ITBO970655A1 - Oligopeptidi antiparalleli e oligopeptidi idrofobicamente complementari, matrici che li contengono e loro uso nella purificazione e nella rivelazione di sottotipi di interferone alfa. - Google Patents
Oligopeptidi antiparalleli e oligopeptidi idrofobicamente complementari, matrici che li contengono e loro uso nella purificazione e nella rivelazione di sottotipi di interferone alfa. Download PDFInfo
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Description
Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo:
“Oligopeptidi antiparalleli e oligopeptidi idrofobicamente complementari, matrici che li contengono e loro uso nella purificazione e nella rivelazione di sottotipi di interferone alfa.”
RIASSUNTO DELL'INVENZIONE
Oligopeptidi antiparalleli e oligopeptidi complementari dal punto di vista idrofobico, le cui sequenze sono determinate opportunamente in modo da risultare affini per alcuni sottotipi di interferone alfa, in particolare per il sottotipo Hu-IFNα8, processo per la purificazione di alcuni sottotipi di interferone alfa mediante l’uso di fasi stazionarie solide costituite da matrici inerti sulle quali sono chimicamente legati detti oligopeptidi e metodo per la rivelazione di alcuni sottotipi di interferone alfa con l’uso di detti oligopeptidi in metodiche tipo ELISA e immunoblotting.
AMBITO DELL’INVENZIONE
L’interferone alfa umano (Hu-IFNα) è composto da una miscela di proteine prodotta dai leucociti umani quando questi vengono a contatto con agenti estranei quali ad esempio virus e batteri. Fino ad ora sono state identificate tredici distinte proteine, denominate sottotipi di Hu-IFNα, che vengono indicate da Alien, G. e Diaz, M.O., J. Interferon Res. 14, 223-226, (1994) come: Hu-IFNα1, Hu-IFNα2, Hu-IFNα4, Hu-IFNα5, Hu-IFNα6, Hu-IFNα7, Hu-IFNα8, Hu-IFNαlO, Hu-IFNαl4, Hu-IFNαl6, Hu-IFNαl7, Hu-IFNα21 e Hu-IFNω , quest’ultima denominata anche Hu-IFNα di tipo II. Queste proteine sono tutte costituite da 166 aminoacidi, eccetto Hu-IFNα2 che ne ha 165 e Hu-IFNtù che ne ha 172. Nella determinazione con il metodo della elettroforesi in gel di poliacrilamide con il 15% di bis-acrilamide in condizioni denaturanti ed in presenza di sodio dodecilsolfato (SDS-PAGE) i sottotipi di Hu-IFNα mostrano pesi molecolari apparenti che vanno da 18000 a 28000 Daltons e soltanto i sottotipi Hu-IFNα2, Hu-IFNαl4 e HU-IFNω risultano glicosilati.
Hu-IFNα esercita una molteplicità di attività biologiche che possono essere riassunte nelle attività antivirale, antiproliferativa ed immunostimolante (Baron S. et al.. Interferon, Principles and Medicai Applications, The University of Texas, Medicai Branch of Galveston, Department of Microbiology, Galveston, TX, 1992.). I sottotipi di Hu-IFNα si distinguono in tale ambito mostrando delle diversità talora marcate, per cui risulta che taluni di essi hanno una più marcata attività antivirale, altri un’attività antiproliferativa, mentre alcuni addirittura sono antagonisti di altri nell’attività immunostimolante [Visconti C. G., et al.. Medicinal Research Reviews 15, 445-478, (1995)].
Sulla base delle attività biologiche indicate risulta evidente come Hu-IFNα oppure i singoli sottotipi possano esplicare importanti attività farmacoterapeutiche riassumibili nelle azioni antivirale, antiproliferativa ed immunostimolante nelle patologie ad eziologia virale, quali epatiti, papillomatosi, infezioni da herpes, adenovirus e nelle azioni antiproliferativa ed immunostimolante nel trattamento di patologie tumorali.
Di fatto Hu-IFNα ed alcuni suoi singoli sottotipi, in particolare la forma ricombinante di IFNα2, sono registrati praticamente in tutto il mondo per la terapia di patologie del sistema linfatico ed emopoietico, dei tumori solidi e di patologie ad eziologia virale. In particolare Hu-IFNα è prevalentemente prescritto per epatiti B, C e D, papillomatosi, leucemia a cellule capellute, leucemia mieloide cronica, mieloma multiplo, carcinoma renale, linfoma non Hodgkin correlato ad AIDS, melanoma maligno.
In considerazione del largo impiego clinico di Hu-IFNα e della possibile diversificazione dell’azione farmacologica dei sottotipi di Hu-IFNα risulta importante disporre di sistemi preparativi che siano in grado di purificare selettivamente i sottotipi di Hu-IFNα e di sistemi analitici che siano in grado di rivelare selettivamente la loro presenza anche in presenza di complesse miscele proteiche.
Attualmente la cromatografia di immunoaffinità che si basa sull’uso di anticorpi mono e/o policlonali è la tecnica più utilizzata per ottenere la purificazione di proteine. Questi anticorpi sono altresì largamente utilizzati in sistemi di rivelazione analitica ed in diagnostica clinica, quali i sistemi ELISA oppure immunoblotting di SDS-PAGE.
L’uso degli anticorpi presenta tuttavia una serie di svantaggi che ne limitano l’applicazione: difficoltà di produzione a bassi costi, difficoltà di gestione di molecole sensibili all’azione di agenti biologici, quali ad esempio gli enzimi, di agenti chimici, quali ad esempio acidi, basi, agenti ossidanti e solventi organici, di agenti fisici, quali ad esempio la temperatura ed i raggi UV, rischio di contaminazioni biologiche derivanti da patogeni presenti nelle cellule di ibridomi o negli animali che producono anticorpi, quali ad esempio retrovirus ed agenti responsabili delle encefalopatie.
In alternativa è noto che peptidi codificati da una sequenza di RNA sono affini per quelli codificati dalla sequenza antiparallela corrispondente, detti peptidi AP, e possono essere utilizzati nei processi di purificazione delle proteine come descritto nel brevetto italiano IT 1243419.
Inoltre è anche noto che l’affinità tra i peptidi ed i corrispondenti peptidi AP può essere ulteriormente migliorata se la sequenza di questi ultimi viene opportunamente modificata in modo tale che i profili idropatici risultanti siano il più possibile speculari rispetto ai peptidi su cui le sequenze sono costruite [G. Fassina et al.. J. Biol. Chem., 264, 11252, (1989)], i peptidi così modificati sono definiti peptidi idrofobici complementari (IC).
Rispetto agli anticorpi mono e/o policlonali i peptidi AP e IC offrono notevoli vantaggi perché mantengono la selettività tipica degli anticorpi ma, essendo di origine chimica, sono più controllabili dal punto di vista analitico, meno costosi, più rapidi a prepararsi anche in grandi quantità e sicuri dal punto di vista del rischio di contaminazioni biologiche.
Il sottotipo Hu-IFNα8 è risultato essere il composto a più alta attività specifica antivirale tra tutti i sottotipi di Hu-IFNα ed è inoltre risultato che la traduzione del segnale delTHu-IFNα8 avviene attraverso un meccanismo diverso da quello degli altri sottotipi anche se il recettore dei leucociti umani riconosciuto da tale sottotipo è identico a quello degli altri sottotipi di Hu-IFNα [Foster G. R. et al.. J. Interferon Res., 16, 1027-1033, (1996)].
L’elevata e specifica attività antivirale ed il diverso meccanismo di induzione rendono importante disporre di significative quantità di Hu-IFNα8, per cui processi e prodotti che permettono la sua estrazione da miscele intere di Hu-IFNα e la sua rivelazione sono di particolare valore. E’ da sottolineare che procedere all’ ottenimento di Hu-IFNα8 partendo da miscele di Hu-IFNα è particolarmente importante in quanto è stato dimostrato da Foster G. R. et al., J. Interferon Res., 16, 1027-1033, (1996) che i corrispondenti prodotti di Hu-IFNα8 ottenuti con la tecnologia del DNA ricombinante hanno mostrato attività biologiche inferiori al sottotipo naturale.
DESCRIZIONE DELL 'INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce ad oligopeptidi la cui sequenza è stata definita in modo tale da risultare oligopeptidi antiparalleli, peptidi AP, o oligopeptidi idrofobici complementari, peptidi IC, delle sequenze aminoacidiche 142-151 di Hu-IFNα e HU-IFNω , di seguito indicati rispettivamente come IFNα-AP, IFNω -AP, IFNα-IC e IFNω -IC.
Nonostante la sequenza aminoacidica 142-151 di Hu-IFNα sia identica in tutti i sottotipi di Hu-IFNα, i peptidi IFNα-AP, IFNω -AP, IFNα-IC e IFNω -IC risultano inaspettatamente essere affini, sia in soluzione che legati a supporti solidi, solo per alcuni sottotipi di Hu-IFNα, in particolare per il sottotipo Hu-IFNα8. Essi pertanto possono essere utilizzati, quando legati a opportune matrici su supporti solidi, in cromatografìa di affinità per la separazione e purificazione del sottotipo Hu-IFNα8. Inoltre, quando opportunamente funzionalizzati, possono essere utilizzati per il riconoscimento specifico di Hu-IFNα8 in tecniche analitiche quali la rivelazione di composti separati in SDS-PAGE e trasferiti su fogli di nitrocellulosa (SDS-PAGE-blotting) oppure la rivelazione di composti immobilizzati su supporti solidi (enzyme linked immuno sorbent assay o ELISA).
Pertanto le matrici su supporti solidi per cromatografia di affinità cui sono legati gli oligopeptidi EFNα-AP, IFNω -AP, IFNα-IC e IFNω -IC ed il loro uso nella separazione e purificazione della proteina Hu-IFNα8 costituiscono un ulteriore oggetto dell’ invenzione.
I supporti solidi preferiti nell’ attuazione dell’invenzione sono costituiti da resine polimeriche a base di acrilamide o di agarosio.
Inoltre gli oligopeptidi IFNα-AP, IFNω -AP, IFNα-IC e IFNω -IC funzionalizzati con biotina ed il loro uso nell’analisi delle miscele di Hu-IFNα e nel riconoscimento dell’Hu-IFNα8 in dette miscele secondo le procedure previste dai metodi di rivelazione ELISA e SDS-PAGE-blotting costituiscono un ulteriore oggetto dell’invenzione.
Infine anche le composizioni farmaceutiche contenenti il sottotipo Hu-IFNα8 ottenuto da processi di separazione e purificazione che prevedono l’uso di matrici su supporti solidi per cromatografia di affinità contenenti i suddetti oligopeptidi costituiscono scopo della presente invenzione.
I peptidi AP oggetto della presente invenzione presentano le seguenti sequenze: 1. IFNα-AP: H-Gly-Ser-His-Asp-Phe-Cys-Ser-Asp-Asn-Leu-OH
2. IFNω -AP: H-Gly-Phe-His-Asp-Phe-His-Ser-Asp-Asn-Phe-OH Due dei peptidi IC oggetto della presente invenzione presentano le seguenti sequenze, determinate mediante un processo di approssimazioni successive cambiando di volta in volta i residui sino ad ottenere la migliore complementarietà idropatica, basandosi sui valori di idrofobicità degli aminoacidi riportati da Kyte J. e Doolittle R. F. [J. Mol. Biol., 157. 105-132, (1982)]:
3 . IFN α-IC-KD : H-Ile- Arg-Ser-T y r-Pro-Leu-Phe-Hi s-Pro- Giu- V al-Phe-T y r-Arg-OH
4. IFNω -IC-KD: H-Phe-Arg-Ala-Gly-Thr-Ala-Gly-Gln-Met-Tyr-Ala-Thr-Gly-Arg-OH
I restanti due peptidi IC oggetto della presente invenzione, preparati basandosi sui valori di idrofobicità riportati da Chothia C. [J. Mol. Biol., 105. 1-14, (1976)], presentano le seguenti sequenze:
5. IFNα-IC-Ch: H-Val-Glu-Gly-Ser-His-Asp-Phe-Ser-Ser-Lys-Gly-Cys-Gly-Arg-OH
6. IFNω -IC-Ch: H-Gly-Gln-Gly-Phe-His-Asp-Phe-Ser-Ser-Lys-Ser-Leu-Gly-Arg-OH
I peptidi sono stati sintetizzati in forma octamerica su una catena ramificata di 7 residui di lisina (figura 1) mediante la sintesi in fase solida dei peptidi secondo le procedure descritte da Atherton E. e Sheppard R. C., Solid phase peptide synthesis, a practical approach, pubblicato da IRL PRESS, Oxford, New York e Tokyo, pp. 25-37 (1989).
sequenza del peptide AS o IC
Lys
sequenza del peptide AS o IC
sequenza del peptide AS o IC
Lys
sequenza del peptide AS o IC
Lys
sequenza del peptide AS o IC
Lys
sequenza del peptide AS o IC
Lys
sequenza del peptide AS o IC
Lys
sequenza del peptide AS o IC
FIGURA 1
I peptidi dal numero 1 al numero 6, terminata la sintesi, sono stati legati ciascuno ad un supporto solido utile per cromatografie di affinità, preferibilmente costituito da una resina polimerica a base di acrilamide o di agarosio, e ciascuna matrice così funzionalizzata è stata impaccata in una colonna cromatografica sulla quale, a pH neutro, è stata fatta passare una miscela di Hu-IFNα con un’attività specifica compresa tra 1 e 100 x 10 <5 >unità intemazionali per milligrammo di proteine totali (Ul/mg) e con una concentrazione in Hu-IFNα compresa tra 0,1 e 5 x 10<6 >UI. Dopo la carica la colonna è stata lavata con una soluzione 0,1 M di fosfato sodico bibasico e 0,5M di cloruro sodico a pH neutro e quindi il materiale rimasto legato al supporto solido dopo i lavaggi è stato eluito con una soluzione acquosa acida a pH 2, ad esempio una soluzione acquosa contenente 0,1 % di acido tri fluoroacetico oppure una soluzione acquosa 0,1 M di acido citrico.
Il prodotto così eluito dalla colonna è stato quindi analizzato in SDS-PAGE con colorazione argentica ed in immunoblotting usando anticorpi monoclonali specifici per Hu-IFNα ed è risultato che i prodotti eluiti da detta cromatografia avevano un peso molecolare compreso tra 27 e 28 kDaltons, specifico del sottotipo Hu-IFNα8, che tali prodotti erano di origine interferonica in quanto erano riconosciuti da anticorpi specifici per Hu-IFNα, che avevano un’attività antivirale tipica di Hu-IFNα, determinata misurando Γ inibizione dell’effetto citopatico del virus VSV su cellule MDBK seguendo il metodo di Armstrong J. A. [Meth. in Enzymol., 78, 381-387, (1981)] e che nella cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa (RP-HPLC) si otteneva un picco coincidente nel tempo di ritenzione con uno standard di Hu-IFNα8.
Hu-IFNα8 è stato ulteriormente purificato per eluizione su una colonna di esclusione molecolare con taglio molecolare di 10.000 Daltons e successiva liofilizzazione dell’eluato.
Hu-IFNα8 così ottenuto può essere vantaggiosamente utilizzato per la preparazione di composizioni farmaceutiche utili per il trattamento di malattie virali e di affezioni tumorali.
Composizioni farmaceutiche per uso parenterale vengono preparate solubilizzando da 0,1 a 20 milioni di Ul/ml di Hu-IFNα8 in soluzioni acquose fisiologiche sterili contenenti albumina umana serica quale stabilizzante di proteine.
I peptidi dal numero 1 al numero 6 sono stati inoltre funzionalizzati con la biotina ed i prodotti risultanti sono stati usati per l’analisi di miscele di Hu-IFNcx separate in SDS-PAGE e trasferite su di un foglio di nitrocellulosa. Le bande sulle quali i peptidi funzionalizzati si erano legati sono state evidenziate usando una soluzione contenente opportuni composti coniugati ad enzimi quali ad esempio, la streptavidina coniugata con la perossidasi, che a seguito di una reazione colorimetrica colorano la banda.
I peptidi dal numero 1 al numero 6 funzionalizzati con la biotina sono stati usati anche per il riconoscimento della presenza di Hu-IFNα8, quando questo è immobilizzato da solo od in miscele di Hu-IFNα in piastre a pozzetti quali quelle normalmente usate per i saggi di tipo ELISA. Come nel caso precedente soluzioni contenenti opportuni composti coniugati ad enzimi quali, ad esempio, la streptavidina coniugata alla perossidasi, sono stati usati per la colorazione dei pozzetti contenenti Hu-IFNα8.
Gli esempi seguenti riportano, a fine illustrativo ma non limitativo, la preparazione e l’uso dei peptidi AP e IC secondo l’invenzione e composizioni farmaceutiche contenenti Hu-IFNα8.
ESEMPIO 1
Sintesi del peptide IFNα-AP (sequenza del monomero: H-Glv-Ser-His-Asp-Phe-Cvs-Ser-Asp-Asn-Leu-OH)
La sintesi del peptide è stata eseguita in fase solida trattando 2 g di resina poliacrilamidica con 20 mi di 1,6-esandiamina a 50°C per 12 ore. La resina risultante è stata posta in una colonna del diametro di 3 cm con setto poroso nell’estremità terminale ed è stata lavata con Ν,Ν-dimetilformamide per 60 minuti al flusso di 4 ml/min. Tale flusso è stato mantenuto costante in tutte le operazioni successive.
La resina è stata quindi funzionalizzata con 0,6 mM di 1-idrossibenzotriazolo in 4 mi di Ν,Ν-dimetilformamide e 0,6 mM di 2,4,5-trifluorofenil-4-idrossimetilfenossiacetato in 4 mi di Ν,Ν-dimetilformamide. La resina così trattata ha mostrato una funzionalizzazione pari a 0, 1 milliequivalenti/g.
I residui aminoacidici sono stati introdotti tutti protetti all’ α-amino gruppo con il fluorenilmetossicarbonile. Gli esteri del pentafluorofenolo di tutti gli aminoacidi (0,3 mM in 4 mi di Ν,Ν-dimetilformamide) sono stati utilizzati per la condensazione peptidica in presenza di 0,3 mM di 1-idrossibenzotriazolo.
Le funzioni in catena laterale dei residui dell’acido aspartico sono state protette con tert-butilestere, quelle dell’istidina e della lisina con tert-butilossicarbonile, quelle della serina con tert-butiletere, quella della cisteina con tert-butiltioetere. Gli esteri attivi sono stati sciolti in Ν,Ν-dimetilformamide immediatamente prima dell’aggiunta alla resina e la reazione di acilazione è stata condotta a temperatura ambiente per 60 minuti in condizioni di riciclo.
Fra una reazione di acilazione e la successiva la resina è stata lavata con N,N-dimetilformamide per 10 minuti e quindi è stata posta a contatto con una soluzione al 20% di piperidina in Ν,Ν-dimetilformamide per 10 minuti per rimuovere il gruppo protettore fluorenilmetossicarbonile ed infine è stata lavata di nuovo con Ν,Ν-dimetilformamide per 10 minuti.
Dopo ciascuna reazione di acilazione, il completamento della reazione è stato verificato con il test della ninidrina [Kaisen E. et al.. Anal. Biochem., 34, 595, (1970)] ed il test dell’acido trinitrobenzen solfonico [Hancock W. S. et al.. Anal. Biochem., 71, 261, (1976)].
Nel caso in cui dopo 30 minuti dall’aggiunta del derivato aminoacidico la reazione non fosse stata completata e fossero esistiti gruppi aminici liberi, si aggiungeva di nuovo il pentafluorofenolestere dell’ aminoacido nelle stesse quantità usate in precedenza, ripetendo il saggio per determinare la completezza della reazione.
Terminata l’aggiunta dei residui aminoacidici nell’ ordine appropriato, la resina è stata trattata con 10 mi di una soluzione al 95% di acido tri fluoroacetico e all’1% di ani solo in diclorometano, ottenendo così lo sblocco del peptide dalla resina e contemporaneamente la rimozione di tutti i gruppi protettori delle catene laterali.
I solventi sono stati rimossi per evaporazione sotto vuoto ed il peptide è stato ripreso in 5 mi di acqua e parzialmente purificato mediante una cromatografia di esclusione molecolare utilizzando una resina con un taglio molecolare di 2000 Daltons (colonna da 40x2cm, flusso pari a 0,5 ml/min. ed eluente soluzione acquosa 0,05M di ammonio cloruro).
II picco contenente il peptide è stato liofilizzato, ripreso in 20 mi di una soluzione acquosa 0,01 M di bicarbonato d’ammonio e cromatografato su di una colonna a scambio anionico, dietilaminoetil Sephadex, usando come eluente una soluzione acquosa di ammonio bicarbonato con un gradiente lineare da 0,01 a 0,5 M in 10 ore (colonna 15x1 cm; flusso pari a 0,5 ml/min.). Le frazioni contenenti il prodotto principale sono state riunite e liofilizzate. Il residuo è stato ripreso in 5 mi di una soluzione acquosa allo 0,1% di acido trifluoroacetico ed è stato ulteriormente purificato mediante una cromatografia in fase inversa con un gradiente di acetonitrile in una soluzione acquosa allo 0,1% di acido trifluoroacetico dallo 0% al 90% di acetonitrile in un’ora (colonna Vydac CI 8 da 250x10 mm, flusso pari a 3 ml/min.) raccogliendo il picco principale che ha mostrato la seguente analisi degli aminoacidi:
Gly, 7,83 (8,00); Ser, 14,75 (16,00); His, 7,52 (8,00); Asx, 25,60 (24,00); Phe, 7,76 (8,00); Cys, 6,85 (8,00); Leu, 8,00 (8,00); Lys 7,50 (7,00).
Il prodotto è stato analizzato anche in elettroforesi capillare (capillare in silice fusa di 47 cm, lunghezza al rivelatore UV 40 cm, 0 75 pm, voltaggio costante a 20 kV con un eluente costituito da una soluzione acquosa 0,1 M di acido fosforico e fosfato sodico monobasico a pH 2,5) ottenendo un tempo di migrazione elettroforetica pari a 8,33 minuti.
ESEMPIO 2
Sintesi del peptide IFNω -IC-Ch (sequenza del monomero: H-Glv-Gln-Glv-Phe-His-Asp-Phe-Ser-Ser-Lvs-Ser-Leu-Glv-Arg-QID
La sintesi e la purificazione del peptide sono state eseguite con modalità uguali a quelle descritte nell’esempio 1.
Le funzioni in catena laterale dei residui dell’acido aspartico e dell’acido glutammico sono state protette con il tert-butilestere, quelle della lisina e dell’istidina con il tert-butilossicarbonile, quelle della serina con il tert-butiletere e quelle dell’arginina con il 4-metossi-2,3,6-trimetilbenzensulfonile.
Dall’ analisi degli aminoacidi sono risultati i seguenti valori:
Gly, 22,99 (24,00); Ser, 21,78 (24,00); His, 6,78 (8,00); Asx, 7,34 (8,00); Phe, 7,50 (8,00); Arg, 6,85 (8,00); Leu, 8,00 (8,00); Lys 17,6 (15,00); Glx, 8,78 (8,00).
Il prodotto è stato analizzato anche in elettroforesi capillare con modalità uguali a quelle descritte nell’esempio 1 ottenendo un tempo di migrazione elettroforetica pari a 8,99 minuti.
ESEMPIO 3
Preparazione di una resina funzionalizzata con il peptide IFNα-AP.
300 Milligrammi di resina Sepharose Fast-Flow CN-Br (Pharmacia) sono stati rigonfiati e lavati con 100 mi di una soluzione acquosa 1 mM di acido cloridrico a4°C.
10 Milligrammi di peptide IFNα-AP sciolti in 2 mi di una soluzione acquosa 0,1 M di cloruro sodico e 0,5M di bicarbonato sodico a pH 8,3 sono stati aggiunti alla resina e lasciati in agitazione una notte a 4°C; la resina è stata quindi decantata e lavata con la stessa soluzione acquosa. Le funzioni della resina che non hanno reagito sono state bloccate con due cicli di lavaggi consecutivi fatti con 10 mi di una soluzione acquosa 1 M di etanolamina a pH 8 e quindi con una soluzione acquosa 0,1 M di sodio acetato e 0,5 M di cloruro sodico portata a pH 4 con una soluzione acquosa 0,1 M di acido cloridrico.
La resina è stata infine lavata con una soluzione acquosa 0,15 M di cloruro sodico e 0,15 M di fosfato sodico bibasico (PBS) a pH 7,2 e conservata in PBS contenente lo 0,02% di sodio azide.
ESEMPIO 4
Purificazione di Hu-IFNα8
Un millilitro della resina descritta nell’Esempio 3, impaccato in una colonna cromatografica (0 0,5 cm), è stato lavato con 10 mi di PBS. Nella colonna sono stati quindi caricati 1,0 mi di una soluzione contenente 6xl0<6 >UI di Hu-IFNα proveniente da una coltura di leucociti stimolati a produrre Hu-IFNα con il virus Sendai e parzialmente purificato secondo quanto descritto da Cantell K. et al.. Methods in Enzymoi, 78, 29, (1981) e 78, 499, (1981). La fase stazionaria è stata lavata con 10 mi di una soluzione 0,2 M di cloruro sodico e 0,15 M di fosfato sodico bibasico e con 10 mi di una soluzione 0,5 M di cloruro sodico e 0,15 M di fosfato sodico bibasico ed infine con PBS contenente il 10% di glicole etilenico. Il materiale ancora adsorbito sulla resina è stato eluito dalla colonna con 5 mi una soluzione acquosa 0,1 M di acido citrico e 0,2 M di cloruro sodico a pH 2 e portato a pH 7,2 con una soluzione acquosa 0,1 M di sodio idrossido. Il prodotto eluito è stato analizzato in SDS-PAGE su un gel preparato alla concentrazione di acrilamide del 10% e con la colorazione argentica, fornendo un’unica banda a 28 kDaltons coincidente nella migrazione elettroforetica con uno standard di Hu-IFNα8. In un’analisi SDS-PAGE parallela, senza operare la colorazione argentica, la banda è stata trasferita su un foglio di nitrocellulosa ed ha reagito con un anticorpo monoclonale affine per Hu-IFNα8 (NK-2, Celi Tech, UK). Il materiale eluito dalla colonna ha mostrato un’attività antivirale, saggiata secondo il metodo dell’inibizione dell’attività citopatica, pari a 40000 Ul/ml.
10 MI di prodotto eluito sono stati ulteriormente purificati caricandoli su di una colonna di esclusione molecolare con taglio molecolare di 10.000 Daltons alta 40 cm e con diametro di 2,5 cm. La soluzione è stata eluita con una velocità di flusso pari a 3 ml/min usando come eluente una soluzione acquosa contenente 0,3 mg/ml di fosfato sodico monobasico, 1,2 mg/ml di fosfato sodico bibasico e 8,0 mg/ml di cloruro sodico. L’eluato è stato quindi liofilizzato ottenendo Hu-IFNα8 ad elevato grado di purezza.
ESEMPIO 5
Composizione farmaceutica contenente Hu-IFNcc8
Fiale per uso parenterale contenenti 1 x 10<6 >UI di Hu-IFNα8 sono state preparate sciogliendo 1 x 10<9 >UI di Hu-IFNα8, ottenuto secondo il metodo descritto nell’esempio 4, in 900 mi di acqua apirogena bidistillata contenente 7,5 g di una soluzione al 20% di albumina umana serica. A questa soluzione sono stati aggiunti cloruro sodico, fosfato sodico monobasico e fosfato sodico bibasico in quantità tali che nella risultante soluzione risultino presenti 8,0 mg/ml di cloruro sodico, 1,2 mg/ml di fosfato sodico monobasico e 0,3 mg/ml di fosfato sodico bibasico. La soluzione è stata quindi portata a 1000 mi di volume con acqua apirogena bidistillata contenente le suddette concentrazioni di sali, filtrata su filtri sterilizzanti e ripartita in 1000 fiale da 1 mi per uso parenterale.
ESEMPIO 6
Preparazione di derivati di IFNα-AP con biotina (Biot- IFNα-AP)
400 Microlitri di una soluzione preparata sciogliendo 2 mg di biotinil-εaminocaproato di N-idrossisuccinimide in 1 mi di una miscela metanolo / acqua 1:1 sono stati addizionati a 2,5 mg di peptide IFNα-AP sciolti in 1 mi di una soluzione acquosa 20 mM di sodio acetato a pH 6.
La miscela è stata mantenuta per 5 ore a temperatura ambiente sotto agitazione, poi è stata filtrata con un filtro da 0,45 μιη e passata su una colonna cromatografica contenente la resina IFNα-AP descritta nell’ esempio 3 ed impaccata come descritto nell’esempio 4. Il materiale rimasto adsorbito in colonna dopo i lavaggi con 10 mi di una soluzione di 0,5 M di cloruro sodico e 0,15 M di fosfato sodico bibasico, è stato eluito con 10 mi di una soluzione all’1% di acido trifluoroacetico in acqua. Il risultante prodotto Biot-IFNα-AP è stato liofilizzato e ripreso con 2 mi di soluzione acquosa 0,01 M di fosfato sodico bibasico a pH 7,2 ed analizzato in elettroforesi capillare (capillare in silice fusa di 47 cm, lunghezza al rivelatore UV 40 cm, 0 75 μηι, voltaggio costante a 20 kV, eluente soluzione acquosa 0,1 M di fosfato sodico monobasico a pH 2,5) ottenendo un picco unico con un tempo di migrazione pari a 7,90 min.
ESEMPIO 7
Uso di Biot-EFNα-AP in analisi di tipo ELISA
30000 UI di Hu-IFNα in 0,1 mi di una soluzione acquosa di tampone 50 mM di carbonato-bicarbonato sodico a pH 9,6 sono stati depositati in pozzetti di una piastra per ELISA (Pierce) e sono stati tenuti in incubazione per due ore a 37°C. Quindi sono stati eseguiti tre lavaggi con 0,1 mi di PBS contenenti lo 0,05% di Tween 20 e tre lavaggi con 0,2 mi di albumina bovina al 3% in acqua, infine si è lavato ancora con 0,1 mi di PBS contenente lo 0,05% di Tween 20. Nei pozzetti sono stati aggiunti 0,1 mi della preparazione di Biot-IFNα-AP descritta nell’esempio 6 diluiti 1:20 con una soluzione acquosa tampone 50 mM di carbonato-bicarbonato sodico a pH 9,6. La miscela è stata tenuta in incubazione una notte a 4°C e quindi sono stati effettuati tre lavaggi con 0,1 mi di PBS contenenti lo 0,05% di Tween 20 e la miscela è stata mantenuta in incubazione per due ore con 0,1 mi di streptavidina perossidata diluita 1:1000 (Boehringer). La piastra è stata lavata con PBS e colorata con Blue-POD (Boehringer) leggendo allo spettrofotometro a 370 nm. Dopo circa 15 minuti, in funzione del valore della lettura a 370 nm, la colorazione è stata bloccata con una soluzione acquosa 0,1 M di acido solforico e la piastra letta a 450 nm.
Altri pozzetti sono stati preparati con la stessa procedura prima indicata con la differenza che al posto della soluzione di Hu-DFNα sono stati aggiunti 0,1 mi di una soluzione acquosa contenente 1 mg/ml di albumina umana.
Dalla lettura della piastra a 450 nm è risultato che Biot-IFNα-AP riconosce selettivamente miscele di Hu-IFNα contenenti Hu-IFNα8.
ESEMPIO 8
Uso di Biot-IFNα-AP in analisi di tipo blotting.
Seguendo le procedute descritte da Hames B. D. e Rickwood D. su “Gel electroforesis of proteins. A practical approach.” pubblicato da IRL Press, Oxford, New York, Tokio nel 1990, è stato preparato un gel per SDS-PAGE contenente il 15% di acrilamide e lo 0,8% di bis-acrilamide ed una volta effettuata la corsa elettroforetica le bande sono state trasferite su un foglio di nitrocellulosa. Sul gel sono stati caricati in modo distanziato due campioni contenenti 5 μl di una soluzione acquosa contenente lxlO<6 >Ul/ml di Hu-IFNα comprendente anche il sottotipo Hu-IFNα8, caricando in modo intercalato ai precedenti due campioni di 5 μl di una soluzione contenente 1 mg/ml di albumina umana come controllo.
Dopo il trasferimento delle bande sulla nitrocellulosa il foglio è stato tagliato in due in modo che ognuna delle due parti contenesse un campione di Hu-IFNα e uno di albumina. Le due parti sono state saturate con una soluzione acquosa al 3 % di albumina bovina per due ore a temperatura ambiente e quindi lavate con PBS contenente lo 0,01 % di Tween 20. Le due parti sono state quindi incubate in modo separato a 4°C per una notte, una con 10 mi della soluzione di Biot-IFNα-AP proveniente dall’ esempio 6 diluita 1:20, l’altra con un anticorpo monoclonale murino affine per Hu-IFNα8 (NK-2, Celi Tech, UK) diluito 1:1000.
Dopo tre lavaggi con la soluzione di PBS allo 0,01 % di Tween 20, la parte del foglio di nitrocellulosa che era stata a contatto con il peptide Biot-IFNα-AP è stata incubata con streptavidina perossidata diluita 1:1000, mentre quella che era stata a contatto con Γ anticorpo monoclonale è stata incubata con un anticorpo specifico per IgG di topo coniugato con la perossidasi. Dopo lo sviluppo del colore una sola identica banda è stata identificata in corrispondenza della carica di Hu-IFNα in entrambe le parti del foglio mentre nessuna colorazione era visibile in corrispondenza della carica di albumina umana. La banda rivelata presentava una migrazione elettroforetica corrispondente a 28 kDaltons caratteristica di Hu-IFNα8.
Claims (16)
- RIVENDICAZIONI 1) Oligopeptidi antiparalleli che risultano affini per la proteina Hu- IFNα8.
- 2) Oligopeptide secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dalla sequenza: H-Gly-Ser-His-Asp-Phe-Cys-Ser-Asp-Asn-Leu-OH.
- 3) Oligopeptide secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dalla sequenza: H-Gly-Phe-His-Asp-Phe-His-Ser-Asp-Asn-Phe-OH.
- 4) Oligopeptidi idrofobici complementari che risultano affini per la proteina Hu-IFNoc8.
- 5) Oligopeptide secondo la rivendicazione 4 caratterizzato dalla sequenza: H-De-Arg-Ser-Tyr-Pro-Leu-Phe-His-Pro-Glu-Vel-Phe-Tyr-Arg-OH.
- 6) Oligopeptide secondo la rivendicazione 4 caratterizzato dalla sequenza: H-Phe-Arg-Ala-Gly-Thr-Ala-Gly-Gln-Met-Tyr-Ala-Thr-Gly-Arg-OH.
- 7) Oligopeptide secondo la rivendicazione 4 caratterizzato dalla sequenza: H-Val-Glu-Gly-Ser-His-Asp-Phe-Ser-Ser-Hys-Gly-Cys-Gly-Arg-OH.
- 8) Oligopeptide secondo la rivendicazione 4 caratterizzato dalla sequenza: H-Gly-Gln-Gly-Phe-His-Asp-Phe-Ser-Ser-Lys-Ser-Leu-Gly-Arg-OH.
- 9) Matrici su supporti solidi per cromatografia di affinità per la separazione e purificazione della proteina Hu-IFNα8 contenenti un oligopeptide secondo le rivendicazioni da 1 a 3.
- 10) Matrici su supporti solidi per cromatografia di affinità per la separazione e purificazione della proteina Hu-DFNα8 contenenti un oligopeptide secondo le rivendicazioni da 4 a 8.
- 11) Matrici secondo le rivendicazioni 9 e 10 caratterizzate dal fatto che il supporto solido è costituito da una resina polimerica a base di acrilamide o di agarosio.
- 12) Oligopeptidi secondo le rivendicazioni da 1 a 8 funzionalizzati con la biotina.
- 13) Uso degli oligopeptidi secondo a rivendicazione 12 nell’analisi di miscele di Hu-IFNα.
- 14) Uso degli oligopeptidi secondo la rivendicazione 12 nel riconoscimento delTHu-IFNα8 in miscele di Hu-IFNα.
- 15) Composizioni farmaceutiche contenenti Hu-IFNα8 separato e purificato sulle matrici su supporti solidi per cromatografia di affinità secondo le rivendicazioni da 9 a 11.
- 16) Composizioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 15 caratterizzate dal fatto di essere costituite da fiale per uso parenterale contenenti da 0,1 a 20 Ul/ml di Hu-IFNoc8 in soluzioni acquose fisiologiche sterili contenenti albumina umana serica.
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