CN103958017B - 用于疏水性置换色谱法的阴离子置换剂分子 - Google Patents

Abstract

通过反相置换色谱法从混合物中分离有机化合物的方法，包括提供疏水性固定相；向疏水性固定相施加包含待分离的有机化合物的混合物；通过向疏水性固定相施加包含非表面活性疏水性阴离子置换剂分子和约10wt％以下的有机溶剂的水性组合物而从疏水性固定相置换有机化合物；以及收集从疏水性固定相洗脱的含有被分离的有机化合物的多个馏分；其中所述非表面活性疏水性阴离子置换剂分子包含疏水性阴离子和反离子CI，其如说明书中所定义的具有通式A或B：[CM][CI]d[CM-R*-CM’][CI]d？AB。[CM][CI]_d？？？？？？A，[CM-R*-CM’][CI]_d，B。

Description

用于疏水性置换色谱法的阴离子置换剂分子

背景技术

置换色谱法(DC)是三种已知的柱色谱形式——洗脱色谱法、置换色谱法、前沿色谱法——之一。DC主要是一种制备方法，但也有使用具有填充的“窄孔”或毛细管柱的“微制备”DC的分析应用。

当有可用的合适的高纯度置换剂分子时，可以使用四种常规的色谱方法中的任一种来进行置换色谱法。DC用于(a)离子交换色谱(阳离子交换、阴离子交换)，(b)疏水性色谱(反相、疏水相互作用、疏水电荷诱导、嗜硫)，(c)正相色谱，包括亲水相互作用色谱(HILIC)，和(d)固定化金属离子亲和色谱(IMAC)。

采用优化的DC，可以同时获得高纯度(高分辨率)、高回收率(高收率)和高柱加载(高容量)——后者大大高于过载的制备洗脱色谱法。在大多数情况下，这些优势不仅仅补偿了DC的缺点(较慢的流速、较长的运行时间、需要高纯度置换剂)。

通过选择(a)合适的色谱方法、(b)适当的具有合适尺寸的色谱柱、(c)合适的流动相条件、(d)适当的置换剂分子和(e)适当的操作方案与适当配置的LC装置来进行置换色谱法。最初，选择适当的“弱置换的流动相”(载体)，且在适当的流速下使柱平衡。载体可以含有被调节至有用的pH值的pH缓冲化合物。最佳的置换流速倾向于低，通常在35-105cm/hr的范围内，虽然有时候会更高。在样品加载流速下将适量的样品溶液加载到柱上。样品溶液含有载体中的待纯化的物质以及若样品或置换剂分子带有电荷则含有适当水平的离子配对剂或离子配对盐。通常的样品加载量为有效穿透容量(operativebreakthroughcapacity)的50-80％。随后，将由适当的置换剂化合物在载体溶液中以适当的浓度制备的置换剂流动相(置换剂缓冲剂)在置换流速下泵送到柱上直至观察到置换剂穿透。纯化的样品在置换剂穿透的前沿之前从柱中出来。收集从柱中出来的馏分，并单独分析其含量和纯度。最后，使用“置换剂去除溶液”从柱中去除置换剂，随后将柱清洁并再生至其原始状态用于保存或用于随后的使用。

尽管不同于洗脱色谱法，但在某些方面，置换色谱法易于理解和易于实施。在DC中，样品被置换剂从柱中“置换”，而不是被流动相从柱中“洗脱”。当在线监测(例如，经UV吸收、pH或电导率)柱的输出时，获得“置换队列(displacementtrain)”，而不是“洗脱色谱图”。置换队列由并列的“置换带(displacementbands)”组成，而不是在色谱图中由溶剂分离的“洗脱峰”组成。当置换带足够大，以至于使固定相饱和时，形成梯形的“饱和带”。当置换带不大到足以使固定相饱和时，形成小的、三角形的“非饱和带”。饱和带的高度通过操作点的结合等温线来确定；梯形带或三角形带的面积与组分的量成正比。

疏水性色谱法几乎完全取决于水的独特的溶剂化性质，这些性质来自该高度结构化的、自身缔合的、氢键结合的液体。对于常规的反相色谱固定相(不带电荷的C₁₈柱)，结合通常由熵驱动(+TΔS)，其经常必须克服不利的焓(+ΔH)。因此，在色谱工作者经常使用的温度范围内(10-70℃)，被分析物结合和置换剂结合经常随着温度增加而增强。疏水性色谱的另一有用的特征是使用添加剂，其改变水基溶剂的自身氢键结合的结构和强度。这些添加剂包括：色谱缓冲剂中的盐(NaCl、K₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄)、有机溶剂(MeCN、MeOH、EtOH)和极性有机分子(尿素、寡聚乙二醇)。

可以使用手性被分析物、手性置换剂和手性色谱基质来实施疏水性置换色谱法。在这些条件下，可以使用非手性置换剂，但不能使用手性置换剂的外消旋混合物。还可以使用非手性色谱柱和非手性置换剂来纯化外消旋手性被分析物。在这种情况下，将包括非对映异构体在内的杂质从所关注的外消旋化合物中去除，但没有对映体的手性拆分。阴离子置换剂可以含有一个或多个手性中心。通过适当地选择手性色谱基质、流动相和非手性置换剂，以制备规模来常规地拆分(分离)对映体。取决于具体的环境，当在手性固定相上进行对映体的置换分离时，相对于好的非手性置换剂，好的、对映纯的手性置换剂可以具有操作上的优势。

好的疏水性置换剂分子应当具有化学和物理性质的独特组合，以便使其有效地起作用。某些可溶的疏水性分子可以用作置换剂，但仅有少数几种很好地起作用。本文件所述的很多分子满足对于很好地起作用的置换剂的必要的要求。

由于适当的高纯度置换剂分子的不可得，已阻碍了有用的反相制备置换色谱法的开发。例如美国专利第6,239,262号描述了使用低分子量表面活性化合物作为置换剂的各种反相液相色谱系统。美国专利第6,239,262号公开了极宽范围的可以与疏水性部分偶联以形成用作所公开的置换剂的表面活性化合物的可能的带电荷部分，但公开了必须包括大量的有机溶剂以减轻所公开的置换剂的表面活性。这样大量有机溶剂的存在显著改变了该过程，减少了反相疏水性置换色谱法的益处。此外，美国专利第6,239,262号所公开的表面活性的置换剂化合物不能很好地起作用，导致相对差质量的置换队列，其中在“纯化的”产物中可以存在显著水平的杂质。

我们在此描述了新的置换剂分子和使用它们的方法，其可用于各种形式的疏水性置换色谱法。

发明内容

我们已发现并开发了很多类带有负电荷的疏水性有机化合物，其为盐或两性离子，其独特地具有对于疏水性置换色谱法中好的置换剂行为所必需的化学和物理性质的组合。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及通过反相置换色谱法从混合物分离有机化合物的方法，其包括：

提供疏水性固定相；

向所述疏水性固定相施加包含待分离的有机化合物的混合物；

通过向所述疏水性固定相施加包含非表面活性疏水性阴离子置换剂分子的水性组合物而从所述疏水性固定相置换所述有机化合物；以及

收集从所述疏水性固定相洗脱的含有被分离的有机化合物的多个馏分；

其中所述非表面活性疏水性阴离子置换剂分子包含疏水性阴离子和反离子CI，其具有通式A或B：

[CM][CI]_d[CM-R*-CM’][CI]_d

AB

其中在通式A和B中，各CM或CM’独立地为带有负形式电荷的疏水性化学部分，所述化学部分选自：羧酸盐(XVI)、N-酰基-α-氨基酸(XVII)、磺酸盐(XVIII)、硫酸盐单酯(XIX)、磷酸盐单酯(XX)、磷酸盐二酯(XXI)、膦酸盐单酯(XXII)、膦酸盐(XXIII)、四芳基硼酸盐(XXIV)、硼酸盐(XXV)、硼酸盐酯(XXVI)；其中所述化学部分(XVI)-(XXVI)具有以下化学式：

其中在通式B中，CM和CM’独立地为带有相同或相反的形式电荷的带电荷的化学部分，且通过双连接的化学部分R*而彼此化学地连接，其中R*替换CM上的一个R¹、R²(若存在)、R³(若存在)或R⁴(若存在)化学部分且替换CM’上的一个R^1'、R^2'(若存在)、R^3'(若存在)或R^4'(若存在)化学部分(在此，CM'上的R基团用符号(')表示，例如，R^1'是CM'上的R¹基团)；

其中各R¹、R^1'、R²、R^2'、R³、R^3'、R⁴和R^4'是独立地由下式定义的直链或支链的化学部分，

-C_xX_2x-2r-AR¹-C_uX_2u-2s-AR²，

R*是直接化学键或是由下式定义的双连接的直链或支链的化学部分，

-C_xX_2x-2r-AR¹-C_uX_2u-2s-，

且各R⁵和R^5'独立地为由下式定义的直链或支链的化学部分，

-C_xX_2x-2r-AR²；

其中各AR¹独立地为双连接的亚甲基部分(-CX¹X²-，衍生自甲烷)、双连接的亚苯基部分(-C₆G₄-，衍生自苯)、双连接的亚萘基部分(-C₁₀G₆-，衍生自萘)或双连接的亚联苯基部分(-C₁₂G₈-，衍生自联苯)；

其中AR²独立地为氢(-H)、氟(-F)、苯基(-C₆G₅)、萘基(-C₁₀G₇)或联苯基(-C₁₂G₉)；

其中各X、X¹和X²各自独立地为-H、-F、-Cl或-OH；

其中任意-C_xX_2x-2r-内或任意-C_uX_2u-2s-内或任意-(CX¹X²)_p-内的任意亚甲基部分(-CX¹X²-)可以各自独立地被独立的醚-氧原子-O-、独立的硫醚-硫原子-S-或独立的酮-羰基-C(O)-替换，其方式为使得各醚-氧原子、各硫醚-硫原子或各酮-羰基的每一侧与脂肪族碳原子或芳香族碳原子键合；

其中任何-C_xX_2x-2r-或任何-C_uX_2u-2s-内可替换有不超过两个醚-氧原子、不超过两个硫醚-硫原子和不超过两个酮-羰基；

其中m_x是各-C_xX_2x-2r-中被醚-氧原子、硫醚-硫原子和酮-羰基替换的亚甲基的总数目，且m_u是各-C_uX_2u-2s-中被醚-氧原子、硫醚-硫原子和酮-羰基替换的亚甲基的总数目；

其中G各自独立地为-H、-F、-Cl、-CH₃、-OH、-OCH₃、-N(CH₃)₂、-CF₃、-CO₂Me、-CO₂NH₂；-CO₂NHMe、-CO₂NMe₂的任意组合；

其中G*各自独立地为-F、-Cl、-R²、-OH、-OR²、-NR²R³、-CF₃、-CO₂Me、-CO₂NH₂；-CO₂NHMe、-CO₂NMe₂的任意组合；

其中一对R²、R^2'、R³、R^3'、R⁴和R^4'可以包含单独的化学部分，从而R²/R³、R²/R⁴、R³/R⁴、R^2’/R^3’、R^2’/R^4’或R^3’/R^4’各自独立地为-(CX¹X²)_p-，其中p＝3、4、5或6；

其中对于各R¹、R^1'、R²、R^2'、R³、R^3'、R⁴、R^4'、R⁵、R^5'和R*，各x、r、u、s、m_x、m_u的整数值独立地选择，整数值r和s是所含的分离的顺式/反式烯类(烯烃)基团的总数加上所含的简单单环结构的总数且落在以下范围内：0≤r≤2和0≤s≤2，数值x+u-m_x-m_u落在以下范围内：0≤x+u-m_x-m_u≤11；

其中在A或B的CM或CM’内含有至少一个芳香族化学部分、杂环芳香族化学部分、咪唑啉化学部分、脒化学部分或胍化学部分；

其中各R化学部分的基团-疏水-指数(n)在数值上等于脂肪族碳原子的数目加上烯类碳原子的数目加上硫醚-硫原子的数目加上氯原子的数目加上氟原子的数目的五分之一加上醚-氧原子的数目的一半加上酮-碳原子的数目的一半加上数目超过六个的芳香族碳原子的数目的一半的总和减去超过一个的羟基氧原子的数目；

其中各[CM]或[CM-R*-CM’]的总-疏水-指数(N)在数值上等于脂肪族碳原子的数目加上烯类碳原子的数目加上硫醚-硫原子的数目加上氯原子的数目加上氟原子的数目的五分之一加上醚-氧原子的数目的一半加上酮-碳原子的数目的一半加上数目超过六个的芳香族碳原子的数目的一半的总和减去超过一个的羟基氧原子的数目；

其中R¹和R^1’的基团-疏水-指数(¹n和^1’n)落在以下范围内：4.0<¹n,^1’n<12.0，当存在时，R²、R^2’、R³、R^3’、R⁵、R^5’、R*基团-疏水-指数(²n、^2’n、³n、^3’n、⁵n、^5’n和*n)落在以下范围内：0.0≤²n、^2’n、³n、^3’n、⁵n、^5’n、*n<12.0，且当存在时，R⁴和R^4’的基团-疏水-指数(⁴n和^4’n)落在以下范围内：0.0≤⁴n,^4’n≤5.0；

其中总-疏水-指数(N)除以g的值落在以下范围内：10.0≤N/g<24.0；

其中在A中，当带电荷的部分CM具有形式负电荷时，g＝1，且在B中，当CM和CM’均具有形式负电荷时，g＝2，且在B中，当CM和CM’具有相反的形式电荷且[CM-R*-CM']的总电荷为负时，g＝1；

其中对于环状化学部分所计算的基团-疏水-指数的数值平均分配在两个分别的R化学部分之间；

其中当仅有一个R化学部分连接至CM或CM’时，R¹或R^1'被识别为该R化学部分；其中当有超过一个R化学部分连接至CM或CM’时，R¹或R¹'被识别为具有基团-疏水-指数最大值的该R化学部分；其中当有超过三个R化学部分连接至CM或CM’时，R⁴或R^4'被识别为具有基团-疏水-指数最小值的该R化学部分；且

其中CI是非干扰性的、带相反电荷的反离子或这样的反离子的混合物，且d的值为零、正整数或正分数，从而保持整个疏水性化合物的电中性。

在一个实施方案中，包含非表面活性疏水性阴离子置换剂分子的水性组合物除了pH缓冲剂之外不含有添加的盐。

在一个实施方案中，CM具有通式XXIV或XXV：

其中在通式XXIV中，R¹是苯基、4-EtC₆H₄-、4-ⁿPrC₆H₄-、4-ⁿBuC₆H₄-、4-MeOC₆H₄-、4-FC₆H₄-、4-MeC₆H₄-、4-MeOC₆H₄-、4-EtC₆H₄-、4-ClC₆H₄-或C₆F₅-；且各R₂、R³和R⁴独立地为苯基、4-FC₆H₄-、4-MeC₆H₄-、4-MeOC₆H₄-、4-EtC₆H₄-、4-ClC₆H₄-或C₆F₅-；且

其中在通式XXV中，R¹是4-(4-ⁿBuC₆H₄)C₆H₄-或4-(4-ⁿBuC₆H₄)-3-ClC₆H₃-。

在一个实施方案中，CM具有选自以下的通式：4-R¹C₆H₄SO₃H、5-R⁶-2-HO-C₆H₃SO₃H、4-R¹-C₆H₄-C₆H₃X-4’-SO₃H和4-R¹-C₆H₄-C₆H₃X-3’-SO₃H，其中R¹是CH₃(CH₂)_n，其中n＝4-10且X是H或OH。

在一个实施方案中，CM具有通式XVIII或XXIII：

其中在通式XVIII中和在通式XXIII中，R¹是C₆H₅(CH₂)_n-，其中n＝5-11。

在一个实施方案中，CM具有选自以下的通式：5-R¹-2-HO-C₆H₃CO₂H和R¹C(O)NHCH(C₆H₅)CO₂H，其中R¹是CH₃(CH₂)_n-，其中n＝4-10。

在一个实施方案中，CM具有通式4-R¹C₆H₄PO₃H₂其中R¹是CH₃(CH₂)_n-，其中n＝4-10。

在一个实施方案中，CI是选自以下的非干扰性无机阳离子或这样的非干扰性阳离子的混合物：碱金属离子(Li⁺、Na⁺、K⁺、Rb⁺、Cs⁺)、碱土金属离子(Mg²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺)、二价过渡金属离子(Mn²⁺、Zn²⁺)和NH₄ ⁺；其中CI是选自以下的非干扰性有机阳离子或这样的非干扰性阳离子的混合物：质子化的伯胺(1+)、质子化的仲胺(1+)、质子化的叔胺(1+)、质子化的二胺(2+)、季铵盐离子(1+)、锍离子(1+)、氧化锍离子(1+)、鏻离子(1+)、双-季铵盐离子(2+)，其可以含有C₁-C₆烷基和/或C₂-C₄羟基烷基。

附图说明

图1A是对于根据本发明的示例性实施方案的置换色谱法过程将时间(x-轴)相对于相对吸收单位(y-轴)作图得到的粗合成肽的纯化的置换痕迹(displacementtrace)。

图1B是对于根据本发明的示例性实施方案的置换色谱法过程将馏分数(x-轴)相对于每一馏分中每一组份的浓度(μg/mL)作图得到的图1A中显示的置换数据的馏分分析。

图2A是对于根据本发明的示例性实施方案的置换色谱法过程将时间(x-轴)相对于相对吸收单位(y-轴)作图得到的粗合成寡核苷酸的纯化的置换痕迹。

具体实施方式

本文中针对根据本发明所采用的中性非表面活性阴离子置换剂化合物所用的“非表面活性”意指所述化合物的临界胶束浓度(“CMC”)大于根据本发明的置换色谱法过程中所采用的化合物的浓度。在一个实施方案中，在不存在有机溶剂、盐或其它会影响CMC的试剂时，非表面活性置换剂化合物的浓度低于该化合物在水中的CMC的约80％。在一个实施方案中，在不存在有机溶剂、盐或其它会影响CMC的试剂时，非表面活性置换剂化合物的浓度低于该化合物在水中的CMC的约60％。在一个实施方案中，在不存在有机溶剂、盐或其它会影响CMC的试剂时，非表面活性置换剂化合物的浓度低于该化合物在水中的CMC的约50％。

在一个实施方案中，包含根据本发明所采用的非表面活性疏水性阴离子置换剂分子的水性组合物由于以下的两种或更多种的组合而不表现出不利的表面活性特征：(1)阴离子非表面活性置换剂化合物以低于其CMC的浓度存在；(2)各[CM]或[CM-R*-CM’]的总-疏水-指数(N)除以g的值落在以下范围内：10≤N/g<24；(3)各R¹或R^1'的基团-疏水-指数(¹n)落在以下范围内：4<¹n<12，当存在时，各R²、R^2'、R³、R^3'、R⁵、R^5'和R*的基团-疏水-指数(²n、³n、⁵n和*n)落在以下范围内：0≤²n、³n、⁵n、*n<12，且当存在时，各R⁴或R^4'的基团-疏水-指数(⁴n)落在以下范围内：0≤⁴n≤5；(4)该组合物含有大于约5体积％或更多的有机溶剂。

本文所用的"低有机溶剂含量"一般性地指在例如包含根据本发明的非表面活性阴离子置换剂化合物的水性“载体”组合物中的有机溶剂含量为低于约25％体积比。在一个实施方案中，水性“载体”组合物的有机溶剂含量含有低于约20％体积比的任何有机溶剂。在一个实施方案中，水性“载体”组合物的有机溶剂含量含有低于约15％体积比的任何有机溶剂。在一个实施方案中，水性“载体”组合物的有机溶剂含量含有低于约10％体积比的任何有机溶剂。在一个实施方案中，水性“载体”组合物的有机溶剂含量含有低于约5％体积比的任何有机溶剂。在一个实施方案中，水性“载体”组合物不含有机溶剂。

在一个实施方案中，有机溶剂是甲醇(CH₃OH或MeOH)、乙醇(C₂H₅OH或EtOH)或乙腈(CH₃CN或MeCN)中的一种或者两种或更多种的混合物。在一个实施方案中，水性“载体”组合物含有适当的有机溶剂的混合物。在一个实施方案中，水性“载体”组合物不含有机溶剂。

可以使用手性被分析物、手性置换剂和手性色谱基质来实施疏水性置换色谱法。在这些条件下，可以使用手性置换剂，但不能使用手性置换剂的外消旋混合物。还可以使用非手性色谱柱和非手性置换剂来纯化外消旋的手性被分析物。在这种情况下，将包括非对映异构体在内的杂质从所关注的外消旋化合物中去除，但没有对映体的手性拆分。

阴离子置换剂可以含有一个或多个手性中心；参见例如手性置换剂化合物689和698(参见下表V-XIII)。置换剂613和639代表非手性的置换剂化合物。通过适当地选择手性色谱基质、流动相和非手性置换剂，以制备规模来常规地拆分(分离)对映体。取决于具体的环境，当在手性固定相上进行对映体的置换分离时，相对于好的非手性置换剂，好的、对映纯的手性置换剂可以具有操作上的优势。

可用的pH范围–取决于带电荷的部分的化学性质，具有通式A或B的多种类型的阴离子疏水性置换剂具有不同的可用的pH范围。含有可质子化的阴离子基团的阴离子疏水性置换剂应当在高于实际pKa值1-2单位以上的pH下操作。

·磺酸盐–通常，脂肪族磺酸盐(pKa～-1.9)和芳香族磺酸盐(pKa～-2.7)由于其非常低的pka值而具有宽的可用的pH范围，1-11。

·羧酸盐–通常，简单脂肪族羧酸盐(pKa～4.7)、N-酰基-α-苯基甘氨酸盐，pKa～3.0)、芳香族羧酸盐(苯甲酸盐，pKa～4.2)和水杨酸盐(邻-OH苯甲酸盐，pKa～3.0)分别具有6.7-10、5.0-10、6.2-10和5.0-10的可用的pH范围。即使在其完全去质子化的形式下，某些羧酸盐置换剂也具有溶解性限制。

·膦酸盐–膦酸盐是有用的阴离子置换剂，但其应用会由于第二酸解离(pK_a2)而复杂化。应当调节pH，使得置换剂大部分(>90％)处于其1-形式或大部分(>90％)处于其2-形式，以便在DC中获得好的色谱分辨率。通常，简单脂肪族膦酸盐(pKa～2.2,7.7)的可用的pH范围为4.2-6.7(1-)和8.7-10(2-)而简单芳香族膦酸盐(pKa～2.0,7.2)的可用的pH范围为4.0-6.2(1-)和8.2-10(2-)。适当设置的取代基很方便地改变芳香族膦酸的pKa值并改变其可用的pH范围。例如，芳香族膦酸中-PO₃H₂邻位的-OCH₃基团增加pK_a2值(2.3,7.9)而间位的-NO₂基团(pKa～1.5,6.4)或邻位的-OH基团(pKa～2.0,6.4)降低pK_a2值。

·四芳基硼酸盐–通常，这些分子限于中性pH范围(6-8)，这是由于该范围之外的水解不稳定性问题。某些四芳基硼酸盐具有溶解性限制且仅能与窄范围的阳离子-配对试剂一起使用。

·芳基硼酸盐–对于大部分置换剂应用，常规芳基硼酸的pKa值(pKa～8.9)太高，不能用于中性pH范围。即使采用吸电子基团，例如邻位的-NO₂(pKa～7.4)或间位的-Cl(pKa～8.1)，pKa值仍然太高。然而，通过添加某些多元醇而形成硼酸酯使得组合物具有较低的pKa值，在某些情况下低2.0-2.5pKa单位。多元醇分子的化学性质还影响所得的硼酸酯置换剂的疏水性和溶解性。可用的多元醇包括果糖、核糖、山梨醇、甘露醇、顺式-1,2-二羟基环戊烷和顺式-3,4-二羟基四氢呋喃，其使得置换剂在7.1-10.0的pH范围内可用。典型的多元醇浓度(mM)为置换剂浓度的约两倍或者比置换剂浓度高25mM，以较高的为准。

置换剂结合强度–置换剂应当比样品中所有组分更强地与柱结合或者至少比所有所关注的主要组分更强地结合。一个很好的经验法则是比置换剂更强地结合的样品质量应当不超过1-4％。

最佳的置换剂应当与固定相既不太强也不太弱地结合。适当的结合强度取决于所关注的被分析物和相关联的结合等温线。通常，对于多种不同的柱和待纯化的被分析物，需要具有一定范围结合强度的一系列置换剂。若置换剂结合过强，则获得很差的性能，例如较低的分辨率、较低的被分析物结合能力、难以去除置换剂以及更长的循环时间。若置换剂结合过弱，则可能导致很差的置换队列，其置换剂下方有太多的被置换的被分析物的“拖尾”，或者可能仅有部分的置换或者完全不发生置换。

一个有助于选择具有适当的结合强度的置换剂的方便的、经验法则的方法是，使用与要用于置换实验的类似的柱和流动相，对潜在的置换剂和被分析物实施简单的梯度洗脱色谱法。作为第一次筛选，在60分钟梯度中，置换剂应当比所关注的被分析物晚5-15分钟洗脱。理想的是，可以测量单一被分析物和被分析物的混合物的等温线，但这很耗时且经常不实用。由于其初期在结合等温线上操作，该经验法则的方法不完美，但为进一步的DC优化提供方便的出发点。

可用的结合等温线–除了适当的结合强度之外，可用的疏水性置换剂需要具有带有某些其它可用特征的结合等温线。

(1)置换剂和被分析物分子的单模态(monomodal)凸面向上等温线(朗缪尔型等温线行为)有利于有序地形成全同置换队列并简化方法优化过程。与许多其它不带电荷的疏水性置换剂分子的结合等温线相反，这是许多阴离子置换剂分子的有用的性质，所述其它不带电荷的疏水性置换剂分子例如芳香族醇(如，取代的苯酚、萘酚、羟基联苯)、脂肪族醇(如，1-十二醇、1,2-十二烷二醇)和不带电荷的脂肪族羧酸(如，肉豆蔻酸)，其在较低浓度下行为正常，然后在较高浓度下变成双模态并再次增加(BET型等温线行为)。该结合行为经常来自多层疏水性置换剂的沉积，每一层具有不同的结合特性。该结合行为使置换过程以及其可用的实施大大复杂化。

(2)当置换剂分子在溶液中发生自身缔合时，DC中的色谱结果也可能被复杂化。随着浓度增加，与置换剂自身缔合相关的问题变得更严重。同样，阴离子疏水性置换剂中的带电荷基团减少水溶液中的自身缔合问题。

(3)当产物和/或杂质等温线在更高的非线性结合区域与置换剂等温线交叉时，可能产生进一步的复杂性。该行为导致置换顺序的反转，加宽置换带之间的重叠区域和与共-置换相关的问题。在这种情况下，置换剂浓度的微小变化会导致置换队列的大变化，从而使得很难进行方法优化。

我们已经发现，补充有适当的反离子和(当需要时)少量有用的有机溶剂的适当设计的阴离子置换剂分子提供一系列有效的疏水性置换剂，其具有朗缪尔型结合行为和有用的结合强度范围。

用于阴离子置换剂的离子-配对阳离子–由于其所有这许多优势，阴离子疏水性置换剂分子具有一个额外的要求：适当的离子-配对阳离子，CI。阳离子显著影响置换剂的结合等温线和置换剂的功能和应用。通过添加适量的离子-配对阳离子的Cl^-/HCO₂ ^-盐，独立地调节阳离子的浓度。带电荷的疏水性置换剂的离子-配对阳离子的性质强烈影响其置换性质。在溶液中，离子-配对中涉及少数阳离子，而在疏水性基质上的吸附状态中，离子-配对中涉及所有阳离子。此外，在与被分析物(例如，pH＝7的阴离子寡核苷酸)的离子-配对中可以涉及阳离子。对于好的色谱分辨率，应当对置换剂和被分析物使用相同的离子-配对阳离子。可用的离子-配对阳离子通常为带有单电荷的。由于它们较高的溶剂化能量，二价离子(Ca²⁺)和三价离子(La³⁺)通常不那么有用，但可以用在某些专门的情况下。一般规则的例外是诸如Me₃N⁺(CH₂)₄N⁺Me₃的单一有机离子中隔开的多个带有单一电荷的部分。这些离子也可以用作二-阴离子置换剂的反离子。

具有更高疏水性的离子-配对阳离子倾向于增加结合强度并降低溶解性。此外，当使用疏水性置换剂时，若阳离子本身过于疏水或者过于亲水，则DC的分辨率可能下降。通常，阳离子的中等的疏水/亲水特性给出最好的结果，但这根据被纯化的分子而变化。对于每次纯化，应当通过实验来确定最佳的离子-配对阳离子。挥发性离子-配对试剂很方便地减压去除，而非挥发性试剂很容易通过其它方式去除：渗滤、沉淀或结晶。表I给出了可用的一价离子-配对阳离子的部分列表。当使用质子化的胺(pKa～9.8-11.0)、质子化的脒(pKa～12.5)或质子化的胍(pKa～13.5)离子-配对试剂时，操作pH应当比各胺的pKa低两个或更多个pH单位。

表I.具有增加的离子-配对强度的近似顺序的一价阳离子

Na⁺<K⁺<NH₄ ⁺<MeNH₃ ⁺

MeNH₃ ⁺<EtNH₃ ⁺<ⁿC₃H₇NH₃ ⁺<ⁿC₄H₉NH₃ ⁺<ⁿC₅H₁₁NH₃ ⁺<ⁿC₆H₁₃NH₃ ⁺

MeC(NH₂)₂ ⁺<EtC(NH₂)₂ ⁺<ⁿC₃H₇C(NH₂)₂ ⁺<ⁿC₄H₉C(NH₂)₂ ⁺<ⁿC₅H₁₁C(NH₂)₂ ⁺<ⁿC₆H₁₃C(NH₂)₂ ⁺

Me₂NC(NH₂)₂ ⁺<EtMeNC(NH₂)₂ ⁺<ⁿC₃H₇MeNC(NH₂)₂ ⁺<ⁿC₄H₉MeNC(NH₂)₂ ⁺<ⁿC₅H₁₁MeNC(NH₂)₂ ⁺<ⁿC₆H₁₃MeNC(NH₂)₂ ⁺

Me₂NH₂ ⁺<EtNMeH₂ ⁺<ⁿC₃H₇NMeH₂ ⁺<ⁿC₄H₉NMeH₂ ⁺<ⁿC₅H₁₁NMeH⁺<ⁿC₆H₁₃NMeH₂ ⁺Me₂NH₂ ⁺<Et₂NH₂ ⁺<(ⁿC₃H₇)₂NH₂ ⁺

Me₃NH⁺<EtNMe₂H⁺<ⁿC₃H₇NMe₂H⁺<ⁿC₄H₉NMe₂H⁺<ⁿC₅H₁₁NMe₂H⁺<ⁿC₆H₁₃NMe₂H⁺Me₃NH⁺<Et₂NMeH⁺<(ⁿC₃H₇)₂NMeH⁺

Me₃NH⁺<Et₃NH⁺<(ⁿC₃H₇)₃NH⁺

Me₄N⁺<EtNMe₃ ⁺<ⁿC₃H₇NMe₃ ⁺<ⁿC₄H₉NMe₃ ⁺<ⁿC₅H₁₁NMe₃ ⁺<ⁿC₆H₁₃NMe₃ ⁺

Me₄N⁺<Me₂N⁺Et₂<Me₂N⁺C₄H₈<(ⁿC₃H₇)₂NMe₂ ⁺

Me₄N⁺<Et₃NMe⁺<(ⁿC₃H₇)₃NMe⁺

Me₄N⁺<Et₄N⁺<(ⁿC₃H₇)₄N⁺

估计阴离子被分析物与RP基质的铵离子对辅助的结合

·疏水性和增强的结合随着脂肪族碳原子的数目增加。

·对于相同数目的脂肪族碳原子，伯铵基团比季铵基团更好地增强被分析物结合(正丁基-NH₃ ⁺>Et₂NH₂ ⁺>EtMe₂NH⁺>Me₄N⁺)。

·对于相同数目的脂肪族碳原子，直链基团比支链基团更好地增强被分析物结合(正丁基>异丁基)。

·对于相同数目的脂肪族碳原子，直链基团比环状基团更好地增强被分析物结合(正戊基>环戊基)。

·对于某些化学部分，铵离子和某些被分析物之间的氢结合增强被分析物结合，例如，伯铵与磷酸盐二酯(寡核苷酸)以及胍盐与羧酸盐(含Asp-和Glu-的肽)的结合。

混合的离子-配对阳离子经常导致色谱分辨率的损失且通常要避免。然而，当可以使用混合阳离子时有一组条件；即，当(a)所关注的阳离子比存在的其它反离子具有显著更强的离子-配对性质，且(b)所关注的阳离子在样品加载混合物中和在置换剂缓冲剂中以化学计量过量存在时。

为了简化潜在耗时的离子-配对反离子的筛选，以下推荐用作离子-配对阳离子的初始出发点：

·肽和小蛋白(pH＝6.0-9.0)：Me₄N⁺、Me₃NH⁺、Me₃NEt⁺、Me₂EtNH⁺

·寡核苷酸(pH＝6.5-8.0)：正丁基-NH₃ ⁺、正戊基-NH₃ ⁺、正己基-NH₃ ⁺

·DMT-On寡核苷酸(pH＝7.0-8.0)：EtNH₃ ⁺、Et₃NH⁺

由于很多可用的胺或胺盐不能以HPLC-级纯度得到，可用的形式是它们的质子化的铵盐，其在化学上更稳定且容易通过反复重结晶来纯化。适当胺的磷酸氢盐(2-)、单甲基磷酸盐(2-)、膦酸盐(2-，aka亚磷酸盐)、甲基膦酸盐(2-)和乙基膦酸盐(2-)可以与阴离子置换剂一起使用：

[MeNH₃ ⁺]₂[HOPO₃ ^2-]、[Me₃NH⁺]₂[HOPO₃ ^2-]、[nBuNH₃ ⁺]₂[HOPO₃ ^2-]、[ⁿC₆H₁₃NH₃ ⁺]₂[HOPO₃ ^2-]、[MeNH₃ ⁺]₂[EtPO₃ ^2-]、[Me₃NH⁺]₂[EtPO₃ ^2-]、[ⁿBuNH₃ ⁺]₂[EtPO₃ ^2-]、[ⁿC₆H₁₃NH₃ ⁺]₂[EtPO₃ ^2-]。

溶解性–在“疏水性色谱法”中，或者更恰当地说，在“疏溶剂性色谱法”(其中主要的溶剂组分是水)中，潜在的疏水性置换剂分子经常具有有限的溶解性。疏水性分子通常不在水中溶解至任何可感知的程度，除非有“亲水性基团”连接至该疏水性分子，例如带电荷的离子性基团、亲水性反离子、一个或多个作为氢键供体或受体起作用的极性基团。芳香族分子由于其中π-电子作为弱的氢键受体的独特方式而与水以独特的形式相互作用。此外，芳香族分子可以在水溶液中以面对面π-堆叠而啮合(engage)。这些小的但重要的效果反映在苯(9mM)和萘(200μM)在水中相对于环己烷(～10μM)和反式-萘烷(<1μM)的较高溶解度中以及苯酚(960mM)和α-萘酚(7mM)相对于未羟基化的芳烃的较高溶解度中。可用的置换剂分子的分子结构应当有助于在水中和在具有低有机含量的水中合理的溶解度(10-50mM)，但同时足够疏水，从而其与固定相很强地结合。通常，带电荷的置换剂分子由于带电荷的物质(尤其是反离子)的溶剂化能量增加而比中性分子具有更好的溶解性质。这要求物理和化学性质的独特平衡，以便阴离子分子表现为好的置换剂。

一般说来，很重要的是注意，增加有机溶剂的水平以补偿差的置换剂溶解性很少得到有用的结果。用0-25％有机溶剂或更优选的2-15％有机溶剂获得最好的色谱结果。在某些情况下可以使用流动相中更高的有机含量(25-75％)，但容量和分辨率经常会受到很大影响。

降低的产物-置换剂缔合–疏水性置换色谱法的一个潜在的问题是可能的疏水性置换剂与疏水性被分析物在溶液中的缔合。这可能导致分辨率的显著损失和污染。在固定相上成吸附状态的置换剂-被分析物缔合也可能发生，但由于适量的适当的离子-配对试剂的存在而不那么成问题。应对该问题的好的方法是使用带电荷的被分析物和具有相同电荷的带电荷的疏水性置换剂。有时当中性疏水性置换剂和中性疏水性被分析物相互作用时，这些问题更频繁地发生。

置换剂自身缔合与胶束形成–在一些情况下，当化学结构和物理性质有益时，阴离子疏水性分子可以自身缔合，在溶液中形成胶束和类胶束自身缔合结构。这种情况可以导致DC中分辨率的损失以及置换剂溶液的不期望的发泡。溶液中的置换剂以各种形式存在，这些形式通过各种化学平衡而相互关联。此外，胶束可以作为疏水性被分析物分子的载体而起作用，导致它们在溶液中以各种形式存在。这种不期望的现象是浓度依赖性的且通过添加少量的适当的有机溶剂例如甲醇、乙醇或乙腈来有效地抑制。适当设计的阴离子置换剂分子抑制胶束形成并给出更好的置换结果。因此，对于R-基团R¹-R³，保持基团疏水指数低于12.0降低不期望的去垢性的问题。

高纯度–置换剂中的杂质–置换剂应当具有足够的纯度。制备色谱的目的是从所关注的组分中去除杂质。期望的化合物被置换剂本身污染很少是个问题，但在某些情况下，被置换剂溶液中的“早期置换”杂质污染可能是成问题的，这取决于杂质的量及其结合性质。因此，好的置换剂应当含有很少量的早期置换杂质或不含早期置换杂质。

适当的UV吸收–为了在整个DC实验中跟踪置换剂的位置和量，以观察置换剂穿透曲线并在柱再生操作中跟踪置换剂去除，使置换剂具有中等的紫外吸收是有用的。由于置换剂和被分析物的高浓度，不需要也不优选高吸收。通常，优选无色置换剂，其UV光谱具有战略性定位的低吸收窗口，从而可以在某些频率跟踪被分析物并在其它频率监测置换剂。

易于制造和成本–方便的和有成本效益的化学合成、生产和制造方法是重要的，以便以合理的成本生产可用的置换剂。此外，需要实用的纯化方法，尤其是非-色谱纯化，以便以有成本效益的方式达到纯度要求。

化学稳定性、低毒性和长寿命–除了其所有其它期望的化学和物理性质之外，可用的置换剂分子应当是化学稳定的。它应当对被分析物分子是惰性的，且对水、常用的有机溶剂、温和的碱、温和的酸和氧(空气)是化学稳定的(非-反应性的)。它在通常的使用和储存条件下应当是光-稳定的和热稳定的且具有合理的寿命。非常优选置换剂分子是视觉上无色的，但具有必要水平的UV吸收。染料通常不用作DC中可用的置换剂。可用的置换剂分子还需要具有低毒性，这不仅保护工作者还保护可能与置换剂接触的生物和药物样品。

适当的色谱柱：尽管最常用的反相柱类型是十八烷基涂布的硅胶，但很多疏水性固定相可以用于DC中。适当的固定相的实例列于表II中。最终，对于所研究的每个系统，固定相的最佳选择通过实验确定。

表II.用于疏水性固定相的材料

●涂布的多孔硅胶(共价键合的硅烷)

·十八烷基(C₁₈)·十二烷基(C₁₂)

·辛基(C₈)·己基(C₆)

·丁基(C₄)·五氟苯基丙基(C₆F₅-C₃)

·苯基丙基(Ph-C₃)·苯基己基(Ph-C₆)

·p-联苯(Ph-Ph)·β-萘基乙基(Nap-C₂)

●未涂布的多孔聚苯乙烯/二乙烯基苯

●多孔氟碳聚合物

●多孔聚十八烷基甲基丙烯酸酯聚合物

●类碳相：

·多孔石墨化碳

·清洁的炭

·多孔氧化锆上的碳

·与多孔氧化锆上的碳键合的C₁₈

●无机氧化物上的有机聚合物涂层

●混合模式疏水相

·具有负表面电荷的C₁₈

·具有正表面电荷的C₁₈

·具有埋藏的负电荷的C₁₈

·具有埋藏的正电荷的C₁₈

用给出更好的回收和收率的更长的、很好地装填的柱在置换色谱法中获得更好的结果。表III提供了初始选择柱尺寸和初始流速的指引。

表III.色谱柱尺寸

a)500mm或2x250mm

b)初始流速＝75cm/hr(12.5mm/min)；需要优化

适当的柱长度对于好的结果是很重要的。它应当足够长，以完全改进置换队列并给出好的分辨率。然而，过长的柱不必要地增加分离时间并经常导致装填很差的床和降低的分辨率。在很多情况下，两个装填很好的较短的柱可以头尾相连获得好的色谱结果。相当多的利用小分子(MW<3KDa)的实验表明，最佳的柱长度落在以下范围内：对于5μm颗粒为15-45cm且对于10μm颗粒为20-60cm。孔径为的多孔颗粒适于传统的药物和小肽，孔径适于中等的和大的寡肽和寡核苷酸且孔径适于大多数蛋白和DNA。可以使用非-多孔的颗粒，但加载容量会显著下降。

在圆柱形柱中，重要的是建立平面的流动前沿，使得其垂直于流动的轴。在置换色谱法中，一旦已经在较小的柱上形成了优化的方案，则按比例放大以纯化更大量的样品是简单易行的。在发现可接受的最短的柱长度之后，通过增加柱直径同时保持恒定的线性流速而简单地实现按比例放大。经适当的修改，可以用径向流动柱和用轴向流动整体柱来使用置换色谱法。置换色谱法的原理还可以适用于分析和制备薄层色谱。

运行成功的置换色谱法实验

尽管有机化合物、传统药物和肽的置换色谱法已被进行了很多年，但经常获得中等至差的结果。本文所公开的好的置换剂、好的柱和好的操作方案产生优异的重复性和非常好的色谱性能。

置换剂和浓度–使用好的通用阴离子置换剂作为具有适当的结合强度的三甲基铵盐来进行初始的评价。在操作pH下，阴离子被分析物分子要求阴离子置换剂。在操作pH下，可以使用阴离子置换剂来纯化阴离子和中性被分析物。置换剂应当比待纯化的物质与柱更强地结合，但置换剂不应当过强地结合。通常的置换剂浓度为10-50mM的范围。起初，置换剂浓度被设定为10-15mM。根据需要，向置换剂溶液中添加pH缓冲剂和离子-配对试剂。除了置换剂的存在以及离子-配对盐的水平之外，置换剂溶液和载体溶液应当具有相同的组成(包括pH)。置换剂579、609和634(参见下表V-XIII)是好的通用阴离子置换剂的实例。在方法优化过程中，将置换剂浓度增加至20-30mM或更高可能是有帮助的。

选择离子-配对试剂–表I含有可用于疏水性色谱的可用的一价离子-配对阳离子(CI)的列表。当置换剂或被分析物带电荷时需要它们。对于阴离子被分析物和置换剂，结合等温线强烈地取决于反离子的化学性质及其浓度。那些具有中等至中强的结合性质的离子-配对阳离子通常是可用的最好的。在初始实验中由三甲基铵甲酸盐或磷酸盐出发。当被分析物需要离子-配对试剂时，它通常在DC实验中规定离子-配对试剂的选择。用于被分析物和置换剂的离子-配对试剂应当相同。

离子-配对试剂的浓度–如之前所注意到的，使用不足水平的好的离子-配对试剂是置换色谱法实验中差色谱性能的一个主要原因。以下给出用于计算样品溶液中离子-配对试剂的适当浓度(C_IPS,mM))的公式：

C_IPS＝E_sxC_s(mM)xG_s

其中E_s是样品的过量因子，C_s是样品的浓度(mM)且G_s是操作pH下样品的净电荷的绝对值。E_s的最佳值是需要实验确定的参数。以下给出用于计算置换剂溶液中离子-配对试剂的适当浓度(C_IPD,mM)的公式：

C_IPD＝E_dxC_d(mM)xG_d

其中E_d是置换剂的过量因子，C_d是置换剂的浓度(mM)且G_d是操作pH下置换剂的净电荷的绝对值。E_d的最佳值是需要实验确定的参数。关键是，溶液中存在至少化学计量量的离子-配对试剂(E_s≥1.0和E_d≥1.0)。在实践中，我们的经验是E_s应当为1.1-10.0的范围，更优选1.2-6.0的范围，还更优选1.5-4.5的范围。此外，我们的经验是E_d应当为1.1-10.0的范围，更优选为1.2-4.0的范围。当离子-配对浓度未优化或者过低时，即E_s<1.0和/或E_d<1.0时，导致色谱性能的严重恶化。

选择RP柱–对于初期的反相工作，应当评价若干质量好的硅胶上的十八烷基或硅胶上的苯基己基柱(5μm球状颗粒，尺寸为4.6x250mm)。按比例放大至更大的制备柱可以随后进行，且相对容易。关键问题是选择适当的孔径。具有过大或过小的孔的基质经常导致容量降低并且有时分辨率降低。参见上文的表II和III。

流速–因为置换色谱法是“准-平衡技术”，所以经常需要相对慢的流速。最佳的流速是不损失分辨率的可能的最快流速。样品加载流速和置换流速应当大致相同，均在35-105cm/hr的范围内。对于传统的药物、寡肽和寡核苷酸由75cm/hr开始，或者对于蛋白质和DNA由40cm/hr开始。再生流速应当为置换流速的2-8倍。当在反相柱上在升高的温度下纯化药物、肽或寡核苷酸时，可以使用更快的流速。

温度–因为反相色谱和其它形式的疏水性色谱在很大程度上被+TΔS与+ΔH驱动，所以更高的温度经常导致更强的结合、更快的结合动力学和明显不同的分辨率。因此，应当小心地调节柱的温度以及在某种程度上置换缓冲剂的温度(+/-0.5℃)以防止带变宽。初始工作经常在25℃下进行，然后如果样品可以承受则尝试升高的温度(45,65℃)，且有机溶剂的沸点是合适的。

选择有机溶剂–尽管大多数与水混溶的有机溶剂会起作用，但最经常使用乙腈、甲醇和乙醇。在很少有机溶剂或根本无有机溶剂存在的条件下进行某些DC纯化。这允许用低盐和低有机溶剂进行实际的未变性的蛋白质的RPC和HIC纯化。当存在与挥发性易燃溶剂相关的安全问题时，在无有机溶剂的条件下操作也可以是有用的。在实验时，首先对肽、低分子量有机药物和小蛋白质尝试乙腈，或者对大蛋白质、寡核苷酸和DNA尝试甲醇。若样品在水中的溶解度可以接受，则由载体缓冲剂、置换剂缓冲剂和样品加载溶液中的3％v/vMeCN、4％v/vEtOH或5％v/vMeOH开始；这三种溶液中的有机含量应当相同。有机溶剂含量是对于每个样品、柱和置换剂需要优化的重要参数。对于通用操作，有机溶剂应当低于约15体积％，更优选低于约10体积％，还更优选约5体积％。当使用十八烷基柱时，对于基质的最佳功能，通常需要2-3体积％乙腈、3-4体积％乙醇或4-5体积％甲醇。苯基己基和辛基柱通常可以承受不存在有机溶剂的条件。

选择pH和pH缓冲剂–当样品、置换剂、离子-配对试剂中或固定相上存在可电离的质子时，需要pH缓冲剂。某些被分析物仅在特定pH范围内稳定。对于某些被分析物，色谱分辨率是强pH-依赖性的。使用阴离子置换剂和阴离子pH缓冲剂纯化包括阴离子蛋白质(pH>pI)在内的阴离子样品。与阴离子pH缓冲剂缔合的阳离子应当与离子-配对阳离子相同，但在某些情况下可以是具有显著更弱的离子-配对性质的阳离子。此外，在某些不常见的情况下，可以使用阳离子pH缓冲剂，但仅当它们具有比主要的离子-配对阳离子更弱的离子-配对性质时。因此，当三甲基铵、三乙基铵或正丁基铵是离子-配对阳离子时，有时可以使用N-甲基吗啉(7.4，NMM)、三乙醇胺(7.8，TEOA)和TRIS(8.1)作为pH缓冲剂。具有中间范围pK_a值的阴离子化合物可以是有用的pH缓冲剂：碳酸盐(9.9)、硼酸盐(9.0)、TABS(8.9)、TAPS(8.4)、TAPSO(7.6)、甲基膦酸(7.6，MPA)、MOPS(7.2)、MOPSO(6.9)、磷酸(6.8)、单甲基磷酸(6.3)、亚磷酸(6.3)、MES(6.2)、3,3-二甲基戊二酸(5.9，DMG)、琥珀酸(5.2，SUC)、乙酸(4.6，HOAc)。

表IV.用于10mM[Me₃NH⁺][D^-]置换剂的缓冲体系

a)酸-胺缓冲剂应当完全溶于操作溶剂水和有机溶剂的混合物中。

b)更碱性的胺要求更高的pH(>7.8)；置换剂(D-)应当具有相同的反离子。

共-置换–当处理含有数百个组分和杂质的样品时，共-置换几乎是不可避免的现象，因为不管DC实验发生在结合等温线的任何地方，都很有可能存在若干与主要的受关注组分共-置换的次要组分。幸运的是，置换色谱法中的共-置换远远没有制备洗脱色谱中的共-洗脱问题那么严重。共-置换在两种条件下发生：(1)当结合等温线如此类似，使得产生差的分辨率时，以及(2)当在结合等温线的操作区域附近存在结合等温线的交叉时。幸运的是，存在简单的方法来应对该问题：通过

a.改变置换剂的浓度，

b.改变至具有不同结合形式不同置换剂，

通过在结合等温线的不同点操作而在不同的条件下进行第二DC实验。

或者，可以通过以下来改变等温线本身：

c.改变色谱基质(固定相)，

d.改变有机溶剂的浓度，

e.改变至不同的有机溶剂，

f.改变至不同的离子-配对试剂，

g.改变温度。

第二“正交”IP-RPDC步骤通常以优异的收率(90-95％)给出优异的纯度(～99.5％)。

柱加载–在相对高的加载下进行DC实验，通常在最大加载容量的60-80％范围内。有效柱加载容量不是固定的数字；而是取决于DC实验在结合等温线的何处进行操作。

不是所有的柱容量都可以利用(参见下文的“例外”)。在实践中，仅90-98％的柱容量是可用的。一旦样品已被加载到柱上，随后就将置换剂缓冲剂泵送到柱上。形成有三种前沿，其各自以不同的速度沿柱行进：(1)液体前沿(T₁，置换剂缓冲剂减去置换剂)，(2)样品前沿(T₂)以及(3)置换剂饱和前沿本身(T₃)。第一前沿比第二和第三前沿行进得更快且限定了可用的柱容量，因为第一前沿应当在置换队列(T₂)开始出来之前离开柱。各前沿的实际速度直接取决于置换流速。前沿速度的比例α，Vel₁/Vel₂，由下式给出：

α＝K_m/(RxC_d)

其中K_m是置换剂浓度为C_d时基质的置换剂结合容量(每mL装填的基质的置换剂mg数)，其中C_d是置换剂缓冲剂中的置换剂浓度(每mL置换剂缓冲剂的置换剂mg数)，R是柱中液体的体积与柱的总体积的比例(每mL床体积的液体mL数)。最大％可用柱容量由下式给出：

(100x(α-1))/α

在下文的实施例2中，各自的α-值是21.98，且各自的最大可用容量为95.4％。注意，随着C_d增加，K_m也会增加，但若在等温线的非线性部分的高处运行时，不会增加很多。因此，α会降低且最大％可用柱容量会降低。

对于前述内容有例外。若样品中存在显著水平的不期望的、初期置换的杂质，可以通过将柱过加载并在置换剂流开始之前在样品加载期间将这些杂质移除来增加柱的可用容量，甚至超过100％。因此，基于整个样品，柱加载可以为最大值的105％，但基于主要产物的量加上后期置换的杂质，柱加载可以仅为80％。

样品加载方法–使用两种方法之一经样品注射阀将样品加载到柱上。应当在前沿色谱条件下在结合等温线上进行DC实验的同一点处加载样品。在加载样品后，载体不经过柱。方法1：使用样品加载泵；方法2：使用注射环。通常，仅使用部分环注射(partialloopinjection)。环中的样品应当首先被载体然后被置换剂溶液驱出环到柱上。不超过85-95％的环体积应当被加载到柱上，从而不加载被载体稀释的样品。

样品溶液的浓度和体积–加载样品的浓度是一个重要的操作参数。最佳的样品加载浓度(mg/mL)与来自置换实验的经纯化产物的输出浓度(置换队列的平台区域)相同。结合等温线、柱结合容量和输出浓度是初始未知的。使用如下所示的初始估算，用加载到柱上的样品溶液简单地进行第一次置换实验：

(1)选取希望工作的初始柱加载百分数，例如75％。

样品加载时间＝置换剂穿透时间(T₃-T₁)x0.75

＝(736min-312min)x0.75＝318min(对于实施例1)

(2)通过两种方法之一选取样品的初始浓度：

(a)初始样品浓度(mg/mL)＝0.12x置换剂浓度(mM)x式量(mg/μmole)

＝0.12x10mMx2.30mg/μmole＝2.76mg/mL(对于实施例1)

(b)对于样品选取估算的柱结合容量，例如50mg样品/mL基质。假定置换流速和样品加载流速相同：

初始样品浓度(mg/mL)＝(柱结合容量(mg/mL_m)x柱体积(mL_m)/((T₂-T₁)x样品流速(mL/min))

＝(50mg/mL_mx4.155mL_m)/((736min-312min)x0.208mL/min)

＝2.36mg/mL

(对于实施例1)

若用加载的样品进行的第一次DC实验导致过加载条件(>100％加载)，则在一半的样品浓度下重新运行实验。从使用样品的第一次成功的DC实验的结果，很容易计算实际加载浓度和实际柱加载容量，且这些值随后用于调节用于第二次DC实验的样品浓度和加载。

样品制备–以上文所述的浓度和量制备加载样品溶液。为了过量填充该环或者填充样品加载泵和递送线路的死体积，需要足够过量的溶液。pH、pH缓冲剂的量和有机溶剂的量与载体和置换剂缓冲剂相同。将样品溶解在载体中改变其pH，因此样品溶液的pH必须在溶解后再次调节。然而，离子-配对试剂的量可以不同。样品溶液中所用的离子-配对试剂必须与置换剂缓冲剂中所用的相同。对此，样品的离子-配对要求规定样品溶液中和置换剂溶液中使用何种离子-配对试剂。基于操作pH下的形式化学电荷以及主要被分析物的浓度，计算离子-配对试剂或离子-配对盐的浓度。参见上文的“离子-配对试剂的浓度”。

样品的组成和历史应当是已知的。若样品含有阳离子，则其化学性质和量(浓度)也应当是已知的。(a)显然，若不存在阳离子，则在样品制备中不进行调节。(b)若样品中的阳离子与DC中所用的离子-配对试剂相同，则相应地减少添加至样品溶液的离子-配对试剂的量。(c)若样品中的阳离子的离子-配对性质显著弱于DC中所用的离子-配对阳离子，则其存在可以忽略。(d)若样品中的阳离子的离子-配对性质强于DC中所用的离子-配对阳离子，则阳离子应当在处理之前被交换或去除。

收集馏分–置换色谱法给出优异的色谱分辨率，尤其是使用好的C₁₈-反相柱采用优化的方案时。然而，分辨率很难观察到，因为所有的带作为置换队列中背靠背的带而一起从柱中出来。许多小杂质的三角形带的宽度小于30秒(<100μL)。因此，对于置换剂穿透时间为250分钟且样品加载为80％的实验，置换队列会为约200分钟宽，且必须提取超过400个馏分，从而在馏分收集过程中不损失色谱分辨率。分析400个馏分确实有启发且有趣，但也是令人生畏的工作。这时，在线实时馏分分析会是有用的。在实践中，可以稍微不理会分辨率，而仅收集100-130个较大的馏分。即便是该减少数目的馏分的分析也代表相当大量的工作。

在进行制备DC实验且仅关注纯化的主要组分的情况下，馏分收集过程被大大简化。基于在不同频率(UV)下观察的置换队列的形状，判断所关注的主要带的开始和结束，然后在这两个区域中分析约10个馏分，以便确定要汇集哪些馏分。分析20个馏分而不是100-130个馏分是更容易的工作。

在下文的实施例3中，分析甚至更容易。基于以上的方法，判断所关注的主要带的开始和结束，不经过分析而进行保存性汇集且对最终汇集物仅进行一次分析。

置换剂去除和柱再生–使用5-10倍柱体积的95/5(v/v)乙醇-水或80/10/10(v/v/v)乙腈-正丙醇-水而不使用任何pH缓冲剂或离子-配对试剂来去除置换剂。目的是在最短的时间内有效地从柱中去除>99.9％或更多的置换剂。若基质可以承受增加的反压(back-pressure)，则增加流速(100-400cm/hr)以加速柱再生过程。在置换剂的吸收最大值(参见置换剂说明)附近观察置换剂的去除允许通过UV检测而小心地监控和优化再生过程。

添加的盐的效果–水性溶剂中的盐使得溶剂对溶解的疏水性被分析物和疏水性置换剂不那么友好，导致与疏水性色谱基质更强的结合。这是疏水性-相互作用色谱(HIC)背后的原理。只要被分析物在盐溶液中的溶解性足够，则盐的添加是调节被分析物对疏水性基质的结合和选择性的良好方式。

在某些情况下，被分析物与疏水性基质的结合是如此弱，使得需要添加的盐以获得足够的被分析物结合。常用的盐溶液包括0.5-2.5M(NH₄)₂SO₄、K₂SO₄、Na₂SO₄、NaCl和KCl中的一种。在各种浓度的许多不同盐的帮助下，置换模式的HIC为有用的蛋白质色谱分离提供许多选择。

仪器方案–参见实施例2的示例性方案(双泵操作)。因为来自先前试验的残余置换剂是潜在的问题，所以该方案具有线路清洗操作、快速柱再生和平衡操作以确保HPLC系统和柱在临加载样品之前完全清洁并适当地平衡。这些步骤仅仅是警戒性的，但不总是必要的。该方案在单一的方案中包括(a)预-平衡程序，(b)平衡程序，(c)样品加载程序，(d)置换程序，和(e)再生程序。为了克服与系统中的死体积相关的问题，所有加载的缓冲剂、置换剂缓冲剂和样品溶液均在临泵送至柱上之前被经过系统冲洗至废液中。通过这种方式，在紧随阀门切换之后，柱中会出现未稀释的溶液的尖锐前沿。样品溶液应当被脱气，使得在其中不形成气泡。当使用注射环时，它们需要被过填充约10％。过填充可以被收集用于进一步应用。不应当使用满环注射，仅使用部分环注射。经验要求，根据环管路的内径，仅可以使用85-95％的环体积，因为样品溶液与驱动溶液混合并将其稀释。环中的样品被加载缓冲剂驱动到柱上，但将近样品加载过程的末尾，将驱动溶液换成置换剂缓冲剂。这允许在临将置换剂缓冲剂本身直接泵送到柱上之前将置换剂缓冲剂冲洗经过系统。在再生过程的初始部分，使用较慢的流速。因此，与高反压相关的问题很少发生。一旦大部分置换剂被去除，则可以使用较高的流速。

方法优化–对于所有形式的制备色谱，色谱方法和操作的优化都是很重要的，但它需要一些实验。置换色谱法的益处经常伴随着价格–时间。可以在方法优化过程中使耗时因素最小化。

·确定置换纯化的近最佳条件而不考虑分离的时间。

·增加置换剂浓度和样品加载溶液的浓度直至分辨率下降。

·增加置换流速和样品加载流速直至分辨率下降。

·缩短预-平衡程序和置换剂去除/柱再生程序。

现存的方案为方法优化提供有用的起点，但它们会需要针对被研究的具体样品进行修改。下文示出一个样品方案(实施例2)，其已被针对纯度进行了优化，而不考虑时间。重要的是进行适应于所关注的样品的具体物理性质和色谱性质的方法优化。在优化后，较长的处理时间(600-800min)经常可以降至200-300分钟，且在某些情况下降至100-150分钟。

以置换模式使用的疏水性色谱具有(a)高基质生产率(在基质的寿命期间内每升基质的产物克数)，(b)高体积生产率(每升柱体积的产物克数)，(c)高溶剂生产率(每升所用溶剂的产物克数)，但(d)可能具有中等的时间生产率(每单位时间的产物克数)。适当的方法优化减轻时间因素。

适当配置的仪器：以下给出用于小制备HPLC系统的典型的仪器配置。

·主泵：不锈钢、钛、陶瓷、PEEK；精确的0.01-10mL/min流速；3000-4500psi压力。

·任选的柱旁路阀门：双位、六通开关阀(不锈钢、PEEK)；柱串联(columninline)或旁路柱。这是方便选项。

·要求的样品注射阀：用于注射环或样品注射泵的双位、六通注射阀(不锈钢、PEEK)。

·注射环：20-40mL注射环(不锈钢、PEEK)。环应当被过加载(～10％)。仅使用部分环注射，通常不超过环体积的85-95％。使用注射环或样品泵中的一个。

·样品泵：这类似于用于样品注射的主泵。样品应当与泵头的流程(flowpath)相容。使用注射环或样品泵中的一个。对于双泵操作，应当校准两个泵的流速，使得它们的流速可以匹配。

·无梯度混合器：在置换色谱法中绕过或去除梯度混合器。

·UV检测器：多波长或光-二极管-阵列检测器，200-400nm频率范围，具有短程、低体积石英流动池(0.2-2.0mm流程，<10μL流动体积)。

·任选的电导检测器：UV检测器之后的电导检测器，具有流动池，0.1-200mS，<100μL流动体积；在<500μL/min的置换流速下收集用于分析的馏分时的旁路电导流动池。

·馏分收集器：通过时间或通过滴数的10μL至10mL的每个馏分。

·柱冷却器/加热器：0-100℃+/-0.5℃。若柱在显著不同于环境温度的温度下操作，需要进行设置，以加热或冷却缓冲剂溶液。

实施例1：使用置换剂579(4-正己基苯磺酸盐)–阴离子置换剂在近中性pH对粗专有肽(Proprietarypeptide)(20-mer)进行置换色谱法纯化(参见图1A–置换痕迹，图1B分析)

操作条件：

起始肽：粗20-mer肽，65.8％纯度，FW～2.300mg/μmole，电荷＝-4

柱：WatersXbridgeBEH130，5μm，4.6x250mmSS，硅胶上的-C₁₈

流速：加载＝208μL/min；置换＝208μL/min

离子-配对试剂：三甲基铵(Me₃NH⁺)；

温度＝23℃；pH＝7.1；

置换剂缓冲剂：10.0mM置换剂579+15mMH₃PO₄(HPLC级)在含有5％(v/v)MeOH的DI水中，pH＝7.1，含有37％Me₃N(HPLC级)，最终Me₃NH⁺浓度～25mM。

加载缓冲剂：15mMH₃PO₄(HPLC级)在含有5％(v/v)MeOH的水中，pH＝7.1含有37％Me₃N(HPLC级)，Me₃NH⁺浓度～25mM。

样品溶液：3.02mg/mL肽在含有5％(v/v)MeOH的水中，15mMH₃PO₄；pH＝7.1含有37％Me₃N，Me₃NH⁺浓度～25mM。

加载量：157.2mg，来自加载泵(泵2)；加载时间＝250.0min。

馏分量：520μL；5mL甲酸添加至每个馏分，pH降至3.5；样品立即冷冻(-20℃)直至分析或汇集。

结果：

馏分分析：通过分析洗脱HPLC在215nm分析未稀释的馏分(17μL注射体积)；基于面积％进行计算。

总运行时间：12.3hr

输出浓度；2.77mg/mL

柱加载：最大容量的88.2％

柱容量：

～42.9mg肽/mL基质2.79mg肽/mL溶液，基于整个样品

～58.6mg肽/mL基质2.79mg肽/mL溶液，基于纯产物

～212μmole置换剂/mL基质10.0μmole置换剂/mL溶液

纯度％：99.3％99.3％99.3％99.3％

收率％：80％85％90％95％

评述：样品浓度/输出浓度＝1.1

样品中Me₃NH⁺的量＝化学计量量的4.7倍。

使用小的“分析型”柱在一步中从粗肽中以合理的加载(42.9g/L)、优异的纯度和优异的收率(99.3％纯度90％收率)获得好的结果。该实施例被设计为显示使用阴离子置换剂采用阳离子性离子-配对试剂在中性pH(7.1)对粗合成阴离子肽的纯化。不使用伯胺或仲胺，而是选择质子化的叔胺作为IP试剂，以防止任何可能的酰胺交换反应。一系列叔胺的筛选显示，三甲基胺在该实施例中给出最好的分辨率、纯度和收率。在使用同一个柱的制备条件下，在pH＝7.1下(99.3％纯度90％回收率；5％MeOH与三甲基磷酸铵)比在pH＝2.0下(98.6％纯度90％收率；3％MeCN与三氟乙酸；数据未示出)更好地去除主要杂质。置换剂带和肽带相当尖锐，导致近乎矩形的置换带和近乎均匀的共置换(总共0.7％，由5种次要的杂质组成)。结果是，在整个80-95％的收率范围内，回收的纯度在99.3％几乎不变。只有一种杂质在两种pH条件下(2.0,7.1)均共置换，表明该在同一个柱上在两个不同的pH值下的两步纯化会导致最终纯度为99.8-99.9％，且两步总收率为85-90％。

实施例2：用于纯化粗合成寡核苷酸的置换方案

仪器配置：主泵(1)具有4条缓冲剂线路，样品加载泵(2)具有1条溶剂线路，泵选择器阀门，柱旁路阀门

泵选择器阀门：6-通阀，其由单通道切换逻辑(single-channeltogglelogic)控制(S3＝0，泵1至柱-泵2至废液；S3＝1，泵1至废液-泵2至柱)

柱阀门：6-通阀，其由单通道切换逻辑控制(S6＝0，液体流经柱；S6＝1，液体流绕过柱)

柱之后的UV光二极管阵列检测器(流动池：0.5mm流程，9μL体积)，随后是电导检测器(流动池：170μL体积)；当收集馏分用于分析时，去除电导流动池。

加载缓冲剂＝泵1上的A-线(S1＝1-流动开，S1＝0-流动关)；置换剂缓冲剂＝泵1上的B-线(S2＝1-流动开，S2＝0-流动关)；置换剂去除缓冲剂＝泵1上的C-线(S4＝1-流动开，S4＝0-流动关)；柱储存缓冲液＝泵1上的D-线(S5＝1-流动开，S5＝0-流动关)；样品溶液＝泵2上的A-线(S7＝1，样品流动开，S7＝0，样品流动关)。将样品溶液过滤(0.2μ)并脱气。

在程序开始之前，将清洁的柱简单地用A-缓冲剂冲洗，以去除柱储存缓冲剂。对于细节的描述，参见实施例3。

置换剂去除缓冲剂(C-缓冲剂)＝乙腈中的10％(v/v)1-丙醇、10％(v/v)DI水。

柱储存缓冲剂(D-缓冲剂)＝含有甲酸(15mM)和甲酸铵(15mM)的70/30(v/v)甲醇/水。

实施例3：使用置换剂607b(5-正己基-2-羟基苯磺酸盐)–阴离子置换剂在近中性pH进行粗寡核苷酸(20-mer)的置换色谱法纯化(参见图示2A)

操作条件：

起始肽：粗合成寡核苷酸(20-mer，A₂G₆T₈C₄，铵盐，单硫代磷酸盐骨架)，82.2％纯度，FW＝6.7397mg/μmole，电荷＝-19。

柱：WatersXbridgeBEH130,5μm，4.6x250mmSS，硅胶上的-C₁₈。

流速：加载＝208μL/min；置换＝208μL/min

离子-配对试剂：正丁基铵(ⁿBuNH₃ ⁺)

温度＝23℃

pH＝7.0

置换剂缓冲剂：15.0mM置换剂607b+20mMH₃PO₄(HPLC级)+含有5％(v/v)MeOH的50mM纯化的正丁基胺的DI水溶液，pH＝7.0含有50％HCO₂H(HPLC级)。

加载缓冲剂：20mMH₃PO₄(HPLC级)+含有5％(v/v)MeOH的50mM纯化的正丁基胺的水溶液，pH＝7.0含有50％HCO₂H(HPLC级)。

样品溶液：含有5％(v/v)MeOH的3.78mg/mL(561μM)寡核苷酸(oligo)的水溶液，20mMH₃PO₄+100mM纯化的ⁿBuNH₂；pH＝7.0含有50％HCO₂H(HPLC级)。

加载量：124.2mg，来自加载泵(泵2)；加载时间＝158.0min.(2.63hr)

馏分量：624μL

样品制备：将粗合成20-mer寡核苷酸的氨水溶液(25.1mg/mL)在真空下置于旋转蒸发仪上(30℃)，直至几乎所有的NH₃和水被除去，形成无色粘性残余物。使用稀释缓冲剂-1和加载缓冲剂的组合，将样品稀释回相同的原始体积(在旋转蒸发仪上去除溶剂之前)，使得样品含有100mMⁿBuNH₃ ⁺。仅需要轻微的pH调节。使用稀释缓冲液-2将一部分浓缩物由25.1mg/mL稀释到3.78mg/mL。将稀释的样品溶液过滤，脱气并储存在4℃直至使用。除了具有120mMⁿBuNH₃ ⁺之外，稀释缓冲剂-1与加载缓冲剂相同。除了具有100mMⁿBuNH₃ ⁺之外，稀释缓冲剂-2与加载缓冲剂相同。

结果：

馏分分析：不进行馏分分析。基于置换痕迹的形状，将纯化的馏分保存性汇集。

使用分析洗脱IP-RP色谱和阴离子交换色谱对汇集的产物进行分析。

在260nm监测馏分；计算是基于面积％。

总运行时间：7.5hr

输出浓度：2.40mg/mL

柱加载：基于总样品的最大容量的100.3％；

基于主要带的最大容量的85.2％

柱容量：～30.0mg寡/mL基质2.40mg寡/mL，基于总样品

～35.3mg寡/mL基质2.40mg寡/mL，基于主要带

～221μmole置换剂/mL基质15.0μmole置换剂/mL溶液

纯度％：99.0％

收率％：75％；数据基于保存性馏分汇集，不经过馏分分析；实际可用的收率很可能更高(80-85％)。

评述：样品浓度/输出浓度＝1.57

样品中ⁿBuNH₃ ⁺的量＝化学计量量的9.4倍。

尽管加载浓度有点高(3.78vs2.40mg/mL)且加载量有点高(100％vs80％)，但使用小“分析型”柱在一步中以合理的加载(30.0g/L)和好的纯度(99.0％纯度75％收率)由粗寡核苷酸获得了好的结果。该样品被设计为显示使用具有阳离子离子-配对试剂的阴离子置换剂进行的粗合成寡核苷酸的置换纯化。该实验还显示，可以进行成功的样品汇集，而不需要大规模地分析馏分。伯、仲和叔胺以及季铵盐的筛选显示三种给出合理的结合强度和分辨率的离子-配对试剂：ⁿC₄H₉NH₃ ⁺、ⁿC₅H₁₁NH₃ ⁺和ⁿC₆H₁₃NH₃ ⁺。制备IP-RP置换色谱法是寡核苷酸的制备阴离子交换置换色谱法补充和替换。此外，该方法在近中性pH(pH＝7-8)操作，并且与寡-RNA的纯化相容。

实施例4：HPLC分析-

方法4a,4b–用于阴离子(磺酸盐、羧酸盐)的反相：

样品注入：25μL在A缓冲剂中的～1mM样品溶液

UV检测：208-220nm，取决于待分析的化合物

流速：1.0mL/min。

A缓冲剂：含有15mM磷酸(HPLC-级)和25mM三甲胺(HPLC-级)的5％CH₃OH(v/v)在HPLC-级蒸馏水中；缓冲剂在添加甲醇之前的pH为7.10+/-0.05。

B缓冲剂：含有15mM磷酸(HPLC级)和25mM三甲胺(HPLC-级)的5％H₂O(v/v)在HPLC-级CH₃OH中。

调查梯度法：100％A0-2min

100％A至100％B2-62min

100％B62-70min

分析梯度法：15％B0-2min

15％B至50％B2-62min

50％B至100％B62-67min

100％B67-70min

方法4c–用于阴离子(磷酸盐、膦酸盐)的反相：

样品注入：25μL在A缓冲剂中的～1mM样品溶液

UV检测：208-220nm，取决于待分析的化合物

流速：1.0mL/min。

A缓冲剂：含有15mM磷酸(HPLC-级)和25mM三甲胺(HPLC-级)的5％CH₃OH(v/v)在HPLC-级蒸馏水中；缓冲剂在添加甲醇之前用甲酸调节pH至6.10+/-0.05。

B缓冲剂：含有15mM磷酸(HPLC级)、25mM三甲胺(HPLC-级)和甲酸(与在A缓冲剂中相同的量)的5％H₂O(v/v)在HPLC-级CH₃OH中。

调查梯度法：100％A0-2min

100％A至100％B2-62min

100％B62-70min

方法4d–用于阴离子(硼酸盐)的反相：

样品注入：25μL在A缓冲剂中的～1mM样品溶液

UV检测：208-220nm，取决于待分析的化合物

流速：1.0mL/min。

A缓冲剂：含有15mM甲基膦酸(HPLC-级)、25mM三甲胺(HPLC-级)和35mM顺-3,4-二羟基四氢呋喃的5％CH₃OH(v/v)在HPLC-级蒸馏水中；缓冲剂在添加甲醇之前的pH为7.90+/-0.05。

B缓冲剂：含有15mM甲基膦酸(HPLC级)、25mM三甲胺(HPLC-级)和35mM顺-3,4-二羟基四氢呋喃的5％H₂O(v/v)在HPLC-级CH₃OH中。

调查梯度法：100％A0-2min

100％A至100％B2-62min

100％B62-70min

方法4e–用于长链烷基卤化物的反相：

样品注入：25μL在A缓冲剂中的～1mM样品溶液

UV检测：200-220nm，取决于待分析的化合物

流速：1.0mL/min。

A缓冲剂：含有0.1％(v/v)三氟乙酸的5％CH₃CN(v/v)在HPLC-级蒸馏水中。

B缓冲剂：含有0.1％(v/v)三氟乙酸的5％H₂O(v/v)在HPLC-级CH₃CN中。

梯度法：50％A/50％B0-2min

50％A/50％B至100％B2-62min

100％B62-70min

实施例5：4-正己基苯磺酸(置换剂579；游离酸，fw＝242.34)的制备。

在装配有回流冷凝器、磁力搅拌器、500mL加料漏斗和-涂布的热电偶的1L3-颈圆底烧瓶中，将97.37g新鲜蒸馏的正己基苯(0.60mole，fw＝162.276，～113mL)添加至300mL搅拌的无水1,2-二氯乙烷中。将玻璃器皿和其它装置在烘箱中干燥以去除表面水气。除了作为安全性预防之外，实际上不需要回流冷凝器。反应在干氮气气氛下进行，伴随缓慢的N₂吹扫。在环境温度下，将300mL无水1,2-二氯乙烷中的69.92g氯磺酸(0.60mole，fw＝116.525，～40mL)逐滴添加至搅拌的反应混合物，其添加速率(～5-6mL/min)使得整个添加在约60分钟内完成。观察到缓和的放热(～10℃)。在添加完所有氯磺酸之后，将混合物在环境温度下搅拌约20小时。通过HPLC周期性地监测反应混合物。在20-24小时后，当残余正己基苯的量为初始量的5-10％时，认为反应完成。若否，则添加二氯甲烷中的另外的氯磺酸，同时将混合物再搅拌12小时。在反应的末尾，观察到少量残余的未反应的己基苯，且没有二磺化的迹象。观察到一些单磺化异构体(0.5％3-异构体，3.5％2-异构体)，其通过随后的纯化来去除。此时，反应溶液是澄清的黄色溶液。然而，若反应溶液是不透明的或模糊的，则这表明有少量水进入了系统。不将混合物暴露于潮湿的空气，真空除去溶剂和HCl副产物，得到淡棕色油状产物。在使用低温阱以保持溶剂和其它挥发物之前，使用含有KOH小球的阱去除气态HCl。最后，在环境温度下将产物置于高真空(0.01托)下24小时，以便完全除去挥发物。该4-正己基苯磺酸(游离酸)的制备还用于随后的制备(产物a)。或者，将产物溶解在最小量的干正戊烷(～1.5L)中，随后用作戊烷溶液(产物b)；通过HPLC来估算磺酸在戊烷中的浓度。同样，不将混合物暴露于潮湿的空气，真空除去正戊烷，得到纯化的淡棕色油状产物(产物c)。注意，当制备戊烷溶液时，大部分磺酸产物(90-95％)溶解；戊烷不溶的部分被保存用于其它用途。然而，若磺酸产物暴露于少量空气湿气，则形成氧鎓盐，其不溶于戊烷且在戊烷萃取过程中提取更少量的磺酸。正己基苯磺酸(游离酸)是独特的分子，其在实际上所有溶剂中均略微可溶：正戊烷、环戊烷、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、二乙醚、叔丁基甲基醚、乙腈、甲苯、二氧六环、异丙醇、无水乙醇、甲醇和水。

实施例6：4-正己基苯磺酸一水合物(OH₃ ⁺盐，fw＝242.34)的制备

方法A.在搅拌下将精确为一当量的纯化的水(ca10.8g)小心地逐滴添加至来自实施例5的整个正己基苯磺酸(游离酸)产物(产物a)。与水的反应是明显放热性的。经冷却的反应混合物用200mL正戊烷萃取两次，以便除去正己基苯和其它有机物质。将合并的戊烷部分弃去，同时在真空下从磺酸一水合物中去除残余的戊烷。反应接近定量，得到粘稠的淡棕色液体。

方法B.在剧烈搅拌下将精确为一当量的纯化的水(6-10g)小心地逐滴添加至来自实施例5的正戊烷中的整个正己基苯磺酸(游离酸)产物(产物b)。与水的反应是明显放热性的。将冷的反应混合物冷却至约0℃，除去上层的戊烷层，并将下层产物层用200mL正戊烷萃取一次。将合并的戊烷部分弃去，同时从磺酸一水合物中去除残余的戊烷。反应接近定量，得到粘稠的黄色液体。

方法C.尽管前述方法简单易行，但所得的烷基磺酸具有中等的纯度且很难纯化。另一方法涉及钠盐的分离和纯化，其反过来被转化回游离酸。将26.4g纯化的和重结晶的4-正己基磺酸钠(100mmole，fw＝264.32)悬浮在300mLHPLC-级2-丙醇中。将搅拌的混合物加热至70℃约10分钟，随后冷却至0-5℃。将冷的混合物称重。将气态HCl缓慢而小心地鼓泡进入冷的、搅拌的混合物中，同时将温度保持在低于10℃(小心，溶液强烈放热)。在添加18-20gHCl之后，停止添加HCl。将搅拌的混合物小心加热至约50℃并保持在该温度下约6小时。真空(旋转蒸发仪)除去溶剂和过量的HCl。向混合物添加300mL2-丙醇并再次真空除去溶剂。将残余物溶解于150mL二乙醚中，将溶液过滤，并使用旋转蒸发仪真空除去溶剂和其它挥发物。最后，在环境温度下将产物置于高真空下(0.01托)24小时，以便完全去除所有挥发物。该操作得到22-23g纯的、无色的、粘稠的油，在5℃下和黑暗中将其保存在干燥器中的P₂O₅上。因为起始的钠盐是纯的，所得磺酸一水合物的纯度为>99.7％(HPLC)。残余的氯化物含量为<0.5mole％。卡尔-费休(Karl-Fisher)滴定表明，磺酸以一水合物存在(每当量磺酸0.9-1.1当量H₂O)。

方法D.在除去1,2-二氯乙烷或HCl之前，在搅拌下小心地向来自实施例5的最终反应溶液滴加10.8g纯化的水。在室温下，烷基苯磺酸的一水合物的溶液可溶于二氯乙烷。然而，在低温下(-20℃)，高级烷基磺酸(正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基)的一水合物从溶液中很好结晶成无色的蜡状晶体。在无湿气气氛(干N₂)中使用低温过滤经过烧结的玻璃分离高级烷基磺酸的氧鎓盐。将晶体用冷的无水溶剂洗涤：二氯乙烷/戊烷(50/50)随后是正戊烷。真空除去残余的戊烷。当加热至室温时，固体一水合物融化随后在冷却至–20℃时再次固化。相反，中间体烷基磺酸(正戊基、正己基、正庚基)的一水合物在–20℃下不从二氯乙烷中结晶。

实施例7：4-正己基苯磺酸钠盐(fw＝264.32)的制备。

在环境温度下，在约30分钟的时间内将来自上述制备的整个产物4-正己基苯磺酸(实施例5，产物a)逐滴添加至包含在2L烧杯中的800mL剧烈搅拌的NaBr的水溶液(3.0M，过滤的)。在添加过程中，形成灰白色固体，且在添加完成之后，将混合物在环境温度下剧烈搅拌约60分钟。向搅拌的溶液中逐滴添加足够的NaOH(50％水溶液)，直至pH接近中性(pH＝6-8，通过pH试纸)。经过烧结的玻璃过滤而回收固体，并用无水乙醇洗涤两次并用乙腈再洗涤两次。将固体产物通过抽吸干空气经过它过夜而干燥。通过如下完成重结晶：将产物溶解在4倍其重量的热乙醇-水(50/50w/w)中，然后经过烧结的玻璃快速过滤进干净的烧瓶中。若需要，则向过滤的溶液添加少量的无水乙醇以便补偿真空过滤过程中损失的部分。将过滤的溶液加热至约65-70℃，然后在搅拌下快速添加等量(4倍)的温的(65-70℃)无水乙醇。使温的混合物在室温下静置约4小时，在此期间开始形成期望的产物的晶体(白色薄片)。随后使结晶混合物在–20℃下静置约4小时以完成结晶。使用冷烧结玻璃过滤器将冷的混合物快速真空过滤，然后使混合物升温至环境温度。在室温下，使用少量乙腈将产物洗涤一次，然后通过使干空气经过过滤器而干燥。该操作产生约82g(57％收率，基于反应的正己基苯的量)白色晶体状产物，其HPLC纯度为>99.8％(HPLC)。通过调节乙醇-水混合物中溶剂的量和水的量，类似地制备了其它烷基苯磺酸的高纯度钠盐：正戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基和正十一烷基。

实施例8：4-正己基苯磺酸三甲基铵盐(fw＝301.45)的制备。

方法A.在环境温度下，将来自上述制备的整个产物4-正己基苯磺酸(游离酸)(实施例5，产物a)溶解在2L烧瓶中的1000mL不含过氧化物的二乙醚中。将气态三甲胺缓慢鼓泡进入搅拌的醚溶液中，直至不再观察到反应。将吸湿的淡黄色晶体状固体过滤，用二乙醚洗涤并通过使干氮气经过滤饼而干燥。将产物溶解在900mL温的(40℃)2-丙醇中并随后冷却至室温。将混合物过滤，以除去不溶物。再添加900mL2-丙醇，随后缓慢添加二乙醚(～5L)以引起产物的初始结晶。将混合物冷却至–20℃并在该温度下静置过夜。使用烧结的玻璃过滤冷的混合物，产生灰白色晶体，随后将其用二乙醚洗涤并干燥。将该产物从2-丙醇/二乙醚中再次重结晶，得到113g(69％收率，基于反应的正己基苯)白色吸湿性晶体，纯度为>99.5％(HPLC)。将产物在真空烘箱中干燥(50℃，25托)约6小时，并保存在干燥器中的P₂O₅上。可以类似地制备许多其它烷基苯磺酸的烷基铵盐。所有均可溶于水和简单的醇中。某些不溶于二乙醚和正戊烷中(例如三甲基铵盐和四甲基铵盐)，而其它可溶于二乙醚但不溶于正戊烷(例如正丁基铵盐和正己基铵盐)。

方法B.在4-正己基苯磺酸(0.33mmole游离酸每mL，实施例5，产物b)的1000mL冷却的(10℃)搅拌的正戊烷溶液中缓慢鼓泡气态三甲胺，其速率使得温度被保持低于20℃，直至上清液为碱性(湿的pH试纸)。将溶液在环境温度下搅拌约15分钟以完成产物的结晶。使用烧结玻璃将白色晶体过滤，用二乙醚洗涤并通过使干氮气经过滤饼而干燥。在环境温度下将白色固体溶解在2-丙醇中，过滤然后根据上文的实施例20的方法A从2-丙醇/二乙醚中重结晶。该操作得到约84g(84％收率)的白色晶体状产物，其HPLC纯度为>99％。

方法C.将26.4g纯化的和重结晶的钠盐(100mmole，fw＝264.32)悬浮于300mLHPLC-级2-丙醇中。添加11.0g三甲基氯化铵晶体(115mmole，fw＝95.57)，添加数滴新鲜制备的HCl(～8％气态HCl在HPLC-级2-丙醇中)，直至pH为清晰的酸性(湿的pH试纸)，随后将混合物搅拌并短暂加热至75℃10分钟。在6小时的时间内使搅拌的混合物缓慢冷却至环境温度。将混合物温和地加热至约40℃，然后经烧结的玻璃过滤以除去氯化钠。真空(旋转蒸发仪)从滤液中去除溶剂，再添加300mL2-丙醇，然后也真空去除。添加更多的2-丙醇，使得混合物的总体积为约270mL，然后添加730mL不含过氧化物、不含抑制剂的二乙醚并混合。将该混合物冷却至–20℃过夜以便完成产物的结晶。将冷的混合物经烧结的玻璃快速过滤，用二乙醚洗涤，通过使干氮气经过滤饼而干燥，在真空烘箱(50℃，25托)中进一步干燥约6小时，并保存在干燥器中的P₂O₅上。该操作得到约26g(86％收率)的纯的白色晶体状产物。该物质适用于置换剂。芳烃磺酸盐阴离子的HPLC纯度与起始物质基本相同(>99.8％)。残余氯化物含量为<0.2mole％且残余钠为<0.05mole％。

实施例9：4-正丙基联苯-4’-磺酸(游离酸，fw＝276.36)的制备。

在装配有回流冷凝器、磁力搅拌器、500mL加料漏斗和-涂布的热电偶的1L3-颈圆底烧瓶中，将117.8g新鲜蒸馏的4-正丙基联苯(0.60mole，fw＝196.29，～120mL)添加至300mL搅拌的无水1,2-二氯乙烷中。将玻璃器皿和其它装置在烘箱中干燥以去除所有表面水气。除了作为安全性预防之外，实际上不需要回流冷凝器。反应在干氮气气氛下进行，伴随缓慢的N₂吹扫。在环境温度下，将300mL无水1,2-二氯乙烷中的69.92g氯磺酸(0.60mole，fw＝116.53，～40mL)逐滴添加至搅拌的反应混合物，其添加速率(～5-6mL/min)使得整个添加在约60分钟内完成。观察到缓和的放热。在添加完所有氯磺酸之后，将混合物在环境温度下搅拌约20小时。通过HPLC周期性地监测反应混合物。在20小时后，当残余正丙基联苯的量为初始量的5-10％时，认为反应完成。若否，则添加二氯甲烷中的另外的氯磺酸，同时将混合物再搅拌12小时。在反应的末尾，除了观察到主要产物之外，还观察到一些未反应的丁基联苯(～5％)以及单磺化异构体(～0.2％)和一些二磺化(～2％)，其均在随后通过萃取或重结晶来去除。此时，反应溶液是澄清的黄色溶液。不将混合物暴露于潮湿的空气，真空除去溶剂和HCl副产物，得到淡棕色油状产物。在使用低温阱以保持溶剂和其它挥发物之前，使用含有KOH小球的阱去除气态HCl。最后，在环境温度下将产物置于高真空(0.01托)下24小时，以便完全除去挥发物。该4-正丙基联苯-4’-磺酸(游离酸)的制备用于随后的置换剂制备中。

实施例10：4-正丙基联苯-4’-磺酸一水合物(置换剂632；OH₃ ⁺盐，fw＝294.37)的制备。

在除去1,2-二氯乙烷或HCl之前，在搅拌下在30分钟的时间内小心地向来自实施例9的最终反应溶液滴加10.8g纯化的水。在水的添加过程中，一水合物的白色晶体从溶液中沉淀出来。将混合物在室温下搅拌60分钟，然后冷却至约0℃并在该温度下静置2小时。使用烧结的玻璃在干N₂气氛中将冷的混合物过滤，用二氯乙烷、环戊烷和最后用正戊烷洗涤。通过使干N₂经过滤饼而将产物干燥，并最后在真空烘箱中(45℃，25托)干燥约6小时。将白色固体保存在密封容器中，该容器保持在干燥器中的P₂O₅上。该操作产生约128g(79％收率，基于反应的丙基联苯的量)的吸湿性白色晶体状固体，其HPLC纯度为98-99％。通常，烷基联苯磺酸的一水合物在室温下很好地从二氯甲烷中结晶成白色固体。

实施例11：4-正丙基联苯-4’-磺酸三甲基铵盐(置换剂634；fw＝355.47)的制备。

将58.8g4-正丙基联苯-4’-磺酸一水合物(实施例10，200mmole，fw＝294.37)溶解于175mL无水乙醇中。若存在颗粒，则将溶液经烧结的玻璃过滤。在环境温度下，经该搅拌的溶液，将气态三甲胺小心地鼓泡进入溶液，直至其为碱性(pH试纸)。随着酸被胺中和，溶液明显变得温暖，且温度升至50-55oC。在冷却并在室温下静置约1小时后，大量白色晶体从溶液中分离。添加约450mL二乙醚，并将混合物在室温下再搅拌约1小时。将混合物用烧结的玻璃在干N₂气氛中过滤，用二乙醚洗涤两次，并通过使干N₂经过滤饼而干燥。经产物从温的无水乙醇中第二次重结晶，并像以前一样洗涤/干燥。最后将产物在真空烘箱中(45℃，25托)干燥约6小时。将白色固体保存在密封的容器中，将容器保持在干燥器中的P₂O₅上。该操作产生约65g(92％收率)的白色晶体状固体，其HPLC纯度为>99.5％。类似地制备了Na⁺、NH₄ ⁺和其它烷基铵盐。

实施例12：7-苯基庚烷-1-磺酸钠盐(置换剂660；fw＝278.35)的制备。

将25.5g新鲜蒸馏的1-溴-7-苯基庚烷(100mmole，fw＝255.20)和190mL乙腈置于装配有加热套、机械搅拌器、回流冷凝器和-涂布的热电偶的一升3-颈圆底烧瓶中。反应在干氮气气氛下进行，伴随缓慢的N₂吹扫。将50.4g亚硫酸钠(400mmole，fw＝126.04)溶解在150mL温的纯水中，并将溶液过滤，以除去颗粒。将亚硫酸盐水溶液全部一次添加到反应烧瓶中，并将反应混合物在76℃下加热约20小时，伴随剧烈的机械搅拌。使反应混合物在15-20℃下静置过夜以允许混合物完全分成两层。将各层分离，并将上层(产物加乙腈)用无水硫酸镁干燥。然后真空去除溶剂，并形成白色晶体状产物。将混合物用烧结的玻璃过滤器过滤，用不含过氧化物的二乙醚洗涤数次并通过使干N₂经过滤饼而在过滤器上干燥。将产物在真空烘箱中(50℃，15托)进一步干燥过夜。该操作得到约23.9g(86％收率)的白色晶体状固体，其HPLC纯度为>99％。

实施例13：L-N-辛酰基-2-苯基甘氨酸游离酸(fw＝277.36)的制备。

在装配有温度计、磁力搅拌和外部冷却的开口的750mL锥形瓶中，将28.42gL-2-苯基甘氨酸(188mmole，>98％ee，fw＝151.17，S-对映体)悬浮于200mL纯水中。在15分钟的时间内，滴加13.60g50％NaOH(170mmole，fw＝40.00)溶液。将混合物在室温下搅拌30分钟，然后冷却至10-15℃。在15分钟的时间内逐滴添加13.83g新鲜蒸馏的辛酰氯(85mmole，fw＝162.66)，然后将混合物在10-15℃下再搅拌60分钟。在搅拌下再添加两次N_aOH溶液和随后的辛酰氯：8.96g50％NaOH，9.16g辛酰氯，在10-15℃下搅拌1小时，7.52g50％NaOH，7.59g辛酰氯，在室温下搅拌三小时。将混合物经烧结的玻璃过滤，将滤液冷却至10-15℃，并滴加浓HCl水溶液(试剂，37％)直至pH为约1(pH试纸)。在酸添加过程中，作为粗产物形成的澄清油状层或粘稠固体从溶液中出来。在搅拌下添加250mL不含过氧化物的二乙醚，以便将产物吸收到醚中。分离各层，将上层醚层用无水硫酸镁干燥，随后通过过滤除去硫酸镁，并真空除去醚，留下无色的油或粘稠的白色晶体状物质。将该物质吸收在最小量的略温的(30℃)二乙醚中，然后允许其在–20℃下结晶过夜。用烧结的玻璃将冷的混合物快速过滤，然后用正戊烷洗涤，并最后在环境温度下在真空中(0.01托)干燥，以获得纯的白色晶体状固体(～42g，81％收率)。

实施例14：L-N-辛酰基-2-苯基甘氨酸三甲基铵盐(fw＝336.48)的制备。

将L-N-辛酰基-2-苯基甘氨酸游离酸的干的过滤的二乙醚溶液(5mL醚每g)置于适当的锥形瓶中并在环境温度下磁力搅拌。将气态三甲胺(>99％)缓慢鼓泡进入搅拌的醚溶液，同时保持温度低于30oC。三甲基铵盐的白色晶体立即由溶液中结晶。一旦上清液足够碱性(pH>8，湿的pH试纸)，即停止胺的添加，且使混合物在5℃下静置两小时。将冷的混合物经由烧结的玻璃迅速过滤，用醚洗涤，随后真空干燥，产生接近定量收率(>95％)的三甲基铵盐。将产物从无水乙醇/二乙醚中重结晶一次，得到的HPLC纯度为>99.5％。未检测到辛酸或其盐。将白色固体保存在密封的容器中，该容器在室温下保持在干燥器中的P₂O₅上。

实施例15：二(正丁基铵)甲烷膦酸盐(fw＝244.30)。

为了避免污染，使用仔细清洁过的硼硅酸盐玻璃器皿，烧杯、烧瓶、烧结玻璃过滤器和移液管；避免使用有机可萃取的塑料实验室器皿。在约15分钟的时间内将32.62g新鲜蒸馏的正丁基胺(440mmole，fw＝74.138)逐滴添加至19.21g新鲜重结晶的甲烷磷酸(200mmole，fw＝96.023)溶解在110mLHPLC-级变性乙醇(90/5/5w/w乙醇/甲醇/2-丙醇)中的搅拌的溶液中。在添加胺的过程中，有明显的放热。将温的溶液短暂加热至70℃随后使其冷却至室温约6小时，以便再次结晶。然后，添加110mL不含过氧化物、不含抑制剂的二乙醚，将混合物搅拌并随后在–20℃下静置过夜。将二铵盐用烧结的玻璃过滤，用二乙醚洗涤两次，用HPLC-级正戊烷洗涤一次，并通过抽吸干氮气经过滤饼而干燥。通过将白色晶体状产物溶解在适当的热的变性乙醇中而第二次重复重结晶过程。在最后的重结晶之后，将产物在真空烘箱中(45℃，25托)进一步干燥约6小时，然后保存在干燥器中的P₂O₅上。该操作得到约43g(88％收率)的稳定的、不含溶剂的、轻微吸湿的白色晶体状盐，其足够醇，从而能够以10-100mM的范围添加到HPLC缓冲剂中。

通常，除了常用的非常有限范围的试剂例如三乙胺和磷酸之外，用作HPLC缓冲剂的HPLC-级胺和酸难以获得。因此，获得用于HPLC用途的缓冲阴离子的稳定的高纯度铵盐是有用的。铵盐在化学上比相应的游离胺更稳定，且它们比纯的胺本身更容易处理。该通用操作经微小的修改用于制备纯化的甲烷膦酸、磷酸和亚磷酸的二铵盐。使用高质量HPLC-级磷酸、高质量新鲜重结晶的固体亚磷酸或甲烷膦酸。在使用前对液态胺进行蒸馏以便除去许多杂质。高纯度(>99％)气态胺，Me₃N、Me₂NH、MeNH₂、EtNH₂，以气态形式从钢瓶递送。通常，这些胺的可商购的水溶液不够纯，以至于不能使用。还使用高纯度氢氧化季铵的水溶液(～35％w/w)。HPLC-级甲醇或HPLC-级变性乙醇这两种溶液中的任一种以2-20mL溶剂每克盐的使用率用于结晶。使用该方法制备了大范围的晶体状二铵盐。

(R¹NH₃ ⁺)₂(R-PO₃ ^2-)R¹＝CH₃,C₂H₅,ⁿC₃H₇,ⁿC₄H₉,ⁿC₅H₁₁,ⁿC₆H₁₃；

R＝H-,CH₃-,C₂H₅-,HO-,CH₃O-

(R¹R²NH₂ ⁺)₂(R-PO₃ ²-)R¹＝R²＝CH₃；R¹＝R²＝C₂H₅；R¹＝CH₃,R²＝C₂H₅；R¹＝CH₃,

R²＝ⁿC₃H₇；R¹＝CH₃,R²＝ⁿC₄H₉；R＝H-,CH₃-,C₂H₅-,HO-,CH₃O-(R¹R²R³NH⁺)₂(R-PO₃ ²-)R¹＝R²＝R³＝CH₃；R¹＝R²＝R³＝C₂H₅；R¹＝R²＝CH₃,R³＝C₂H₅；

R¹＝R²＝C₂H₅,R³＝CH₃；R¹＝R²＝CH₃,R³＝ⁿC₃H₇；R¹＝R²＝CH₃,

R³＝ⁿC₄H₉；R＝H-,CH₃-,C₂H₅-,HO-,CH₃O-

(R¹R²R³R⁴N⁺)₂(R-PO₃ ²-)R¹＝R²＝R³＝R⁴＝CH₃；R¹＝R²＝R³＝R⁴＝C₂H₅；R¹＝R²＝CH₃,

R³＝R⁴＝C₂H₅；R¹＝R²＝R³＝CH₃,R⁴＝C₂H₅；R¹＝R²＝CH₃,

R³+R⁴＝-(CH²)₄-；R¹＝R²＝R³＝CH₃,R⁴＝ⁿC₄H₉；

R＝H-,CH₃-,C₂H₅-,HO-,CH₃O-

Claims (10)

1.通过反相置换色谱法从混合物分离有机化合物的方法，包括：

提供疏水性固定相；

向所述疏水性固定相施加包含待分离的有机化合物的混合物；

通过向所述疏水性固定相施加包含非表面活性疏水性阴离子置换剂分子的水性组合物而从所述疏水性固定相置换所述有机化合物；以及

收集从所述疏水性固定相洗脱的含有被分离的有机化合物的多个馏分；

其中所述非表面活性疏水性阴离子置换剂分子包含疏水性阴离子和反离子CI，其具有通式A或B：

[CM][CI]_d[CM-R*-CM’][CI]_d

AB

其中在通式A和B中，各CM或CM’独立地为带有负形式电荷的疏水性化学部分，所述化学部分选自：羧酸盐(XVI)、N-酰基-α-氨基酸(XVII)、磺酸盐(XVIII)、硫酸盐单酯(XIX)、磷酸盐单酯(XX)、磷酸盐二酯(XXI)、膦酸盐单酯(XXII)、膦酸盐(XXIII)、四芳基硼酸盐(XXIV)、硼酸盐(XXV)、硼酸盐酯(XXVI)；其中所述化学部分(I)-(XXVI)具有以下化学结构：

其中在通式B中，CM和CM’独立地为带有相同或相反的形式电荷的带电荷的化学部分，且通过双连接的化学部分R*而彼此化学地连接，其中R*替换CM上的一个R¹、R²(若存在)、R³(若存在)或R⁴(若存在)化学部分且替换CM’上的一个R^1'、R^2'(若存在)、R^3'(若存在)或R^4'(若存在)化学部分；

其中各R¹、R^1'、R²、R^2'、R³、R^3'、R⁴和R^4'是独立地由下式定义的直链或支链的化学部分，

-C_xX_2x-2r-AR¹-C_uX_2u-2s-AR²,

R*是直接化学键或是由下式定义的双连接的直链或支链的化学部分，

-C_xX_2x-2r-AR¹-C_uX_2u-2s-,

且R⁵为由下式定义的直链或支链的化学部分，

-C_xX_2x-2r-AR²；

其中各AR¹独立地为衍生自甲烷的双连接的亚甲基部分-CX¹X²-、衍生自苯的双连接的亚苯基部分-C₆G₄-、衍生自萘的双连接的亚萘基部分-C₁₀G₆-或衍生自联苯的双连接的亚联苯基部分-C₁₂G₈-；

其中AR²独立地为氢(-H)、氟(-F)、苯基(-C₆G₅)、萘基(-C₁₀G₇)或联苯基(-C₁₂G₉)；

其中各X、X¹和X²各自独立地为-H、-F、-Cl或-OH；

其中任意-C_xX_2x-2r-内或任意-C_uX_2u-2s-内或任意-(CX¹X²)_p-内的任意亚甲基部分(-CX¹X²-)可以各自独立地被独立的醚-氧原子-O-、独立的硫醚-硫原子-S-、或独立的酮-羰基-C(O)-替换，其方式为使得各醚-氧原子、各硫醚-硫原子或各酮-羰基的每一侧与脂肪族碳原子或芳香族碳原子键合；

其中任何-C_xX_2x-2r-或任何-C_uX_2u-2s-内可替换有不超过两个醚-氧原子、不超过两个硫醚-硫原子和不超过两个酮-羰基；

其中m_x是各-C_xX_2x-2r-中被醚-氧原子、硫醚-硫原子和酮-羰基替换的亚甲基的总数目，且m_u是各-C_uX_2u-2s-中被醚-氧原子、硫醚-硫原子和酮-羰基替换的亚甲基的总数目；

其中G各自独立地为-H、-F、-Cl、-CH₃、-OH、-OCH₃、-N(CH₃)₂、-CF₃、-CO₂Me、-CO₂NH₂；-CO₂NHMe、-CO₂NMe₂的任意组合；

其中G*各自独立地为-F、-Cl、-R²、-OH、-OR²、-NR²R³、-CF₃、-CO₂Me、-CO₂NH₂；-CO₂NHMe、-CO₂NMe₂的任意组合；

其中一对R²、R^2'、R³、R^3'、R⁴和R^4'可以包含单独的化学部分，从而R²/R³、R²/R⁴、R³/R⁴、R^2’/R^3’、R^2’/R^4’或R^3’/R^4’各自独立地为-(CX¹X²)_p-，其中p＝3、4、5或6；

其中对于各R¹、R^1'、R²、R^2'、R³、R^3'、R⁴、R^4'、R⁵和R*，各x、r、u、s、m_x、m_u的整数值独立地选择，整数值r和s是所含的分离的顺式/反式烯类(烯烃)基团的总数加上所含的简单单环结构的总数且落在以下范围内：0≤r≤2和0≤s≤2，数值x+u-m_x-m_u落在以下范围内：0≤x+u-m_x-m_u≤11；

其中在A或B的CM或CM’内含有至少一个芳香族化学部分、杂环芳香族化学部分、咪唑啉化学部分、脒化学部分或胍化学部分；

其中各R化学部分的基团-疏水-指数n在数值上等于脂肪族碳原子的数目加上烯类碳原子的数目加上硫醚-硫原子的数目加上氯原子的数目加上氟原子的数目的五分之一加上醚-氧原子的数目的一半加上酮-碳原子的数目的一半加上数目超过六个的芳香族碳原子的数目的一半的总和减去超过一个的羟基氧原子的数目；

其中各[CM]或[CM-R*-CM’]的总-疏水-指数N在数值上等于脂肪族碳原子的数目加上烯类碳原子的数目加上硫醚-硫原子的数目加上氯原子的数目加上氟原子的数目的五分之一加上醚-氧原子的数目的一半加上酮-碳原子的数目的一半加上数目超过六个的芳香族碳原子的数目的一半的总和减去超过一个的羟基氧原子的数目；

其中R¹和R^1’的基团-疏水-指数¹n和^1’n落在以下范围内：4.0<¹n,^1’n<12.0，当存在时，R²、R^2’、R³、R^3’、R⁵、R^5’、R*的基团-疏水-指数²n、^2’n、³n、^3’n、⁵n、^5’n和*n落在以下范围内：0.0≤²n、^2’n、³n、^3’n、⁵n、^5’n、*n<12.0，且当存在时，R⁴和R^4’的基团-疏水-指数⁴n和^4’n落在以下范围内：0.0≤⁴n,^4’n≤5.0；

其中总-疏水-指数N除以g的值落在以下范围内：10.0≤N/g<24.0；

其中在A中，当带电荷的部分CM具有形式负电荷时，g＝1，且在B中，当CM和CM’均具有形式负电荷时，g＝2，且在B中，当CM和CM’具有相反的形式电荷且[CM-R*-CM']的总电荷为负时，g＝1；

其中对于环状化学部分所计算的基团-疏水-指数的数值平均分配在两个分别的R化学部分之间；

其中当仅有一个R化学部分连接至CM或CM’时，R¹或R^1'被识别为该R化学部分；其中当有超过一个R化学部分连接至CM或CM’时，R¹或R^1'被识别为具有基团-疏水-指数最大值的该R化学部分；其中当有超过三个R化学部分连接至CM或CM’时，R⁴或R^4'被识别为具有基团-疏水-指数最小值的该R化学部分；且

其中CI是非干扰性的、带相反电荷的反离子或这样的反离子的混合物，且d的值为零、正整数或正分数，从而保持整个疏水性化合物的电中性。

2.如权利要求1所述的方法，其中包含非表面活性疏水性阴离子置换剂分子的所述水性组合物除了pH缓冲剂之外不含有添加的盐。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中CM具有通式XXIV或XXV：

其中在所述通式XXIV中，R¹是苯基、4-EtC₆H₄-、4-ⁿPrC₆H₄-、4-ⁿBuC₆H₄-、4-MeOC₆H₄-、4-FC₆H₄-、4-MeC₆H₄-、4-MeOC₆H₄-、4-EtC₆H₄-、4-ClC₆H₄-或C₆F₅-；且各R²、R³和R⁴独立地为苯基、4-FC₆H₄-、4-MeC₆H₄-、4-MeOC₆H₄-、4-EtC₆H₄-、4-ClC₆H₄-或C₆F₅-；且

其中在所述通式XXV中，R¹是4-(4-ⁿBuC₆H₄)C₆H₄-或4-(4-ⁿBuC₆H₄)-3-ClC₆H₃-。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中CM具有选自以下的通式：4-R¹C₆H₄SO₃H、5-R¹-2-HO-C₆H₃SO₃H、4-R¹-C₆H₄-C₆H₃X-4’-SO₃H和4-R¹-C₆H₄-C₆H₃X-3’-SO₃H，其中R¹是CH₃(CH₂)_n，其中n＝4-10且X是H或OH。

5.如权利要求1或2所述的方法，其中CM具有通式XVIII或XXIII：

其中在所述通式XVIII中和在所述通式XXIII中，R¹是C₆H₅(CH₂)_n-，其中n＝5-11。

6.如权利要求1或2所述的方法，其中CM具有选自以下的通式：5-R¹-2-HO-C₆H₃CO₂H和R¹C(O)NHCH(C₆H₅)CO₂H，其中R¹是CH₃(CH₂)_n-，其中n＝4-10。

7.如权利要求1或2所述的方法，其中CM具有通式4-R¹C₆H₄PO₃H₂其中R¹是CH₃(CH₂)_n-，其中n＝4-10。

8.如权利要求1或2所述的方法，其中CI是选自以下的非干扰性无机阳离子或这样的非干扰性阳离子的混合物：碱金属离子、碱土金属离子、二价过渡金属离子和NH₄ ⁺；其中CI是选自以下的非干扰性有机阳离子或这样的非干扰性阳离子的混合物：质子化的伯胺(1+)、质子化的仲胺(1+)、质子化的叔胺(1+)、质子化的二胺(2+)、季铵盐离子(1+)、锍离子(1+)、氧化锍离子(1+)、鏻离子(1+)、双-季铵盐离子(2+)，其可以含有C₁-C₆烷基和/或C₂-C₄羟基烷基。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述碱金属离子是Li⁺、Na⁺、K⁺、Rb⁺或Cs⁺；所述碱土金属离子是Mg²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺或Ba²⁺、所述二价过渡金属离子是Mn²⁺或Zn²⁺。

10.如权利要求1或2所述的方法，其中包含非表面活性疏水性阴离子置换剂分子的所述水性组合物包含至多25体积％的有机溶剂。