo per la determinazione quantitativa di una immunoglobulina o di una miscela di immunoglobuline mediante la tecnica ELISA che comprende:
(1) l'immobilizzazione su una micropiastra per determinazioni ELISA di un composto capace di legarsi non covalentemente ad almeno una immunoglobulina,
(2) L'incubazione sulla micropiastra di un campione contenente la o le immunoglobuline da determinare,
(3) il lavaggio della micropiastra,
(4) La rivelazione deL complesso composto immobiLizzato/immunoglobulina,
ed è caratterizzato dal fatto che:
il composto capace di Legarsi non covalentemente ad almeno una immunoglobulina è un Composto di formula (I) in cui G, K ed R hanno i significati indicati più sopra.
La determinazione analitica di immunoglobuline con la tecnica ELISA è ampiamente descritta in letteratura ("Immunochemistry in Practice", Johnstone & Thorpe, (1987), Blackwel, Oxford, UK.
Preferibilmente, la fase 1 viene condotta con micropiastre in materiale plastico quale, ad esempio, il PVC, dotate di 96 pozzetti che vengono riempiti con soluzioni di bicarbonato di sodio 0,1 M, pH 9, contenenti quantità variabili (da 0 a 50 ug) di Ligando. Dopo 24 d'incubazione, la soluzione viene rimossa, le micropiastre vengono lavate con tampone fosfato ed i pozzetti vengono riempiti con una soluzione aL 3% di albumine bovine per eliminare i siti d'interazione aspecifica-Nella fase 2, te micropiastre vengono lavate con tampone fosfato ed i relativi pozzetti vengono riempiti con soluzioni contenenti IgG, preferibilmente derivatizzate con biotina. Le micropiastre vengono poi incubate a 20-37°C per altre 4-18 ore.
Il lavaggio della fase 3 viene preferibilmente eseguito con tampone fosfato.
Infine, la fase 4 viene condotta aggiungendo ad ogni pozzetto una soluzione di avidine coniugate a perossidasi. Dopo 2 ore di incubazione le micropiastre vengono nuovamente lavate accuratamente con tampone fosfato. Viene quindi aggiunta una soluzione di o-fenilendiammina e si registra la formazione di colore con un adatto lettore di micropiastre.
Queste ed altre caratteristiche della presente invenzione risulteranno più evidenti dagli esempi che seguono e dalle allegate figure in cui:
- la Figura 1 mostra il legame delle IgG di coniglio biotinilate a micropiastre per determinazioni ELISA derivatizzate con il Composto di formula (I) in cui Χ', X" e Y sono H (Composto 1) a diverse concentrazioni e, per confronto, il legame delle IgG di coniglio biotinilate a piastre derivatizzate con Proteina A;
- la Figura 2 illustra il legame di IgG murine, dei sottotipi lgG2A e IgG1B, a piastre derivatizzate con il Composto 1; - la Figura 3 illustra la purificazione di immunoglobuline di coniglio da siero grezzo mediante cromatografia di affinità su una colonna preparata immobilizzando il Composto 1.
Per la sintesi dei Composti di formula (I) in fase solida, è stato utilizzato un sintetizzatore automatico della Applied Biosystems (Poster City, CA, USA) - modello 431 A, software version 1.1 - seguendo La procedura di sintesi consigliata dal costruttore e che si basa su metodiche note e già riportate in letteratura (Atherton S Sheppard, 1989, Solid Phase Pepetide Synthesi s: A practical Approach, IRL Press, Oxford).
Negli esempi che seguono l'abbreviazione "Cat No." sta da indicare "numero di catalogo".
I Composti 1 e 2 sono stati preparati partendo da una resina per sintesi peptidica acido labile prederivatizzata con glieina (resina clorotritilicloridrica NOVABIOCHEM Cat No. 04-12-2800, 0,1 mmoli) protetto al gruppo amminico N-terminale dal gruppo Fmoc che, nel primo ciclo di sintesi, è stato deprotetto mediante trattamento con 3,0 mi di piperidina al 20% in N-metil-pirrolidone (ABI Cat No. 400629) per 14 minuti a temperatura ambiente sotto agitazione.
La resina deprotetta è stata poi lavata 5 volte con 2,5 mi di N-metil-pirrolidone (Merck Cat. No. 806072) per 9 minuti sotto agitazione, a temperatura ambiente.
Nel frattempo il residuo aminoacidico in posizione 2 al C-terminale (1 mmole) è stato preattivato mediante incubazione con 1 mi di HOBt 1 M sciolto in N-metil-pirrolidone (ABI Cat. No. 400662) e 1 mi di 1 M dicicloesilcarbodiimide in N-metilpirrolidone (ABI Cat. No. 400663).
L'aminoacido attivato è stato incubato con la resina per 51 minuti sotto costante agitazione. La resina è stata poi lavata con N-metil-pirrolidone (4 Lavaggi di 0,5 minuti con 2 mi). A questo punto La resina è stata sottoposta ad un secondo cicLo di deprotezione con piperidina e di accoppiamento dell'aminoacido successivo. Questa procedura è stata ripetuta in maniera sequenziale per tutti i residui aminoacidici compresi neLLe sequenze riportate più sopra. In particolare sono stati usati i seguenti derivati aminoacidici: Fmoc-LysCFmoc) (Novabiochem Cat. No. 04-12-1085-1662), FmocArg(Pmc) (Novabiochem Cat. No.
04-12-1073) ; Fmoc-Thr(OtBu) (Novabiochem Cat. No. 04-121000); Fmoc-Tyr(OtBu) (Novabiochem Cat. No. 04-12-1037). Dopo aver completato La sintesi e dopo aver rimosso iL gruppo Fmoc N-terminale mediante trattamento con piperidina, La resina è stata Lavata con metanolo, dicLorometano, e di nuovo con metanoLo, e seccata accuratamente sotto vuoto per 12 ore.
Per La preparazione deL Composto 1, iL peptide è stato rimosso daLLa resina incubando 100 mg di resina con 5 mL di una miscela costituita da acido trifLuoroacetico (Pierce cat No.
28901)/fenolo (CarLo Erba Cat. No. 451285)/acqua (Merck Cat. No. 15333)/etanditioLo (ALdrich Cat No. E 360-0)/tioanisolo (ALdrich Cat. No. T 2.800-2) 84:4:3:3:3 per 2 ore a temperatura ambiente sotto agitazione. La resina è stata poi filtrata su filtro in vetro sinterizzato. IL filtrato è stato ridotto di volume a pochi mL mediante evaporazione sotto vuoto ed il Liquido residuo è stato poi trattato con 50 mi di etere etilico freddo. IL materiale peptidico cosi precipitato è stato separato mediante centrifugazione ed il centrifugato è stato risospeso in 25 mi di acqua/ acetonitriLe/acido t rifluoroacetiCO 50:50:0,1, congelato e liofilizzato- Infine, il liofilo è stato purificato da contaminanti mediante cromatografia ad alte prestazioni (HPLC) utilizzando una colonna Lichrospher RP-8 (25 X 1 cm I.D.) (Merck Cat. No. 150153), equilibrata ad un flusso di 3 ml/min con acqua/ acetonitri le/acido trif luoroacetico 95/5/0,1, ed eluendo con un gradiente lineare di acetonitrile variante dal 5% al 80X in 55 minuti. Il materiale corrispondente al picco principale è stato raccolto, congelato e liofilizzato .
IL Composto 2 è stato preparato trattando la resina, alla fine della sintesi, con una miscela di sblocco costituita da acido acetico (Merck Cat. No. 63), dicLorometano (Merck Cat. No. 6050) ed etanolo (Merck Cat. No. 8006) in rapporto 80:10:10 v/v.
Questo trattamento consente il distacco del peptide dalla resina ma non dei gruppi protettori delle catene laterali degli aminoacidi .
Il Composto 2 è stato poi sottoposto agli stessi trattamenti di precipitazione con etere etilico e purificazione mediante RP-HPLC.
L'identità dei Composti 1 e 2 cosi ottenuti è stata confermata mediante determinazione
- della composizione amino acidica,
- del residuo N-terminale
- del peso molecolare (spettrometria di massa).
ESEMPI0_2
interazione delComposto 1 con immunoglobuline Micropiastre per determinazioni ELISA (Falcon Cat No. 3912) sono state trattate con iL Composti 1 in concentrazione da 0 a 50 pg/ml in tampone sodio bicarbonato pH 9,0 per 12 ore a 4°C. Le piastre sono state lavate con un tampone sodio fosfato 150 mM, pH 7,2 (PBS) e poi, ad ogni pozzetto delle micropiastre, sono stati aggiunti 200 mi di una soluzione di PBS contenente il 3% di albumina di siero bovina (BSA, Sigma Cat. No. a-4503). Dopo un'ora, le piastre sono state ancora lavate per 4 volte con PBS ed ogni pozzetto è stato riempito con soluzioni (100 pi) contenenti igG di coniglio (Sigma Cat. No. I 5006) derivatizzate con biotina, a seconda dei casi, in concentrazioni variabili da 0 a 10 pg/ml. Dopo un'incubazione di 2 ore, le piastre sono state lavate nuovamente con PBS 8 volte e, successivamente, ad ogni pozzetto, sono stati aggiunti 100 ul di una soluzione di streptavidina coniugata a perossidasi (Sigma Cat. No. S 5512) diluita 1:100 con PBS contenente 3% BSA. Dopo un'ora le piastre sono state nuovamente lavate con PBS. Poi ogni pozzetto è stato riempito con 100 pi di una soluzione 1 mg/ml di o-fenilendiamina (Sigma P 6912) in 0,1 M sodio citrato, e 5 mM perossido di idrogeno. Dopo circa 30 minuti. La reazione di sviluppo è stata bloccata mediante l'aggiunta di 25 mi di acido solforico 4,5 M. L'assorbanza a 490 nm di ogni pozzetto è stata determinata mediante un Lettore di piastre (Merck , Mod. MIOS). Le specificità delL'interazioni osservate sono state determinate mediante studi di inibizione, incubando il Composto 1 o La proteina biotinilati in presenza di concentrazioni variabili di competitori non marcati. La vaLutazione preliminare delle capacità di interazione del Composto 1 è stata condotta misurando l'associazione di immunoglobuline di coniglio derivatizzate con biotina a micropiastre per determinazioni ELISA prederivatizzate con il Composto 1 della presente invenzione.
Come riportato in Figura 1, le immunoglobuline si associano al Composto 1 immobilizzato in maniera dose dipendente.
L'interazione risulta inibibile in presenza di Composto 1 in soluzione.
Peptidi di controllo (8SA, o un peptide scorrelato) non sono risultati in grado di inibire l'interazione.
Risultati analoghi sono stati ottenuti con il Composto 2. Analoghi risultati sono anche stati ottenuti con IgG di altre specie come ratto, capra, topo, e con IgA umane.
In particolare, si è constatato che i Composti 1 e 2 legano anche Le IgG di topo delle sottoclassi 1 e 2.
ESEMPI0_3
Immgbilizzazione del Composto 2 su Eupergit C30_N e piri ficazione di immunoglobuline da sieri mediante cromatografia di affinità
I L Composto 1 (5 mg) è stato sciolto in 5 mi di tampone sodio bicarbonato 0,1 M pH 9,0 e poi aggiunto a 1,2 g di resina Eupergit C30 N (Sigma Cat. No. 0 9879 ), supporto per cromatografia di affinità preattivato con gruppi epossidici per L'accoppiamento diretto di peptidi e proteine. La sospensione è stata posta in agitazione per 24 ore e L'entità dell'accoppiamento è stata monitorata mediante preLievi della misceLa di reazione a tempi diversi e successiva analisi mediante RP-HPLC. Dopo 24 ore, risultava legato covalentemente al supporto circa L'85% della quantità iniziale di Composto 1.
La resina derivatizzata è stata lavata con 50 mi di TRIS 1 M pH 9,0 e poi impaccata su una colonna in vetro delle dimensioni di 100 x 6,6 mm I.D..
Per la di purificazione di immunoglobuline, la colonna è stata equilibrata con un tampone TRIS 50 mM pH 7,0, ad un flusso di 1 ml/min, monitorando l'eluente a 280 nm. Un millilitro di siero grezzo di coniglio (Sigma Cat. No. R 9133), contenente IgG impura per la presenza di albumine di siero in quantità predominante, è stato poi applicato in colonna e dopo l'eluizione del materiale non trattenuto al volume morto della colonna, L'eluente è stato cambiato in acido acetico 0,1 M. Il materiale desorbito da tale trattamento è stato raccolto ed analizzato mediante analisi elettroforetica su gel di poliacrilammide.
La Figura 3 illustra la purificazione di immunoglobuline di conig l io da siero grezzo mediante cromatografia di affinità e l'analisi elettroforetica delle frazioni raccolte.
Come chiaramente evidenziato dall'analisi elettroforetica, la colonna è stata in grado di trattenere la frazione immunoglobulinica del siero grezzo mentre le albumine non sono state trattenute ed sono state eluite al volume morto della colonna. Più in particolare, nella frazione trattenuta erano presenti solo piccolissime tracce di albumine.
Risultati analoghi sono stati ottenuti con il Composto 2. La selettività di questa colonna è risultata almeno pari a quella di colonne di proteina A immobilizzata. Infatti, la purificazione dello stesso tipo di siero con colonne, delle stesse dimensioni, di proteina A hanno dato frazioni purificate contenenti sempre tracce di albumine.
Risultati analoghi sono stati ottenuti, con colonne contenenti i Composti 1 e 2 immobilizzati, nell'isolamento di IgG di ratto, topo, capra e di uomo dai rispettivi sieri.
Claims (16)
- RIVENDICAZIONI 1 . Un composto di formula: X ' ed X", uguali o diversi fra loro, sono H o un composto scelto dal gruppo dei composti comunemente usati nella chimica dei peptidi per proteggere l'ossidrile, Y è H o un composto scelto dal gruppo dei composti comunemente usati nella chimica dei peptidi per proteggere il gruppo funzionale guanidinico del l'arginine.
- 2. Un composto secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che X', X" ed Y sono idrogeno.
- 3. Un composto secondo La rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che X'ed X” sono tBu ed Y è Pmc. A.
- Un procedimento per preparare un composto di formula CI) come indicato neLLa rivendicazione 1, caratterizzato dalle seguenti fasi: a) accoppiamento di un residuo di glieina ad un supporto acido- labile per sintesi peptidica in fase solida, b) successivo accoppiamento di un residuo di lisina attivabile nei suoi gruppi funzionali alfa ed epsilon amminici; c) ulteriore accoppiamento di un residuo di lisina attivabile nei suoi gruppi funzionali alfa ed epsilon amminici; d) accoppiamento sequenziale di residui di tirosina protetta al gruppo ossidrilico, treonina protetta al gruppo ossidrilico ed arginina protetta al gruppo guanidinico; e) sblocco del peptide dalla resina in maniera da ottenere il peptide in forma protetta; e f) quando lo si desidera, sblocco delle funzioni ossidriliche e/o guanidiniche del peptide.
- 5. Un metodo per separare e purificare un'immunoglobulina che comprende (i) l'immobilizzazione su un supporto per cromatografia di affinità di un composto capace di Legarsi non covalentemente ad almeno una immunoglobulina. (i i ) l ' i mpaccamento della resina cosi ottenuta in una colonna cromatografica, (iii) L'equiLibrazione della colonna con un tampone capace di favorire la formazione del Legame immunoglobulina/ composto immobilizzato, (iv) il caricamento della colonna con un fluido contenente almeno una immunoglobulina, (v) il lavaggio della colonna con almeno un liquido capace di eluire le impurezze senza però interferire sul legame immunoglobulina/composto immobilizzato, (vi) l'eluizione della immunoglobulina precedentemente adsorbita dalla colonna mediante un eluente dissociente, ed è caratterizzato dal fatto che: il composto capace di legarsi non covalentemente ad almeno una immunoglobulina è un Composto di formula (I) secondo la rivendicazione 1.
- 6. Un metodo secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che il supporto per cromatografia di affinità è del tipo preattivato con gruppi epossidici per l'accoppiamento diretto di peptidi e proteine.
- 7. Un metodo secondo la rivendicazione 5 o 6, caratterizzato dal fatto che il supporto per cromatografia di affinità è la resina Protein-Pak.
- 8. Un metodo secondo la rivendicazione 5 o 6, caratterizzato dal fatto che il supporto per cromatogra f i a di affinità è la resina Eupergit C30 N.
- 9. Un metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 ad 8, caratterizzato dal fatto che La fase (i) viene condotta in presenza di una soluzione tampone basica.
- 10. Un metodo secondo La rivendicazione 9, caratterizzato dal fatto che si opera ad un pH compreso fra 8,5 e 9,0.
- 11. Un metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 10, caratterizzato dal fatto che la fase (iii) viene condotta in presenza di una soluzione tampone neutra.
- 12. Un metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 11, caratterizzato dal fatto che la fase (v) viene condotta in presenza di una soluzione tampone avente un pH compreso fra 5,5 e 7,5.
- 13. Un metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 12, caratterizzato dal fatto che l'eluente usato nella fase (vi) è una soluzione acquosa acida o basica.
- 14. Un metodo secondo La rivendicazione 13, caratterizzato dal fatto che l'eluente è una soluzione acquosa di acido acetico avente pH 2,5, circa.
- 15. Un metodo secondo la rivendicazione 13, caratterizzato dal fatto che l'eluente è una soluzione acquosa di bicarbonato di sodio avente pH 9, circa.
- 16. Un metodo di determinazione quantitativa di una immunoglobulina o di una miscela di immunoglobuline che comprende: (1 ) l 'immobilizzazione su una micropiastra per determinazioni ELISA di un composto capace di legarsi non covalentemente ad dimeno una immunogLobuLina, (2) L'incubazione suLLa micropiastra di un campione contenente La o Le immunoglobuline da determinare, (3) iL Lavaggio deLLa micropiastra, e (4) La rivelazione deL complesso composto immobiLizzato/immunoglobulina. ed è caratterizzato dal fatto che: iL composto capace di Legarsi non covaLentemente ad almeno una immunogLobuLina è un Composto di formula (I) secondo La rivendicazione 1.
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| Publication number | Publication date |
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| ITMI951328A0 (it) | 1995-06-21 |
| IT1276761B1 (it) | 1997-11-03 |
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|---|---|---|---|
| 0001 | Granted |