JP2000502951A - スルフィド、スルフォキシド、スルフォンまたはスルフォネート基からなる結合基を介して結合しているリガンドを有する樹脂の調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 標的化合物と結合することができるリガンドであって、スルフィド、スルフォキシド、スルフォンまたはスルフォネート反応性基からなる結合基を介して支持マトリックスに共有結合しているリガンドを有する支持マトリックスを含むクロマトグラフィー樹脂の調製法を開示する。特に、開示方法においては、フリーラジカル条件下において、エチレン系不飽和反応性基を有する支持マトリックスをチオール基またはビスルファイト塩と接触させる。チオール基を用いた反応の場合には、必要に応じてスルフィドをスルフォンまたはスルフォキシドに酸化する。

Description

【発明の詳細な説明】スルフィド、スルフォキシド、スルフォンまたはスルフォネート基からなる結合 基を介して結合しているリガンドを有する樹脂の調製法 発明の背景 発明の分野 本発明は、標的化合物と結合することができ、スルフィド、スルフォキシドま たはスルフォン反応性基からなる結合基を介してマトリックスに共有結合してい るリガンドを有する支持マトリックスを含む樹脂の調製方法に関する。とりわけ 、本方法においては、フリーラジカル反応条件下においてチオール基と接触させ ることにより、エチレン系不飽和反応性基を有する支持マトリックスをスルフィ ド結合に変換し、続いて、必要に応じてスルフィドをさらに酸化してスルフォン またはスルフォキシド基に変換する。 本発明はさらに、標的化合物と共有結合することができ、結合基を介してマト リックスに共有結合しているリガンド（ここで、該リガンドは末端にスルフォネ ート反応性基を有する）を有する支持マトリックスを含む樹脂の調製方法に関す る。とりわけ、本方法においては、フリーラジカル反応条件下においてビスルフ ァイト塩と接触させることにより、末端のスルフォネート基を得る。 参考文献 以下の出版物、特許および特許出願を上付き番号で本出願中に引用する。 以上のすべての出版物、特許および特許出願の全体を本明細書中に参照として 取り入れ、それらの中で特別に個別に示されている個々の出版物、特許または特 許出願の全体も参照として取り入れる。 発明の属する技術分野 化合物のクロマトグラフィーによる分離においては二相系が用いられ、そのひ とつは移動相であり、もうひとつは固定相である。固定相内を移動相が通過する 間に、化合物の吸着および脱離過程が繰り返されることによって分離される。化 合物はその分配係数にしたがって分離する。化合物が強く吸着されていればいる ほど、より多く固定相に分配され、移動相に対してよりゆっくり移動する。 ある実施態様においては、固定相は固体相マトリックスからなっている。固体 相マトリックスは、シリカ、アルミナ、ゼオライト類などの無機性材料、または 、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート類、ポリスチレン 、ポリアクリルアミドなどの有機性材料のいずれを用いることもできる。標的化 合物（類）に対する固体相マトリックスの分離能を上げるためには、マトリック スを化学修飾することが常套手段である。そのような修飾には、マトリックスの 表面にリガンドを共有結合させる方法があり、ここで、該リガンドは、吸着段階 において、固体の固定マトリックスに対して標的化合物の吸着が強くなるように 選択する。修飾されたマトリックスへの標的化合物の吸着は、該修飾されたマト リックスからの脱離において、吸着条件とは異なる脱離条件を要する程度に強め ることができる。好ましい実施態様においては、マトリックスを修飾するために 使用するリガンドはさらに、脱離段階において、固体の固定マトリックスからの 標的化合物の脱離が促進されるように選択する^1,2。 一般的には、リガンドの共有結合は、固体支持マトリックス上のヒドロキシル 、カルボキシル、チオール、アミノ基など反応性基を用いて行われる。従来から の化学的手法によって、そのような反応性基を有する共有アミン、エーテル、チ オエーテル、アミド、カルバメート、ウレア、カルボキシルエステル結合を作出 することができる。 標的化合物に対するリガンドの吸着能を上げるためには、リガンドと固体支持 マトリックスとの間に連結子（linking arm）を用いることが一般的である。連 結 子が、マトリックスからリガンドを物理的に離すことができ、それによって、マ トリックスからの干渉が最小限の状態で標的化合物がリガンドと相互作用するよ うに、そのような連結子としては、３個以上の原子を有するものが好ましい。樹 脂の合成においてはそのような連結子の使用を要するが、マトリックスの表面上 の反応性基と反応することができる少なくとも１個の反応性基を有する２または それ以上の反応性試薬は、それら自身で共有結合を形成し、また、リガンド上の 反応性基と反応することができる少なくとも１個の反応性基を有する２またはそ れ以上の反応性試薬は、それら自身で共有結合を形成する。連結子を介してリガ ンドが共有結合している固体支持マトリックスを含む樹脂の合成におけるそのよ うな二反応性試薬の使用例に関しては、アクセン（Axen）ら³およびサンドバー グ（Sundberg）とポラス（Porath）⁴によって記載されている。 しかしながら、そのような二反応性試薬の使用にあたっては、困難がつきまと う。例えば、第一の反応性基をマトリックスと共有結合させる間に、他の反応性 基の副反応を活性化レベル（即ち、マトリックス１グラムあたりの反応基の数） にまで下げることができるが、これは、これらの副反応がリガンドと反応する他 の反応性基の反応性を減弱または排除する可能性があるからである。この現象の ひとつの例としては、第二の反応性基とマトリックス上の相補的反応性基との予 期しない反応であり、これが、それらに結合するリガンドの結合能を排除するだ けでなく、マトリックスの架橋結合をも誘発する。加えて、これらの副反応は、 樹脂のクロマトグラフィー特性に対して、樹脂の多孔度の減少などの悪影響を及 ぼす。 この問題を最小限に抑えるひとつの方法としては、二反応性試薬を用いること であり、ひとつの反応性基は遮蔽（マスク）または活性型にするためには活性化 を要するようにし、第一の反応性基が固体支持マトリックスに共有結合するまで は、遮蔽の除去または活性化を行わないようにする。この方法の例としては、固 体支持マトリックスにアリルブロミドを反応させてマトリックスにアリル基を共 有結合させ、続いて、臭素／水などを用いてアリル基を活性化し、反応性のブロ モヒドリン、オキシラン、ビシナルジブロミド反応性基を形成する^5,6,9。ハラ イドの活性化として列挙されているその他の活性化法としては、塩素／水、ヨウ 素 ／水、Ｃｌ₂、Ｂｒ₂、Ｉ₂が挙げられる。 この方法は有効ではあるが、ハライド活性化条件を用いることにより、化学反 応性に関する特異性に欠ける中間生成物が生成する。すなわち、ハロヒドリン、 オキシランまたはビシナルジハライドは、試薬と選択的に反応するわけではない 。むしろ、これらの反応性基は、例えば、アミノ基、チオール基、水酸基などと 幅広い反応性を示す。さらに、臭素水は高い毒性を有するため、商業ベースでの 大々的な使用が禁止されている。 以上の観点から、操作が容易で、所期の反応に対して特異的であり、かつ、さ まざまな支持マトリックス上において高い活性レベルを達成することができるよ うな樹脂の合成方法を提供することの必要性は、今だ存在している。 発明の概要 本発明は、支持マトリックスに結合しているエチレン系不飽和反応性基を、該 エチレン系不飽和基を活性化することなく、チオール基に共有結合させることが できる発見に関する。本発明においては、フリーラジカル条件下において、エチ レン系不飽和基にチオール基を直接共有結合させる。ひとつの実施態様において は、ＲＳＨチオール試薬を用いることにより、共有結合を形成することができ、 ここで、Ｒは、標的化合物に結合し、連結子を介して支持マトリックスにリガン ドのスルフィド結合を形成することかできるリガンドである。さらに、このスル フィド結合を必要に応じて酸化し、スルフォンおよびスルフォキシド結合基を形 成することができる。 従って、本発明のこの実施態様においては、標的化合物と結合することができ 、スルフィド、スルフォキシドまたはスルフォン反応性基からなる結合基を介し てマトリックスに共有結合しているようなリガンドを有する支持マトリックスを 含むクロマトグラフィー用の樹脂の調製方法を提供し、その方法は、 （ａ）エチレン系不飽和反応性基が結合している支持マトリックスを生成し、 （ｂ）該マトリックスに共有−ＳＲ結合を形成するのに十分なフリーラジカル 条件下において、上記のマトリックス（ａ）を構造式Ｒ−ＳＨを有する反応性チ オール化合物に接触させ（ここで、Ｒは標的化合物と結合することができるリガ ンド）、さらに、 （ｃ）必要に応じて、該スルフィド結合を酸化してスルフォキシドまたはスル フォンとする ことからなる。 本発明の別の実施態様においては、エチレン系不飽和反応性基をビスルファイ ト塩と反応させて、スルフォネート反応性基を末端に有するリガンドを生成する 。従って、本発明の本実施態様においては、標的化合物と結合することができ、 結合基を介してマトリックスに共有結合しているリガンド（ここで、該リガンド が末端スルフォネート反応性基を有する）を有する支持マトリックスを含む樹脂 の調製方法を提供し、その方法は、 （ａ）エチレン系不飽和反応性基が結合している支持マトリックスを生成し、 （ｂ）該マトリックスにスルフォネート基の共有結合を形成するのに十分なフ リーラジカル条件下において、ビスルファイト塩に上記のマトリックス（ａ）を 接触させる ことからなる。 図面の簡単な説明 図１は、支持マトリックスにエチレン系不飽和部位を導入するために使用した 既知の反応を示す。 図２は、図１のエチレン系不飽和部位に対して、従来の臭素水反応を使用して 得られた反応生成物を示す。 図３は、チオールを含有するリガンドを使用し、フリーラジカル付加反応によ って得られた反応生成物を示す。 発明の詳細な説明 本発明は、標的化合物と結合することができ、結合基を介してマトリックスに 共有結合しているリガンドを有する支持マトリックスを含むクロマトグラフィー 用の樹脂の調製方法に関し、ここで、該リガンドは、スルフィド、スルフォキシ ドまたはスルフォン反応性基を有する連結子、または、末端にスルフォネート反 応性基を含む。 本発明をさらに詳細に説明する前に、まず、以下の用語を定義しておく。 「樹脂」または「クロマトグラフィー樹脂」とは、混合物から標的化合物をク ロマトグラフィー的に分離することができる物質を指し、ここで、樹脂は、支持 マトリックス、マトリックスに結合した場合に標的化合物を結合させることがで きるリガンド、およびリガンドを支持マトリックスに共有結合させるための連結 子を含む。リガンド／連結子の複数のコピーが支持マトリックス上に存在し、樹 脂は次のような式で表すことができる： 支持マトリックス−［連結子−リガンド］_m ここで、支持マトリックス、連結子およびリガンドは下記のように定義されるも のであり、ｍはマトリックス上のリガンド密度、支持マトリックスの活性化レベ ルをｎとすると（すなわち、樹脂内のエチレン系不飽和基の数）、ｍ≦ｎである 。すなわち、リガンド密度ｍは、反応が完全な場合には活性化レベルｎよりも小 さくなる。 「支持マトリックス」または「支持体」とは、樹脂の骨格物質であって、該物 質に連結子／リガンドを共有結合させることができるような反応性基を含むもの を指す。骨格物質は、無機性（例えば、シリカ、アルミナなど）または有機性の いずれを用いることもできる。骨格物質が有機性である場合には、ポリマーであ ることが好ましく、適切な有機性ポリマーは当該分野において既知である。 支持マトリックスはポリマー性物質であることが好ましく、この場合、移動相 に不溶性または可溶性のいずれであってもよく、本明細書においてはしばしば、 固体支持マトリックスと記載している。好ましくは、支持マトリックスは固体、 不溶性の物質である。 本明細書に記載している樹脂としての使用に適している固体支持マトリックス には、例えば、セルロース、再生セルロース、アガロース、シリカ、被覆シリカ 、デキストラン、ポリマー類（ポリアクリレート類、ポリスチレン、ポリアクリ ルアミド、フラクトゲル（Fractogel）などの市販ポリマーを含むポリメタクリ ルアミドなど）、コポリマー類（スチレンとジビニルベンゼンとのコポリマーな ど）、それらの混合物などがある。また、少なくともひとつのモノマーを含むコ −ポリマー、ター−ポリマーまたはさらに高次のポリマーを用いることもでき、 あるいは得られたポリマーが反応性基を含むように誘導体化することもできる。 本明細書に記載されている樹脂として、可溶性支持マトリックスを使用すること もでき、 その例としては、ポリエチレングリコールが挙げられる。 リガンドを共有結合させることができるような支持マトリックスの反応性基は 、当該分野において既知である。そのような基には、ヒドロキシル（水酸）基、 チオール基、アミノ基などがある。これらの反応性基を用い、従来の反応によっ て、それらにリガンドを共有結合させることができる。さらに、従来の反応を用 いて、これらの基を支持マトリックスに導入することができる。 「連結子（linking arm）」とは、リガンドを支持マトリックスに共有結合さ せる基を指す。本発明においては、連結子は、チオール含有リガンドまたはビス ルファイト塩とのフリーラジカル反応において用いられる飽和型のエチレン系不 飽和体である。例えば、ビニル含有体がアリル基の場合、リガンドの支持マトリ ックスへの共有結合は、−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂−連結子となる。エチレン系不飽和 基が結合している支持マトリックスは、当該分野において既知であり、例えば、 リンドグレン（Lindgren）^5,6、ヘルテン（Hjerten）ら⁷、およびノチュンソン （Nochumson）⁸によって記載されている。 連結子は、少なくとも約３個の原子を含んでいることが好ましく、より好まし くは、約３〜15個である。 「リガンド」または「チオール含有リガンド」とは、フリーラジカル条件下に おいて、支持マトリックスに結合しているエチレン系不飽和基と反応するチオー ル反応性基を含む化合物であって、ここでリガンドが支持マトリックスヘ結合さ れた場合に、クロマトグラフィーの吸着段階において、標的化合物を結合させる ことができるものを指す。支持マトリックスに結合しているリガンドによる標的 化合物の捕捉は、当該分野において詳細に記載されている従来法のいずれによっ ても達成することができ、これらには例えば、疎水性相互作用、親水性相互作用 、イオン性相互作用、バイオアフィニティ（例えば、酵素／基質など）などが挙 げられる。所望する結合方法、およびフリーラジカル条件下においてエチレン系 不飽和基と反応するリガンドの能力に応じて、特定のリガンドを選択するが、こ れらの判断基準は当業者においては既知である。求められていることは、選択さ れたリガンドが、支持マトリックスに結合しているエチレン系不飽和基と反応す るチオール基を有していることのみである。支持マトリックスに存在するエチレ ン 系不飽和基に結合するするチオール基の結合能は、フリーラジカル条件下におい て単に試薬を混合することによって容易に確認することができ、カップリングが 起こるか否かによって判断することができる。 フリーラジカル条件下において、支持マトリックスに結合しているエチレン系 不飽和基と反応する、チオール反応性基を含むリガンドは、「反応性チオール含 有リガンド」と呼ぶ。 ひとつの実施態様においては、チオール含有リガンドは、アミノ、ヒドロカル ビルアミノ、ジヒドロカルビルアミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、スルフェ ート、ホスフェート、ヘテロサイクリックおよびカルボアミジン（グアニジン） 反応性基からなる群から選択される、ひとつまたはそれ以上の追加の反応性基を 有する。別の実施態様においては、チオール含有リガンドはヒドロカルビル基、 すなわち、Ｒ’−ＳＨ（ここで、Ｒ’はヒドロカルビル）のみを有する。 本発明における使用に適しているチオール含有リガンドの例としては、例えば 、メルカプト酢酸、メルカプトエチルピリジン、グルタチオン、システアミン（ ２−アミノエタンチオール）、メルカプトブチル酸、ジチオスレイトール、２− メルカプトエタンスルホン酸、２−メルカプトエタノール、４−メルカプトエタ ノール、３−メルカプト−１−プロパンスルホン酸、２−メルカプトプロピオン 酸、システイン、３−メルカプトプロピオン酸、メルカプトコハク酸、２−ナフ タレンチオールなどが挙げられる。本明細書に記載している方法において有用な その他のチオール含有化合物としては、例えば、レイド（Reid）¹³によって記載 されている。 緩和なフリーラジカル条件下において、支持マトリックスに結合しているエチ レン系不飽和基と特に反応しないチオール含有リガンドの例としては、プロパン チオール、４−メルカプトピリジン、メルカプトベンズイミダゾールおよびメル カプトプロピオン酸のエチルアミド誘導体が挙げられる。本発明の目的を達成す るにあたっては、そのような化合物は反応性チオール含有リガンドとはいえない 。 本明細書において使用している「ビスルファイト塩」とは、［ＨＳＯ₃］_pＭ塩 を指し、ここで、Ｍは陽イオンであり、ｐはＭの価数である。 本明細書において使用している「ヒドロカルビル」とは、炭素と水素とから構 成される有機性ラジカルを指し、脂肪族、脂環族、芳香族およびそれらの組み合 わせ（例えば、アリールアルキルなど）である。好ましくは、ヒドロカルビル基 は、遊離の不飽和脂肪族（すなわち、エチレンおよび不飽和アセチレン）である 。 本明細書において使用している「ヘテロサイクリック（ヘテロ環）」とは、単 環または複素環−これは芳香族（例えば、ピリジル、フリル、ナフトピリジニル 、キノキサリル、キノリニル、インドーリジニル、もしくはベンゾ［ｂ］チエニ ルなど）または非芳香族（モルフォリン、ピペリジンなど）のいずれも用いられ る−を有し、また、少なくとも１個の環内に少なくとも１個のヘテロ原子、たと えばＮ、ＯまたはＳなど有する炭素環を指す。好ましくは、そのようなヘテロサ イクリック基は、４〜20個の炭素原子および１〜３個のヘテロ原子から構成され る。 本明細書において使用している「カルボアミジン(グアニジン)」とは、構造式 で表される反応性基を指す。 「標的化合物」とは、水性溶液から単離しようとする特定の化合物を指す。標 的化合物としては、タンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド 、サッカライド、オリゴサッカライド、炭水化物、ステロイド、サイクリック芳 香族化合物、ジオール、インドール誘導体、薬剤性化学物質またはそれらの中間 体、細胞の一次または二次代謝産物などが挙げられる。特定の標的化合物として 限定されるものはない。しかしながら、好ましい実施態様においては、標的化合 物は、タンパク質もしくはペプチド、細胞の一次もしくは二次代謝産物、ならび に薬剤性化学物質中間体からなる群より選択される。 「エチレン系不飽和基」とは、ビニル（＞Ｃ＝Ｃ＜）またはアセチレン基（− Ｃ＝Ｃ−）を指す。好ましくは、エチレン系不飽和基はビニル基であり、より好 ましくは、末端ビニル基（すなわち、＞Ｃ＝ＣＨ₂）である。最も好ましくは、 エチレン系不飽和基はアリル基である。 「フリーラジカル条件」とは、フリーラジカル反応が進行する条件を指す。該 条件下においては、フリーラジカル反応を阻害または終了させることで知られて いる抗酸化剤は用いない。酸素、照射（例えば、紫外光、放射性元素（例えば⁶⁰ Ｃｏ）など）のようなフリーラジカル促進剤、過酸化物などの化学促進剤を１種 またはそれ以上使用するような従来の反応条件が用いられる。さらに、酸性条件 で行うこともできる。フリーラジカル条件には、フリーラジカル触媒を全く加え ず、反応系内に十分量の酸素、痕跡量の過酸化物などを存在させることによって フリーラジカル反応を進行させるような反応系も含まれる。 好ましくは、フリーラジカル条件には、水性溶液または少なくとも部分的に水 性の溶液が使用される。 「ハロゲン」とは、塩素、臭素およびヨウ素を指す。 方法 スルフィド反応性基を有する連結子を介して支持マトリックスに共有結合して おり、標的化合物を結合させることができるようなリガンドを有する支持マトリ ックスの合成は、フリーラジカル条件下において、支持マトリックスに結合して いるエチレン系不飽和反応性基を反応性チオール含有リガンドに反応させること により行われる。チオールとエチレン系不飽和基との反応については、液相化学 の分野において数多く記載がある。^10-12 驚くべきことに、これらの既知の方 法は、支持マトリックス上において実施することが可能であることがわかり、エ チレン系不飽和支持マトリックスを支持マトリックスに共有結合させることによ り、本発明の樹脂の合成方法を導き出した。 この支持マトリックスに結合しているエチレン系不飽和基を有する支持マトリ ックス類に関しては、当該分野において多数の記載があり、^5-8 特定の経路に 限定されるわけではない。すなわち、反応は、例えば、塩基の存在下、従来法に よって、アリルグリシジルエーテル、アリルハライドまたはプロパギルハライド などを用い、エチレン系不飽和基が結合している支持マトリックスを得ることが できる。特に、図１に示すように、アルカリ性のpHにおいて、ハライドまたはグ リシジル基はマトリックスの水酸基と反応する。これらの条件下においては、ア リル基とマトリックスとの反応性または反応液として使用する水との反応性は、 制限されると考えられる。それ故、架橋結合の形成および／または共有結合して いる活性基の加水分解を生じることなく、高い活性化レベルを得ることができる 。 次に、フリーラジカル条件下において、エチレン系不飽和性基をチオール含有 基と反応させ、リガンドの共有結合を形成する。この反応は以下の反応（１）に 示しているが、図示のため、エチレン性不飽和性基としてアリル基を用いている 。 支持マトリックス−（ＣＨ₂ＣＨ＝ＣＨ₂）_n ＋ ＲＳＨ → 支持マトリックス−（ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂−ＳＲ）_n （１） ここで、Ｒはチオール含有リガンドまたはビスルファイト塩であり、「支持マト リックス」およびｎは上述の通りである。 好ましくは、反応は水中で行う。しかしながら、混和可能な少量の有機溶媒、 例えば、ジメチルスルフォキシド（DMSO）、メタノール、エタノール、アセトン などを含む水性溶液を用いることもできる。好ましくは、混和可能な有機溶媒は DMSOであり、より好ましくは、使用する水の総量に対して、約０〜約50容量％の DMSOを用いる。 本発明においては、一般的に、フリーラジカル条件は、溶存酸素、露光、およ び／または反応系内の痕跡量の過酸化物不純物によって開始される。しかしなが ら、所望する場合には、フリーラジカル開始触媒を用いることもできる。そのよ うな触媒としては、アンモニウムパースルフェートなどの水溶性化合物、または アゾビスイソブチロニトリル（AIBN）などのアルコール可溶性触媒が挙げられる 。一般的には、そのような触媒は、反応混合物内のチオールまたはエチレン基の 総モル数に対して、約0.1〜約５モル％用いる。 反応は約15〜80℃で行うことが好ましいが、20〜70℃がより好ましい。特定の 反応温度および反応時間は、試薬、フリーラジカル触媒を用いるか否かなどによ って定められ、当業者においては容易に決定することができる。 反応は、弱酸性のpH、例えば、約2.5〜約6.2で行うことが好ましい。場合によ っては、反応のpHをモニターし、チオール含有リガンドのエチレン系不飽和基へ の適切な反応が起こっていることを確認する。例えば、pH３〜４においては、４ −メルカプトエチルピリジンは、エチレン系不飽和反応性基と非常によく反応す るが、一方、pH２では反応は進行しない。弱酸性のpHを採用することは、アルカ リにおいて不安定なシリカなどの支持マトリックスに対して特に有利である。 得られた支持マトリックスは、例えば、ろ過、遠心分離などの従来法によって 回収することができる。 Ｒがビスルファイト塩の場合、得られる化合物はスルフォネートであり、その 反応は次のように表される： 支持マトリックス−（ＣＨ₂ＣＨ＝ＣＨ₂）_n ＋ ［ＨＳＯ₃］_pＭ → 支持マトリックス−（ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂−ＳＯ₃Ｍ）_n （２） ここで、支持マトリックスおよびｎは上述のように定義したものであり、Ｍは 陽イオンであり、ｐはＭの価数である。本反応においては、もちろん、Ｍの陽イ オン電荷は、支持マトリックス−（ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂−ＳＯ₃）の陰イオン電荷と 均衡がとれており、Ｍの電荷が＋２の場合には、支持マトリックス−（ＣＨ₂Ｃ Ｈ₂ＣＨ₂−ＳＯ₃）１モルあたり1/2モルのみのＭが存在する。 適切な塩としては、周期律表のIa、IIa、IIIa、IVa、Va、 VIa、 VIIa、VIII 、Ib、IIb、およびIIIbに属する金属陽イオンが挙げられる（コットン（cotton ）＆ウィルキンソン（Wilkinson）著、高等無機化学（Advanced Inorganic Chem istry）第３版、ジョン・ウィリー＆サンズ（John Wiley & Sons）社の一部門で あるインターサイエンス出版社（Interscience Publishers）、ニューヨーク、 ニューヨーク州、アメリカ合衆国（1972年））。 Ｒがチオール含有リガンドである場合には、得られたスルフィドを必要に応じ てさらに酸化して、スルフォキシドまたはスルフォンとすることができるが、こ れは、従来の酸化法、例えば、過酸化水素、メタクロロ過酸化安息香酸、臭素水 などを用いて行う。 応用 本発明の方法は、標的化合物を含む混合物から、標的化合物をクロマトグラフ ィー的に分離する、または標的化合物を固定することに適した樹脂を提供する。 標的化合物の分離は吸着過程、すなわち、ここで、該標的化合物（単数または複 数）は、混合物に含まれている他の成分のうちの少なくともひとつと比較した時 に、樹脂に対して異なる結合親和性を示すような吸着過程によって達成される。 適切なリガンドを選択することにより、本明細書に記載している樹脂は、標的 化合物の回収にも使用することができる。すなわち、本実施態様においては、樹 脂上に導入するリガンドは、吸着過程において用いる条件下、または標的化合物 が樹脂に対して同じ親和性ではもはや結合できないように吸着過程の条件を変え た場合において、標的化合物の結合が可逆性となるように選択する。この後者の 過程の例としては、バートン（Burton）ら^1,2によって記載されており、ここで は、リガンドの利用について開示しており、pHを変化させることによってリガン ド上に電荷を誘導し、この誘導性電荷を用いて樹脂の吸着／脱離特性に影響を与 えている。 本発明の方法は、エチレン系不飽和反応性基を用いた従来のカップリング反応 、例えば、臭素／水、続いて臭素原子を介してリガンドを結合するといった反応 よりも多くの利点を有する。本明細書に記載している方法のひとつの特筆すべき 利点は、フリーラジカルの添加は、チオール含有化合物に特異的であり、アミン 、カルボキシル、およびヒドロキシル基と架橋反応を起こさないことである。従 って、マトリックスへの非特異的付加反応または架橋反応を起こすことがないた め、本発明において使用するリガンドは、ヒドロキシル、アミン、カルボキシル 基を含んでいてもよい。 別の利点としては、リガンドのカップリングが、従来法に比べて１段階少なく 、かつ、基本的には外来性の触媒を要せずに（そのような触媒を用いることもで きるが）完了することである。また、臭素あるいは臭素／水の使用も排除される 。この後者の点については、図２に示されるように明らかであり、すなわち、臭 素あるいは臭素／水（またはその他のハライド類）による副反応においては、マ トリックスへのある程度のハライドの取り込みが生じるが、本明細書に記載して いる方法では生じない。従って、本明細書に記載されている方法においては、得 られた樹脂中のハライドのレベルは、約0.2％未満（乾燥重量１グラムあたり） である。 本明細書に記載されている方法のさらなる利点は、本明細書に記載されている フリーラジカル法を経由することにより、従来法に比べてより効率的に複数のリ ガンドの共有結合が行われ、かつ、非常に高いリガンド密度が得られる。 実施例 以下の実施例は請求の範囲に記載された発明を説明するためのものであり、本 発明を制限するものではない。 特に述べていない限り、温度はすべて℃である。また、本実施例においては、 以下に定義しているもの以外は、略語は一般的に認識されている意味を表す。 ＡＢ ＝アリルブロミド ＡＧＥ ＝アリルグリシジルエーテル ＡＰＳ ＝アンモニウムパースルフェート ＢＭＥ ＝２−メルカプトエタノール ＤＭＳＯ ＝ジメチルスルフォキシド ＥＣＨ ＝エピクロロヒドリン ｇ ＝グラム ＧＳＨ ＝グルタチオン Ｍ ＝モル ＭＡＡ ＝メルカプト酢酸 ｍｅｑ ＝ミリ当量（10^-3ｇ当量） ｍＬ ＝ミリリットル ｍＭｏｌｅｓ ＝ミリモル（文中ではｍＭと表記） ｍＭ ＝ミリモル ＭＰＡ ＝メルカプトプロピオン酸 ＭＳＡ ＝メルカプトコハク酸 ｎｍ ＝ナノメーター ＴＣＡ ＝トリクロロ酢酸 μＬ ＝μリットル 以下の実施例においては、アリルグリシジルエーテル、チオール酢酸、メルカ プト酢酸、チオサリチル酸、システアミン塩酸塩および３−メルカプトプロピオ ン酸は、ヤンセンケミカ（Janssen Chimica）（ベルギー、ギール（Geel））か ら入手；４−メルカプトピリジン、メルカプトコハク酸およびチオフェノールは 、アルドリッヒ・ケミー（Aldrich-Chemie）（ドイツ、ステインハイム、）また はアルドリッヒ・ケミカル（Aldrich-Chemical）（アメリカ合衆国、ウィスコン シン州、ミルウォーキー）から入手；グルタチオンおよびブチロラクトンは、シ グマ・ケミカル（Sigma Chemical）（アメリカ合衆国、ミズーリ州、セントルイ ス） から入手；アリルブロミド、システイン、ベンゾイルパーオキサイド、アンモニ ウムパースルフェート、水酸化カルシウムおよび４−メトキシフェノールは、Ｂ ＤＨ（イギリス、ドーセット）から入手；２−メルカプトエタノール、水酸化バ リウム８水和物、およびシステイン塩酸塩は、リーデル・デ・ハーン（Riedel-d e Hahn）（ドイツ、セルツ）から入手；硫酸ナトリウムはメイ・アンド・ベーカ ー（May and Baker）（イギリス、マンチェスター）から入手；メタ重亜硫酸（ メタビスルファイト）ナトリウムはアヤクス・ケミカルズ（Ajax Chemicals）（ オーストラリア、ＮＳＷ、オーバーン）から入手；ならびにチオ尿素はメルク（ Merck）（ドイツ、ミュニッヒ）から入手した。４−メルカプト酪酸は、カラシ ュ（Kharasch）とラングフォード（Langford）の方法¹⁶に従って、ブチロラクト ンとチオ尿素とから調製した。６−メルカプトヘキサン酸は、イヴァノヴィクス （Ivanovics）とヴァーハ（Vargha）の方法¹⁷に従って、６−ブロモヘキサン酸 と重亜硫酸ナトリウムとから調製した。 パーロツァ（Perloza）樹脂は、テセック（Tessek）（チェコ、プラハ）また はＩＣＳ（チェコ、プラハ）から入手した。セファロース（Sepharose）樹脂は ファルマシア（Pharmacia）（スウェーデン、ウプサラ）から入手した。パーロ ツァ（Perloza）樹脂は、ロボケミ（Lovechemie）（チェコ、ロボシ（Lovosice ））からも入手可能である。 以下の実施例において、ＤＭＳＯ％＝樹脂中に用いられているＤＭＳＯ（ｍＬ ／ｇ）である。同様に、グラムで表示されているマトリックスの重量は、吸引乾 燥重量であり、グラム（乾燥）で表示されている重量は、オーブン乾燥重量（〜 110℃、１〜２時間、乾燥状態で冷却）である。マトリックスの吸引乾燥重量に おいては、水和状態であることに注意する。 実施例１−４−メルカプトエチルピリジン塩酸塩の合成 ４−メルカプトエチルピリジン塩酸塩は、ヴィニトン（Viniton）¹⁴によって 記載されている２−メルカプトエチルピリジンの調製方法における付加反応によ り、４−ビニルピリジンとチオ酢酸とから調製した。撹拌しながら、４−ビニル ピリジン（95％、250ｍＬ）を予め−30℃に冷却（メタノール／氷槽中）し、約 １時間かけてチオ酢酸（170ｍＬ）を滴下した。５〜10分後に溶液は凍結し、添 加速度を 上げて温度を15〜25℃に上昇させ、効率的に撹拌できるようにした。さらに添加 を制御して、反応温度を15〜25℃に維持し、30℃を超えないようにした。室温で さらに１時間撹拌し、その後一晩反応させた。 生成物をエーテルと混合し、飽和重炭酸ナトリウム溶液を用いて３回抽出した （３回目の抽出においては、気体は発生しなかったことを記しておく）。エーテ ル層は、飽和塩溶液で１回洗浄し、活性炭処理して脱色し、無水硫酸マグネシウ ムで乾燥した。次にろ過を行い、約30℃の水浴中で減圧蒸留した。得られた油状 物に800ｍＬの６Ｍ塩酸を加えて少なくとも４時間撹拌し、吸引によって酸層を 除去した。乾燥した固体をイソプロピルアルコールに懸濁してろ過し、乾燥する ことにより、328ｇ（理論値387ｇ）の乳白色の４−メルカプトエチルピリジン塩 酸塩（収率85％）、融点190〜191℃（文献値189℃、バウアー（Bauer）とガーデ ラ（Gardella）による¹⁵））が得られた。206ｍＬのビニルピリジン、140ｍＬの チオ酢酸を用い、より効率的に塩酸除去を行った再度の調製においては、308ｇ （理諭値318ｇ、収率97％）の乳白色の固体、融点189〜190℃が得られた。 実施例２−支持マトリックスに結合しているエチレン系不飽和基の調製 本実施例においては、支持マトリックスに結合しているエチレン系不飽和基の 調製に用いられるさまざまな方法を概説するが、これは、単に例示のためのもの である。例えば、さまざまな反応条件下において、２つの異なる支持マトリック スを２つの異なるアリル試薬を用いて活性化することについて記述している。ア リル試薬の濃度、溶媒の種類、反応温度および時間の効果についても検討してお り、得られたリガンドの密度を種々の滴定法を用いて比較している。 一般的な反応方法 反応は室温で行い、特に指定していない限り、樹脂をイカ ヴィブラ−ミック ス（Ika Vibra-mix）シェーカーに入れて機械的に混合した。水浴中（撹拌しな い）でインキュベートすることにより、反応の温度を上げた。ガラスバイアル（ 25ｍＬ）を用い、マトリックスのサンプル（最大量15ｇまで）を定期的に採取し た。混合物の量がより多い場合には、ガラスジャー（容量1250ｍＬまで）を使用 した。特に記載していない限り、活性化反応には、パーロツァ（Perloza）100を 用いた。パーロツァ（Perloza）は水で洗浄するか、または溶媒混合物で溶媒交 換して、活 性化に用い、焼結ガラスロート内で吸引乾燥した。活性化混合物は、吸引乾燥し たマトリックス100ｇあたりのアリル試薬（ｍＬ）の量によって定められ、％で 表される。 Ａ．パーロツァ（Perloza）のアリルブロミドによる活性化 使用するアリル試薬１モルあたり、１〜1.1モルの水酸化イオンを用いた。パ ーロツァ（Perloza）の75％ＤＭＳＯ溶液を用い、初期条件は60℃とした。反応 温度を室温に変えても不都合はみられなかった。有機溶媒を用いる方が試薬の効 率は高かったが、水性系を用いても高い活性化レベルは得られた。多量の有機溶 媒を用いる場合には、アルカリとしてBa(OH)₂を用いることが好ましいが、その 他の場合はNaOHを用いた。試薬の比率を増すと、活性化レベルの定常的な上昇が 見られた（表１）。水性混合物と15％ＤＭＳＯ混合物との間で、活性化に関する 違いはわずかであったことから、通常の方法においては水性活性化が適していた 。 アリルブロミド活性化のひとつの例を以下に示す。パーロツァ（Perloza）セ ルロース（ＭＴ100）を５倍量の水（ミリＱ（MilliQ）グレード）で洗浄し、吸 引乾燥した。10ｇ量のマトリックスを、0.8ｍＬのアリルブロミド（予め蒸留済 み）、0.8ｇの水酸化バリウム８水和物、２ｍＬのＤＭＳＯおよび１ｍＬの水と 室温で48時間混合した。活性化したマトリックスは、５倍量の10％−ＤＭＳＯ／ 90％−水の混合物、５倍量の0.1ＭのHCl、10倍量の水で洗浄した。アリル基の濃 度は、以下の実施例３に記載している臭素水法によって測定した。アリル基の個 々の測定は、１ｇの活性化樹脂に３ｍＬの水および100μＬの３−メルカプトプ ロピオン酸（ＭＰＡ）を加え、60℃、４時間混合することによって行った。この 誘導体化された樹脂は、20倍量の水、20倍量の0.1ＭのNaOH、50倍量の水、20倍 量の0.1ＭのHClおよび100倍量の水で洗浄し、0.1ＭのNaOHで滴定した。このＭＰ Ａ滴定法は、上述の活性化マトリックスにも利用することができ、また、実施例 ３にも記載している。 パーロツァ（Perloza）のアリルブロミドによる活性化の追加実施例 ある程度（６％）の活性化においては、水酸化ナトリウム溶液を、用いるアリ ルブロミド１ｍＬあたり、水酸化バリウム（２ｇ）、水酸化カルシウム（0.5ｇ ）またはリン酸カリウム（３ｇ）に置き換えた。また、水酸化バリウムは、パー ロ ツァ（Perloza）の７５％ＤＭＳＯ溶液の10％活性化およびパーロツァ（Perloza ）水溶液の25％活性化にも用いたが、両者とも室温で24時間を要した。 パーロツァ（Perloza）水溶液（５ｇ）、0.5ｍＬの水および１ｍＬのＤＭＳＯ を、0.25ｍＬ、0.5ｍＬまたは0.75ｍＬのアリルブロミド（各々0.5ｇ、１ｇまた は1.5ｇのBa(OH)₂を添加）とそれそれ混合した。さらに混合物として、10ｇのパ ーロツァ（Perloza）、２ｍＬのＤＭＳＯ、ならびに0.8、１もしくは1.2ｍＬの アリルブロミド（各々1.6、２または2.4ｇのBa(OH)₂を添加）を用いた。 パーロツァ（Perloza）水溶液（５ｇ）、0.5ｍＬのアリルブロミドおよび１ｇ のBa(OH)₂を、３ｍＬの水または２ｍＬの12.5、50もしくは100％のＤＭＳＯと混 合した。 標準的な反応（24時間）混合物は、10ｇのパーロツァ（Perloza）水溶液、1.5 ｍＬの溶媒、0.7mＬのアリルブロミドおよび2.4ｍＬの3.75ＭのNaOHとした。使 用した溶媒は、ＤＭＳＯ、ジオキサン、アセトン、エタノールおよび水であった 。２番目のＤＭＳＯサンプルは７時間反応させた。別のＤＭＳＯ反応においては 、NaOH溶液の代わりに、1.4ｇのBa(OH)₂と２ｍＬの水とを使用した。 パーロツァ（Perloza）のアリルブロミドによる活性化における好ましい条件 1.5ｍＬのＤＭＳＯを含む、もしくは含まない10ｇのパーロツァ（Perloza）水 溶液を、0.7ｍＬのアリルブロミドならびに３ｍＬの３ＭのNaOH、4.5ｍＬの２Ｍ のNaOHもしくは５ｍＬの２ＭのNaOHと混合した。７％活性化に好ましい条件とし ては、4.5ｍＬの２ＭのNaOHを使用した（ＤＭＳＯ不含）。「保存用（ストック ）７％」活性化パーロツァ（Perloza）は、100ｇのパーロツァ（Perloza）を７ ｍＬのアリルブロミドおよび45ｍＬの２ＭのNaOHと反応させることによって調製 した。 その他の％のアリルブロミドを使用した場合には、用いたNaOHの量は、パーロツ ァ（Perloza）１ｇあたり0.4〜0.45ｍＬの間とした。しかしながら、アリルブロ ミド１ｍＬあたりの水酸基が12.5〜13ｍＭとなるように、NaOHのモル数を変化さ せた（およそ12ｍＭ）。 10ｇのパーロツァ（Perloza）の２％アリルブロミド活性化においては、4.5ｍ Ｌの0.6ＭのNaOHを用いた。50ｇのパーロツァ（Perloza）の６％活性化において は、20ｍＬの２ＭのNaOHを用いた。400ｇのパーロツァ（Perloza）の7.5％活性 化 においては、30ｍＬのアリルブロミドおよび180ｍＬの2.1ＭのNaOHを用いた。80 ｇのパーロツァ（Perloza）の保存用８％活性化においては、6.4ｍＬのアリルブ ロミドおよび35ｍＬの2.3ＭのNaOHを用いた。50ｇのパーロツァ（Perloza）の「 保存用10％」活性化（１％架橋結合および架橋結合なし）においては、５ｍＬの アリルブロミドおよび21.5ｍＬの３ＭのNaOHを用いた。75ｇのパーロツァ（Perl oza）のもうひとつの保存用10％活性化（架橋結合なし）においては、7.5ｍＬの アリルブロミドおよび32ｍＬの３ＭのNaOHを用いた。700ｇのパーロツァ（Perlo za）100の7.5％活性化においては、52.5ｍＬのアリルブロミドおよび300ｍＬの2 .2ＭのNaOHを用いた。 セファロース（Sepharose）のアリルブロミドによる活性化 セファロース（Sepharose）6B（10ｇ）は、0.5ｍＬのアリルブロミド、0.1ｍ ＬのＥＣＨ（架橋結合剤）および６ｍＬの1.7ＭのNaOHと室温で48時間反応させ た。別のセファロース（Sepharose）6Bサンプルについて、１ｍＬのアリルブロ ミドおよび６ｍＬの2.5ＭのNaOHを用いた以外は同様に反応させた。セファロー ス（Sepharose）CL6Bは、0.6ｍＬのアリルブロミドおよび4.5ｍＬの２ＭのNaOH と室温で18時間反応させた。 Ｂ．パーロツァ（Perloza）のアリルグリシジルエーテルによる活性化 アリルグリシジルエーテルによる活性化の特定の実施例を以下に示す。パーロ ツァ（Perloza）セルロース（パーロツァ（Perloza）MT100微粒子セルロース） は、５倍量の水（ミリＱ（MilliQ）グレードの水）および３倍量の0.3ＭのNaOH で洗浄し、吸引乾燥した。40ｇ量のマトリックスを12ｍＬの99％以上のアリルグ リシジルエーテルと激しく振とうしながら混合した。混合物は、ときどき振とう しながら、室温で48時間放置した。活性化されたマトリックスは、10倍量の水で 洗浄し、３倍量の水に懸濁した。混合物が臭素水を脱色しなくなるまで、臭素水 （１％）を５分以上かけてゆっくり該混合物に添加した。臭素化された樹脂は、 10倍量の水で洗浄した。樹脂上のアリル基の濃度は、脱色した臭素水の量によっ て測定した。樹脂（サンプル１ｇを９ｍＬの水に懸濁したもの）上の反応性臭素 基の濃度は、0.5ｇの硫酸ナトリウムで置換し（60℃、４時間）、続いてpH８に なるまで0.1ＭのNaOHで滴定することによって測定した。同様の反応は、異なる 反応時間、温 度および試薬％においても行った。 その他の別の方法としては次のようなものがある：パーロツァ（Perloza）（1 0ｇ）を0.3ＭのNaOHと溶媒との混合物で前処理する以外は、同様に有機溶媒を含 む反応混合物を調製した。溶媒混合物としては、１：２（アセトン／0.3ＭのNaO H）および１：１（ＤＭＳＯ／0.3ＭのNaOH）を用いた。これらの反応混合物は、 水性混合物に比べて優れた「液性」特性を有しており、機械的振とうによって混 合した。 別の水性活性化においては、前処理は行わず、パーロツァ（Perloza）（８ｇ ）水溶液を、２ｍＬの1.5ＭのNaOHおよび1.2ｍＬのアリルグリシジルエーテルと 混合することによって調製した。この生成物は、より「液性」のスラリーであっ た。保存用アリルグリシジルエーテル化パーロツァ（Perloza）は、15％のアリ ルグリシジルエーテル、続いて12％のアリルグリシジルエーテルを用いて（いず れの場合も10ｍＬの２ＭのNaOHを要する）、50ｇのセルロースの水性スラリーの 活性化を繰り返すことによって同様に調製した。試薬およびNaOHの２回目の添加 の前に、１回目の反応の試薬および生成物を水で洗い流した（焼結ガラスロート 中）。 結果 Ａ．アリルブロミドにおける結果 パーロツァ（Perloza）を用いたアリルブロミド反応においては、エピクロロ ヒドリンによる活性化よりも明らかに高い活性化レベルを示した。これらの結果 は、パーロツァ（Perloza）の75％ＤＭＳＯ溶液10ｇあたり0.3ｍＬのアリルブロ ミドを使用することによって得られた。 この活性化条件は、水含量を最小限にし、アリルブロミドに対する水酸基量が ごくわずかに過量モル（およそ1.05）となるように選択した。非常に活性化され たサンプルにおいては、マトリックスの膨潤体積の著しい減少（活性化後の吸引 乾燥により、10〜15％の重量減）が見られた。リガンドの置換によっても、サン プルは元の膨潤体積に戻ることはなかった。膨潤体積の減少は、多数の架橋結合 またはアリル基の親水性効果によると考えられる。アリルブロミドはそれ自身で は架橋結合を引き起こさない（リンドグレン（Lindgren），1994年）が、不純物 は引き起こすかもしれない。アリルブロミドは本来無色のはずであるが、使用し たものはやや褐色に着色していた。蒸留によって無色の試薬を得、次の実験に使 用した。 活性化には、室温が適しているようであった。なぜなら、60℃の反応について 、上述した６％のアリルブロミドを用いて、反応１時間後に高レベル（0.15ｍＭ ／ｇ）に達したからである。続くすべてのアリルブロミドによる活性化は、室温 下としたが、反応時間は24時間に延長した。 上述の反応混合物の初期のpHは非常に高く（14以上）、反応に対するより低い pHの効果を調べた。すなわち、６％のアリルブロミドによる活性化において用い た２ｍＬの3.75ＭのNaOH溶液を水酸化バリウム／カルシウムもしくはリン酸カリ ウム（固体）ならびに２ｍＬの水に置き換えた。Ba(OH)₂を用いた場合には高レ ベルの活性化が起こった（0.46ｍＭ／ｇ）が、Ca(OH)₂およびK₃PO₄を用いた場合 には低レベルであった（それそれ0.1ｍＭ／ｇ）。Ca(OH)₂は、Ba(OH)₂よりも溶 解性が低く、水に対する飽和水酸基濃度は、それぞれおよそ0.01Ｍおよび0.2Ｍ であった。１ＭのK₃PO₄のpHは13であったが、緩衝効果のため、反応中には初期 のpHは維持されなかったと考えられる。すなわち、最適な活性化を行うためには 、およそ13〜13.5のpHを維持できるような十分な強度の塩基が必要であるが、pH が高すぎると活性化効率が下がるようであった。しかしながら、弱塩基を用いて 生成した活性の低いマトリックスの膨潤体積はそれほど変化せず、このことから 、高レベルの活性化はマトリックスの収縮の原因であることが示唆された。吸引 乾燥（75％ＤＭＳＯ）したパーロツァ（Perloza）10ｇあたりのアリルブロミド の割合を１ｍＬまで増やすと、非常に活性化されたマトリックス（0.71ｍＭ／ｇ ）が得られた。 別の高度に置換されたマトリックス（0.43ｍＭ／ｇ）は、パーロツァ（Perloz a）水溶液（10ｇ）および25％のアリルブロミドを用いることによって生成され た。試薬の消費量は非常に多いが、この反応から、高レベルの活性化は、水性媒 体中で達成することができることが示された。アリルブロミドの水に対する溶解 性は低いにもかかわらず、効果的に反応が行われた。 セルロースに対する試薬の比とＤＭＳＯ：水＝１：６に溶解したセルロースに おいて得られた活性化レベルとの間の関係は、５、10および15％のアリルブロミ ドおよびBa(OH)₂を用いて測定した。活性化レベルはそれそれ、0.99、1.42およ び1.97ｍＭ／ｇ（乾燥時）であった。滴定値は、ほぼ直線状に増加した。例えば 、以下の表１を参照。活性化レベルの上昇に際して、セルロースの反応性の低下 はみられなかった。このことは、非常に高い活性化レベルが先に達成されたこと と合致する。 表１ アリルブロミドによる活性化レベルを変化させた場合の滴定方法の比較 ¹ スルフォネート誘導体は、ブロム化したマトリックスを スルファイト置換することによって調製した。 上記の５〜15％のアリルブロミドによる活性化レベル（乾燥時、ｍＭ／ｇ）は 、メルカプトプロピオン酸の添加および滴定（滴定法は以下に記載）によって求 めた。臭素水滴定値（表１）との相関関係は妥当であり、滴定の終点の目視判定 および時間超過による臭素濃度の低下による変動を排除した。対照的に、スルフ ォネート滴定値では、特に高アリルブロミド％においては、活性化レベルは低く 出た。故に、活性化レベル（メルカプトプロピオン酸がメルカプト酢酸によって 置換されるまで）のルーチン測定においては、メルカプトプロピオン酸滴定法を 用いた。 パーロツァ（Perloza）水溶液のアリルブロミド（10％）による活性化で得ら れた活性化レベルが0.79ｍＭ／ｇであったことから、反応混合物中に少量のＤＭ Ｓを添加することによって反応効率が大幅に上昇することが示唆された。この差 異は、試薬の混合状態が改善されることによる。一定量の水およびアリルブロミ ド（10％）を用いた場合において、セルロースに対するＤＭＳＯの割合の増加が もたらす効果は、初期には活性化レベルを上昇させるが、ＤＭＳＯが20％を超え ると変化はない（表２）。スルフォネート滴定値はやはり低かった。 表２ 試薬および共溶媒の割合を変化させた場合の滴定値^{2 2} 塩基はBa(OH)₂を使用 反応混合物の水含量が非常に増したため、初期pHが14を超えないようにして水 酸化ナトリウムを用いることができた。Ba(OH)₂、水および15％のＤＭＳＯを用 いて７％のアリルブロミド活性化を行うと（24時間）、活性化レベルは0.183ｍ Ｍ／ｇであった。Ba(OH)₂／水の代わりに2.4ｍＬの3.75ＭのNaOHを用いると、よ り高い活性化レベルに達した。溶媒の割合よりも種類の変化が及ぼす効果につい て、NaOH法を用いて検討し、その結果を表３に記す。ＤＭＳＯの代わりにアセト ンを用いることにより、同等の活性化が得られた。ジオキサンおよび水を用いて 得られた活性化レベルはわずかに低く、エタノールでは非常に低かった。７時間 反応させたサンプル（ＤＭＳＯ）の活性化レベルは、24時間反応させたサンプル のおよそ70％であった。水性サンプルにさらに1.5ｍＬの水を加えたことから、 水性系とＤＭＳＯ／アセトン系との間の活性化レベルの差は、有機溶媒によって 反応が促進されたというよりもむしろ、単に、水：セルロースの比が増したこと によるものといえる。 表３ 溶媒および塩基の変化に伴う活性化レベル 表３においては、未検定の臭素水（およそ0.1ｍＭ／ｍＬ）を用いた。この表 の結果は、メルカプトプロピオン酸を用いた滴定結果に対して良好な相関関係を 示したが、スルフォネート滴定については一般的に低値であった。より高濃度の 硫酸ナトリウム溶液を用いたことにより、高度に置換が生じたものと考えられる 。 セファロース（Sepharose）の活性化の例 セファロース（Sepharose）6B（10ｇ）を５および10％のアリルブロミドを用 いて反応させたときに得られた滴定値（メルカプトプロピオン酸による）は、0. 088および0.139ｍＭ／ｇ（乾燥時、1.60および1.97ｍＭ／ｇ）であった。ＥＣＨ によって導入されたエポキシド基（架橋結合しているセファロース（Sepharose ）を含む）は、活性化レベルにそれほど関与していないものと考えられた。ＥＣ Ｈ：アリルブロミドの比は小さく、使用した活性化条件下においては、大多数の エポキシド基は反応したはずである。６％のアリルブロミドを用いてセファロー ス（Sepharose）6Bを反応させても、非常に活性化された（乾燥時、1.42ｍＭ／ ｇ）マトリックスが得られた。 パーロツァ（Perloza）の水性活性化における好ましい条件 連続アリルブロミド活性化においては、水性溶媒が一般的である。「外部から の」方法（例えば、回転翼スターラーよりも回転など）によって最も良く混合を 行うためには、セルロース10ｇについて４〜５ｍＬのNaOH溶液を要する。これに よって、自由流動性のスラリーが得られた。故に、異なるアリルブロミド量に対 して、NaOH溶液の量ではなくモル数を変化させた。0.7ｍＬのアリルブロミドを 用いたパーロツァ（Perloza）（10ｇ）の同様の活性化（0.163〜0.169ｍＭ／ｇ ）は、３ｍＬの３ＭのNaOHまたは4.5ｍＬの２ＭのNaOH（1.5ｍＬのＤＭＳＯを含 む、または含まない）を用いて実施した。３ＭのNaOHを用いた活性化においては 、より高い値が得られることが期待されたが、混合が不十分であった。混合を良 くするために1.5ｍＬのＤＭＳＯを加えた場合には、より高い活性化レベルが得 られた（0.199ｍＭ／ｇ）。２ＭのNaOHの量が少し多く（５ｍＬ）なると、活性 化レベルは大きく低下した（0.11ｍＭ／ｇ）。10ｇ（セルロース量として）の反 応スケールにおいては、一般的に、アリルブロミドの割合が１％上昇する毎に、 活性化は0.023〜0.025ｍＭ／ｇ上昇した。100〜400ｇの反応スケールにおいては 、若干高 いレベルが得られた。これらの結果を表４にまとめる。表４においては、「反応 混合物」の項に特に記載していない限り、10ｇのセルロースを用いた。 表４ 種々のアリルブロミド％および10〜700ｇのセルロース量における滴定値 中級＝中級グレードのパーロツァ（Perloza） Ｂ．アリルグリシジルエーテルによる活性化の結果 最初に、アリルグリシジルエーテルは、0.3ＭのNaOHに溶解したパーロツァ（P erloza）と反応させたが、この時のNaOH濃度は、サンドバーグ（Sundberg）とポ ラス（Porath）によるビスエポキシドの活性化における最適水酸基濃度に関する 報告⁴から類推した。アリルグリシジルエーテルと吸引乾燥した（NaOH溶解）セ ルロースとを混合することにより、反応混合物を濃厚懸濁液とした。アリルグリ シジルエーテルの標準量使用は0.3ｍＬ／ｇ（30％）であった。反応は、60℃、 ５時間で終了した。吸引乾燥したパーロツァ（Perloza）の臭素水（末検定）に よる滴定値（1.7ｍＬ／ｇ）は、19時間反応後も変化しなかった。同じ臭素水溶 液を用いて測定したところ、40℃24時間後に1.8ｍＬ／ｇ、ならびに室温では24 時間後に1.5および48時間後に２ｍＬ／ｇと、活性化レベルがわずかに上昇した 。48時間後では、室温での活性化レベルは0.183ｍＭ／ｇであった（臭素水を用 いて測定）。この活性化セルロースは、元のセルロースと同程度の湿重量を有し ていた。従って、マトリックスの膨潤体積は、活性化によってそれほど変化しな いと考えられた。 10％、20％および40％のアリルグリシジルエーテル混合物における活性化レベ ルの比較においては、用いた試薬の割合の増加が及ぼす効果は低いことが示され た（表５）。しかしながら、30％のアリルグリシジルエーテルを用いた反復活性 化においては、非常に高い活性化レベル（0.315ｍＭ／ｇ、臭素水測定による） が得られた。 表５ ＡＧＥ％に対する活性化レベル アリルグリシジルエーテル（15％）活性化（室温、72時間）の効率を、0.3Ｍ のNaOHまたはＤＭＳＯ／NaOH＝50：50混合物に溶解したパーロツァ（Perloza） （10ｇ）について比較した。反応は室温で72時間行った。活性化レベル（メルカ プトプロピオン酸滴定）はそれそれ、0.109および0.194ｍＭ／ｇであった。活性 化レベルが高いほど加水分解率は低い。33％のアセトン溶液（15％のアリルグリ シジルエーテルスラリー）および水性溶液（12％懸濁液）について活性化率を比 較した。96時間後の滴定値はそれそれ、1.05および0.703ｍＬ／ｇ（乾燥時）で あった。水性法においては、48時間以降の活性化レベルの上昇はみられなかった が、33％のアセトンマトリックスにおいては、反応の終了に72時間を要した。こ れらの結果を表６にまとめる。 表６ ＡＧＥ反応時間および溶媒を変化させた場合のＭＰＡ滴定値 定まった理論があるわけではないが、アセトンまたはＤＭＳＯの使用は、反応 混合物の「流動性」を増し、回転または浸透によって反応混合物の効率的な混合 を促すと考えられる。100％水性溶液において同様の混合を行うためには、さら に0.3ＭのNaOH（パーロツァ（Perloza）８ｇあたり２ｍＬ）の添加を要した。15 ％ のアリルグリシジルエーテルを用い、本方法によって48時間活性化を行った場合 の活性化レベルは0.113ｍＭ／ｇであった。15％のアリルグリシジルエーテル、 続いて第二の活性化段階において12％のアリルグリシジルエーテルを用い、本水 性スラリー法によって保存用アリルグリシジルエーテル（27％）を調製した。活 性化レベルは0.153ｍＭ／ｇであった。 実施例３−滴定法 マトリックスへのアリル基の取り込み量は、はじめに２％臭素水滴定によって 、続いてアリル基のメルカプト酸滴定を行うことによって定量した。 Ａ．マトリックスのアリル基の臭素水滴定 臭素水滴定は、活性化されたマトリックスのサンプル0.5〜２ｇに検定済みの 臭素水（およそ２％）を徐々に添加（100μＬ、200μＬまたは１ｍＬのギルソン （Gilson）ピペットを使用）することによって行った。臭素の脱色速度が明らか に遅くなった場合、通常、総添加量の60〜75％を添加後には、ごく少量ずつ（50 μＬ）添加した。終点は目視で判断した。通常、滴定は２〜５分で終了した。 臭素水は２つの方法によつて検定した： （１）臭素（1.5〜2.5ｇ）を100ｍＬの測容フラスコに迅速に測り取り、水を 加えて100ｍＬとすることにより、できるだけすばやく臭素水（1.5〜2.5％）を 調製した。初期の臭素濃度が滴定時において維持されている（蒸発損失はない） ものと仮定して、臭素水のモル数を計算した。 （２）上述の方法と同様な濃度範囲の臭素水を保存溶液として調製し、使用直 前に検定した。臭素水（0.5ｍＬ）を水で希釈して25ｍＬとし、410nmにおける吸 光度を測定した。標準（方法１によって新たに調製されたもの）と値を比較する ことによって臭素濃度を計算した。 保存用２％臭素水溶液の一連の希釈（１：99、２：98、３：97、４：96、およ び５：95）における吸光度は、それそれ0.154、0.327、0.500、0.698および0.91 0であった。吸光度0.5までは、妥当な直線的増加がみられた。従って、適切な希 釈を行って、測定はこの範囲に限定した。新たに調製した臭素水の410nmにおけ る吸光度は、0.014％のとき0.117および0.036％のとき0.305であった。これらの 値は、吸光度×希釈×0.12＝臭素水の％に等しい。この変換を次の「定量的臭素 滴 定」に用いた。臭素水定量は、滴定の直前に臭素水の吸光度検定を実施すること によって定量性が向上する。この臭素水滴定は、ルーチンの実験室検定にはふさ わしくない。というのは、迅速さが要求され、また、臭素水の使用による有害な 蒸気が発生するからである。 Ｂ．アリル基のメルカプト酸滴定 活性化したマトリックス（１ｇ）を、100μＬのメルカプト酢酸（ＭＡＡ）も しくはメルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）ならびに１〜５ｍＬの水と混合した。 混合物は、60℃で４〜16時間または室温で24〜48時間（ＭＡＡの場合のみ）イン キュベートした。サンプルを焼結ガラスロートに移し、20ｍＬの水、20ｍＬの0. 1ＭのNaOHおよび゛20ｍＬの水を10回用いて余分な試薬を洗い流した。カルボン 酸基を滴定することにより、マトリックスへのアリル基の取り込みレベルがわか る。 これらの異なる方法によるアリル基の定量については、上記の表１に示してい る。 以下の実施例７および10においては、すべてのサンプルについて、メルカプト 酢酸法により「逆滴定」を行った。事前添加または後添加したサンプルをメルカ プト酢酸で滴定した。添加量は、（事前添加メルカプト酢酸滴定−後添加滴定） の差によって求めた。 以下の実施例においては、アリル化パーロツァ（Perloza）およびアリルグリ シジルエーテル化パーロツァ（Perloza）とは、特に記載していない限り、水溶 化され、吸引乾燥したパーロツァ（Perloza）を指す。 実施例４〜10は、特異的なフリーラジカル付加による、広範な種類のチオール およびビスルファイトイオンの簡便な結合について示しており、それによって、 これらのマトリックスに、広範な種類の異なるリガンドを結合させることができ 、すなわち、標的化合物の分離が容易に行えることになる。加えて、従来法とは 対照的に、これらの条件下においてアミン（エタノールアミン）が存在しない反 応であることから、フリーラジカル付加の特異性が示された。 実施例４−アリル基へのメルカプトプロピオン酸およびメルカプト酢酸の付加 方法 アリル化パーロツァ（Perloza）（上述のように調製）へのメルカプトプロピ オ ン酸の初期付加においては、2.5ｍｇのアンモニウムパースルフェートを含む75 μＬ／ｇの湿潤マトリックスを用いた。続いての付加には100μＬ／ｇを用いた 。反応は60℃で３〜４時間行った。変法として、４−メトキシフェノール（20ｍ ｇ）を含み、アンモニウムパースルフェートを含まず、室温で16時間の反応を行 った。アンモニウムパースルフェートを含まず、60℃少なくとも４時間という反 応を標準法とした。十分に混合するように、水（１〜５ｍＬ）を用いた。 メルカプト酢酸付加については、同様の試薬の割合および反応条件を標準とし た。試験の変形として、試薬の割合（30および60μＬ／ｇ）、室温（24または48 時間）およびpHを６に調整した場合、について行った。 本方法に従って、未修飾のパーロツァ（Perloza）をメルカプトプロピオン酸 およびメルカプト酢酸と反応させ、対照とした。 結果 メルカプトプロピオン酸（100μＬ）を30％のアリルグリシジルエーテル化パ ーロツァ（Perloza）（１ｇ）と触媒性アンモニウムパースルフェートと共に60 ℃、４時間反応させたところ、付加レベルは0.198ｍＭ／ｇであった。同じ、ア リルグリシジルエーテル活性化パーロツァ（Perloza）を臭素水と反応させ、つ づいて硫酸ナトリウムと置換した場合の滴定値は0.177ｍＭ／ｇであった。アン モニウムパースルフェートなしでの60℃における付加反応は同様に効率的（0.18 6ｍＭ／ｇ）であったが、20ｍｇの４−メトキシフェノールによって大きく阻害 された（0.044mＭ／ｇ）。室温、16時間の付加反応は、中間の滴定値を示した（ 0.136ｍＭ／ｇ）。反応混合物から酸素を除去することはしなかったことから、 光、溶存酸素、および／または痕跡量の過酸化物が、追加の触媒を要することな く、反応を開始させるものと考えられた。故に、次のメルカプト酢酸付加におい ては、過酸化物触媒を使用しなかった。４−メルカプトフェノールの阻害効果は 、予期されるフリーラジカル機構を示唆するものであった。結果を表７にまとめ る。 表７においては、対照サンプル（パーロツァ（Perloza）＋ＭＰＡ）以外は、 アリルグリシジルエーテル化（30％）パーロツァ（Perloza）を用いた。特に記 載していない限り、ＭＰＡをリガンドとして用いた。フリーラジカルの阻害剤と してはメトキシフェノールを用いた。効率は、対照の滴定値に基づく補正および ＭＡ Ａに見られる「可能な」付加レベル（60℃、４時間、触媒なし）との比較を行う ことによって計算した。 表７ メルカプト酸の付加に対する温度、触媒および阻害剤の及ぼす効果 未修飾パーロツァ（Perloza）へのメルカプトプロピオン酸またはメルカプト 酢酸の付加（60℃）の滴定値が0.004ｍＭ／ｇであったことから、反応にはアリ ル基を要することが示された。わずかな滴定値を示したことは、不純物、希釈効 果、もとのパーロツァ（Perloza）上の電荷基およびマトリックス上の痕跡量の アルデヒド（これは、チオールの求核的付加を行うことができる（マクマリー（ McMurry）18））の組み合わせによって説明される。未修飾パーロツァ（Perloza ）の滴定においても同様の値（0.005ｍＭ／ｇ）を示したことから、わずかなレ ベルの電荷基は、未修飾パーロツァ（Perloza）とメルカプトプロピオン酸との 反応によるものではないことが示唆された。 定量的なメルカプト酢酸付加には５モルまたはそれ以上過量が好ましいと考え られ、反応の完結には室温で十分である。 30％のアリルグリシジルエーテル活性化パーロツァ（Perloza）を用いたメル カプト酢酸の付加（60℃）も行った。滴定値が0.204ｍＭ／ｇと、メルカプトプ ロピオン酸を用いた場合よりも高かったことから、pHが８であることによる、よ り優れた反応性および／またはより完全に滴定が行われたことが示唆された。滴 定値から、１ＭのNaCl中におけるメルカプト酢酸パーロツァ（Perloza）のpKaは 、メルカプトプロピオン酸パーロツァ（Perloza）のそれよりも明らかに低いこ とを示している（前者は3.9、後者は4.9）。しかしながら、どちらの樹脂もpH７ 以上では滴定されない。従って、優れた反応性が期待されることから、アリル基 の滴定には、メルカプトプロピオン酸をメルカプト酢酸に置き換えた。 アリルグリシジルエーテル活性化パーロツァ（Perloza）サンプルへの付加に おいては、室温、48時間の場合と60℃４時間の場合で同レベルの反応が観察され た（両者とも0.135ｍＭ／ｇ）。別のアリルグリシジルエーテル活性化マトリッ クスに対する室温、24時間後の付加レベルは0.191ｍＭ／ｇであった（60℃の場 合は0.194ｍＭ／ｇ）。メルカプト酢酸の標準使用量はアリル活性化パーロツァ （Perloza）１ｇあたり100μＬであった。このことは、活性化されたマトリック スが0.28ｍＭ／ｇまたはそれ以下であったのに対して、５モルまたはそれ以上の 過量のアリル基が存在していることを示していた。より活性化されたアリルグリ シジルエーテル化マトリックスへより少ない量で付加を行った場合の滴定値は、 0.119ｍＭ／ｇ（２モル過量のメルカプト酢酸を使用）および0.184ｍＭ／ｇ（同 ４モル過量）であった。これらのレベルはそれそれ、標準滴定値の61および95％ であった。従って、定量的なメルカプト酢酸付加においては、５モルまたはそれ 以上の過量が好ましいと考えられ、反応を完全に行うには室温で十分であった。 実施例５−アリル基へのメルカプトスクシン酸付加法 上述した方法に従い、メルカプトスクシン酸をアリル化パーロツァ（Perloza ）および水（１：１）と60℃で16時間または室温で64時間反応させた。メルカプ トスクシン酸（マトリックス１ｇあたり0.15ｇ）は反応混合物に溶解した。 pH10におけるアリルグリシジルエーテル化マトリックス（0.134ｍＭ／ｇ、１ ｇ）へのメルカプトスクシン酸（0.15ｇ）の付加による滴定値は0.189ｍｅｑ／ ｇであった。メルカプトスクシン酸は２個のカルボキシル基を有するため、これ は0.0095ｍＭ／ｇと等価である。メルカプトスクシン酸樹脂の滴定は、メルカプ ト酢酸樹脂よりも高いpHで行ったが、これは、pH８においてもまだ滴定が起こっ ていると考えられたためである。pH10の反応の終点においては、希釈による効果 は発揮されていなかった。メルカプトスクシン酸の適切な添加量は、おおよそ70 ％までであった（メルカプト酢酸量との比較）。 メルカプトスクシン酸付加の効率は、室温で60時間反応させることにより向上 した。保存用７％アリルブロミド活性化パーロツァ（Perloza）（メルカプト酢 酸による滴定値0.174／ｇ）を用いた。pH８におけるメルカプトスクシン酸滴定 値は0.313ｍｅｑ／ｇ（0.157ｍＭ／ｇ、 90％）であった。メルカプトスクシン 酸のチ オール基は二次的なものであるが（立体障害によると考えられる）、非常に高い 付加レベルが達成された。前の結果とは対照的に、pH８以上においては滴定値は それほど上昇しなかった（pH９においては0.317ｍｅｑ／ｇ）。メルカプトスク シン酸誘導体は、イオン交換カラムに利用することができる。ジカルボン酸部位 との間に特異的イオン相互作用が生じるものと考えられる。 実施例６−アリル基への他のメルカプト酸の付加 下記のように変更した上述の方法に従い、グルタチオン、メルカプト酪酸、チ オサリチル酸およびメルカプトヘキサン酸を上述のように調製したアリル化パー ロツァ（Perloza）に結合させた。 とりわけ、グルタチオン（遊離酸型）は同じ条件で反応させたが、マトリック ス１ｇあたり0.2ｇを用いた。また、グルタチオンは、水の代わりに0.2ＭのH₃PO₄ を用いてパーロツァ（Perloza）と反応させた（60℃）。 メルカプトヘキサン酸（0.2ｍＬ）、メルカプト酪酸（0.5ｇ）およびチオサリ チル酸（0.2ｍＬ）はアリル化パーロツァ（Perloza）（１ｇ）と60℃、48時間反 応させた。リガンドの溶解性を上げるため、エタノール（１ｍＬ）を加えた。 アリルグリシジルエーテル化マトリックス（１ｇ、0.134ｍＭ／ｇ）へのグル タチオン（0.2ｇ）の付加は、60℃、16時間の反応でも効率よく行われた。pH７ における滴定値が0.115ｍＭ／ｇ（まで）であったことから、付加が起こるもの の、その効率はメルカプトプロピオン酸付加またはメルカプト酢酸付加よりも低 いことが示された。しかしながら、用いたグルタチオンの過量モル数は他のチオ ールよりも少なかった。 他のアリルグリシジルエーテル化マトリックスへグルタチオンを付加したとこ ろ、pH８で0.098ｍＭ／ｇ、pH11で0.203ｍＭ／ｇという結果が得られた（メルカ プト酢酸による滴定値は0.135ｍＭ／ｇ）。このグルタチオン樹脂は、グルタチ オンの還元遊離酸型を付加することによって調製された。希釈リン酸中でのグル タチオン付加では、より低い滴定値（pH11で0.046ｍＭ／ｇ）が得られた。グル タチオン樹脂においては、pH7までの滴定では、グルタチオン１個につき１個の カルボキシル基が固定化されていることを示していると考えられた。pH11までの 滴定においては、グルタチオンのアミノ基が含まれていると考えられた。このこ とか ら、グルタチオンの２番目のカルボキシル基は、滴定開始時点では、カルボキシ イオンの形でアミノ基に関与していることが考えられた。希釈効果を許容して（ pH11でのブランクの滴定値は0.017ｍＭ／ｇ）、pH10および11の間で滴定を行っ たところ、付加レベルは0.093ｍＭ／ｇ（メルカプト酢酸の70％）と計算された 。 グルタチオン付加の効率は、室温で60時間反応させることによって向上した。 保存用７％アリルブロミド活性化パーロツァ（Perloza）（メルカプト酢酸によ る滴定値0.174/ｇ）を用いた。グルタチオン樹脂の滴定値は、pH７およびpH11に おいてそれぞれ、0.136および0.300ｍｅｑ／ｇであった。ブランク滴定値を差し 引いた後の付加レベルは0.142mM/g（82％）と計算された。室温でグルタチオン の付加が効率よく行われたことから、本方法は、他のチオール含有ペプチドやお そらくタンパク質を加温することなく、固定化する際に利用できることが示唆さ れた。グルタチオンのフリーラジカル付加は、グルタチオンアフィニティー樹脂 の非常に簡便な生成法である。未反応のアリル基は、メルカプトエタノールを用 いて容易にブロックできる。 より過量モル（３以上）のグルタチオンを用いると、付加レベルは上昇すると 思われる。 チオサリチル酸（アリル化パーロツァ（Perloza）１ｇあたり0.2ｍＬ）を60℃ 48時間反応させても付加は起こらなかった（滴定値は0.002Ｍｍ／ｇ）。60℃、9 6時間の反応にもかかわらず、メルカプト酪酸（0.5ｇ）および特にメルカプトヘ キサン酸（0.2ｍＬ）の付加は、メルカプトプロピオン酸およびメルカプト酢酸 に比べて効率が悪かった。滴定値はそれそれ、0.131および0.026ｍＭ／ｇであっ た（同じ樹脂に対するＭＡＡの滴定値は0.180ｍＭ／ｇ）。 チオールリガンドはアリル基に代表されるエチレン系不飽和基を付加しないこ とから、本発明の目的にかなう反応性チオールリガンドではない。 実施例５および６のデータを以下の表８に示す。 表８ ＭＡＡと比較したＭＳＡおよびグルタチオンの付加効率 メルカプト酢酸に比べてグルタチオンおよびメルカプトスクシン酸の付加レベ ルが若干低いのは、アミン基による阻害（ＧＳＨの場合）、２個の酸を有するリ ガンドのイオン化が大きいこと（メルカプト酢酸と比較して）、立体効果または 単に反応性が低いことによるものと考えられる。より過量モルのグルタチオンを 用いれば、付加レベルは上昇する。 実施例７−アリル基へのメルカプトエタノールおよびジチオスレイトールの付 加法 上述の方法に従い、メルカプトエタノールおよびジチオスレイトールを上記の ように調製したアリル化パーロツァ（Perloza）に結合させた。 すなわち、メルカプトエタノール（100μＬ）の付加は、60℃（16時間）また は室温（24もしくは48時間）で行った。 ジチオスレイトールの付加は、アリル化パーロツァ（Perloza）（２ｇ、0.16 ｍＭ／ｇ）を４モル過量（0.17ｇ）のジチオスレイトールと室温、48時間混合す ることにより行った。 メルカプト酢酸による逆滴定により、ジチオスレイトールの付加は0.062ｍＭ ／ｇであることがわかったが、これは、樹脂１ｇあたりおよそ0.1ｍＭのジチオ スレイトールが結合していることに相当する。 60℃（16時間）におけるアリルグリシジルエーテル活性化パーロツァ（Perloz a）（１ｇ）（メルカプト酢酸による滴定値0.144ｍＭ／ｇ）への２−メルカプト エタノール（100μＬ）の付加は、ほぼ定量的であった。室温（24時間）におけ る他のアリルグリシジルエーテル活性化パーロツァ（Perloza）（メルカプト酢 酸による滴定値0.191ｍＭ／ｇ；乾燥時1.35ｍＭ／ｇ）への２−メルカプトエタ ノールの付加は、同様に効率的であり、アリル基がメルカプトエタノールと完全 に反応していることを示していた。メルカプト酢酸を用いた両樹脂の「逆」滴定 は、0.001ｍＭ／ｇであった。後者のサンプル（乾燥時1.39ｍＭ／ｇ）の硫黄の 元素分析値が4.45％であったことから、メルカプト酢酸誘導体に対して滴定によ って得られた値と一致しており、室温における２−メルカプトエタノールの付加 は、他のリガンドの付加後の未反応のアリル基のブロッキング（他のリガンド基 が立体制限を起こさないようにするため）に有効な方法であることが示された。実施例８−アリル基へのビスルファイト付加法 初期反応は上述のように行い、硫酸ナトリウムおよびメタ重亜硫酸ナトリウム を各0.1ｇ、ならびにアリル化パーロツァ（Perloza）１ｇにつき５〜10ｍＬの水 を用いた。上述のように、反応は、室温または60℃で４〜48時間行った。 これとは別に、0.2ｇのメタ重亜硫酸ナトリウムを用い、１ＭのNaOHで反応混 合物のpHを５〜5.5に調整した。後者の反応においては、１ｍＬの４Ｍの酢酸緩 衝液（pH5.5）を加えた。pH5.5のサンプルは48時間反応させ、そのうち１サンプ ルについては反応24時間後にpHを６に再調整した。 別の実施態様においては、メタ重亜硫酸ナトリウムおよび硫酸ナトリウムをそ れぞれ５モル過量に使用し、NaOHでpHを７に調整し、過量の４Ｍの酢酸緩衝液を 用いてpHを維持した。10モル過量の硫酸ナトリウムを用い、塩酸でpHを８に調整 した最終pHについては、追加の緩衝液を使用しなかった。 別の方法としては、反応体積を少なくすることにより、付加反応を変形するこ とができる。例えば、等部（重量基準）のメタ重亜硫酸ナトリウムと硫酸ナトリ ウムとを含む溶液を用いることができる。最初は、スルファイト＋ビスルファイ ト塩の総％は32％であり、マトリックス１ｇあたり１ｍＬの「ビスルファイト」 溶液を用いた。後の反応においては、40％のスルファイト溶液（マトリックス１ ｇあたり0.7〜1.0ｍＬ）を用いた。この溶液の半量まで（マトリックス１ｇあた り0.2〜0.5ｍＬ）をマトリックスの事前洗浄に使用し、次に吸引乾燥し、一方、 残りの0.5ｍＬ／ｇを反応混合物に使用した。本方法に従って、大量反応（20〜2 50ｇのアリル化パーロツァ（Perloza）を使用）を行った。対照反応としては未 修飾のパーロツァ（Perloza）を用いた。 結果 初期の実験には、硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウムおよびアリル化セ ルロースを重量比１：１：10で使用し、その結果、付加（室温、24時問）は容易 に起こることが示された。過酸化物触媒の添加を要しなかったが、これは、フリ ーラジカル機構による付加反応であり、溶存酸素または痕跡量の過酸化物が開始 剤として作用していると考えられた（カラシュ（Karasch）¹⁰ら）。カラシュ（K arasch）らの報告¹⁰によれば、反応種はビスルファイトであり、ビスルファイ ト付加に好ましいpH範囲は５〜６であった。しかしながら、pH５において未緩衝 のビスルファイトを用いると、反応中にpHが低下し、付加量が少なくなった。pH の低下は、ビスルファイトが酸化により、より酸性のビスルフェートイオンにな るためと考えられた。より高温（60℃）での反応では付加率は低く（30％のアリ ルグリシジルエーテル化マトリックスにおいて0.031ｍＭ／ｇ、メルカプト酢酸 滴定値0.204mＭ／ｇ）、室温での付加は若干良かった（0.037ｍＭ／ｇ）。 室温、48時間におけるアリルグルシジルエーテル化パーロツァ（Perloza）へ のビスルファイト（pHを5.5に調整）の付加では、より高い収率が得られた（0.1 39ｍＭ／ｇ）。同様の付加において24時間後にpHを６に調整すると、滴定値は0. 192ｍＭ／ｇ（乾燥時1.30ｍＭ／ｇ）であった。メルカプト酢酸における比較値 は0.204ｍＭ／ｇ（乾燥時1.31ｍＭ／ｇ）であった。このことは、アリル基への ほぼ定量的な反応が行われたことを意味している。故に、続いて行う付加におい ては硫酸ナトリウムまたはアセテートを用い、pH５以上になるように反応を緩衝 した。硫酸ナトリウム（pH８に調整）を別のアリルグルシジルエーテル化パーロ ツァ（Perloza）サンプルと混合した場合には、ほとんど反応は起こらなかった 。滴定値は0.018ｍＭ／ｇであり、これに対応するメルカプト酢酸滴定値は0.206 ｍＭ／ｇであった。pH７においてはより迅速に付加が起こったが、滴定値は0.07 4ｍＭ／ｇと低かった。アリル化パーロツァ（Perloza）へのビスルファイト付加 における初期pHの影響については下記の表９に示す。 表９においては、pH６の実験は、最初にpH5.5で24時間反応させ、続いてpHを ６に調整してさらに24時間反応させた。他のすべてのサンプルについては、pHを 調整することなく48時間反応させた。pH５〜６の付加においては、アリルグルシ ジルエーテル化パーロツァ（Perloza）（メルカプト酢酸滴定値0.204ｍＭ／ｇ） を用いた。pH７および８においては、アリルグルシジルエーテル化パーロツァ（ Perloza）（メルカプト酢酸滴定値0.206ｍＭ／ｇ）を用いた。 表9 種々のpHにおけるビスルファイトの付加レベル pHの影響および反応容量に関する先に行われた実験結果は不定であった。アリ ルブロミド活性化パーロツァ（Perloza）を用いた同様の実験では、メルカプト 酢酸付加またはブロム化およびスルファイト置換によるものを用いた場合よりも 著しく低い結果が得られた。表３のビスルファイト付加（７および24時間、ＤＭ ＳＯサンプル）後の滴定値は、0.067および0.142ｍＭ／ｇであった。対応するメ ルカプトプロピオン酸滴定値はずっと高かった（0.145および0.202ｍＭ／ｇ）。 １ｍＬのビスルファイト試薬（重亜硫酸ナトリウムおよびビスルファイトを各 0.16ｇ含有）を用いたアリル化パーロツァ（Perloza）（１ｇ）の反応によって 、高度のスルファイト付加レベルが達成された。保存用アリルグリシジルエーテ ル化パーロツァ（Perloza）、７％アリルグリシジルエーテル化パーロツァ（Per loza）および10％アリルブロミド化パーロツァ（Perloza）に対する滴定値はそ れぞれ、0.160、0.161および0.213ｍＭ／ｇであり、これに対して、メルカプト 酢酸付加の場合はそれぞれ、0.153、0.180および0.252ｍＭ／ｇであった。アリ ルブロミ ド活性化パーロツァ（Perloza）における付加レベルは、メルカプト酢酸による それよりも依然として低かったが、先の結果よりも著しく向上した。10ｍＬにつ き硫酸ナトリウムおよびメタ重亜硫酸ナトリウムを各２ｇ含有するビスルファイ ト溶液を用いると、アリルブロミド活性化パーロツァ（Perloza）への付加は向 上するが、パーロツァ（Perloza）の量を20ｇまで増やすと、10％アリルブロミ ド活性化パーロツァ（Perloza）への付加は低下した（0.196ｍＭ／ｇ）。故に、 10％アリルブロミド活性化パーロツァ（Perloza）への付加に及ぼす時間、加熱 および触媒の影響について比較した。高い温度（60℃）においては付加レベルは 非常に低かった（0.070ｍＭ／ｇ）。特に理論があるわけではないが、これらの 結果は、高い温度においては、付加率に比べてスルファイトの酸化率の方が大き いことによるものと考えられた。触媒（発砲空気または過酸化水素）の添加では 変化はなかった。室温における24時間付加および48時間付加の間では、わずかな 上昇がみられた。滴定値の低い樹脂（空気触媒時、0.200ｍＭ／ｇ）をビスルフ ァイトと再び反応させると、滴定値は0.218ｍＭ／ｇに上昇した。同様に、先に 記載した10％アリルブロミド活性化パーロツァ（Perloza）の20ｇに対して繰り 返し付加を行うと、滴定値は0.216ｍＭ／ｇに上昇した。この繰り返し付加にあ たっては、樹脂１ｇあたり１ｍＬのビスルファイト溶液を調製し、そのうち半量 を樹脂への事前溶媒化（水の置き換え）に用い、次に吸引乾燥した。残りの半量 のビスルファイト溶液を吸引乾燥した樹脂と48時間混合した。この方法は、少反 応量および高濃度試薬を用いたものであり、続いてのビスルファイト付加反応に 適していた。これらのビスルファイト付加の結果を表10にまとめる。 表10 重硫酸（ビスルファイト）ナトリウム付加の最適化 化学的性質 リガンド 滴定値 乾燥重量 置換 アリルブロミド活性化レベルが高い場合においては、ビスルファイトは、メル カプト酢酸付加と一致しなかった。可能なレベルの85〜90％に達しているにもか かわらず、反応はそれ以上の変化を見せなかった。これも特に理論があるわけで はないが、反応の落ち込みは、高活性化レベルにおける電荷遮蔽によるものと考 えられる。メルカプト酢酸においては、付加部および樹脂生成物は電荷を帯びて いないが、ビスルファイトおよびスルフォネート樹脂生成物は負の電荷を帯びて いる。従って、静電斥力がアリル基の一部への接近を制限していると考えられる 。この制限の度合いは、アリル基の総密度が増すと上昇すると予想された。ビス ルファイトを用いた保存用７％アリルブロミド化パーロツァ（Perloza）の反応 では滴定値は1.25ｍＭ／ｇ（乾燥時）であり、それに対して、メルカプト酢酸付 加の場合には1.36ｍＭ／ｇ（乾燥時）であった。しかしながら、スルフォネート 樹脂へのメルカプト酢酸の付加においては、プロトン化型およびNa⁺型の間で差 異はみられなかった（両方とも乾燥時、1.25ｍＭ／ｇ）。理論があるわけではな いが、このことから、スルフォネート基は、付加試薬の性質とは無関係に一部の アリル基への接近を制限することが示唆された。しかしながら、臭素水滴定では アリル基は検出されなかったが、これは、存在するアリル基の量が少なすぎて、 本方法によって迅速、正確に検出できないためと考えられ、なぜならば、自然脱 色の速度が遅いからである。しかしながら、未反応基への臭素の接近は制限され ていた と考えられる。メルカプトエタノールを用いて未反応基をブロックしようとした が、ＭＡＡがスルフォネート樹脂と反応しないようだったため、ほとんど効果が なかった。もし残っている基がビスルファイトまたは少量のチオールと反応しな いならば、これらが巨大分子と相互作用することは期待できず、従って、タンパ ク質クロマトグラフィーに有用である。 実施例９−アリル基へのシステイン、システアミンおよびＭＥＰ付加法 最初の付加反応には、非緩衝のシステイン塩酸塩を用いた。反応は、アリルグ リシジルエーテル活性化パーロツァ（Perloza）（１ｇ）、0.08ｇのシステイン 塩酸塩および５ｍＬの水を用いて60℃、16時間行った。続いて、システイン（塩 酸塩ではない）を用いた（５モル過量、50μＬのギ酸を含む、または含まない） 。 ギ酸の代わりに、トリクロロ酢酸、シュウ酸または酢酸も使用した（システイン １モルにつき１モル）。酢酸およびギ酸についてはより大量に使用した（５また は10モル等量）。システアミンおよび４−メルカプトエチルピリジン塩酸塩（５ モル過量）を１モル等量（7.5Ｍ）のNaOHで中和し、２〜５モル過量の有機酸を 用いて再び酸性にした。初期の反応においては、酢酸を用い、溶液は、アリルグ リシジルエーテル活性化パーロツァ（Perloza）と60℃、16時間反応させた。こ れらは、システアミン／アセテート付加混合物および４−メルカプトエチルピリ ジン／アセテート付加混合物と呼ぶ。次の付加においては、ギ酸を用いた（シス テアミン／ホルメート混合物および４−メルカプトエチルピリジン／ホルメート 混合物と呼ぶ）。 保存用７％アリルブロミド活性化パーロツァ（Perloza）に対するシステアミ ン／ホルメート（５モル過量）の初期付加反応は、アンモニウムパースルフェー ト（2.5ｍｇ）または過酸化ベンゾイル（3.6ｍｇ）を含む、または含まない条件 下、60℃、48時間反応行った。触媒を含まない別のサンプルを60℃、96時間反応 させた。保存用10％アリルブロミド活性化パーロツァ（Perloza）に対する同様 の付加は、10モル過量のシステアミン／ホルメートを用い、70〜75℃で24、48、 96および144時間行った。同様に、保存用６％アリルブロミド活性化パーロツァ （Perloza）をシステアミン／ホルメートと反応させた。対照サンプルとして、 保存用10％アリルブロミド活性化パーロツァ（Perloza）とシステアミン塩酸塩 を70℃、1 44時間反応させた。保存用10％アリルブロミド活性化パーロツァ（Perloza）（1 .7ｇ）への10モル過量のシステイン／ギ酸の付加反応は、同じ温度で行った（96 時間）。アリル化パーロツァ（Perloza）を用いた対照反応（60℃、96時間）に は、エタノールアミン（１モル等量のギ酸を含む、または含まない）を使用した 。対照反応はまた、未修飾パーロツァ（Perloza）およびシステアミン／ホルメ ートを用いて行った。 上述の反応に加えて、「ヒート」ランプ（タングスラム（Tungsram）250ワッ ト、超光、IR2）を用い、ＭＥＰ、システインおよびシステアミンの添加を60〜7 0℃で行ったが、この「ヒート」ランプは、波長の点から、フリーラジカル反応 には理想的な触媒ではなく、緩和な触媒と考えられた。中でも、メルカプトエチ ルピリジン（ＭＥＰ）塩酸塩（ＭＥＰ、0.52ｇ）は0.5ｍＬの水に溶解し、0.3ｍ Ｌの10ＭのNaOHおよび0.6ｍＬの氷酢酸と混合した。30ｍＬのビーカー内でＭＥ Ｐアセテート溶液を３ｇのアリル化パーロツァ（Perloza）（0.203ｍＭ／ｇ；乾 燥時1.45ｍＭ／ｇ）と混合し、プラスチックフィルムで密閉し、３時間照射した （ランプはビーカーの一番上から15〜20cmの位置）。反応混合物はいくらか温ま ったが、それは30〜40℃程度であった。得られた樹脂のピリジン滴定値は0.24ｍ Ｍ／ｇ（乾燥時1.36ｍＭ／ｇ）であった。 結果 上述のチオール付加において有効であった条件（60℃、16時間）を用いてのア リルグリシジルエーテル化パーロツァ（Perloza）マトリックス（１ｇ）へのシ ステイン塩酸塩（0.08ｇ）の付加は限定されたものであった（0.013ｍＭ／ｇ、 メルカプト酢酸滴定値は0.134ｍＭ／ｇ）。別のアリルグリシジルエーテル化パ ーロツァ（Perloza）サンプル（１ｇ）へのシステアミン塩酸塩（５モル過量、0 .12ｇ）の付加レベルはもっと低かった（0.006ｍＭ／ｇ、メルカプト酢酸滴定値 は0.204ｍＭ／ｇ））。リン酸存在下では、グルタチオンの付加が制限されたこ とから、システイン塩酸塩をシステイン（５モル過量、0.1ｇ）に置き換え、１ モル過量のギ酸を加えた、または加えなかった。ギ酸存在下では、付加はよりよ く行われた（ギ酸なしの場合0.012ｍＭ／ｇに対して、ギ酸ありの場合0.063ｍＭ ／ｇ）。別のアリルグリシジルエーテル化マトリックス（メルカプト酢酸による 滴定値0.08 2ｍＭ／ｇ）へのシステアミン／ギ酸付加における滴定値は0.035ｍＭ／ｇであっ た。ギ酸を酢酸に置き換えても目立った変化はなかったが（0.033ｍＭ／ｇ）、 ＴＣＡおよびシュウ酸は効果が低かった（0.025および0.007ｍＭ／ｇ）。これら の結果は、酸強度の効果を示しており、後者２つはギ酸および酢酸よりも強い酸 である。水中でのシュウ酸の分解およびその二番目のカルボキシル基は、反応に 対して負の影響を与えていると考えられた。ギ酸または酢酸の１モル過量または 10モル過量の使用についてはほとんど差がなかった（0.033〜0.035ｍＭ／ｇの範 囲）。60℃における繰り返し付加では滴定値が0.055ｍＭ／ｇまで上昇したが、 室温での付加では滴定値は上昇しなかった。システアミン／アセテートおよび４ −メルカプトエチルピリジン／アセテートを用いた単回付加でも同様の結果が得 られた（前者は0.032ｍＭ／ｇ、後者は0.043ｍＭ／ｇ）。 アリルブロミド化パーロツァ（Perloza）（メルカプト酢酸滴定値0.180ｍＭ／ ｇ）を用いたシステアミン／ホルメート反応（60℃、48時間）においては、より 良好な結果が得られたが、アンモニウムパースルフェートまたは過酸化ベンゾイ ルを加えても向上しなかった（表11）。触媒なしのサンプルを同じ温度で96時間 反応させた場合の滴定値は0.103ｍＭ／ｇであった。非常に活性化されたアリル ブロミド化パーロツァ（Perloza）（メルカプト酢酸滴定値0.249ｍＭ／ｇ）にお いては、システアミン／ホルメートを用いて70℃、長時間反応（96時間）を行っ たところ、付加の限界値（0.128ｍＭ／ｇ）が得られた。24、48および144時間に おける滴定値はそれそれ0.054、0.098および0.129ｍＭ／ｇであった。新たにシ ステアミン／ホルメートを用いて反応を繰り返した場合には、わずかに上昇がみ られた（0.135ｍＭ／ｇ）。しかしながら、この付加レベルは、少量反応を行う ことにより改善されるものと考えられた。システアミン塩酸（ギ酸を含まず）を 用いると、結果はより低くなった。システイン（10モル過量）／ギ酸の付加（70 ℃）では、システアミンと同程度の結果（0.114ｍＭ／ｇ）が得られた。低置換 アリルブロミド化樹脂（メルカプト酢酸滴定値0.139ｍＭ／ｇ）へのシステアミ ン／ギ酸付加では、滴定値は0.110ｍＭ／ｇであった（効率79％）。これらの結 果を表11にまとめる。 表11においては、システアミン塩酸塩を用いた１サンプルを除いては、システ アミンとはシステアミン／ホルメート混合物を指す。特に示している以外は、60 ℃におけるシステアミン付加には保存用７％アリルブロミド化パーロツァ（Perl oza）を用い、70℃における付加には保存用10％アリルブロミド化パーロツァ（P erloza）を用いた。 表11 アリル化パーロツァ(Perloza)へのシステアミンおよびシステインの付加レベル システインおよびシステアミンの付加は起こったが、それらの反応性は他のア ミン含有リガンドであるグルタチオンよりもかなり低かった。特に理論があるわ けではないが、グルタチオンはアミン基に対して過剰の酸を有しており（用いた 溶液のpHは２であった）、チオール基に最も隣接した窒素は中性アミド結合の一 部を構成していることに留意されたい。 ＭＥＰの代わりにシステアミン塩酸塩を用いて同様の実験を行った。アミン滴 定値は0.134ｍＭ／ｇ（乾燥時1.04ｍＭ／ｇ）であった。NaOH/酢酸を用いないＭ ＥＰ塩酸塩を用いた同様の実験においては、付加は起こらなかった。酢酸緩衝液 を用いない場合の溶液のpHは２以下であった。芳香環（メルカプトベンズイミダ ゾールおよび４−メルカプトピリジン）に直接結合したチオール、または酢酸緩 衝した「イリデーション」法を用いたプロピルメルカプタンについては、付加は 起こらなかった。水（１ｍＬ）およびギ酸（0.2ｍＬ）に混合したシステイン（0 .12ｇ）のアリル化パーロツァ（Perloza）（0.054ｍＭ／ｇ、４ｇ）への付加は 、この方法で良好に行われた。付加レベルの滴定値は0.053ｍＭ／ｇであった（p H11においてブランク滴定を行って補正した後の値）。 二重結合とギ酸の反応についての報告（ナイト（Knight）ら¹⁹）はあるが、観 察された滴定値から、アミン基がパーロツァ（Perloza）に結合していることに 間違いない。エタノールアミン（ギ酸を含むまたは含まない）を用いた（60℃、 96時間）場合のアリル化パーロツァ（Perloza）とアミン基との間、またはシス テアミン／ホルメートと未修飾パーロツァ（Perloza）との間においては、反応 はみられなかった。滴定値はすべて0.001ｍＭ／ｇであり、開始pHは4.88〜4.96 の間であった。アリル化パーロツァ（Perloza）へのシステアミン／ホルメート の付加における対応する滴定値は0.080ｍＭ／ｇであり、開始pHは10.20であった 。リガンドのチオール基およびマトリックスのアリル基は、両者とも付加に必須 であった。アリル基へのアミンのフリーラジカル付加は期待されなかった（カド ガン（Cadogan）とパーキンス（Perkins）²⁰）が、エタノールアミンを用いた結 果がこれを支持していた。ギ酸／酢酸の効果は、触媒性またはアミン基の「マス キング」によるものと考えられた。 酸素を除去することなく、触媒を簡便に利用する方法をこれらの実施例におい て用いた。これらの条件下においては、化学触媒の利用による利点は観察されな かった。70℃以上の反応温度では反応収率が向上した。より適切なラジカル化触 媒を用いることにより、より良好な結果が期待される。これらの反応は、メルカ プトエタノールおよびメルカプト酸類による反応に比べるとかなり効率が下がる が、特に優れた触媒技術を用いることにより、経済的に行うことができる。チオ ール基を介しての反応が特異性を有することは、従来法によるチオールの結合よ りも優れている。 実施例10−アリル基へのチオール酢酸およびチオフェノール付加法 アリルグリシジルエーテル活性化パーロツァ（Perloza）をチオール酢酸（100 μＬ）および５ｍＬの水と室温で24時間または60℃で16時間反応させた。別の室 温反応においては、水ではなく、エタノール溶媒を用いた。アリルグリシジルエ ーテル活性化パーロツァ（Perloza）は、５倍量の50％および100％のエタノール でそれぞれ洗浄し、吸引乾燥し、チオール酢酸および５ｍＬのエタノールと混合 した。チオール酢酸（0.2ｍＬ）の付加には、水溶媒化アリルブロミド化パーロ ツァ（Perloza）（保存用７％）を使用し、水およびエタノール各２ｍＬを加え 、室 温で90時間行った。 チオフェノール（0.2ｍＬ）は、７％保存用アリルブロミド化パーロツァ（Per loza）（１ｇ）、２ｍＬの水、ならびに３ｍＬのアセトンもしくはエタノールと 混合し、室温で90時間反応させた。 チオールアセテート樹脂は20倍量の水で洗浄した。チオフェノール樹脂は、そ れぞれ10倍量のエタノール、0.1ＭのNaOHおよび水で洗浄した。未反応のアリル 基は、メルカプト酢酸の「逆」滴定によって定量した。 結果 チオール酢酸（100μＬ）を用いた場合の結果は、いくらか反応が起こったが 、完了にはほど遠いものであった。メルカプト酢酸を用いた「逆」滴定による分 析から、チオールエステルが加水分解しているおよび／またはチオール基が酸化 されていることがわかった。元のメルカプト酢酸滴定値が0.135ｍＭ／ｇであっ たのに対して、水性反応サンプルの逆滴定値は、0.105ｍＭ／ｇ（60℃）および0 .112ｍＭ／ｇ（室温）であった。これは、チオールアセテート基の0.029および0 .023ｍＭ／ｇと等価であった。エタノール／水混合物を用いた付加においても同 様の結果が得られた（チオアセテート基において0.023ｍＭ／ｇ）。100％のエタ ノール溶媒を用いても結果は向上しなかった。これらの付加レベルの低さは、チ オ酢酸の強い酸度（１％溶液のpHは1.95）によるものと考えられ、これは、使用 する溶媒によって打ち消すことができる。より強力な触媒の使用が必要であろう 。 ７％アリル化パーロツァ（Perloza）へのチオフェノールの付加は起こってい るであったが、可能なレベル（ＭＡＡによる）のわずか20〜25％にすぎなかった 。アセトン溶媒化およびエタノール溶媒化サンプルの逆滴定値は、それそれ0.13 7および0.128ｍＭ／ｇであった。元のメルカプト酢酸滴定値は0.174ｍＭ／ｇで あったことから、チオフェノールの付加レベルは0.037および0.046ｍＭ／ｇであ った。さらに、紫外線照射または同様の方法を用いることにより、アリル化パー ロツァ（Perloza）へのチオフェノールの付加効率を上げることができる。 実施例11−チオールリガンドを含有する樹脂を用いたアフィニティークロマト グラフィー ２％アリル化パーロツァ（Perloza）（アリルブロミドから上述に従って調製 さ れたもの）へのメルカプト酢酸付加によって調製されたメルカプト酢酸パーロツ ァ（Perloza）（0.054ｍＭ／ｇ、３ｇ）をエチルジメチルアミノプロピルカルボ ジイミド（ＥＤＣ、0.15ｇ）およびｐ−アミノベンズアミジン二塩酸塩（0.15ｇ ）とpHを4.7に調製しながら24時間反応させた（pHは最初の２時間制御した）。 新たにＥＤＣ（0.1ｇ）を加えて反応を繰り返した。ヒクソン（Hixson）らの記 載(Arch．Biochem．Biophys.，154: 501-509(1973))に従い、この樹脂を粗トリ プシン（11型、シグマ・ケミカル（Sigma Chemical）社）のアフィニティークロ マトグラフィーに使用した。pH8.2（0.5ＭのNaClを含むまたは含まない）におい て強力な吸着がみられ、pH2.5（50ｍＭのギ酸）において溶出した。非常に精製 されたトリプシンが得られ、このことは、280ｎｍにおいて吸収を示す物質が除 去されていること、高イオン強度での洗浄および電気泳動による純度（IX型トリ プシンと等電荷）によって確認した。 実施例12−チオールリガンドを有する樹脂を用いたクロマトグラフィー 上述に従って調製したメルカプトエチルピリジン（ＭＥＰ）パーロツァ（Perl oza）（標準ピリジン滴定曲線（開始pHは6.8）を有する）をバートン（Burton） らの方法¹に従って使用し、粗サブチリシンおよびアミラーゼを吸着させ、pHの 変化によって溶出させた。両酵素とも、pH7.5（20ｍＭのＨＥＰＥＳ＋0.5ＭのNa Cl）においてカラムにかけ、pH5.2（20ｍＭのアセテート）において溶出させた 。アリル活性化、ブロム化および求核置換によって精製したこれらのＭＥＰ樹脂 のクロマトグラフィー特性については区別できなかった。 上述の発明について、明らかにし、理解を深める目的で、実施例を用いて詳細 を記載してきたが、いくらかの変更および修飾は本請求の範囲に含まれることは 明らかである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．標的化合物と結合することができ、スルフィド、スルフォキシドまたはスル フォン反応性基からなる結合基を介してマトリックスに共有結合しているリガ ンドを有する支持マトリックスを含むクロマトグラフィー樹脂の調製方法であ って、 （ａ）エチレン系不飽和反応性基が結合している支持マトリックスを生成し、 （ｂ）該マトリックスに共有−ＳＲ結合を形成するのに十分なフリーラジカル 条件下において、上記のマトリックス（ａ）を構造式Ｒ−ＳＨで表される反 応性チオール化合物と反応させ（ここで、Ｒは標的化合物と結合することが できるリガンド）、さらに、 （ｃ）必要に応じて、該スルフィド結合を酸化してスルフォキシドまたはスル フォンとする ことからなる方法。 ２．該マトリックスが無機固体支持体であることを特徴とする請求の範囲第１項 記載の方法。 ３．該無機固体支持体が、シリカ、アルミナおよびゼオライト類からなる群から 選択されることを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。 ４．該マトリックスが有機固体支持体であることを特徴とする請求の範囲第１項 記載の方法。 ５．該有機固体マトリックスが、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリ アクリレート類、ポリスチレンおよびポリアクリルアミドからなる群から選択 されることを特徴とする請求の範囲第４項記載の方法。 ６．該エチレン系不飽和反応性基が構造式＞Ｃ＝ＣＨ₂で表される末端オレフィ ンを含むことを特徴とする請求の範囲第４項記載の方法。 ７．該末端オレフィンがアリル基であることを特徴とする請求の範囲第６記載の 方法。 ８．該アリル基が、アリルハライドおよびアリルグリシジルエーテルからなる群 から選択される反応性アリル基に由来するものであることを特徴とする請求の 範囲第７項記載の方法。 ９．該リガンドが、スルフィド結合を介して該マトリックスに共有結合している ことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 10．該リガンドが、スルフォキシド結合を介して該マトリックスに共有結合して いることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 11．該リガンドが、スルフォン結合を介して該マトリックスに共有結合している ことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 12．該リガンドが、アミノ、ヒドロカルビルアミノ、ジヒドロカルビルアミノ、 ヒドロキシル、カルボキシル、スルフェート、ホスフェート、ヘテロアリール およびカルボアミジン反応性基からなる群から選択される１個またはそれ以上 の反応性基を有することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 13．標的化合物と結合することができ、結合基を介してマトリックスに共有結合 しているリガンド（ここで、該リガンドは末端スルフォネート反応性基を有す る）を有する支持マトリックスを含むクロマトグラフィー樹脂の調製方法であ って、 （ａ）エチレン系不飽和反応性基が結合している支持マトリックスを生成し、 （ｂ）該マトリックスにスルフォネート基の共有結合を形成するのに十分なフ リーラジカル条件下において、上記のマトリックス（ａ）をビスルファイト 塩と反応させる、 ことからなる方法。 14．該マトリックスが有機固体支持体であることを特徴とする請求の範囲第13項 記載の方法。 15．該マトリックスが無機固体支持体であることを特徴とする請求の範囲第14項 記載の方法。 16．該無機固体支持体が、シリカ、アルミナおよびゼオライト類からなる群から 選択されることを特徴とする請求の範囲第15項記載の方法。 17．該エチレン系不飽和反応性基が構造式＞Ｃ＝ＣＨ₂で表される末端オレフィ ンを含むことを特徴とする請求の範囲第14項記載の方法。 18．該末端オレフィンが非共役オレフィンであることを特徴とする請求の範囲第 16項記載の方法。 19．該非共役末端オレフィンがアリル基であることを特徴とする請求の範囲第18 項記載の方法。 20．該アリル基が、アリルハライドおよびアリルグリシジルエーテルからなる群 から選択される反応性アリル基に由来するものであることを特徴とする請求の 範囲第19項記載の方法。